CN1756562A - 流感病毒疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗流感病毒感染引起的疾病的疫苗，和免疫接种方法。所述疫苗含有与载体蛋白质偶联的从流感病毒的M2和/或HA蛋白质衍生的肽。

Description

流感病毒疫苗

相关申请的交叉参考

本申请要求分别在2003年3月7日和2003年12月18日提交的美国临时申请No.60/452749和60/530690的利益，在这里引作参考。

发明领域

本发明涉及用于预防和治疗涉及流感病毒疾病的疫苗、接种和治疗领域。

发明背景

流感病毒，有包膜、分段的负链RNA病毒以两种主要类型存在，甲型流感和乙型流感。该病毒是引起人类流感的传染性物质。根据两种病毒跨膜蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，甲型流感病毒进一步分为亚型。迄今为止，在人类中已经鉴定了甲型流感的三种亚型，H1N1，H2N2，和H3N2(Hilleman，Vaccine20，3068-3087，2002)。几乎仅在人类循环的乙型流感病毒特征在于抗原改变比率比较低。最近得到的乙型流感病毒的分离物分类为两个主要系统树，乙型流感病毒/维多利亚/2/87亚类和乙型流感病毒/Yamagata/16/88亚类。这两种谱系在抗原上和遗传上是不同的，使得在白鼬几乎没有或没有发现感染后交叉-中和抗体反应(Rota等，J GenVirol 73(Pt 10)，2737-42(1992))。

流感病毒基因组的分段性质使得超感染细胞中病毒复制期间能够进行节段重新分配。节段重新分配，结合基因突变和漂移，随着时间产生各种血清型组中流感病毒的多种趋异株。新病毒株表现出血凝素和神经氨酸酶蛋白质中抗原性的变异。

目前预防流感的主要措施是每年接种。最常见的是使用全病毒疫苗。它们必须含有甲型流感H1N1株，甲型流感H3N2株，和乙型流感株。然而，由于流感跨膜蛋白的连续抗原变异，单一的抗那些蛋白质的疫苗对于年复一年地使用是不合适的。因此，大群体的流感病毒许多株得以表征、示踪和预测。根据指定一年期间各病毒株的流行和预测，设计一种疫苗来刺激抗优势和预期病毒株的保护性免疫应答。

与一次接种提供几年或终生保护的疫苗的使用相比，每年接种的方法对于患者和内科医师是不方便的，对患者人群施用是易变的，不提供抗给定血清型组中其他流感病毒株的交叉保护作用，并且导致流感感染而丧失生命。因此，能一次接种、能提供抗高度趋异病毒群中新病毒株的交叉保护作用，并且能提供疫苗的多年或终生的所述保护作用的抗流感疫苗大有裨益。

对于给定流感类型的所有病毒株都有稳定流感抗原基础上的疫苗能提供这样的裨益。最近，甲型流感的M2蛋白质经研究是抗原性蛋白质，其是形成这样的疫苗的基础(Slepushkin等，1995 Vaccine 13：1399-1402)。M2蛋白质是结构保守的病毒表面蛋白质。M2是流感病毒体相对次要的成分(Zebedee和Lamb，1988 J.Virol.62：2762-2772)，但是在病毒感染期间在受感染细胞中大量表达(Lamb等，1985Cell 40：627-633)。在受感染细胞中，M2出现在细胞膜中并且提供病毒复制的质子流(Helenius，1992 Cell 69：577-578)。

有人阐述在感染的体内和体外模型中甲型流感病毒的复制受到抗M2抗体的抑制(Zebedee和Lamb，1988 J.Virol.62：2762-2772；Hughey等，1995 Virology 212：411-421)。Slepushkin等，1995Vaccine 13：1399-1402，描述了一个实验，其中用全长M2接种的小鼠受到抗异源甲型流感致命侵袭的保护，并且显示病毒从感染的肺组织清除的提高的清除率。

最近，有报道说其中去除了疏水性跨膜结构域的修饰的M2蛋白质对于制备疫苗是有用的(美国专利6,169,175)。另一观点中，Neirynck等，1999 Nature Med.5：1157-1163，描述了利用M2的胞外结构域与乙型肝炎核心抗原N-末端的融合。当将肝炎核心抗原掺入到病毒样颗粒中时，据说M2表位作为乙型肝炎核心抗原暴露的N-末端的部分而呈递。作者阐明，在它们的系统中，与乙型肝炎核心抗原的N-末端的融合，以模拟病毒颗粒和感染细胞中M2蛋白质野生型结构的方式呈递M2表位。

但是，这种方法不能延伸至乙型流感病毒，因为没有等价于M2的疫苗靶。乙型流感病毒M2-等价功能最可能的候选蛋白质，BM2，具有只有5-7个氨基酸的极短的胞外结构域(Mould等，DevelopmentalCell 5，175-184，2003)。另一种候选蛋白质，NB，最近被证明对于体外病毒复制不是必要的(Hatta等，J.Virol.77，6050-6054，2003)。

开发通用乙型流感病毒疫苗的另一种方法以称作HA₀的HA前体的成熟切割位点为基础。导向于HA的保守表位，特别是HA₀的保守表位的疫苗，将适用于甲型流感和乙型流感。

包膜糖蛋白HA介导病毒的最初附着和接着的内化(Skehel等，Annual Review of Biochemistry 69，531-69，2000)。HA由HA₁和HA₂两个亚基构成，这两个亚基是由它们的前体HA₀的切割而来的(Skehel等，Proc Natl Acad Sci USA 72，93-7(1975；Chen等，Cell 95，409-17，1998)。HA₀成熟是细胞-相关过程，由其中复制病毒的细胞分泌的蛋白酶介导(Zhirnov，Biochemistry(Mosc)68，1020-6(2003)。很多分泌的酶都与HA₀裂解有关，包括纤维蛋白溶酶，激肽释放酶，尿激酶，凝血酶，血液凝固因子Xa，顶体蛋白，类胰蛋白酶Clara，类胰蛋白酶TC30，小-纤维蛋白溶酶，来自人呼吸道灌洗液的蛋白酶，和来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的细菌蛋白酶。HA₀裂解成HA₁-H_A2激活病毒传染性(Klenk等，Virology 68，426-39，1975；Lazarowiz & Choppin，Virology 68，440-54(1975)，并且对于人和鸟类宿主致病性起决定作用(Klenk & Garten，Trends Microbiol2，39-43 1994；Steinhauer，Virology 258，1-20，1999)。

决定其对宿主蛋白酶敏感性的HA的主要特征是HA₀前体的蛋白质水解位点的构成，最近通过X-射线结晶学解决了甲型流感病毒的结构(Chen等，Cell 95，409-17，1998)。HA₀几乎与成熟加工的HA₁-HA₂蛋白质相同，主要不同在于切割位点周围18个残基。在前体中，这些残基折叠成延伸的没有切割的环。亚基间切割位点的氨基酸序列在各个流感亚型中，和在乙型流感病毒的两个系中是高度保守的。HA₂侧，其相应于融合肽，在甲型流感亚型中也是保守的，与H3和H1，以及和乙型流感几乎相同。

在本说明书中，术语HA₀肽类用来指从HA₀的一级序列衍生的任何肽。这包括对于HA₀独特的切割位点序列，但是还有HA₀前体和成熟HA共有的任何序列。成熟HA由两个共价连接的亚基HA₁和HA₂构成。因为这个原因，与切割位点序列不同的HA₀肽指，或者是作为HA肽，或HA₂肽。这些术语的每一个指这里称作HA₀肽中的肽的一个类型。

Nagy等首先披露了这种方法的可行性，他证明用相应于HA₀的序列317-341(H1亚型)的合成肽接种的小鼠得以部分保护免受致病病毒侵袭(Nagy等，Scand J Immunol40，281-91，1994)。HA₀向HA₁-HA₂转化为疫苗靶的进一步证实来自蛋白酶抑制剂对病毒复制的作用。在带有单碱基切割位点的流感病毒中，丝氨酸蛋白酶抑制剂能减少人呼吸上皮和受感染小鼠肺中HA₀切割和病毒激活(Zhirnov等，J GenVirol 63，469-74，1982；Zhirnov等，J Gen Virol 65，191-6，1984；Zhirnov等，J Virol 76，8682-9，2002)。

发明概述

本发明的一方面是蛋白质-肽偶联物，或者其药学可接受盐，其中各自包含甲型流感病毒M2蛋白质的胞外表位的多个肽与载体蛋白质的表面偶联。

本发明的另一方面是蛋白质-肽偶联物，或者其药学可接受盐，其中各自包含甲型流感病毒HA₀蛋白质的表位的多个肽与载体蛋白质的表面偶联。

本发明的另一方面是蛋白质-肽偶联物，或者其药学可接受盐，其中各自包含乙型流感病毒HA₀蛋白质的表位的多个肽与载体蛋白质的表面偶联。

在特定的实施方案中，通过使肽与蛋白质表面上的反应位点共价连接而将肽与蛋白质偶联。得到的结构是一种偶联物。蛋白质表面上的反应位点是有化学活性的或者能被活化的并且空间上对于与肽的共价连接是可行的位点。优选的反应位点是氨基酸赖氨酸的ε氮原子。共价连接指存在生理条件下对水解稳定的共价键。优选地，该共价键对于在包括加成物形成，氧化，和还原的生理条件下可能发生的其他反应是稳定的。肽与蛋白质的共价连接是通过“连接工具”实现的。这样的工具包括相应的结构，物质，或这里描述的作用及其等价物。

在本发明这个方面的特定实施方案中，载体蛋白质是疫苗接种领域中有用的抗原性蛋白质。在本发明特定实施方案中，抗原蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌(Neiserria meningitidis)的外膜蛋白质复合体(OMPC)。在其他实施方案中，载体蛋白质可以是破伤风类毒素，白喉类毒素，乙肝表面抗原(HBsAg)，乙肝核心抗原(HBcAg)，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，或者牛或人乳头瘤病毒病毒样颗粒(VLP)的L1蛋白，例如6，11或16型HPV的VLP。

在本发明这个方面的其他实施方案中，肽通过它们的N-末端或者它们的C-末端与载体蛋白质偶联。

在其他实施方案中，肽通过接头部分与载体蛋白质偶联。在特定实施方案中，接头是单性或两性间隔基。

在其他实施方案中，载体蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体(OMPC)，并且偶联物有与各个OMPC表面偶联的大约100至大约6000个肽。

在另外的实施方案中，其他氨基酸置换肽序列中的天然存在的氨基酸。在特定实施方案中，丝氨酸残基置换半胱氨酸残基。

在另外的实施方案中，对肽序列进行修饰，以改变肽的等电点。

本发明的另一方面是具有偶联物，佐剂和生理可接受载体的疫苗。在具体实施方案中，佐剂是以铝为基础的佐剂。在具体实施方案中，疫苗进一步包括阳离子佐剂，例如QS21佐剂。

本发明的另一方面是具有M2偶联物和来自乙型流感的HA₀肽的偶联物，佐剂和生理可接受载体的疫苗。

本发明的另一方面是具有M2偶联物和来自甲型流感的HA₀肽的偶联物，来自乙型流感的HA₀肽的偶联物，佐剂和生理可接受载体的疫苗。

本发明的另一方面是用包括肽-蛋白质偶联物，或者其药学可接受盐的疫苗对患者进行抗甲型流感病毒感染引起的疾病的接种的方法，其中各自包含甲型流感病毒的M2蛋白的胞外表位的多个肽与载体蛋白质表面偶联。在优选实施方案中，对患者施用有效量的本发明的疫苗。

本发明的另一方面是用包括肽-蛋白质偶联物，或者其药学可接受盐的疫苗对患者进行抗甲型流感病毒感染引起的疾病的接种的方法，其中各自包含甲型流感病毒的HA₀蛋白表位的多个肽与载体蛋白质表面偶联。在优选实施方案中，对患者施用有效量的本发明的疫苗。

本发明的另一方面是用包括肽-蛋白质偶联物，或者其药学可接受盐的疫苗对患者进行抗甲型或乙型流感病毒感染引起的疾病的接种的方法，其中各自包含甲型或乙型流感病毒的HA₀蛋白表位的多个肽与载体蛋白质表面偶联。在优选实施方案中，对患者施用有效量的本发明的疫苗。

本发明的另一方面是通过使具有流感病毒M2蛋白质的胞外表位序列的肽与蛋白质表面上的反应位点共价连接来制备肽-蛋白质偶联物的方法。

本发明的另一方面是通过将本发明的偶联物配以佐剂并且用药学可接受载体配制配以佐剂的偶联物来制备疫苗的方法。

本发明的另一方面是联合疫苗，其中抗原成分中的一个包括具有与载体蛋白质表面的氨基酸偶联的甲型流感病毒的M2蛋白质胞外表位的肽。在具体实施方案中，联合疫苗包括选自流感嗜血杆菌，甲型、乙型或丙型肝炎病毒，人乳头瘤病毒，麻疹，腮腺炎，风疹，水痘，轮状病毒，肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抗原成分。另外，本发明的疫苗能与甲型流感病毒和乙型流感病毒的其他抗原成分，特别是从血凝素和神经氨酸酶衍生的表位联合使用。

附图的简要描述

图1.硫醇化载体(1)与溴乙酰化(2)或马来酰亚胺化(3)肽反应，并且得到硫醇醚键(方案I)。

图2.载体本身带有的伯胺(1)与溴乙酰化(2)或马来酰亚胺化(3)肽反应，并且得到仲胺键(方案II)。

图3.马来酰亚胺化载体(1)与包含硫醇的肽(2)反应并且产生硫醇醚键(方案III)。对于含有多个硫醇的肽，单个肽能产生与载体马来酰亚胺的多个键。这能减少加给载体的肽的总量。如果对独立的蛋白质上的马来酰亚胺上产生多个键，则能发生通过肽的载体亚基的交联。

图4.卤代烷载体(1)与含有硫醇的肽(2)反应并且产生硫醇醚键(方案IV)。对于含有多个硫醇的肽，单个肽能产生与载体卤代烷的多个键(碘乙酰或溴乙酰)。这能减少加给载体的肽的总量。如果对独立的蛋白质上的碘乙酰基团产生多个键，则能发生通过肽的载体亚基的交联。

图5.交联的马来酰亚胺化流感肽和硫醇化OMPC的水解。能定量测定非蛋白质氨基酸S-(1，2-二羧乙基)-高半胱氨酸，提供共价键的证据。能定量测定4-氨基丁酸和6-氨基己酸，来估计存在的总的肽(方案V)。

图6.偶联的溴乙酰化流感肽和硫醇化OMPC的水解。能定量测定非蛋白质氨基酸S-(羧甲基)-高半胱氨酸，提供共价键证据。能定量测定6-氨基己酸，来估计存在的总的肽(方案VI)。

图7.含有流感肽和碘乙酰化OMPC的偶联半胱氨酸的水解。能定量测定非蛋白质氨基酸S-羧甲基-半胱氨酸，提供共价键证据。能定量测定6-氨基己酸，来估计存在的总的肽。能定量测定4-氨基苯甲酸来估计与OMPC缔合的交联剂的总量(方案VII)。

图8.包含Flu M2肽和马来酰亚胺化OMPC的偶联半胱氨酸的水解。能定量测定非蛋白质氨基酸S-(1，2-二羧乙基)-半胱氨酸，提供共价键证据。能定量测定6-氨基己酸，来估计存在的总的肽。能定量测定4-氨基苯甲酸来估计与OMPC缔合的交联剂的总量(方案VII)。能定量测定凝血酸来估计与OMPC缔合的交联剂的总量(方案VIII)。

图9.在小鼠中用M2肽偶联物疫苗诱导M2-特异性抗体应答。雌性Balb/c小鼠，每组10只，用0.01微克，0.1微克或1微克指定偶联物肌内免疫接种(剂量基于肽的重量)，三周之后用相同剂量加强接种一次。第一次接种(PD1)之后两周和加强接种(PD2)之后三周采集血样。通过酶联免疫吸附测定法(Elisa)测定M2-特异性抗体滴度。数据代表组几何平均值+/-标准误(GMT+/-SE)。CT M2 15聚体ma-OMPC，是通过C-末端半胱氨酸与马来酰亚胺-活化的OMPC偶联的M2 15-聚体(SEQ ID NO：10)；CT BrAc-M2 15聚体OMPC，是与硫醇化OMPC偶联的C-末端溴乙酰化M2 15-聚体(SEQ ID NO：13)；NT BrAc-M2 15聚体OMPC，是与硫醇化OMPC偶联的N-末端溴乙酰化15-聚体M2肽(SEQ ID NO：11)；CT BrAc-M2(SRS)OMPC，是与硫醇化OMPC偶联的C-末端溴乙酰化M2 23-聚体(SRS)(SEQ ID NO：39)。GMT＝几何平均滴度。

图10.按照图9图示说明的动物免疫方法，CT M2 15聚体ma-OMPC和CT BrAc-M2 15聚体OMPC抗致命流感侵袭的保护作用。加强免疫之后四周用流感A/HK/68重分配体的LD90鼻内侵袭动物。如下计算重量变化百分比：实验这天的组平均重量/侵袭后第0天的组平均重量×100％。如下计算存活百分比：实验这天的动物数量/侵袭后第0天的动物数量×100％。

图11.CT BrAc-M2 15聚体OMPC和CT BrAc-M2(SRS)OMPC抗致命流感侵袭的保护作用。按照图9和图10的说明。

图12.CT BrAc-M2 15聚体OMPC和NT M2 15聚体ma-OMPC抗致命流感侵袭的保护作用。按照图9和图10的说明。

图13A马来酰亚胺衍生化流感肽与硫醇化OMPC的偶联。

图13B溴乙酰化流感肽与硫醇化OMPC的偶联。

图14肽SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：14是如图13A所示能与载体蛋白质连接的肽的例子。肽SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：13是如图13B所示能与载体蛋白质连接的肽的例子。肽SEQ ID NO：39是带有能与OMPC或者其他载体蛋白质的硫醇反应性衍生物偶联的C-末端半胱氨酸的SRS M2序列的截短的形式。SEQ ID NO：2代表更长的M2相应物。

图15.赖氨酸支架上多个M2肽的图示说明。

R＝SEQ ID NO：8.

图16.赖氨酸支架上多个M2肽的图示说明。

R＝SEQ ID NO：1.

图17.赖氨酸支架上多个M2肽的图示说明。

R＝SEQ ID NO：2.

图18.赖氨酸支架上多个M2肽的图示说明。

R＝SEQ ID NO：2.

图19.A连接成二聚体的多个M2肽的图示说明。DAP＝L-2，3-二氨基丙氨酸。上面的二聚体包括SEQ ID NOs：55 & 56。下面的二聚体包括SEQ ID NOs：57 & 58。

图20.赖氨酸支架上多个M2肽的图示说明。

R＝SEQ ID NO：2。向图18所示结构导入Cys残基提供如图17和20所示带有自由硫醇官能团的MAP。这样的MAPs可以用于偶联包含溴乙酰基，马来酰亚胺或其他硫醇反应团的载体蛋白质。

图21.赖氨酸支架上多个M2肽的图示说明，其中支架结构连接在一起。R＝SEQ ID NO：2。

图22A.HA₀-特异性抗体反应抗乙型流感肽-偶联物疫苗。

图22B.对用乙型流感肽-偶联物疫苗接种小鼠进行乙型流感病毒侵袭之后的存活曲线。

图23.在亚致死侵袭模型中试验乙型流感疫苗成分对体内病毒复制的作用。

图24.用甲型流感HA₂肽偶联物疫苗免疫的小鼠的存活曲线。

图25.通过X-射线在12-壳粒VLP中测定的L1蛋白质的带状图(Chen等，″Structure of small virus-like-particles assembledfrom the L1 protein of human papillomavirus 16″，Mol.Cell.，Vol.5，pp.557-567，2000)。各个中等灰色小球代表位于VLP外表面上19 Lys链的NZ原子。暗灰色簇是Phe 50，它是H16.V5和H16E70抗体两者表位的部分。浅灰色簇代表对于H16.J4抗体的结合环。使用MolMol程序制图(Koradi，R.，Billeter，M.，和Wutrich，K.1996。MOLMOL：a program for display and analysis ofmacromolecular structures.J.Mol.Graphics 14，51-55)。

图26A & 26B.(27A)SEC-BLC和(27B)分析超速离心测定的HPVVLP 16型(实心线)，活化/淬火的HPV-VLP(虚线)和偶联的M2-HPV VLP(带圈的实线)的颗粒大小分布。

图27.M2-HPV VLP的电子显微镜图像。

图28.对于HPV VLP 16型(实心线)，活化/淬火的HPV-VLP(虚线)和偶联的M2-HPV VLP(带圈的实线)，通过350nm OD监测的温度-诱导的聚集作用。

图29A & 29B.29A：在T＝0和T＝4周用含有不同肽剂量的M2-BPV VLP的疫苗接种之后T＝2和6周在小鼠体内M2-HPV VLP诱导的抗-M2抗体的几何平均滴度(GMT)。29B：用含有不同肽剂量的M2-BPV VLP的疫苗接种小鼠后抗致命侵袭成活率。

图30.用M2-KLH偶联物疫苗接种，抗小鼠鼻和肺病毒脱落的保护作用。对小鼠亚致死病毒侵袭之后上下呼吸道病毒脱落曲线。数据代表每个数据时间点上八只小鼠的GMT+/-S.E.。虚线是分析测定阈值。GMT＝几何平均滴度。

图3l.M2-OMPC偶联物疫苗在猕猴中诱导抗体反应。将三十只猕猴分为十组，每组三只。每个数据点代表每组三只动物的平均GMT。Mean/Alum代表所有四组接受明矾配制的M2-OMPC的OMPC免疫或未接触过OMPC的猴的GMT。GMT＝几何平均滴度。

本发明详细描述

本发明提供一种流感疫苗，其中包含甲型流感病毒的M2蛋白质的胞外表位的多个肽与载体蛋白质表面上的氨基酸偶联。本说明书提供了制备偶联物和配制疫苗的方法。本发明还提供了对患者接种的方法，其中患者实现了长期抵抗疾病的保护作用并且减弱了甲型流感病毒感染引起的症状。

肽

甲型流感病毒的M2蛋白质的胞外部分一般认为是蛋白质的24个N-末端氨基酸。疫苗中使用的肽具有从这24个氨基酸序列中选择的氨基酸序列。特定的肽序列可以是整个24个氨基酸的序列或者是具有至少7个氨基酸并且包括抗原性表位的其子集。

应该注意流感病毒M2蛋白质的第一个氨基酸是甲硫氨酸。在本发明的所有实施方案中，末端甲硫氨酸的存在是任选的。

例如通过下面的方法能确定24个N-末端氨基酸的有效序列。首先，分析具有该子序列的肽是否被产生的抗24氨基酸序列的抗体结合。然后将肽与载体蛋白质偶联并且使用得到的偶联物接种动物例如小鼠，白鼬或猴。对来自动物的血清测定该肽的抗体的存在。最后，用流感病毒侵袭动物。评价感染过程和产生的疾病的严重程度。使用多个动物进行该评价最好，结果是对所有动物的评价。如果用偶联物接种减小了感染水平或产生的疾病的严重程度，则认为这种肽在疫苗的制备中是有用的。

在优选实施方案中，肽的氨基酸序列包括M2蛋白质的24，23，22，21，20，19，18，17，16，15，14个或其它数目的N-末端氨基酸。最小大小只受人们期望对患者免疫系统呈递的表位的大小。一些优选的氨基酸序列是SEQ ID NOs：1，10和39。

SEQ ID NO	氨基酸序列
		1	Ac-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD-Aha-C-NH2(Aha＝6-氨基己酸)
2	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-Aha-C-NH2
		3	Ac-SLLTEVETPIRNEWGCRSNDSSD-Aha-C-NH2
4	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRCNDSSD-Aha-C-NH2
		5	Ac-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPL-MKQIEDKLEEILSKLYHIENELARIKKLLGER-NH-2
6	Ac-MSLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLVVAASIIGILHLILWILD-NH2
		7	Ac-SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDPLWAAS-Aha-C-NH2
8	Ac-SLLTEVETPIRNEWGC-(S-Acm)RC-(S-Acm)NDSSD-Aha-C-NH2
		9	C-b-SSLTEVETPIRNEWG-Abu-R-Abu-NDSSD
10	Ac-SLLTEVETPIRNEWG-Aha-C-NH2
		11	溴乙酰基-Aha-SLLTEVETPIRNEWG-NH2
12	4-马来酰亚胺基丁酰-SLLTEVETPIRNEWG-NH2
		13	Ac-SLLTEVETPIRNEWG-Aha-Lys(溴乙酰基)-NH2
14	Ac-SLLTEVETPIRNEWG-Aha-Lys(4-马来酰亚胺基丁酰)-NH2
		15	CGPEKQTRGLFGAIAGFIENG
16	RVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEK
		17	KIDLWSYNAELLVALENQHT
18	Ac-SLLTEVETPIRN-Aha-C-NH2
		19	Ac-SLLTEVETPIRNEW-Aha-C-NH2
20	Ac-SLLTEVETPIRNE-Aha-C-NH2
		21	Ac-SLLTEVETPARNEWGSRSNDSSD-Aha-C-NH2
22	Ac-SLLTEVETPIANEWGSRSNDSSD-Aha-C-NH2
		23	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-Aha-K(4-马来酰亚胺基丁酰)-NH2
24	Ac-LTEVETPIRNEW-NH2
		25	Ac-LTEVET-Aib-PIRNEW-NH2
26	Ac-SLLTEVATPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
		27	Ac-SLLTEAETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
28	Ac-ALLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
		29	Ac-SLATEVETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
30	Ac-SALTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
		31	Ac-SLLTEVETPIRNEWASRSNDSSD-NH2
32	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSA-NH2

33	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSAD-NH2
		34	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDASD-NH2
35	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNASSD-NH2
		36	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSADSSD-NH2
37	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRANDSSD-NH2
		38	溴乙酰基-Aha-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
39	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-Aha-Lys(BrAc)-NH2
		40	4-马来酰亚胺基丁酰-Aha-SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
41	Ac-LTEVETPIRNEW-NH2
		42	Ac-SLLTEVETAIRNEWGSRSNDSSD-NH2
43	Ac-SLLTEVET-Aib-IRNEWGSRSNDSSD-NH2
		44	Ac-SLLTEVEAPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
45	Ac-SLLTAVETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
		46	Ac-SLLAEVETPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
47	Ac-SLLTEVETPIRNEWGSASNDSSD-NH2
		48	Ac-SLLTEVETPIRNEWGARSNDSSD-NH2
49	Ac-SLLTEVPIRNEWGSRSNDSSD-NH2
		50	Ac-SLLTEVETPARNEWGSRSNDSSD-NH2
51	Ac-SLLTEVETPIRNEAGSRSNDSSD-NH2
		52	Ac-SLLTEVETPIRNAWGSRSNDSSD-NH2
53	Ac-SLLTEVETPIRAEWGSRSNDSSD-NH2
		54	Ac-SLLTEVETPIANEWGSRSNDSSD-NH2
55	Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Asp-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Cys-NH2
		56	Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Dap-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Cys-NH2
57	Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Asp-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Cys-NH2
		58	Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Dap-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Cys-NH2

在其中肽的氨基酸序列包括M2蛋白质的17位或19位半胱氨酸的实施方案中，半胱氨酸可以优选地被丝氨酸取代。丝氨酸取代半胱氨酸是有用的，因为根据使用的偶联技术，半胱氨酸的反应性能导致在内部半胱氨酸处而不是在肽的添加的末端半胱氨酸处的肽的多聚化，肽与肽的偶联，或者肽与载体蛋白质的偶联。这些副反应对于偶联物能产生较低的肽加载产率。但是，应该注意肽与载体蛋白质在肽的内部半胱氨酸处的偶联不会产生无效疫苗并且是在本发明的范围之内的。

HA₀的一些片段，特别是位于亚基内切割位点区和HA₂亚基中的那些，是高度保守的。根据大量系列重叠HA₀肽的体内免疫原性和保护作用研究，我们鉴定了几个包含保护性表位的HA₀区。一个区包括HA₀的切割位点，并且其他的区位于HA₂亚基中(见下表)。

此外，与单独给出的偶联物相比，用HA肽制备的偶联物和用M2肽制备的偶联物的联合能提供抗甲型流感病毒引起的疾病的卓越保护作用。因此，本发明的一个优选实施方案是含有M2肽偶联物和其他保守的、保护性流感病毒肽构成的偶联物的疫苗。本发明方法的优选实施方案是对患者施用这样的疫苗，患者产生抗甲型流感病毒的免疫应答，比施用只有M2肽偶联物的疫苗产生的免疫应答优越。

HA肽可选自下组：

HA肽可选自下组：

	简称	序列
			SEQIDNO
		甲型流感
59	Cys-A/H3/HA2-6	CbKIDLWSYNAELLVALENQHT-NH2
			63	A/H3/HA2-9-Cys	GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGCGKKKK-NH2
64	Cys-A/H3/HA2-10	CbIEKTNEKFHQIEKE-NH2
			65	Cys-A/H3/HA2-11	CbRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTK-NH2
66	A/H3/HA2-12-Cys	IEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKbC-NH2
			67	A/H3/HA2-13-Cys	Ac-DQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLKGGC-NH2
68	A/H3/HA2-15	Ac-CGGDQINGKLNRVIEKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLKGGC-NH2
			69	Cys-A/H3/HA2-16	CbRTRKQLRENAEDMGNGAbuFKIY-NH2
70	Cys-A/H3/HA2-17	Ac-CGGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHT-NH2
			71	Cys-A/H3/HA2-19	CGWYGFRHQNSEGTGQAADLK-NH2
72	A/H3(L)/HA2-20-Cys	GLFGAIAGFIENGCE-OH
			73	A/H3(L)/HA2-22-Cys	Ac-GLFGAIAGFIENGCE-OH
74	A/H3(L)/HA2-23-Cys	Suc-GLFGAIAGFIENGCE-OH
			75	Cys-A/H3(L)/HA2-21	Ac-CGGLFGAIAGFIENGE-OH
76	A/H3(L)/HA2-24-Cys	Ac-GLFGAIAGFIENGWEGMVDGCE-OH
			77	A/H3(L)/HA2-25-Cys	GLFGAIAGFIENGWEGMVDGCE-OH
78	Cys-A/H3(L)/HA2-26	Ac-CGQTRGLFGAIAGFIENGE-OH
			79	A/H3/HA2-25-Cys	GIFGAIAGFIENGWEGMVDGCE-OH
80	A/H1/HA2-25-Cys	GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGCE-OH
			81	A/H3(L)/HA2-26-Cys	GLFGAIAGFIENGWEGMVDGKKCE-OH
82	A/H1/HA2-26-Cys	GLFGAIAGFIEGGWTGMIDGKKCE-OH
83	Cys-A/H3/HA0-2	CGPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH2
			84	A/H3/HA0-4-Cys	PEKQTRGLFGAIAGFIGIuNGGCGKKKK-NH2(Pro-Glu内酰胺桥)
85	Cys-A/H3/HA0-7	PEKQTRGLFGAIAGFIC(环)
			86	Cys-A/H3/HA0-8	CGPEKQTRGLFGA-NH2

87	A/H3/HA0-9-Cys	PEKQTRGLFGAIAGFIENGC-NH2
			88	A/H3/HA0-10-Cys	GMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGC-NH2
89	A/H3/HA0-11	CGPEKQTRGLFG-NH2
			90	A/H3/HA0-12	CGPEKQTRGLF-NH2
91	A/H3/HA0-13	CGPEKQTRGL-NH2
			92	A/H3/HA0-14	CGPEKQTRG-NH2
93	A/H3/HA0-15	CGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH2
			94	A/H3/HA0-16	CGNVPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH2
95	Ac-A/H3/HA0-11	Ac-CGPEKQTRGLFG-NH2
			96	Ac-A/H3/HA0-12	Ac-CGPEKQTRGLF-NH2
97	Ac-A/H3/HA0-13	Ac-CGPEKQTRGL-NH2
			98	Ac-A/H3/HA0-14	Ac-CGPEKQTRG-NH2
99	Ac-A/H3/HA0-15	Ac-CGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH2
			100	Ac-A/H3/HA0-16	Ac-CGNVPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH2
101	Ac-A/H3/HA0-2	Ac-CGPEKQTRGLFGAIAGFIENG-OH
			102	Cys-A/H3/HA0-18	Ac-CGPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH
103	Cys-A/H3/HA0-19	Suc-CGPEKCTRGLFGAIAGFIENGE-OH
			104	A/H3/HA0-17-Cys	Suc-EPEKQTRGLFGAIAGFIENGC-OH
105	BrAc-A/H3(L)/HA0-2	BrAc-GPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH2
			106	BrAc-A/H1/HA0-2	BrAc-GPSIQSRGLFGAIAGFIEGG-NH2
107	Cys-A/H1/HA0-2	CGPSIQSRGLFGAIAGFIEGG-NH2
			108	Cys-A/H3/HA0-20	CGPEKQTRGIFGAIAGFIENG-NH2
109	BrAc-A/H3/HA0-21	BrAc-GPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH
			110	BrAc-A/H3/HA0-22	BrAc-EGPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH
111	BrAc-A/H1/HA0-21	BrAc-GPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH
			112	BrAc-A/H1/HA0-22	BrAc-EGPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH
113	Cys-A/H3/HA0-22	Ac-CEGPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH
			114	Cys-A/H1/HA0-21	Ac-CGPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH
115	Cys-A/H1/HA0-22	Ac-CEGPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH
			116	Cys-A/H3(L)/HA0-24	Ac-CEGPEKQTRGLFGAIAGFIENGWEGMIDE-OH
62	Cys-A/H3(L)/HA0-25	Ac-CEGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH
			117	Mal-A/H1/HA0-21	Mal-GPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH
118	Cys-A/H3(L)/HA0-22	Ac-CEGPEKQTRGLFGAIAGFIEE-OH
			119	Cys-A/H1/HA0-27	Ac-CRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGE-OH

61	Cys-A/H1/HA0-25	Ac-CEGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGE-OH
			120	Cys-A/H1/HA0-28	Ac-CEGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGE-OH
121	Cys-A/H1/HA0-29	Ac-CRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGKKE-OH
			122	Cys-A/H1/HA0-30	Ac-CEGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGWTGMIDGKKE-OH
123	Cys-A/H1/HA0-31	Ac-CEGLRNIPSIQSRGLE-OH
			124	BrAc-A/H3(L)/HA0-25	BrAc-Ahx-EGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH
125	BrAc-A/H1/HA0-25	BrAc-Ahx-EGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGE-OH
					乙型流感
			126	BrAc-B/HA0-21	BrAc-GPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
127	Cys-B/HA0-21	Ac-CGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
			60	BrAc-B/HA0-22	BrAc-EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
128	Cys-B/HA0-22	Ac-CEGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
			129	BrAc-B/HA0-23	BrAc-EGAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
130	BrAc-Ahx-B/HA0-22	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
			131	Mal-Ahx-B/HA0-22	Mal-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
132	Cys-Ahx-B/HA0-22	Cys-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
			133	Ac-B/HA0-22	Ac-EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
134	B/HA0-22-E1	Ac-GPAKLLKERGFFGAIAGFLE-NH2
			135	B/HA0-22-N1	Ac-AKLLKERGFFGAIAGFLE-NH2
136	B/HA0-22-N2	Ac-KLLKERGFFGAIAGFLE-NH2
			137	B/HA0-22-N3	Ac-LLKERGFFGAIAGFLE-NH2
138	B/HA0-22-N4	Ac-LKERGFFGAIAGFLE-NH2
			139	B/HA0-22-N5	Ac-KERGFFGAIAGFLE-NH2
140	B/HA0-22-N6	Ac-ERGFFGAIAGFLE-NH2
			141	B/HA0-22-N7	Ac-RGFFGAIAGFLE-NH2
142	B/HA0-22-N8	Ac-GFFGAIAGFLE-NH2
			143	B/HA0-22-C1	Ac-GPAKLLKERGFFGAIAGFL-NH2
144	B/HA0-22-C2	Ac-GPAKLLKERGFFGAIAGF-NH2
			145	B/HA0-22-C3	Ac-GPAKLLKERGFFGAIAG-NH2
146	B/HA0-22-C4	Ac-GPAKLLKERGFFGAIA-NH2
			147	B/HA0-22-C5	Ac-GPAKLLKERGFFGAI-NH2
148	B/HA0-22-C6	Ac-GPAKLLKERGFFGA-NH2
			149	B/HA0-22-C7	Ac-GPAKLLKERGFFG-NH2

150	B/HA0-22-C8	Ac-GPAKLLKERGFF-NH2
			151	B/HA0-22-C9	Ac-GPAKLLKERGF-NH2
152	B/HA0-22-C10	Ac-GPAKLLKERG-NH2
			153	B/HA0-22-C11	Ac-GPAKLLKER-NH2
154	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A1	BrAc-Ahx-AGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
			155	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A3	BrAc-Ahx-EGAAKLLKERGFFGAIAGFLEE-OH
156	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A4	BrAc-Ahx-EGPAALLKERGFFGAIAGFLEE-OH
			157	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A5	BrAc-Ahx-EGPAKALKERGFFGAIAGFLEE-OH
158	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A6	BrAc-Ahx-EGPAKLAKERGFFGAIAGFLEE-OH
			159	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A7	BrAc-Ahx-EGPAKLLAERGFFGAIAGFLEE-OH
160	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A8	BrAc-Ahx-EGPAKLLKARGFFGAIAGFLEE-OH
			161	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A9	BrAc-Ahx-EGPAKLLKEAGFFGAIAGFLEE-OH
162	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A12	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGAFGAIAGFLEE-OH
			163	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A13	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGFAGAIAGFLEE-OH
164	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A16	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAAAGFLEE-OH
			165	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A19	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAIAGALEE-OH
166	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A20	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAIAGFAEE-OH
			167	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A21	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAIAGFLAE-OH
168	BrAc-Ahx-B/HA0-22-A22	BrAc-Ahx-EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEA-OH

BrAc＝溴乙酰基

Ac＝乙酰基

Mal＝马来酰亚胺基

Suc＝琥珀酰

Ahx＝6-氨基己酸

b＝β-丙氨酸

Abu＝2-氨基丁酸

此外，乙型流感病毒HA₀切割位点肽制备的偶联物和用甲型流感病毒M2肽制备的偶联物的组合能提供抗甲型流感病毒和乙型流感病毒两者引起的疾病的保护作用。因此，本发明的一个优选的实施方案是包含M2肽偶联物和来自乙型流感病毒的其他保守的保护性肽构成的偶联物的疫苗。本发明的另一个优选的实施方案是包含M2肽偶联物和来自甲型流感病毒的其他保守的保护性肽构成的偶联物以及来自乙型流感病毒的其他保守的保护性肽构成的偶联物的疫苗。本发明方法的优选实施方案是对患者施用这样的疫苗，患者产生抗甲型流感病毒的免疫应答，比施用只有M2肽偶联物的疫苗产生的免疫应答优越。

M2或HA₂肽抗原也可以由赖氨酸或其他合适的支架上多个抗原肽(MAPs)表示。以这样的方式排列的肽能在本发明的偶联物疫苗中使用。实例参见图.15-18 & 20-21。本发明的偶联物疫苗中肽的另一个可选择的代表是二聚体M2或HA₀肽。在这个形式中，利用连接键，优选共价键，交联两个肽，形成二聚体。M2肽的例子见图19。肽以这种方式排列的偶联物疫苗比用相应的单体肽偶联物制备的疫苗更具有抗原性。

利用本领域共知的技术能制备肽。这样的技术包括化学和生物化学合成。Vincent，在Peptide and Protein Drug Delivery，New York，N.Y.，Dekker，1990中提供了肽的化学合成技术的例子。Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley，1987-1998，和Sambrook，等，在Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中提供了生物化学合成技术的例子，涉及将核酸导入细胞并表达核酸。

载体蛋白质

这里所指的载体蛋白质意思是肽与之偶联的免疫原性蛋白质。各种各样的载体蛋白质是本领域已知的并且用于多糖-蛋白质偶联物疫苗。这些和其他免疫原性蛋白质也可以在本发明疫苗中使用。优选的载体蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌(Neiserria meningitidis)外膜蛋白复合体(OMPC)，破伤风类毒素蛋白质，包括表面抗原蛋白(HBsAg)和核心抗原蛋白(HB Core)的乙肝病毒蛋白，匙孔血蓝蛋白(KLH)，轮状病毒衣壳蛋白和牛乳头瘤病毒VLP或人乳头瘤病毒VLP，例如，6，11或16型HPV的VLPs。

为了制备方便，可以使用一种类型的载体蛋白质制备偶联物。但是，人们也可以使用不同的载体蛋白质一次制备一种以上的偶联物。然后，人们可将偶联物混合配制疫苗。用这种方式，人们能提供疫苗，其除了产生抗流感免疫应答外，还产生抗偶联物中使用的不同载体蛋白质的免疫应答。如果期望，进一步排列组合了各种肽和载体蛋白质的偶联物也是可能的。

优选的载体蛋白质是OMPC。OMPC包含多个可用于偶联的反应位点。通过OMPC中存在的原子形成基团和基团的位置来确定偶联的反应位点的可利用性。利用本领域共知的技术能确定可用于偶联的亲核性官能团(参见Emini，等美国专利No.5,606,030)。能用作偶联的反应位点的一种类型的基团是氨基酸上存在的伯氨基，例如赖氨酸的ε氨基和蛋白质的N-末端氨基酸的α氨基。另外，给出OMPC硫醇化形式的这些氨基的转化作用提供了可以用于与硫醇反应肽偶联的反应官能团。硫醇反应肽的例子是如图13详细描述的溴乙酰化的或马来酰亚胺衍生的肽。利用本领域共知的技术，例如Fu，美国专利No.5,494,808描述的那些，能获得OMPC。

另一类优选的载体蛋白质的代表是具有自组装成病毒样颗粒(VLPs)能力的病毒衣壳蛋白。用作肽载体的VLPs的例子是乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和核心抗原(HBcAg)(Pumpens等，″Evaluationof HBs，HBc，and frCP virus-like particles for expression ofhuman papillomavirus 16 E7 oncoprotein epitopes″，Intervirology，Vol.45，pp.24-32，2002)，戊型肝炎病毒颗粒(Niikura等，″Chimeric recombinant hepatitis E virus-likeparticles as an oral vaccine vehicle presenting foreignepitopes″，Virology，Vol.293，pp.273-280，2002)，多形瘤病毒(Gedvilaite等，″Formation of Immunogenic Virus-likeparticles by inserting epitopes into surface-exposed regionsof hamster polyomavirus major capsid protein″，Virology，Vol.273，pp.21-35，2000)，和牛乳头瘤病毒(Chackerian等，″Conjugation of self-antigen to papillomavirus-likeparticles allows for efficient induction of protectiveautoantibodies″，J.Clin.Invest.，Vol.108(3)，pp.415-423，2001)。最近，构建了模拟真实病毒颗粒分子量和大小的抗原呈递人工VLPs(Karpenko等，″Construction of artificial virus-likeparticles exposing HIV epitopes and the study of theirimmunogenic properties″，Vaccine，pp.386-392，2003)。

利用乳头瘤病毒VLP作为肽抗原载体的预期好处是抗原序列以有序排列呈递，确保来自免疫系统的最佳应答。在一份报告中，发现模拟二十面体病毒体的基质中抗原序列的暴露消除了体液免疫系统区分自身和外来者的能力(Chackerian等，″Induction ofautoantibodies to mouse CCR5 with recombinant papillomavirusparticles″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.96，pp.2373-2378，1999)。通过连接小鼠自身-肽TNF-α和乳头瘤病毒，诱导了小鼠VLP高滴度持续时间长的抗体。使用VLP作为最小抗原载体的一个挑战是要避免由于预先接触VLP载体而诱导的抗-载体抗体的存在而使产生的偶联物疫苗的免疫原性降低。

人乳头瘤病毒(HPV)VLP具有大约60nm大小典型的二十面体晶格结构，每一个通过72 L1蛋白质五聚物的装配而形成(称作壳粒)(Chen等，2000；Modis等，″Atomic model of the papilloma viruscapsid″，EMBO J.，Vol.21，pp.4754-4762，2002)。牛乳头瘤病毒VLP已经被成功用于携带抗原序列，所述抗原序列通过基因融合插入到VLP的L1蛋白质(Chackerian等，1999)，或L2(Greenstone等，″Chimeric papillomavirus virus-like particle elicitantitumor immunity against the E7 oncoprotein in an HPV 16tumor model″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.95，pp.1800-1805，1998)蛋白质，或者融合链霉抗生物素蛋白，然后与生物素化VLPs结合(Chackerian等，2001)。

根据上述参考文献指明的以及下面举例的专利和专利申请，人和牛乳头瘤病毒VLP的制备是本领域共知的：US 6,159,729，US 5,840,306，US 5,820,870和WO01/14416。

下面的实施例描述通过流感病毒肽片段与人乳头瘤病毒(HPV)病毒样颗粒(VLP)的化学偶联而获得的示例性偶联物疫苗的制备和免疫原性。得到的偶联物分子每个VLP由抗原肽的大约800至4,000个拷贝构成，它是通过肽上C-末端半胱氨酸残基与马来酰亚胺活化的HPVVLP反应而获得的。这些偶联物具有比单独的VLP载体稍大一些的平均粒度，并且表现出增强的总的抗化学和热诱导的变性的稳定性。M2-HPV VLP偶联物丧失了对于一些抗-HPV构象抗体的结合亲和性，但是被抗-M2抗体完全识别。用铝佐剂配制流感M2肽-HPV VLP偶联物疫苗。发现两剂30-ng肽是高度免疫原性的，并且在小鼠中带来好的抗流感病毒致命侵袭的保护作用。这些结果表明HPV VLP能用作偶联物疫苗中流感病毒肽的载体。

使用人乳头瘤病毒VLP系统作为抗原载体，用于开发化学偶联的流感肽偶联物疫苗提供一些优点。化学偶联避免能干扰VLPs的适当组装的肽插入L1序列的可能的问题，并且比生物素化作用和结合过程简单的多。此外，得到的结果表明化学偶联使得与先前报道的方法相比每个VLP的肽加载量高得多。此外，在下面的实施例中，肽偶联过程不引起HPV VLP形态的显著改变。因此，VLPs，包括HPV VLPs和类似的牛乳头瘤病毒VLP，能用来构建本发明中的疫苗。

偶联作用

利用本领域任何偶联方法都能偶联本发明的肽和载体。例如，使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC)，N-[ε-马来酰亚胺基己酰氧]磺基琥珀酰亚胺酯(sEMCS)，N-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)，戊二醛，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)，双-重氮联苯胺(BDB)，或N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯(NAHT)能实现偶联。

在载体马来酰亚胺-活化方法中，使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC)，或N-马来酰亚胺基苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯实现偶联。使用sSMCC的方法被广泛使用并且是高特异性的(参见，例如，Meyer等，2002，J.of Virol.76，2150-2158)。sSMCC将半胱氨酸残基的SH-基团与载体蛋白质上赖氨酸残基的氨基偶联。

在使用sSMCC的偶联反应中，首先通过sSMCC试剂与载体的胺(例如赖氨酸)残基结合而活化载体。从过量试剂和副产物分离活化载体之后，加入含有半胱氨酸的肽，并且通过向活化载体的马来酰亚胺官能团加SH-基团而发生连接。使用MBS的方法通过相似机理偶联肽和载体。

使用sSMCC的偶联对于SH-基团可以是高度特异性的。因此，肽中半胱氨酸残基对于容易偶联是必需的。如果肽没有半胱氨酸残基，应该给肽加上半胱氨酸残基，优选在N-末端或C-末端。如果肽中期望的表位包含半胱氨酸，应该利用不使用sSMCC活化载体的方法实现偶联。如果肽包含一个以上的半胱氨酸残基，使用sSMCC，肽不与载体偶联，除非过量的半胱氨酸残基能被置换或修饰。

键不应该干扰肽中期望的表位。优选地，半胱氨酸和期望的表位序列间隔至少一个氨基酸的距离作为间隔区。

本发明中有用的另一种偶联是使用N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯(NAHT)实现的。例如，硫内酯能被用来将硫醇官能团加到OMPC上，允许与马来酰亚胺化或溴-乙酰化肽偶联(Tolman等，Int.J.PeptideProtein Res.41，1993，455-466；Conley等，Vaccine 1994，12，445-451)。

在本发明特定实施方案中，偶联肽和载体蛋白质的偶联反应涉及在一种反应物上导入和/或使用内在的亲核基团并且在另一种反应物中导入和/或使用内在的亲电基团。优选的活化方案(I)(图1)是向载体蛋白质(优选OMPC)导入亲核硫醇基团并且向肽加亲电基团(优选烷基卤化物或马来酰亚胺)。得到的偶联物具有连接肽和载体的硫醇醚键。肽亲电基团(马来酰亚胺或烷基卤化物)和载体蛋白质的内在亲核基团(优选伯胺或硫醇)的直接反应，产生仲胺键(方案(II)图2)或者硫醇醚键。然而，在相似反应条件下预期硫醇亲核基团的反应性比胺高使得方案I是优选的。另一个方案涉及向载体加马来酰亚胺基团(III)图3或者烷基卤化物(IV)图4并且向肽导入末端半胱氨酸和/或再次使用内在肽硫醇产生硫醇醚键。

键

含有硫的氨基酸包含反应性硫基团。含有硫的氨基酸的例子包括半胱氨酸和非蛋白质氨基酸如高半胱氨酸。另外，在活化并且与载体反应之前二硫化物形式中可以存在反应性硫原子。与用亲电基团例如马来酰亚胺或烷基卤化物活化的载体的偶联反应中能使用M2序列中存在的半胱氨酸17和19(方案III(图3)和IV(图4))。利用包含反应性马来酰亚胺和活化酯的杂双功能交联剂导入马来酰亚胺基团是常见的。实现多聚蛋白质马来酰亚胺活化的高水平的尝试能导致交联反应，其中胺基能与交联剂的两个官能团反应。这会产生较低水平的可利用的马来酰亚胺基团，因此产生较低的肽加载量。多聚载体亚基的交联也可能影响偶联物的免疫原性和/或稳定性。对于具有多个半胱氨酸的肽，单个肽可以存以与载体马来酰亚胺或烷基卤化物基团的多个连接。这可能减小肽加载水平。如果通过不同载体蛋白质上马来酰亚胺发生多个连接，则能产生通过肽的载体蛋白质亚基交联的可能性。N-乙酰基半胱氨酸内酯对OMPC伯胺的硫醇化作用能实现高水平硫醇基团，其在合适的缓冲反应条件下产生载体亚基最小限度交联(通过二硫键形成)(Marburg等，1986 J.Am.Chem.Soc.108：5282-5287)。单一末端亲电基团对肽的活化作用(马来酰亚胺或烷基卤化物)能导致高水平肽加载量，高度指导肽与载体偶联。

接头

连接肽和载体的共价接头在生理条件下是稳定的。这样的接头的例子是非特异性交联试剂，单性间隔区和两性间隔区。非特异性交联试剂和它们的使用是本领域公知的。这样的试剂及其应用的例子包括与戊二醛的反应；与N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的反应，有或没有琥珀酰化载体的混合物；糖基化取代基的高碘酸盐氧化作用之后接着在氢硼化钠或氰基氢硼化钠的存在下与蛋白质载体的游离氨基偶联；没有乙酰化的末端丝氨酸和苏氨酸残基的高碘酸盐氧化作用能产生末端醛，其然后能与胺或酰肼反应产生Schiff碱或腙，然后用氰基氢硼化物将其还原为仲胺；芳香氨基的重氮化后接着在蛋白质的酪氨酸侧链残基上偶联；与异氰酸酯反应；或者混合的酸酐的反应。参见，一般性地，Briand，等，1985 J.Imm.Meth.78：59。

单性间隔区及其应用是本领域公知的。单性间隔区是双功能的，并且要求在发生偶联之前将反应对配偶体中的一个官能化。单性间隔区及其应用的例子涉及在碳二亚胺的存在下将免疫原性HCV肽与双功能分子脂肪酸二肼的一个末端偶联。推测二乙酰化肼由载体的下垂的谷氨酸或天冬氨酸羧基形成。然后通过在碳二亚胺的存在下与载体蛋白质的第二偶联反应进行偶联。

两性间隔区及其应用是本领域公知的。在反应对的每一个配偶体官能化之后形成两性间隔区。当每个官能化配偶体与其相对配偶体反应形成稳定共价键时发生偶联作用(参见，例如，Marburg，等，1986 J.Am.Chem.Soc.108：5282-5287；和Marburg，等，美国专利No.4,695,624.)。

肽偶联载荷量

本发明的优点在于人们在偶联物中能实现肽与载体蛋白质的各种摩尔比。通过改变试验和误差方式中偶联程序的某些方面，实现具有期望性质的偶联物，使得载体蛋白质上“肽偶联载荷量”可以是不同的。例如，如果期望高偶联载荷量使得载体蛋白质上每个反应位点与肽偶联，人们能估计载体上的反应位点并且包括偶联反应中大量摩尔过量的肽。如果期望低密度偶联加载，可包括每摩尔载体蛋白质上的反应位点小于1摩尔肽的摩尔比。

最终，实现的产率，偶联物的物理性质，得到的偶联物的效力，患者群和希望给药的期望剂量指导人们选择特定条件。如果疫苗中总的蛋白质不是重要的考虑因素，人们能配制不同偶联载荷量和不同免疫原性偶联物的剂量，以送递相同有效剂量。然而，如果总的蛋白质或体积是重要的考虑因素，例如，如果意在联合疫苗中使用偶联物，人们可以留心偶联物对最终联合疫苗贡献的总的体积或蛋白质。人们然后可以估计具有不同偶联载荷量的几种偶联物的免疫原性，然后选择使用具有合适免疫原性和加给联合疫苗的可接受的总的蛋白质或体积水平的偶联物。

一般情况下，获得高的肽载荷量有两个主要障碍：(i)偶联物的溶解度，和(ii)肽的溶解度。这些性质不是独立的，改善后者的操作对前者是不利的。因此，通常难以获得高的肽载荷量。

因此，期望修饰2003年12月18日提交的美国专利申请60/530,867描述的肽的序列。这篇专利申请描述了提高肽的免疫原性的方法。所述方法包括通过修饰肽，并且使肽与载体偶联来调节肽的等电点(pI)。根据这里使用的，″调节肽的pI″意思是将肽的pI改变成这样一个范围，使得提高偶联物的肽载荷量和溶解度。经常，肽的pI低于这个范围。

利用象等电点聚焦(IEF)这样的实验，或者利用合适软件计算能确定肽的pI。根据美国专利申请60/530,867所述，用改变肽的总电荷的各种方法能改变肽的pI。修饰作用可以是导致肽电荷改变的对肽的任何改变。修饰作用可包括肽中置换，添加，或缺失氨基酸残基。修饰作用还可以包括肽的残基侧链或N-末端氨基或C-末端羧基的修饰。这样的修饰方法在本领域技术人员知识之内。

应该在免疫原性活性序列，即期望的表位之外修饰肽，这样保证保持免疫特性。修饰作用应该即不涉及也不干扰肽中期望的表位。因为修饰作用对肽-偶联物的免疫特性没有影响，优选在肽的N和/或C末端引入改变。

人们还应该记住最高偶联载荷量不一定总是得到最具有免疫原性的偶联物。对于任何给定载体蛋白质的肽长度和偶联载荷量可以影响偶联物总的免疫原性。因此，人们应该评定任何特定载体蛋白质上任何特定肽的偶联载荷量的范围的免疫原性。利用此信息，人们然后能制备和配制疫苗，提供合适剂量的偶联物，以刺激患者中可接受的免疫原应答。

制剂

根据本领域公知和使用的方法能配制本发明的疫苗。一般给药标准在下面的文献中提供，例如，Modern Vaccinology，Kurstak编著，Plenum Med.Co.1994；Remington′s Pharmaceutical Sciences第18版，Gennaro编著，Mack Publishing，1990；和ModernPhannaceutics第二版，Banker和Rhodes编著，Marcel Dekker，Inc.，1990。

本发明的偶联物能制备成酸式盐或碱式盐。药学可接受盐(水溶性或油溶性或可分散性产物形式)包括例如从无机或有机酸或碱形成的常规无毒盐或季铵盐。这样的盐的例子包括酸加成盐，例如乙酸盐，己二酸盐，藻酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸盐，苯磺酸盐，亚硫酸盐，丁酸盐，柠檬酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，环戊烷丙酸盐，二葡糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，延胡索酸盐，葡糖庚酸盐，甘油磷酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，2-羟基乙磺酸盐，乳酸盐，马来酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，甲苯磺酸盐，和十一酸盐；和碱加成盐，例如铵盐，碱金属盐，例如钠盐和钾盐，碱土金属盐，例如钙盐和镁盐，与有机碱的盐，例如二环己基胺盐，N-甲基-D-葡糖胺盐，和与氨基酸例如精氨酸和赖氨酸的盐。

优选地，选择佐剂，使适合与偶联物中使用的特定载体蛋白质一起使用以及最后制剂中的离子组成。还应该考虑单独的偶联物是否配制成疫苗或者偶联物是否配制成联合疫苗。在后一种情况下，应该考虑缓冲液，佐剂和最终联合疫苗中存在的其他制剂成分。

以铝为基础的佐剂是本领域常规使用的，并且包括磷酸铝，氢氧化铝，羟基磷酸铝和羟基-硫酸盐磷酸铝。通常使用的佐剂的商品名包括ADJUPHOS，MERCK ALUM和ALHYDROGEL。根据所期望的和根据使用的特定佐剂所适合的，偶联物可以与佐剂结合或者与之共同沉淀。

也可以使用非铝佐剂。非铝佐剂包括QS21，脂质-A和它们的衍生物或变体，弗氏完全或不完全佐剂，中性脂质体，含有疫苗和细胞因子或趋化因子的脂质体。

优选的是用铝佐剂配制疫苗。在其他优选实施方针中，用铝佐剂和QS21两者配制疫苗。

在一些实施方案中，优选使用来自乙型流感病毒的免疫原，象本申请中描述的那些，和/或使用来自流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)，甲肝、乙肝或丙肝，人乳头瘤病毒，麻疹，流行性腮腺炎，风疹，水痘，轮状病毒，肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的免疫原配制M2肽-蛋白质偶联物。另外，本发明的疫苗可以与特别包括从血细胞凝集素和神经氨酸苷酶衍生的表位的甲型流感病毒的其他抗原成分联合。以该方法能制备联合疫苗。由于要求的接种量较少，联合疫苗具有提高患者舒适性并且给药成本更低的优点。

在配制联合疫苗时应该留心各种缓冲液和与其他免疫原使用的佐剂。一些缓冲液可能对于一些免疫原-佐剂对合适而对于其他的不合适。特别地，人们应该估计磷酸盐水平对各种免疫原-佐剂对的作用，以确保在最终制剂中的相容性。

免疫接种

通过不同的途径能施用本发明的疫苗，例如静脉内，腹膜内，皮下，或肌肉内。优选的途径是肌肉内。优选考虑本领域公知的因素，包括患者的年龄，体重，性别和医学状况；给药途径；期望的效果；使用的特定偶联物(例如，肽，载体上加载的肽等)，确定合适的给药方案。能以多剂接种形式使用疫苗。期望一剂由1微克至1.0毫克范围总蛋白质构成。在本发明的实施方案中，这个范围是0.1mg至1.0mg。然而，优选根据送递的肽的量调节剂量。在任何情况下这些范围是指导性的。应该通过评估产生的偶联物的免疫原性确定更精确剂量，从而送递免疫有效剂量。免疫有效剂量是刺激患者的免疫系统，建立足以提供抗流感病毒感染引起的疾病的长期保护作用的免疫记忆水平的剂量。偶联物优选用佐剂配制。

给药时间取决于本领域公知的因素。开始给药之后，可以接着给与一次或多次加强剂量以保持抗体滴度。给药方案的例子可以是第一天给一剂，一个月或两个月时给第二剂，4，6或12个月时给第三剂，根据需要，在远期时间进行附加的加强。

这里使用的患者或受试者，是动物。哺乳动物和鸟类，特别是家禽，是合适的接种受试者。优选地，患者是人。患者可以是任何年龄，这个年龄的患者能通过产生免疫应答而对用本发明疫苗的接种有所反应。这样产生的免疫应答能完全或部分保护以抵抗流感病毒感染引起的疾病和使症状减轻。

应该注意只有M2肽的本发明的疫苗不预防患者细胞的感染。这是因为当进入患者并且开始感染之时，疫苗肽中M2表位在流感病毒上以非常低的拷贝数存在。典型地，只在病毒感染的细胞表面上看到M2表位。因此，用M2肽-蛋白质偶联物为基础的疫苗进行接种产生的免疫应答定向于感染的细胞。不受有效性特定理论的制约，相信患者免疫应答减小病毒爆发规模，减弱总的病毒感染，从而基本上限制对最初感染的细胞的感染。

本发明疫苗的一个优点是产生抗流感病毒保守表位的免疫应答。因此，施用本发明疫苗会避免每年接种的必要性，以保持患者抵抗流感感染的保护作用。

本发明M2肽-蛋白质偶联物疫苗能与其他疫苗一起配制，得到如上所述的联合疫苗。然后能使用联合疫苗对患者接种，产生抗M2表位以及联合疫苗中其他免疫原的免疫应答。

实施例1

肽的制备

通过本领域常用的固相化学合成方法制备代表M2蛋白质序列部分并且包含C-末端或N-末端反应性溴乙酰基或马来酰亚胺基团的合成肽。

例如，C-末端溴乙酰化M215-聚体，CT-BrAcM2-15聚体，Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Aha-Lys(N^ε-BrAc)-NH2 TFA盐(SEQ ID NO：13)，在APPLIEDBIOSYSTEMS 430A肽合成仪(APPLIED BIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成为与保护的树脂结合的肽。用0.5毫摩尔对-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂起始，该方法使用4倍过量的(2毫摩尔)的各种N^α-Boc保护的氨基酸。侧链保护作用是Lys(Fmoc)，Trp(甲酰基)，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用实现偶联。偶联乙酸，导入N-末端乙酰基。使用1∶1TFA和二氯甲烷(MeCl₂)和用二异丙基乙胺中和TFA盐进行Boc基团的去除。

装配保护的肽树脂之后，通过用25％吡啶的NMP溶液手工处理10分钟，去除Trp残基上的甲酰基和N^ε-Lys残基上的Fmoc保护。用NMP和MeCl₂洗涤树脂之后，Lys上的N^ε氨基与溴乙酸酐(1g/20mlMeCl₂)反应1小时或者直到观察到阴性茚三酮反应。用MeCl₂洗涤之后，将树脂干燥至恒重(2.70g)。

0℃下，用HF(30ml)和作为清除剂的茴香醚(3ml)处理保护的肽树脂(2.70g)1小时。蒸发HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗涤残余物，过滤并且用25％乙酸的水溶液(200ml)萃取。将滤液冻干，得到1.5g粗产物。

通过制备HPLC，缓冲液A＝0.1％TFA-H₂O；B＝0.1％TFA-CH₃CN实现粗产物的纯化。粗产物(0.75g)溶解于最小体积的20％乙酸-H₂O(约100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC离心式压缩柱(WATERS，Milford，MA，DELTA-PAK，15微米，100埃，5×30cm)上，这个柱子在90％A-10％B缓冲液中平衡过。

装载肽之后装载1升90％A-10％B缓冲液混合物。从1升各自连续增加浓度(5％)的流动相产生步进梯度(10％B至40％B)(100mL增量)。使用80mL/min流速洗脱产物。通过监测214nm的UV吸收进行检测。将均质产物级分(通过HPLC分析＞98％纯)合并并且冻干，提供200mg CT-BrAcM2-15聚体肽。通过氨基酸分析和质谱分析证实身份。

类似地进行其他C-末端溴乙酰化肽的合成。例如，C-末端溴乙酰化M223-聚体肽，CT-BrAc-M2-23聚体，Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Lys(N^ε-BrAc)-NH2 TFA盐，(SEQ ID NO：39)，被如下在APPLIED BIOSYSTEMS 430A肽合成仪(APPLIED BIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成为与保护的树脂结合的肽。用0.75毫摩尔对-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂起始，该双偶联方法使用过量的(2毫摩尔)的各种N^α-Boc保护的氨基酸。侧链保护作用是Ser(Bzl)Lys(Fmoc)，Trp(甲酰基)，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)，Asp(OcHex)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用实现偶联。偶联乙酸，用于导入N-末端乙酰基。使用1∶1TFA和二氯甲烷(MeCl₂)和用二异丙基乙胺中和的TFA盐进行Boc基团的去除。装配保护的肽树脂之后，通过用25％吡啶的NMP溶液手工处理10分钟，去除Trp残基上的甲酰基和N^ε-Lys残基上的Fmoc保护。用NMP和MeCl₂洗涤树脂之后，Lys上的N^ε氨基与溴乙酸酐(1g/20ml MeCl₂)反应1小时或者直到观察到阴性茚三酮反应。用MeCl₂洗涤之后，将树脂干燥至恒重。

0℃下，用HF(20ml)和作为清除剂的茴香醚(2ml)处理保护的肽树脂(1.83g)的一半1小时。蒸发HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗涤残余物，过滤并且用25％乙酸的水溶液(200ml)萃取。将滤液冻干，得到1.1g粗产物。

通过制备HPLC，缓冲液A＝0.1％TFA-H₂O；B＝0.1％TFA-CH₃CN实现粗产物的纯化。粗产物(1.1g)溶解于最小体积的20％乙酸-H₂O(≈100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC离心式压缩柱(WATERS，DELTA-PAK，Milford，MA，15微米，100埃，5×30cm)上，这个柱子在90％A-10％B缓冲液中平衡过。装载肽之后装载1升90％A-10％B缓冲液混合物。从1升各自连续增加浓度(5％)的流动相产生步进梯度(10％B至40％B)(100mL增量)。使用80mL/min流速洗脱产物。通过监测214nm的UV吸收进行检测。将均质产物级分(通过HPLC分析＞98％纯)合并并且冻干，提供224mg产物CT-BrAcM2-23聚体。通过氨基酸分析和质谱分析证实身份。

如下详细说明马来酰亚胺化肽的合成。用0.75毫摩尔对-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂起始，合成肽Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Aha-Lys(N^ε-4-马来酰亚胺基丁酰-NH₂ TFA盐(SEQ ID NO：14)。在APPLIED BIOSYSTEMS 430A肽合成仪(APPLIED BIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成与保护的树脂结合的肽。该方法使用4倍过量的(2毫摩尔)的各种N^α-Boc保护的氨基酸。侧链保护作用是Lys(Fmoc)，Trp(甲酰基)，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用实现偶联。偶联乙酸，以导入N-末端乙酰基。使用1∶1TFA和二氯甲烷(MeCl₂)和用二异丙基乙胺中和的TFA盐进行Boc基团的去除。装配保护的肽树脂之后，通过用25％吡啶的NMP溶液手工处理10分钟，去除Trp残基上的甲酰基和N^ε-Lys残基上的Fmoc保护。用NMP和MeCl₂洗涤树脂之后，去除树脂的25％部分(0.188毫摩尔)，Lys上的N^ε氨基与4-马来酰亚胺丁酸(2毫摩尔)和2毫摩尔的DCC和HOBT在NMP中反应3小时或者直到观察到阴性茚三酮反应。用NMP和MeCl₂洗涤之后，将树脂干燥至恒重(0.7克)。

0℃下，用HF(15ml)和作为清除剂的茴香醚(1.5ml)处理保护的肽树脂(0.70g)。蒸发HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗涤残余物，过滤并且用25％乙酸的水溶液(100ml)萃取。将滤液冻干，得到0.40g粗产物。

通过制备HPLC，缓冲液A＝0.1％TFA-H₂O；B＝0.1％TFA-CH₃CN实现粗产物的纯化。粗产物(0.40g)溶解于最小体积的20％乙酸-H₂O(≈100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC离心式压缩柱(DELTA-PAK，15微米，100埃，5×30cm，WATERS，Milford，MA)上，这个柱子在90％A-10％B缓冲液中平衡过。装载肽之后装载1升90％A-10％B缓冲液混合物。从1升各自连续增加浓度(5％)的流动相产生步进梯度(10％B至35％B)(100mL增量)。使用80mL/min流速洗脱产物。通过监测214nm的UV吸收度进行检测。将均质产物级分(通过HPLC分析＞98％纯)合并并且冻干，提供94mg产物。通过氨基酸分析和质谱分析证实身份。

HPLC分析条件

柱子：Vydac 15cm #218TP5415，C18。

洗脱剂：梯度95∶5(0.1％TFA/乙腈)至5∶95(0.1％TFA/乙腈)，经45分钟。

流速：1.5ml/min。

波长：214nM，254nM。

滞留时间：16.9min。

分子式：C₉₉H₁₅₅N₂₅O₃₁。

分子量：2190.13。

如下详细说明第二种马来酰亚胺化肽，Ac-Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly-Ser-Arg-Ser-Asn-Asp-Ser-Ser-Asp-Aha-Lys(N^ε-4-马来酰亚胺基丁酰)-NH₂ TFA盐(SEQ ID NO：23)的合成。用0.50毫摩尔对-甲基二苯甲胺(MBHA)树脂起始，在APPLIED BIOSYSTEMS 430A肽合成仪(APPLIEDBIOSYSTEMS，CITY STATE)上合成与保护的树脂结合的肽。该双偶联方法使用过量的(2毫摩尔)的各种N^α-Boc保护的氨基酸。侧链保护作用是Ser(Bzl)，Lys(Fmoc)，Trp(甲酰基)，Glu(OcHex)，Arg(Tos)，Thr(Bzl)，Asp(OcHex)。利用甲基-2-吡咯烷酮(NMP)中DCC和HOBT活化作用实现偶联。偶联乙酸，导入N-末端乙酰基。使用1∶1TFA和二氯甲烷(MeCl₂)和用二异丙基乙胺中和的TFA盐进行Boc基团的去除。装配保护的肽树脂之后，通过用25％吡啶的NMP溶液手工处理10分钟，去除Trp残基上的甲酰基和N^ε-Lys残基上的Fmoc保护。用NMP和MeCl₂洗涤树脂之后，50％部分(0.25毫摩尔)树脂与4-马来酰亚胺丁酸(2毫摩尔)和2毫摩尔的DCC和HOBT反应3小时或者直到观察到阴性茚三酮反应。用NMP和MeCl₂洗涤之后，将树脂干燥至恒重(2.0克)。

0℃下，用HF(20ml)和作为清除剂的茴香醚(2ml)处理保护的肽树脂(2.0g)。蒸发HF和茴香醚之后，用乙醚充分洗涤残余物，过滤并且用50％乙酸的水溶液(200ml)萃取。将滤液冻干，得到1.0g粗产物。

通过制备HPLC，缓冲液A＝0.1％TFA-H₂O；B＝0.1％TFA-CH₃CN实现粗产物的纯化。粗产物(1.0g)溶解于最小体积的10％乙酸-H₂O(≈100ml)并且用泵加到C-18反相HPLC离心式压缩柱(DELTA-PAK，15微米，100埃，5×30cm，WATERS，Milford，MA)上，这个柱子在85％A-15％B缓冲液中平衡过。装载肽之后经90分钟15％B-45％B梯度洗脱。使用80mL/min流速洗脱产物。通过监测214nm的UV吸收进行检测。将均质产物级分(通过HPLC分析＞98％纯)合并并且冻干，提供320mg产物。通过氨基酸分析和质谱分析证实身份。

HPLC分析条件

柱子：Vydac 15cm #218TP5415，C18。

洗脱剂：梯度95∶5(0.1％TFA/乙腈)至5∶95(0.1％TFA/乙腈)，经45分钟。

流速：1.5ml/min。

波长：214nM，254nM。

滞留时间：16.4min。

分子式：C₁₂₉H₂₀₃N₃₇O₄₈。

分子量：3038.46。

测定合成肽的硫醇当量。例如，NT-BrAcM2-15(N-末端溴乙酰化M215-聚体SEQ ID NO：11)和CT-BrAcM2-15(C-末端溴乙酰化M2 15-聚体SEQ ID NO：13)溶解于N₂-喷洒的25mM硼酸盐，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 8.5缓冲液，最终浓度为7.5mg肽粉末/毫升。用0.97NaOH将pH调节至8.5。溶液经0.2微米过滤。如下通过硫醇消耗分析测定等分样品的溴乙酰基当量。向肽的适当稀释液(约15-30μM终浓度)和等体积的缓冲液加入溶解于N₂-喷洒的25mM硼酸盐，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 8.5缓冲液中的N-乙酰基-半胱氨酸，并且在室温下温育30分钟。温育之后，加入5，5’-二硫-双[2-硝基苯甲酸](DTNB；Ellman’s试剂)(使用N₂饱和的0.1M磷酸钠，0.1M NaCl，2mMEDTA，pH7中的50mM DTNB原液，5mM终浓度)。室温下温育15分钟之后，减去合适的DTNB空白之后，使用ε412nm，测定硫醇浓度，1cm＝14.15×10³M^-1cm^-1。存在肽和不存在肽情况下游离硫醇的差异估计硫醇反应当量。

类似地，NT-MalM2-15(N-末端马来酰亚胺化M2 15-聚体SEQ IDNO：12)和CT-MalM2-15(C-末端马来酰亚胺化M2 15-聚体SEQ ID NO：14)溶解于N₂-喷洒的0.1M HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 7.3缓冲液，最终浓度为7.5mg肽粉末/毫升。用0.97NaOH将pH调节至7.3。溶液经0.2微米过滤。如下通过硫醇消耗分析测定等分样品的马来酰亚胺当量。向肽的适当稀释液(约15-30μM终浓度)和等体积的缓冲液加入溶解于N₂-喷洒的20mM HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 7.3缓冲液中的N-乙酰基-半胱氨酸，并且在室温下温育30分钟。温育之后，加入DTNB(使用0.1M磷酸钠，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH7中50mM DTNB原液，5mM终浓度)。室温下温育15分钟之后，减去合适的DTNB空白之后，使用ε412nm，测定硫醇浓度，1cm＝14.15×10³M^-1cm^-1。存在肽和不存在肽情况下游离硫醇的差异估计硫醇反应当量。

对于包含硫醇的肽(例如：SEQ ID NO：1，2，3，4，10等)，肽溶解于(2.5-7.5毫克/毫升)冰冷N₂饱和的0.1M HEPES，2mM EDTA，0.15M NaCl，pH7.3并且0.2微米过滤。通过将合适体积的肽稀释到N₂饱和的0.1M磷酸钠，0.1MNaCl，2mM EDTA，pH7缓冲液中测定硫醇含量。加入DTNB，使用0.1M磷酸钠，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH7缓冲液中的50mM DTNB原液，达到5mM终浓度。室温下温育15分钟之后，减去合适的DTNB空白之后，使用ε412nm，测定硫醇浓度，1cm＝14.15×10³M^-1cm^-1。

过滤的溴乙酰基或马来酰亚胺化肽的硫醇反应当量

肽样品	[硫醇反应当量]aμmol/mL	[肽]bμmol/mL	每个肽的硫醇反应当量cmol/mol
				NT-BrAcM2-15在硼酸盐缓冲液中OMPC-FLU-9-BrAc肽	0.71n＝1	3.37n＝1	0.21
NT-MalM2-15在HEPES缓冲液中OMPC-FLU-9-Mal肽	3.12n＝1	2.98n＝1	1.05
				CT-BrAcM2-15在硼酸盐缓冲液中OMPC-FLU-10-肽BrAC	0.91n＝1	3.06n＝1	0.30
CT-MalM2-15在硼酸盐缓冲液中OMPC-FLU-10-肽Mal	3.31n＝1	3.11n＝1	1.06

^a通过硫醇消耗量分析测定

^b通过asp，glu，gly，val，ile，leu，& arg值的AAA平均值测定

^c注：由于在硫醇消耗分析中溴乙酰基较低的反应性，NT-BrAcM2-15的[硫醇反应当量]可能被低估大约3-5倍。

含有半胱氨酸的过滤的M2肽的硫醇含量

肽	硫醇/肽  mol/mol预期a          实验b
		SEQ ID NO：1	3              3.0
SEQ ID NO：2	1              0.9
		SEQ ID NO：10	1              1.0

^a以肽序列为基础。

^b以改进的Ellman′s分析为基础的硫醇含量。肽浓度以M2肽的单一色氨酸为基础(假定ε278nm，1cm＝5,550M^-1cm^-1和ε288nm，1cm＝4,550M^-1cm^-1。使用的浓度是在这两个波长下测定的平均值。

实施例2

脑膜炎奈瑟氏球菌的硫醇化外膜蛋白复合体(OMPC)的制备

利用本领域公知的和美国专利No.5,494,808描述的技术获得OMPC。使用Marburg等1986描述的通用方法，通过使用无菌技术制备带有N-乙酰基高半胱氨酸内酯的硫醇化作用。对于NT-BrAcM2-15和CT-BrAcM2-15，硫醇化OMPC最后重新悬浮于N₂饱和的25mM硼酸盐，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 8.5；对于与NT-MalM2-15和CT-MalM2-15反应，重新悬浮于20mM HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH 7.3。通过将硫醇化OMPC适当稀释到N₂饱和的0.1M磷酸钠，0.1MNaCl，2mM EDTA，pH 7缓冲液中测定硫醇含量。使用N₂饱和的0.1M磷酸钠，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH 7缓冲液中50mM DTNB原液将DTNB加到5mM最终浓度。室温下温育15分钟之后，减去合适的DTNB空白和OMPC空白(没有DTNB)之后，使用ε412nm，测定硫醇浓度，1cm＝14.15×1³M^-1cm^-1。

硫醇化OMPC的性质

硫醇化OMPC样品	[硫醇]aμmol/mL	[蛋白质]bmg/mL	硫醇/蛋白质μmol/mg
				硫醇化OMPC在硼酸盐中OMPC-FLU-9-1OMPC-FLU-10-1	1.631.54	6.356.09	0.260.25
硫醇化OMPC
				在HEPES中OMPC-FLU-9-2OMPC-FLU-10-2	1.721.55	6.576.29	0.260.25

^a通过改进的Ellman′s分析测定。

^b通过改进的Lowry分析测定。

实施例3

马来酰亚胺化或烷基卤化物-活化的OMPC的制备

所有操作无菌进行。通过加入合适体积的无菌0.5M NaHCO₃在NaHCO₃pH 8.5±0.1中制备50mM无菌OMPC的水溶液(5.5mg/mL)。温和搅拌下向缓冲的OMPC滴加4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC)或(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSIAB)(10mM冰冷H₂O中的原液；从PIERCE CHEMICAL CO.，ROCKFORD，IL购得的化学品)，给出最终浓度2.5mM sSIAB或sSMCC和大约3.8mg/mL的OMPC浓度。也能使用溴乙酸N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯。反应在4℃避光老化1小时。1小时之后，用无菌1M磷酸钠将反应混合物调节至pH 7.3，并且以300K分子量截留量(MWCO)DISPODIALYZER(SPECTRUM INDUSTRIES，INC.，RANCODOMINGUEZ，CA)用无菌6.3mM磷酸钠，pH 7.3，0.15M NaCl在4℃下经12-24小时彻底透析。或者，可以省去pH-调节而直接透析反应混合物。透析可以使用20mM HEPES，0.15M NaCl，2mM EDTA，pH7.3，其他合适的缓冲液，或者水。SIAB透析避光进行。可以加N₂-喷洒透析缓冲液。

对于SIAB活化的OMPC混合物，优选的透析缓冲液是50mM，溶于NaHCO₃ pH 8.5+0.1。使用上述对于肽描述的N-乙酰基-半胱氨酸消耗分析对透析的活化的OMPC测定硫醇反应当量，除了分析缓冲液是0.1M磷酸钠，0.1M NaCl，2mM EDTA，pH 7并且N-乙酰基半胱氨酸温育时间是15分钟。进行OMPC空白实验(没有DTNB)校正其在412nm时的贡献。通过改进的Lowry测定蛋白质。对于pH 8.5下马来酰亚胺活化作用，一般实现0.09-0.12毫摩尔马来酰亚胺当量/毫克Lowry蛋白质水平。该水平比pH 7.3获得的值高大约2-3倍。使用无菌0.5M EDTA，pH 8原液将活化的OMPC制成2mM EDTA终浓度。

实施例4

M2肽与硫醇化OMPC的偶联

利用无菌技术，如下使硫醇化OMPC偶联于M2肽NT-BrAcM2-15(N-末端溴乙酰化M2 15-聚体SEQ ID NO：11)，CT-BrAcM2-15(C-末端溴乙酰化M2 15-聚体SEQ ID NO：13)，NT-MalM2-15(N-末端马来酰亚胺化M2 15-聚体SEQ ID NO：12)，和CT-MalM2-15(C-末端马来酰亚胺化M2 15-聚体SEQ ID NO：14)。硫醇化OMPC加给不同量的肽并且温和搅拌。不用混合，4℃下反应混合物避光老化过夜。

然后利用无菌技术将反应封端并且脱盐。通过在N-乙基马来酰亚胺(NEM)中使反应混合物成为5mM而与过量OMPC上的硫醇反应并且4℃下避光老化4小时进行NT-BrAcM2-15和CT-BrAcM2-15/硫醇化OMPC偶联反应封端。通过4℃下在300K MWCO DISPODIALYZER中用0.15M NaCl透析，使封端的反应混合物脱盐。通过在碘乙酰胺中使反应混合物成为5mM并且4℃下避光老化4小时进行NT-MalM2-15/硫醇化OMPC偶联反应封端。通过4℃下在300K MWCO DISPODIALYZER中用0.15M NaCl透析，使封端反应混合物脱盐。

实施例5

M2肽与马来酰亚胺化或碘乙酰化OMPC的偶联

使用无菌技术如下进行马来酰亚胺化OMPC或碘乙酰化OMPC(或者溴乙酰化OMPC)与含有硫醇的M2肽(SEQ ID NO：1)的偶联。以硫醇/马来酰亚胺摩尔比大约3的比例向温和混合的马来酰亚胺化或碘乙酰化OMPC滴加M2肽。也可以反过来加入，例如向肽加入OMPC，并且是优选的。反应混合物不用混合，在4℃下避光老化12-24小时。使用0.2微米过滤的β-巯基甲醇(15mM终浓度)接着使试剂不用混合，在4℃下避光与偶联物反应3-4小时，终止(“封端”)OMPC上过量硫醇反应基团。4℃下在300K MWCO DISPODIALYZER中用0.15M NaCl彻底透析封端的反应。

实施例6

偶联物分析

对于测定OMPC蛋白质或者测定偶联物中蛋白质加肽，使用改进的Lowry分析。在该项分析中，在载体脱氧胆酸钠的存在下用三氯乙酸沉淀蛋白质样品(Bensadoun和Weinstein1976，Anal.Biochem.70：241-250)。用含有Lowry试剂A的SDS溶解蛋白质沉淀。用类似方法处理BSA标准物。

对于氨基酸分析(AAA)，用内部标准物正亮氨酸处理样品，并且在真空下在110℃用6N HCl，0.2％苯酚(w/v)处理70小时。见方案V-VIII，图5-8，用于预期的氨基酸水解产物。水解之后，将样品干燥并且重新悬浮于样品缓冲液中并且通过阳离子交换色谱法分析，使用过柱后茚三酮检测(BECKMAN Model 6300，Palo Alto，CA)。也能利用其他系统，包括ACCUTAG^TM(WATERS CORP.，MILFORD，MA)或AMINOACID DIRECT^TM(DIONEX CORP.，SUNNYVALE，CA)进行氨基酸分析，它们可以提供灵敏性和/或分辨率的优势。

通过至少两种方法能从氨基酸数据测定偶联物的肽载荷量。从肽中独特的氨基酸(例如，6-氨基己酸，AHA)能估计肽的量。从OMPC中存在的但是肽中不存在的氨基的量能估计OMPC蛋白质的量。Lowry蛋白质数目获得来自肽的贡献，而且高肽载荷量能对获得的值有重要的贡献。另一种方法涉及以分散层形式使用AAA数据的多重回归分析，最小二乘分析(Shuler等，1992 J.Immunol.Meth.156：137-149)。一般情况下，两种方法产生彼此20％之内的吻合。

还原偶联物样品的SDS-PAGE/染色分析能提供肽偶联物的定性证据。对于马来酰亚胺或碘乙酰基-活化的OMPC/含有硫醇的M2肽，猝灭/活化OMPC的偶联物分析能提供导致以三聚体存在的主要2类OMPC蛋白质的交联的SMCC或SIAB副反应的证据。

实施例7

硫醇化OMPC/马来酰亚胺化或溴乙酰化M2偶联物的性质

透析的NT-BrAcM2-15/硫醇化OMPC偶联物的性质

反应样品OMPC-FLU-9-1	Mod.Lowrya“蛋白质+肽”mg/mL	AAAb蛋白质mg/mL(Lowry/AAA)	S-羧甲基-高半胱氨酸c	肽/OMPCdmol/mol
					A2.8μmol OMPC硫醇+5.7μmol肽	1.22	0.82(1.49)	是	5.122
B2.8μmol OMPC硫醇+2.9μmol肽	1.78	1.54(1.16)	是	3.662
					C2.8μmol OMPC硫醇+1.4μmol肽	2.29	1.95(1.17)	是	3.258
D2.8μmol OMPC硫醇+0.7μmol肽	2.17	2.05(1.06)	是	2.398
					E2.8μmol OMPC硫醇+没有肽	1.64	1.64(1.00)	否	NA

^a改进的Lowry测定法。

^b以从AAA数据计算的值的平均值为基础，假设0.42微摩尔赖氨酸/毫克Lowry蛋白质和0.63微摩尔丙氨酸/毫克Lowry蛋白质。

^cS-羧甲基半胱氨酸分析是定性的。

^d以通过AAA测定的蛋白质值，假设的OMPC MW＝40×10⁶，以及AAA蛋白质/6-氨基己酸(Aha)值为基础，给出肽的摩尔数。

透析的NT-MalM2-15/硫醇化OMPC偶联物的性质

反应样品OMPC-FLU-9-2	Mod.Lowrya“蛋白质+肽”mg/mL	AAAb蛋白质mg/mL(Lowry/AAA)	S-二羧乙基-高半胱氨酸c	肽/OMPCdmol/mol
					A2.9μmol OMPC硫醇+2.8μmol肽	2.91	2.40(1.21)	是	4.300
B2.9μmol OMPC硫醇+1.4μmol肽	2.53	2.29(1.10)	是	3.872
					C2.9μmol OMPC硫醇+0.7μmol肽	2.21	2.07(1.07)	是	2.606
D2.9μmol OMPC硫醇+没有肽	0.65	0.59(1.10)	否	NA

^a改进的Lowry测定法。

^b以从AAA数据计算的值的平均值为基础，假设0.42微摩尔赖氨酸/毫克Lowry蛋白质和0.63微摩尔丙氨酸/毫克Lowry蛋白质。

^cS-二羧乙基高半胱氨酸分析是定性的。

^d以通过AAA测定的蛋白质值，假设的OMPC MW＝40×10⁶，以及AAA蛋白质/6-氨基己酸(Aha)值为基础给出肽的摩尔数。

透析的CT-BrAcM2-15/硫醇化OMPC偶联物的性质

反应样品OMPC-FLU-10-1	Mod.Lowrya“蛋白质+肽”mg/mL	AAAb蛋白质mg/mL(Lowry/AAA)	S-羧甲基-高半胱氨酸c	肽/OMPCdmol/mol
					A2.6μmol OMPC硫醇+5.2μmol肽	2.27	2.03(1.11)	是	4.783
B2.6μmol OMPC硫醇+2.6μmol肽	2.19	2.04(1.07)	是	3.255
					D2.6μmol OMPC硫醇+0.65μmol肽	2.00	2.44(0.89)	是	1.929
E2.6μmol OMPC硫醇+没有肽	1.69	1.92(0.88)	否	NA

^a改进的Lowry测定法。

^b以从AAA数据计算的值为基础，假设0.63微摩尔丙氨酸/毫克Lowry蛋白质。

^cS-羧甲基高半胱氨酸分析是定性的。

^d以通过AAA测定的蛋白质值，假设的OMPC MW＝40×10⁶，以及AAA蛋白质/6-氨基己酸(Aha)值为基础，给出肽的摩尔数。

透析的CT-MalM2-15/硫醇化OMPC偶联物的性质

反应样品OMPC-FLU-10-2	Mod.Lowrya“蛋白质+肽”mg/mL	AAAb蛋白质mg/mL(Lowry/AAA)	S-二羧乙基-高半胱氨酸c	肽/OMPCdMol/mol
					A2.6μmol OMPC硫醇+2.5μmol肽	2.72	2.45(1.11)	是	5.677
B2.6μmol OMPC硫醇+1.3μmol肽	2.51	2.64(0.95)	是	3.439
					C2.6μmol OMPC硫醇+0.65μmol肽	2.43	2.47(0.98)	是	2.298
D2.6μmol OMPC硫醇+0.33μmol肽	2.14	2.38(0.90)	是	1.882
					E2.6μmol OMPC硫醇+没有肽	1.90	1.98(0.96)	否	NA

^a改进的Lowry测定法。

^b以从AAA数据计算的值为基础，0.63微摩尔丙氨酸/毫克Lowry蛋白质。

^cS-二羧乙基高半胱氨酸分析是定性的。

^d以通过AAA测定的蛋白质值，假设的OMPC MW＝40×10⁶，以及AAA蛋白质/6-氨基己酸(Aha)值为基础，给出肽的摩尔数。

一般情况下，以肽的等(摩尔)电荷，马来酰亚胺化肽比溴乙酰化肽产生更高的偶联物中的肽载荷量。与马来酰亚胺基团相比，溴乙酰基团较低的硫醇动力学反应性可能是差异的原因。

实施例8.

马来酰亚胺化OMPC和选择的含有半胱氨酸的肽偶联物的性质

透析的含有半胱氨酸的肽/马来酰亚胺化OMPC偶联物的性质

肽偶联物	Mod.Lowrya“蛋白质+肽”mg/mL	DCEC/AHAb	肽/OMPCcmol/mol
				OMPC-FLU-2-4SEQ ID NO：1	2.09	3.1	1,110
OMPC-FLU-2-5SEQ ID NO：2	2.84	0.99	2,873
				OMPC-FLU-3-5SEQ ID NO：10	2.40	ND	3,398

^a改进的Lowry测定法。

^b通过AAA对S-二羧乙基半胱氨酸(DCEC)和6-氨基己酸(AHA)的定量分析。DCEC反应因子/ASP反应因子＝1.285。

^c以通过AAA测定的蛋白质值，假设0.63微摩尔丙氨酸/毫克Lowry蛋白质，假设的OMPC MW＝40×10⁶，和6-氨基己酸(AHA)值为基础，给出肽的摩尔数。

含有多个半胱氨酸残基的M2肽(例如，SEQ ID NO：1)与带有单一半胱氨酸的肽(例如，SEQ ID NO：2)相比的较高DCEC/AHA水平提示每个单一M2肽有多个马来酰亚胺/半胱氨酸连接。这可能导致偶联物中较低的肽载荷量并且可能影响偶联物的免疫原性。较小的肽(例如，SEQ ID NO：10)表现出对于含有单一半胱氨酸的M2肽偶联物的反应在相等肽电荷下给出较高的肽载荷量。这种作用可能由于OMPC上马来酰亚胺位点处的空间束缚和/或肽上反应性半胱氨酸附近的电荷差异。对于淬灭/马来酰亚胺活化的OMPC，SDS-PAGE提示活化和脱盐步骤中马来酰亚胺与OMPC中内在亲核试剂反应(参见Brewer和Riehm 1967 Anal.Biochem.18：248-255)发生交联。在较低pH下发生较少明显的交联。SIAB-活化的OMPC表现出最少的交联。通过酰亚胺的开环反应，也可以将一些马来酰亚胺基团转化为马来酰胺酸。马来酰胺酸的硫醇反应性不足。一般情况下，发现使用马来酰亚胺化肽和硫醇化OMPC制备的偶联物相对于含有单一半胱氨酸的肽和马来酰亚胺活化的OMPC的类似肽反应有更高的肽载荷量。使用硫醇化作用(大约0.26微摩尔硫醇/毫克蛋白质)相对于马来酰亚胺化作用(0.09-0.12微摩尔马来酰亚胺/毫克蛋白质)的OMPC活化水平更高，揭示这个发现的原因。

实施例9

偶联物的动物研究

对于动物研究，除了对NT-BrAcM2-15使用大约2的比例之外，都使用大约1的肽/OMPC硫醇电荷比例(mol/mol)制备偶联物。转移在0.15M NaCl中的无菌制备的偶联物，以便用铝佐剂(MERCK明矾)配制。

动物研究中使用的偶联物的性质

偶联物样品	AAAa蛋白质mg/mL	肽/OMPCbmol/mol
			CT-BrAcM2-15	6.29	3,771
CT-BrAc(SRS)M2-23	6.04	2,762
			OMPC-Flu-10-1GNT-BrAcM2-15	2.18	4,453
淬灭的/硫醇化OMPC	6.13	NA
			CT-CysM2-15	2.70	4,576

^a以从AAA数据计算的值为基础，假设0.63微摩尔丙氨酸/毫克Lowry蛋白质。

^b以通过AAA测定的蛋白质值，假设的OMPC MW＝40×10⁶，和6-氨基己酸(AHA)值为基础，给出肽的摩尔数。

实施例10

疫苗配制

实施例11中使用下面的偶联物。“组”号指接种动物的组。制剂中使用的偶联物是CT-M2-15聚体-ma-OMPC(进一步指作偶联物″A″)，在第1-3组中使用；CT-BrAcM2-15聚体-OMPC(进一步指作偶联物″B″)，在第4-6组中使用；NT-BrAcM2-15-聚体-OMPC(进一步指作偶联物″C″)，在第7-9组中使用；CT-BrAcM2(SRS)-23-聚体-OMPC(进一步指作偶联物″D″)，在第10-12组中使用。活化/淬灭的OMPC(进一步指作偶联物″E″)，在第13组中使用。稀释度是根据通过Lowry方法测定的原液的蛋白质浓度和通过氨基酸分析测定的肽载荷量。

步骤1.用1x盐水将偶联物A至D稀释至0.1mg/mL肽浓度。将化合物E稀释至0.5mg/mL蛋白质浓度。

步骤2.以1∶1的比例向预先搅拌的2x明矾(MERCK ALUM，Prod.#39943，MERCK & CO，West Point，PA)加入来自步骤1的各种溶液，使得1x明矾中最终含50mcg/mL蛋白质(对于化合物E，最终蛋白质浓度是1x明矾中0.25mg/mL蛋白质)。

步骤3.室温下在旋转盘上混合2小时。

步骤4.用1x明矾将偶联物稀释，达到目标肽浓度。

4.1如下用1x明矾稀释来自步骤3的溶液：1份溶液用4份1x明矾(v/v)。

4.2室温下在旋转盘上混合1小时。

4.3对于第3，6，9，12组(接受1mcg肽)和第13组(接受5mcg活化/淬火OMPC)留出必要体积的步骤4.2的溶液。

4.4如下用1x明矾混合来自4.2的残留溶液：1份溶液用9份1x明矾(v/v)。

4.5室温下在旋转盘上混合1小时。

4.6对于接受0.1mcg肽的第2，5，8，11组留出必要体积的步骤4.5的溶液。

4.7如下用1x明矾混合来自4.5的残留溶液：1份溶液用9份1x明矾(v/v)。

4.8室温下在旋转盘上混合1小时。

4.9步骤4.8的溶液代表接受0.01mcg肽的第1，4，7，10组的制剂。

步骤5.分配到小瓶中。

所有的样品操作都在无菌条件下进行。

实施例11

对哺乳动物施用疫苗

对小鼠侵袭模型试验M2肽偶联物疫苗的免疫原性和保护作用。

对四种不同的M2肽偶联物评价它们激发M2肽特异性抗体应答的能力以及带来的抗小鼠致命流感病毒侵袭的保护作用。下面表中给出试验偶联物。

普通命名	M2肽序列	偶联化学
			CT BrAc-15聚体-OMPCSEQ ID NO：13	SLLTEVETPIRNEWG	在C-末端与硫醇化OMPC偶联的溴乙酰化肽
CT BrAc-23聚体(SRS)-OMPCSEQ ID NO：39	SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD	在C-末端与硫醇化OMPC偶联的溴乙酰化肽
			NT BrAc-15聚体-OMPCSEQ ID NO：11	SLLTEVETPIRNEWG	在N-末端与硫醇化OMPC偶联的溴乙酰化肽
CT 15聚体-ma-OMPCSEQ ID NO：10	SLLTEVETPIRNEWGC	在C-末端与马来酰亚胺活化的OMPC偶联的硫醇化肽

如实施例10所述，所有的偶联物在MERCK ALUM上配制。对每组由10只雌性Balb/c小鼠组成的每组动物，用100微升偶联物肌内免疫，并且3周之后用相同的偶联物加强免疫一次。以三种不同的剂量对动物试验各种偶联物，即，0.01微克，0.1微克和1微克，以肽含量为基础。例如，实施例10的配制的偶联物A对第1组施用0.01微克，对第2组施用0.1微克，对第3组施用1微克，而配制的偶联物B对第4组施用0.01微克，对第5组施用0.1微克，对第6组施用1微克，以此类推。

用MERCK ALUM中配制的非偶联OMPC按照相同的方案免疫对照动物。第2周(第一次给药后)和第6周(第二次给药后)采集血样。加强免疫之后4周，用LD90(引起90％死亡率的剂量)的小鼠的适应的A/Hong Kong/68重分配体(来自A/HK/68的HA基因和来自A/PR/8/34的M2基因)(H2N2)(这里称作“A/HK/68重分配体″)鼻内侵袭动物。侵袭之后，对小鼠监测每天的体重减轻和死亡率，共监测20天。

通过酶联免疫吸附测定法(Elisa)，使用没有修饰的23氨基酸M2肽作为检测抗原，测定M12-特异性抗体滴度。未接触过抗原的和OMPC对照组都显示没有可检测的抗-M2抗体滴度。图9给出偶联物免疫接种组的结果。所有疫苗组，对PD1和PD2样品都观察到了清楚的剂量效果，表明在合适的剂量范围内测试疫苗。所有的偶联物能显著激发M2-特异性免疫应答。加强免疫之后，以1微克剂量的给予偶联物都激发特异性抗体滴度至五十万或更高。不同疫苗之间，CT BrAc 23聚体(SRS)-OMPC激发最高滴度，而CT 15聚体-ma-OMPC激发最低滴度。CT BrAc-15聚体-OMPC和NT BrAc-15聚体-OMPC之间没有观察到明显差异，表明通过N-末端偶联的肽和通过C-末端偶联的肽免疫原性相当。

致命病毒侵袭之后，正如所预期的，对照组表现出90至100％死亡率。相反，接受了1微克剂量的所有疫苗组有80至100％存活率。这证实试验的疫苗能带来抗死亡的保护作用。图10显示CT BrAc-15聚体-OMPC和CT 15-ma-OMPC之间的比较。两种偶联物之间最显著的差异是0.01微克剂量时，接受CT BrAc-15聚体-OMPC的小鼠有80％存活率，而接受CT 15-ma-OMPC的小鼠和对照组基本上有相同的死亡率。这表明就抗致死侵袭的保护作用来说，CT BrAc-15聚体-OMPC比CT15-ma-OMPC更有效。这个论点是与这两个组表现出的相对M2抗体滴度相吻合的事实。图11显示CT BrAc-15聚体-OMPC和CT BrAc-23聚体(SRS)-OMPC之间的比较。在这种情况下，就死亡率来说，两组之间的差异不明显。然而，接受CT BrAc 23聚体(SRS)-OMPC的组比接受CTBrAc-15聚体-OMPC的组显示总的较少体重减轻，揭示前者可能有更有效的保护作用的倾向。图12显示CT BrAc 15聚体-OMPC和NTBrAc-15聚体-OMPC之间的比较。总之，接受CT BrAc-15聚体偶联物的组比接受NT BrAc-15聚体偶联物的组表现出更高的成活率。在该项实验中，所有M2肽偶联物具有抗致命病毒侵袭的保护作用，而通过C-末端与硫醇化OMPC偶联的M223聚体(SRS)表现出是最有效的疫苗。

实施例12

肽A/H3/HA ₀ -2

SEQ ID NO：	名称	肽序列
			83	A/H3/HA0-2	CGPEKQTRGLFGAIAGFIENG-NH2

A/H3/HA₀-2的肽序列相应于跨越甲型流感序列，H3亚型，HongKong A/68的血细胞凝集素蛋白质前体HA₀的切割位点的亚基内区。粗体是N-末端残基，例如甘氨酸和半胱氨酸残基。这些是通过硫醚键与马来酰亚胺活化的OMPC载体反应产生肽-OMPC偶联物所必须的间隔区并且作为半胱氨酰配体。

A/H3/HA₀-2的肽合成

在先锋肽合成仪(APPLIED BIOSYSTEMS，Foster City，CA)上利用Fmoc/t-Bu化学通过固相法合成肽。使用的树脂是用修饰的Rink接头p-[(R，S)-α-[9H-芴-9-基-甲氧基甲酰胺基]-2，4-二甲氧基苄基]-苯氧基乙酸衍生的，Fmoc-接头AM-Champion，1％交联的(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)PEG-PS为基础的树脂(Rink，H.(1987)Tetrahedron Lett.28，3787-3789；Bernatowicz，M.S.，Daniels，S.B.和Koster，H.(1989)Tetrahedron Lett.30，4645-4667)。

所有的酰化反应用比树脂游离氨基4倍过量的活化氨基酸进行60分钟。用等摩尔量的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸酯)和2倍摩尔过量的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)活化氨基酸。侧链保护基团是：对于Asp，Glu，Ser，Thr和Tyr是叔丁基；对于Cys，Asn，His和Gln是三苯甲基；对于Lys，Trp是叔丁氧羰基。在组装结束时，室温下，用88％TFA，5％苯酚，2％三异丙基硅烷和5％水(Sole，N.A.，和Barany，G.(1992)J.Org.Chem.，57，5399-5403)对干燥肽-树脂处理1.5小时。

将树脂过滤，为了使肽沉淀，向冷的甲基叔丁基醚加溶液。将肽离心之后，用新鲜的冷的甲基叔丁基醚洗涤肽沉淀物，去除有机清除剂。将该过程重复两次。将最终的沉淀物干燥，重新悬浮于H₂O，20％乙腈，并且冻干。

利用半制备WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAK^TMC₁₈柱(40×100mm，15微米)通过反相HPLC纯化粗制肽，使用洗脱剂(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我们使用下面的B梯度：25％-40％经20分钟，流速80ml/min，峰相当于产物，在16’的滞留时间(t_R)洗脱。在ULTRASHPERE，C₁₈柱，25×4.6mm，5微米上进行分析HPLC，用下面的B梯度：20％-50％B，以20′，流速1ml/min。通过在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上进行电子喷射质谱来表征纯化的肽：理论平均mw是2163.48Da，实测值2163.6Da。

A/H3/HA₀-2与OMPC的偶联

设计了从革兰氏阴性细菌纯化OMPC的各种方法(Frasch等，J.Exp.Med.140，87(1974)；Frasch等，J.Exp.Med.147，629(1978)；Zollinger等，美国专利No.4,707,543(1987)；Helting等，ActaPath.Microbiol.Scand.Sect.C.89，69(1981)；Helting等，美国专利No.4,271,147)；利用本领域公知的技术，例如Fu，美国专利No.5,494,808描述的那些，能获得脑膜炎奈瑟氏球菌B改进的外膜蛋白质复合体(iOMPC)。

向2.9mL脑膜炎奈瑟氏球菌改进的外膜蛋白质复合体(iOMPC)溶液(6.84mg/ml)加入0.5M NaHCO₃(0.322mL)至50mM，pH 8.5的最终浓度。向其中滴加0.83mL的20μM二倍过量的(关于OMPC的赖氨酸残基，0.42微摩尔赖氨酸/毫克OMPC蛋白质)杂双功能交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC，PIERCE CHEMICAL CO.，Rockford，I1)溶液。溶液在4℃下避光老化1小时之后，通过加入1M NaH₂PO₄溶液(46微升)将pH降至中性。使用300K MWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES INC.，Rancho Dominguez CA)，使用2升20mM HEPES pH 7.3(4-(2-羟乙基哌嗪-1-乙磺酸)，2mM EDTA(乙二胺四乙酸)的6-缓冲液改变(每2小时)4℃下将溶液透析，去除过量的试剂。透析后共回收8.08mL活化OMPC(OMPC)。

在脱气的0.1M HEPES，2mM EDTA pH 7.3溶液中制备0.7mg/ml含有Cys的肽配体A/H3/HA₀-2的原溶液。通过Ellman分析(Ellman，G.L.(1959)，Arch.Biochem.Biophys.，82，70)测定肽溶液的硫醇含量，并且显示230μM的-SH滴度。

为了确定能安全掺入OMPC上并且不引起沉淀的肽配体的最大量，首先以小规模试验进行偶联反应，其中OMPC与渐增量的肽配体一起温育。OMPC上能掺入的马来酰亚胺基团最大数目受到OMPC上总的赖氨酸残基的限制，即0.42微摩尔赖氨酸/毫克OMPC。如果考虑对于OMPC是40×10⁶Da的平均MW，这相当于16,000赖氨酸摩尔/OMPC摩尔。其中只有一部分实际上被sSMCC活化最多35％，这相当于可获得大约5000摩尔的最大肽载荷量。因此，OMPC与每OMPC摩尔的以下摩尔过量的肽一起温育：500，1000，2000，3000。1小时之后，样品与OMPC样品相比较，检查任何沉淀的存在或者浊度的增加。

在A/H3/HA₀-2的情况下，只有当使用最多2000(Cys-肽/OMPC摩尔的摩尔数)摩尔过量进行1小时温育反应时，偶联反应给出可溶性产物。高于该比例，发生OMPC溶液的完全沉淀。

以这些发现为基础进行大规模反应：用2.08mL的20mM HEPES，2mM EDTA pH 7.3稀释4mL(9.8mg)的OMPC。轻轻涡旋下滴加2.08ml肽原液，相当于2000摩尔过量的肽摩尔数/OMPC摩尔。马来酰亚胺活化的OMPC溶液样品留作测定最终偶联物的肽载荷量的空白样品。让偶联反应混合物4℃下避光老化17小时。然后4℃下避光用β-巯基乙醇将OMPC上所有残留的马来酰亚胺基团淬灭1小时至15mM终浓度(加入8.6微升总体积)。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER，用1升20mM HEPES pH 7.3将溶液透析4次，4小时/改变，去除没有偶联的肽和β-巯基乙醇。

通过Lowry分析(Lowry，O.H.，Rosebrough，N.J.，Farr，A.L.和Randall，R.J.(1951)，J.Biol.Chem.，193，265)测定浓度，对于OMPC-A/H3/HA₀-2测得1.0mg/mL。110℃下用共沸HCl，在抽空的密封玻璃试管中将偶联物和OMPC样品水解70小时。通过氨基酸分析测定氨基酸组成。通过将偶联物氨基酸组成与OMPC载体的和肽配体的相比较，并且通过对数据的多重回归分析，最小二乘分析(Shuler等Journal of Immunological Methods，156，(1992)137-149)，测定肽与OMPC蛋白质的偶联载荷量。对于偶联物OMPC和A/H3/HA₀-2，获得1160的肽对OMPC摩尔数的摩尔比。

实施例13

肽A/H3/HA ₀ -18

根据ProMaC(Protein Mass Calculator软件v.1.5.3计算的，A/H3/HA₀-2肽序列的pI是8.4。为了将肽的pI值降低至4.1，对序列进行工程处理，获得肽HA₀-18，它和A/H3/HA₀-2有着来自流感HA0前体的相同的序列。粗体是偶联，间隔和pI工程处理所必需的残基。

SEQ ID NO：	名称	肽序列1
			102	A/H3/HA0-18	Ac-CGPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH

¹Ac-，乙酰基，CH₃-CO-

A/H3/HA₀-18的肽合成

根据对A/H3/HA₀-2所述合成这种肽。为了制备肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作为活化剂用4-羟甲基苯氧基乙酸接头衍生化的Champion PEG-PS树脂(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)上合成肽。第一个氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二异丙基碳二亚胺)将其活化为对称酸酐，并且酯化成树脂。通过在DMF中与10倍过量的乙酸酐反应在组装的肽末端进行酰化反应。

利用半制备(WATERS MILORD，MA)RCM DELTA-PAK^TMC₁₈柱(40×100mm，15微米)通过反相HPLC纯化粗制肽HA₀-18，使用洗脱剂(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我们使用下面的B梯度：30％-45％经20分钟，流速80ml/min。在ULTRASHPERE，C₁₈柱(BECKMAN，FULLERTON，CA)，25×4.6mm，5微米上进行分析HPLC，用下面的B梯度：30％-45％B，以20′，80％，3’，流速1ml/min。通过在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上进行电子喷射质谱来表征纯化的肽：理论平均MW是2336.83Da，实测值2336Da。

A/H3/HA₀-18与OMPC的偶联

根据实施例12中对于A/H3/HA₀-2所述活化iOMPC。在脱气的0.1MHEPES，2mM EDTA pH 7.3溶液中制备含有Cys肽配体A/H3/HA₀-18原液。通过Ellman分析测定肽溶液的硫醇含量，并且显示230μM的-SH滴度。为了确定能安全掺入OMPC上并且不引起沉淀的肽配体的最大量，还是首先以小规模试验进行偶联反应，其中OMPC与渐增量的肽配体一起温育。即，OMPC与每OMPC摩尔的以下摩尔过量的肽配体一起温育：1000，2000，3000。1小时之后，样品与对照OMPC样品相比较，检查任何沉淀的存在或者浊度的增加。使用较低pI的工程化序列，在使用最大摩尔过量配体3000摩尔/OMPC摩尔下没有见到沉淀或浊度增加。

根据这些发现，向2mL(4.6mg)的OMPC溶液加入1.68mL的肽原液(根据Ellman分析是200μM，相当于3000摩尔过量)。让偶联反应混合物4℃下避光老化17小时。然后4℃下避光用β-巯基乙醇将OMPC上所有残留的马来酰亚胺基团淬灭1小时至15mM终浓度。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER，用20mM HEPES pH 7.3将溶液充分透析，去除没有偶联的肽和β-巯基乙醇。通过对A/H3/HA₀-2所述的Lowry分析和氨基酸分析来分析最终的偶联物。对于偶联物OMPC和A/H3/HA₀-18，获得2542的肽对OMPC摩尔的摩尔比。

实施例14

肽A/H3/HA ₀ -17

SEQ ID NO：	名称	肽序列
			104	A/H3/HA0-17	Suc-EPEKQTRGLFGAIAGFIENGC-OH

¹Suc-，琥珀酰，HOOC-(CH₂)₂-CO-

A/H3/HA₀-17的肽序列相应于甲型流感序列，HK A/68，H3亚型的血细胞凝集素蛋白质前体HA₀的切割位点。该序列类似于实施例1中的A/H3/HA₀-2，但是在这种情况下，与马来酰亚胺活化的载体偶联所需要的半胱氨酸残基在C-末端。该序列进一步被修饰，将肽的pI值调节至4。修饰包括Cys末端羧酸被酰胺代替，在N-末端加谷氨酸和琥珀酰。

A/H3/HA₀-17的肽合成

为了制备肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作为活化剂用4-羟甲基苯氧基乙酸接头衍生化的Champion PEG-PS树脂(BIOSEARCHTECHNOLOGIES，INC.)上进行合成。第一个氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二异丙基碳二亚胺)将其活化为对称酸酐，并且酯化成树脂。根据对A/H3/HA₀-2所述进行组装。通过在DMF中与10倍过量的琥珀酸酐反应在组装的肽末端进行琥珀酰化反应。

利用半制备WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAK^TM C₁₈柱(40×100mm，15微米)通过反相HPLC纯化粗制肽A/H3/HA₀-17，使用洗脱剂(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我们使用下面的B梯度：30％-45％经20分钟，流速80ml/min。在ULTRASHPERE，C₁₈柱(BECKMAN，FULLERTON，CA)，25×4.6mm，5微米上进行分析HPLC，用下面的B梯度：30％-45％B，以20′，80％，3’，流速1ml/min。通过在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上进行电子喷射质谱来表征纯化的肽：理论平均MW是2337.62Da，实测值2336.8Da。

A/H3/HA₀-17与OMPC的偶联

根据实施例12所述活化iOMPC。在脱气的0.1M HEPES，2mM EDTApH 7.3溶液中制备HA₀-17的原液。通过Ellman分析测定肽溶液的硫醇含量，并且显示200μM的-SH滴度。为了确定能安全掺入到OMPC上并且不引起沉淀的肽配体的最大量，首先以小规模试验进行偶联反应，其中OMPC与渐增量的A/H3/HA₀-17一起温育。即，OMPC与每OMPC摩尔以下摩尔过量的肽配体一起温育：1000，2000，3500。1小时之后，样品与OMPC样品相比较，检查任何沉淀的存在或者浊度的增加。使用较低pI的工程化序列，在使用最大摩尔过量配体3000摩尔/OMPC摩尔下没有见到沉淀或浊度增加。

在这些发现的基础上，对3mg(0.94ml)OMPC进行大规模反应。轻轻涡流下，向该溶液滴加1.334ml肽原液，相当于3500摩尔过量的肽摩尔数/OMPC摩尔。让偶联反应混合物4℃下避光老化17小时。然后4℃下避光用β-巯基乙醇与OMPC上所有没有反应的马来酰亚胺基团反应1小时至15mM终浓度。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES，INC.，RANCHO DOMINGUEZ，CA)，用20mMHEPES pH 7.3将溶液充分透析，去除没有偶联的肽和β-巯基乙醇。通过对A/H3/HA₀-2所述的Lowry分析和氨基酸分析来分析最终的偶联物。分析得出掺入1860摩尔A/H3/HA₀-17肽/摩尔OMPC的水平。

实施例15

肽A/H3/HA ₂ -25

SEQ ID NO：	名称	肽序列
			77	A/H3/HA2-25	GLFGAIAGFIENGWEGMVDGCE-OH

A/H3/HA₂-25的肽序列相应于甲型流感序列，H3亚型，HongKongA/68的血细胞凝集素蛋白质HA₂的融合蛋白区。该序列包含用于与马来酰亚胺活化的OMPC偶联的半胱氨酸(粗体)，作为间隔区的甘氨酸残基，和作为C-末端残基将pI调节至3.4值的谷氨酸的插入。

A/H3/HA₂-25的肽合成

为了制备肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作为活化剂用4-羟甲基苯氧基乙酸接头衍生化的Champion PEG-PS树脂(BIOSEARCHTECHNOLOGIES，INC.)上进行合成。第一个氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二异丙基碳二亚胺)将其活化为对称酸酐，并且酯化成树脂。根据对A/H3/HA₀-2所述进行组装。

利用半制备WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAK^TM C₄柱(40×100mm，15微米)通过反相HPLC纯化粗制肽A/H3/HA₂-25，使用洗脱剂(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我们使用下面的B梯度：40％-40％(5’)-60％(20’)，流速80ml/min。在Phenomenex，Jupiter C4柱，15×4.6mm，5微米上进行分析HPLC，用下面的B梯度：35％-55％B，以20′，至80％，3’，流速1ml/min。通过在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上进行电子喷射质谱来表征纯化的肽：理论平均MW是2271.55Da，实测值2271.2Da。

A/H3/HA₂-25与OMPC的偶联

根据实施例12所述活化iOMPC。

在脱气的0.1M HEPES，2mM EDTA pH 7.3溶液中制备A/H3/HA₂-25的溶液。通过Ellman分析测定肽溶液的硫醇含量，并且显示250μM的-SH滴度。

为了确定能安全掺入OMPC上并且不引起沉淀的肽配体的最大量，首先以小规模试验进行偶联反应，其中OMPC与渐增量的A/H3/HA₂-25一起温育。即，OMPC与每OMPC摩尔以下摩尔过量的肽配体一起温育：500，1000，2000，4000，6000。1小时之后，样品与OMPC样品相比较，检查任何沉淀的存在或者浊度的增加。使用较低pI的工程化序列，在使用最大摩尔过量配体6000摩尔/OMPC摩尔下没有见到沉淀或浊度增加。

根据这些发现，对6.3mg(2.57ml)OMPC进行大规模反应。轻轻涡流下，向该溶液滴加3.85ml肽原液，相当于6000摩尔过量的肽摩尔数/OMPC摩尔。让偶联反应混合物4℃下避光老化17小时。然后4℃下避光用β-巯基乙醇与OMPC上所有没有反应的马来酰亚胺基团反应1小时至15mM终浓度。4℃下使用300K MWCO DISPODIALYZER，用20mM HEPES pH 7.3将溶液充分透析，去除没有偶联的肽和β-巯基乙醇。通过对A/H3/HA₀-2所述的Lowry分析和氨基酸分析来分析最终的偶联物。分析得出对于A/H3/HA₂-25掺入2436摩尔肽/摩尔OMPC的水平。

实施例16

肽B/HA₀-22

B/HA₀-22的肽序列相应于乙型流感序列的血细胞凝集素前体HA₀的切割位点，它与Victoria和Yamagata系的乙型流感病毒中的相同，例如B/Ann Arbor/54，B/Hong Kong/330/2001，和B/Yamanashi/166/1998。

SEQ ID NO：	名称	肽序列
			60	B/HA0-22	BrAc-EGPAKLLKER↓GFFGAIAGFLEE-OH

在N-末端导入溴乙酰基使得与甘氨酸间隔区的硫醇化OMPC偶联，从而修饰该序列(Tolman等Int.J.Peptide Protein Res.41，1993，455-466；Conley等Vaccine 1994，12，445-451)，并且进行修饰来调节肽的pI值。修饰作用包括C-末端羧酸被羧酰胺代替，和在N-和C-末端加谷氨酸。

B/HA₀-22的肽合成

在先锋肽合成仪(APPLIED BIOSYSTEMS，Foster City，CA)上利用Fmoc/t-Bu化学通过固相法合成肽。为了制备肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作为活化剂用4-羟甲基苯氧基乙酸接头衍生化的Champion PEG-PS树脂(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)上合成肽。第一个氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二异丙基碳二亚胺)将其活化为对称酸酐，并且酯化成树脂。通过使用DIPCDI/HOBt作为活化剂，与3倍过量的溴乙酸反应，在组装的肽的末端进行溴乙酰化反应。

所有的酰化反应对树脂游离氨基用4倍过量的活化氨基酸进行60分钟。用等摩尔量的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸酯)和2倍过量的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)活化氨基酸。侧链保护基团是：对于Glu是叔丁基；对于Lys是叔丁氧羰基；对于Arg是2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基。在组装之后，室温下，用88％TFA，5％苯酚，2％三异丙基硅烷和5％水(Sole，N.A.，和Barany，G.(1992)J.Org.Chem.，57，5399-5403)处理干燥的肽-树脂1.5小时。将树脂过滤，为了使肽沉淀，向冷的甲基叔丁基醚加该溶液。将肽离心之后，用新鲜的冷的甲基叔丁基醚洗涤肽沉淀物，去除有机清除剂。将该过程重复两次。将最终的沉淀物干燥，重新悬浮于H₂O，20％乙腈，并且冻干。

利用半制备WATERS(MILORD，MA)RCM DELTA-PAK^TMC₁₈柱(40×100mm，15微米)通过反相HPLC纯化粗制肽，使用洗脱剂(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我们使用下面的B梯度：30％-45％经20分钟，流速80ml/min。在ULTRASHPERE(BECKMAN，FULLERTON，CA)，C₁₈柱，25×4.6mm，5微米上进行分析HPLC，用下面的B梯度：30％-50％B，以20′，至80％，3’，流速1ml/min。通过在PERKIN-ELMER API-100上进行电子喷射质谱来表征纯化的肽：理论平均MW是2500.7Da，实测值2500.4Da。

B/HA₀-22与OMPC的偶联

首先通过超速离心(Ti-70转子，50,000RPM，45min，4℃)将iOMPC起始物(150mg)转移到喷洒氮气的无菌过滤的CM761(0.11M硼酸钠，pH 11.3)，并且以10mg/mL的浓度dounce匀化/再悬浮。然后与EDTA-DTT溶液(0.57g EDTA/g OMPC，0.11gDTT/g OMPC，在CM761中)联合，用N-乙酰基高半胱氨酸硫内酯(NAHT)溶液(0.89gNAHT/gOMPC，在通入氮气的水中)将蛋白质硫醇化。硫醇化反应在室温(大约20℃)下进行4小时。然后通过超速离心(50,000RPM，45min，4℃)和dounce匀化/再悬浮步骤，将硫醇化iOMPC转移到25mM硼酸钠，pH 8.0缓冲液中。硫醇化作用之后，进行Lowry分析和Ellman′s分析，然后进行下面的步骤。硫醇化OMPC的硫醇含量是0.25微摩尔硫醇/毫克。

首先以5mg/mL的浓度将65mg的B/HA₀-22溶解于25mM硼酸钠，pH 8.0缓冲液中。然后使用1N NaOH将肽溶液的pH调节回8.0，然后用0.22微米无菌过滤器过滤。然后轻微搅拌下将53mg的硫醇化OMPC(以1.2克肽/克OMPC的质量电荷比)滴加给肽贮存溶液。室温下不用搅拌，让偶联反应进行15.5小时。

偶联反应结束时，将偶联物溶液转移到六个300kDMWCODISPODIALYZERs中，每个操作体积是5mL。将三个DISPODIALYZERs放入4升烧杯中，每个有3.5至4升无菌过滤水。通过使用3-英寸磁搅拌棒和速度可调节搅拌平板，对含有偶联物和3.5至4升无菌过滤水的每个4升玻璃烧杯施加轻微搅拌。总共进行5次对无菌过滤水进行的透析更换，每次更换至少6小时，去除反应副产物和过量的游离肽。

通过对A/H3/HA₀-2所述的Lowry分析和氨基酸分析来分析最终的偶联物。分析得出对于B/HA₀-22掺入6500摩尔肽/摩尔OMPC的水平。

实施例17

对接种HA₀肽-OMPC偶联物的小鼠用甲型流感病毒的小鼠侵袭实验

用与OMPC偶联的HA肽的偶联物对雌性Balb/c小鼠肌内免疫接种。在使用HA₀-21(H1)和HA₀-22(H3)的实验中，偶联使用的化合物是硫醇化OMPC和溴乙酰化肽。在使用HA₀-25(H3L)和HA₀-25(H1)的实验中，使用的化合物是马来酰亚胺基-OMPC和半胱氨酰-肽。利用标准方法纯化偶联物并且制备制剂。

所有的疫苗用Merck Alum或20微克的QS21佐剂配制，并且每次注射以每只小鼠100微升体积给药。在第0，2和4周对小鼠接种。在第7周，用致死剂量的流感病毒PR8或HK对小鼠鼻内侵袭。下面给出数据。

使用HA肽/OMPC偶联物疫苗的小鼠侵袭实验

疫苗	佐剂	疫苗剂量a	存活率	对照组存活率	侵袭病毒
						A/H1/HA0-21A/H3/HA0-22A/H1/HA0-25A/H3(L)/HA0-25A/H3(L)/HA0-25A/H3(L)/HA0-25A/H3(L)/HA0-25	明矾明矾明矾QS21明矾明矾QS21	1ug1ug1ug4ug1ug3ug3ug	5/101/106/107/102/104/107/10	0/101/100/101/101/101/101/10	PR8(H1)HK(H3)PR8(H1)HK(H3)HK(H3)HK(H3)PR8(H1)

^a各肽-OMPC偶联物制剂中肽的量

根据如上所述的标准ELISA形式收集和分析血清样品。

Elisa滴度

                                                        ELISA       SEQ ID

疫苗               序列                                 滴度        NO：

A/H1/HA₀-21       BrAc-GPSIQSRGLFGAIAGFIEE-OH          9×10⁵    63

A/H3/HA₀-22       BrAc-EGPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH         2×10⁷    64

A/H1/HA₀-25       Ac-CEGLRNIPSIQSRGLFGAIAGFIEGGE-OH    4×10⁵    61

A/H3(L)/HA₀-25    Ac-CEGMRNVPEKQTRGLFGAIAGFIENGE-OH    3×10⁷    62

实施例18

对用与OMPC偶联的来自乙型流感病毒的HA ₀ 肽接种的小鼠的乙 型流感病毒侵袭实验

根据如上所述制备乙型流感HA₀偶联物(见上面实施例)。对于B型/HA₀-22 EGPAKLLKERGFFGAIAGFLEE(SEQ ID NO：60)肽-OMPC偶联物使用的偶联作用是与硫醇化OMPC偶联的溴乙酰化肽。

用1，10，100或1000ng的B/HA₀-22对雌性Balb/c小鼠肌内免疫接种：第0和28周，在Merck Alum中配制(ng基于制剂中偶联物的肽含量)。第2和4周采集血清样品，并且通过ELISA测定HA0-特异性抗体滴度。

第二次接种之后三周，用LD90(90％小鼠致死剂量)的适应小鼠的乙型流感病毒B/Ann Arbor/54对小鼠鼻内侵袭。监测小鼠存活率和体重变化，观察20天。

B/HA₀-OMPC偶联物疫苗激发有效HA₀-特异性抗体应答(图22A)。抗体应答是剂量依赖性的。1ng疫苗能激发可感知的HA₀-特异性抗体滴度，1000ng疫苗激发大约一百万滴度。

B/HA₀-OMPC偶联物疫苗抗致死病毒侵袭是高效的。如存活率曲线所示(图22B)，接受10ng，100ng或1000ng的B/HA₀-OMPC疫苗的小鼠显示100％存活率，接受1ng疫苗的小鼠有70％存活率。正如所预期的，天然对照显示90％死亡率。B/HA₀-OMPC疫苗还表现出抗体重减轻的显著保护作用。例如，接受100ng或1000ng疫苗的小鼠与对照小鼠30％体重减轻相比，只有最大10％减轻。

在亚致死侵袭模型中试验了乙型流感疫苗对体内病毒复制的作用。以四周间隔对小鼠接种两次并且用亚致死剂量的B/Ann Arhor/54侵袭。第1，3，5和7天收集鼻和肺清洗物。就鼻病毒脱落物来说，疫苗和对照物没有明显差异。然而，与对照相比较，免疫小鼠肺病毒脱落物大大减少(图23.)。

实施例19

在A/H3/HA ₂ 肽-KLH偶联物接种的小鼠中用甲型流感病毒进行的小 鼠侵袭实验

通过向肽的N-末端加半胱氨酸残基，提供用于与马来酰亚胺活化的KLH反应的硫醇基团，制备A/H3/HA₂-6KLH偶联物(KIDLWSYNAELLVALENQHT)(SEQ ID NO.59)。第0，3和5周，用20QS21中的20微克A/H3/HA₂肽-KLH偶联物对每组10只Balb/c小鼠皮下接种。最后接种之后两周，用LD90的流感HK重分配体鼻内侵袭小鼠。HA6-KLH显示抗致死侵袭的部分保护作用。例如，侵袭之后，对照组表现90％死亡率，而疫苗组显示60％死亡率。另外，接受疫苗的小鼠与没有接种的对照组相比，总的严重体重减轻程度较小(图24)。

实施例20

M2肽与HPV VLPs的偶联

根据(Tobery等，2003)所述，从酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)表达并纯化HPV型16VLPs。该项研究中使用的抗原是通过标准t-Boc固相合成法制备的合成25-残基M2-肽。肽的序列类似于流感病毒株A/Aichi/470/68(H3N1)中的M2蛋白质的胞外片段，Ac-SLLTEVETPIRNEWGSRSND-Aha-C-NH2(SEQ ID NO：2)，并且包括非天然氨基酸，6-氨基己酸(Aha)。

抗原-载体偶联物

L1蛋白质浓度是14μM的50mM NaHCO₃，pH8.4中的HPL VLPs与商购杂双功能交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC，PIERCE CHEMICAL CO.，Rockford，IL)混合至约100的最终sSMCC/L1蛋白质(摩尔/摩尔)之比。反应在2-8℃下进行1小时后通过用含有10mM组氨酸，0.5M NaCl，0.015％吐温80的pH6.2缓冲液透析脱盐，产生sSMCC-活化的HPV VLPs。根据实施例1所述，通过DTNB分析测定马来酰亚胺当量。溶解于N₂-喷洒的缓冲液中的M2-肽与sSMCC-活化的HPV VLPs混合，达到大约3的硫醇/马来酰亚胺(摩尔/摩尔)之比。或者，通过以一定硫醇/马来酰亚胺(摩尔/摩尔)之比将sSMCC-活化的IPV VLPs与N-乙酰基半胱氨酸混合，来制备活化/淬灭的BPV VLP(A/QHPV VLP)。反应在2-8℃下进行约15小时。然后用β-巯基乙醇处理两种样品，将所有过量的马来酰亚胺淬灭。最后，用0.5M NaCl和0.015％吐温80将样品透析(DISPODIALYSER MWCO 300,000 SPECTRUMINDUSTRIES INC.，RANCHO DOMINGUEZ，CA)。当在偶联之前用碘代乙酰胺淬灭HPAI VLPs中的游离硫醇时获得相似结果。

蛋白质浓度和每VLP的肽载荷量的测定

通过比色bicinchoninic acid(BCA)分析测定溶液中蛋白质的浓度。通过氨基酸分析测定每VLP的肽载荷量。样品在6N HCl中在110℃下水解70小时，然后在阳离子交换色谱法处理(AAA SERVICESINC.，BORING，OR)之后定量测定。参照Aha含量或者在Shuler等，1992描述的方法的基础上进行分析，测定肽的量。两种方法给出相同结果。

病毒-样颗粒上抗原肽的载荷量

通过定量测定肽中的非天然氨基酸(Aha，6-氨基己酸)或者通过数据的多重回归最小二乘分析(Shuler等，″A simplified methodfor determination of peptide-protein molar ratios using aminoacid analysis″，J.Immunol.Meth.，Vol.156 pp.137-149，1992)，测定HPV VLP上的肽载荷量。两种方法显示每LI蛋白质的肽载荷量大约是11肽。一个HPV VLP中有360个LI蛋白质拷贝(一个VLP包含72个L1蛋白质五聚体或壳粒)，这样产生每VLP大约4000肽拷贝的总的载荷量。这个数字明显大于以前报道的牛乳头瘤病毒颗粒上携带的肽的总数(Chackerian等，2001)。在牛乳头瘤病毒情况下，抗原性肽与链霉抗生物素蛋白(SA)融合，并且融合构建体与生物素化VLPs相互作用。发现VLPs的L1蛋白质提供约1.5SA四聚体，导致每L1单体约6肽的比例。这个载荷量是用我们的M2肽与HPV VLP的偶联物发现的大约一半。有可能是SA四聚体的庞大阻碍了所报道的情况中较高的抗原载荷量。

通过测定肽偶联产生的sSMCC活化的最初的位点有多少能监测偶联效率。氨基酸分析能提供TXA(凝血酸)的定量估计，其中凝血酸是sSMCC交联剂在水解步骤中的产物。测定的TXA的平均量指示每L1蛋白质约19个活化位点，提示肽偶联中只涉及活化位点的58％(或11/19)。有可能一些活化位点可能与蛋白质交联中产生的Cys，Lys或His的邻近侧链相互作用。我们发现M2-HPV VLP和活化的/淬灭的(A/Q)HPV VLPs在还原条件下不能渗透10％SDS-Bis-Tris凝胶，即使在70℃下用变性溶液处理10分钟也是如此。在加载到凝胶之前在相同的条件下处理之后，未活化的HPV VLPs给出预期活动性的蛋白质带。因此，显示在马来酰亚胺活化之后发生显著VLP内交联。正如下面所看到的，VLP大小量度证明VLP内交联对VLP颗粒大小分布的影响可以忽略不计。

当考虑抗原性肽在HPV VLPs表面上的空间分布时，Lys侧链的伯胺最可能是sSMCC活化位点。16型HPV的L1蛋白质中有34个Lys，这些赖氨酸中有9个位于C-末端。图25所示分子图揭示HPV 16型VLPs上推定的活化位点平均散布在VLP表面。图25显示的Lys残基的NZ原子朝着VLP外面取向。除了Lys 230，所有Lys残基大于25％的表面暴露给溶剂。C-末端区非常柔顺并且易接近蛋白酶，所以非常有可能位于该区的Lys的侧链可被活化。遗憾的是，X-射线结构中不能确定C-末端区(Chen等，2000)。

实施例21

M2-HPV VLP偶联物的药学表征

使用高放大倍数的JEOL 1200 EX透射式电子显微镜通过ELECTRONMICROSCOPYBIOSERVICES(MONROVIA，MD)进行电子显微镜测量。用2％磷钨酸对空气风干的样品染色。90°室温下在Malvern 4700仪器上进行动力学光散射测量。输出功率是0.25W，孔径100，总蛋白质浓度0.1mg/mL。报道的大小代表Z-平均水动力学直径，是从对相同样品五个连续测量中获得的数据的单模型分析得到的结果。在装备有89090A型热控制器的分光光度计HP8453上监测HPV VLP或M2-EIPVVLP偶联物溶液由热引起的浊度增加。以约1.5℃/分钟的速度，根据温度从24℃升高至74℃，记录350nm光密度变化。使用转子An6Ti和双扇形区室在分析型超速离心机Beckman XL-I上进行沉降速度实验。转子速度是10,000rpm并且通过280nm的吸光度观察边界变化。应用程序DCDT+(http：//www jphilo.mailway.com)分析数据。在装备有Shodex Ohpak SB-805柱的HP 1100系统上进行SEC-HPLC，并且洗脱缓冲液含有25mM磷酸盐，0.75M NaCl pH7.0。

动力学光散射(DLS)测量表明M2-HPV VLP偶联物的平均粒度稍微有所增加，从未处理的HPV VLP载体的约60nm至偶联物M2-HPV VLP的约80nm。A/Q HPV VLP揭示平均流体动力学大小是约65nm，非常接近没有处理的载体大小的值。SEC-HPLC结果(图26A)呈现在与A/Q或未处理HPV VLP相比更短滞留时间洗脱的M2-HPV VLP偶联物的主峰；其相应于比A/Q或未处理HPV VLP更大的偶联物的粒度。色谱图中小的肩峰揭示偶联之前和之后聚集材料小级分的存在。最后，沉降速度数据(图26B)呈现以比未处理的或A/Q HPV VLP更大的s*值为中心的M2-HPV VLP沉降系数分布。与单独的载体相比偶联物的沉降系数稍有增加，与DLS和色谱法测量揭示的偶联时分子大小有小程度增加的结果相吻合。总的结果还提示偶联过程中没有发生显著的VLP间交联(并暗示聚集作用)。

EM(图27)观察到的M2-HPV VLP偶联物呈现40-95nm之间的大小分布，平均值在大约65nm。这个值非常接近没有处理的HPV VLP。然而，与没有偶联的载体相反，发现偶联物在M2-HPV VLP具有“微毛表观”，这可能由于存在偶联的肽。对HPV VLP也观察到EM图象中所示的多-VLP聚集体；因此它们可能是EM测量中样品处理的结果，并且不代表溶液中的样品。结论是，EM结果证明在化学偶联过程中保留HPVVLP的形态，并且没有发生HPV VLP骨架的主要破坏。

图28给出对于处理的和没有处理的HPV VLPs或偶联物通过溶液浊度试验测定的热诱导聚集作用曲线。对于没有处理的HPV VLPs，热诱导聚集作用(根据由于光散射的光密度的增加所揭示的)在60℃变得可检测，并且如果温度进一步升高，则以突然的方式增加。对于A/QVLPs或M2-HPAT VLP偶联物，溶液浊度在低于70℃时不存在可检测聚集作用。非常可能的是，抗热诱导聚集作用的增强的稳定性是由于sSMCC处理引起的VLP内交联。通过sSMCC形成的附加的-YLP内键可能阻止L1蛋白质部分解折叠和接着的与疏水性表面的接触。值得注意的是偶联或sSMCC处理导致HPV VLPs表面性质的改变，这可能部分有助于载体稳定性的提高。

实施例22

M2-HPV偶联物的体外抗原性分析

偶联物与抗-HPV和抗-M2抗体相互作用的测定

通过在Biacore 2000仪器上利用表面等离子共振技术评价HPV 16型VLPs和M2-HPV VLP偶联物与M2或HPV 16型特异性抗体的结合。抗-HPV抗体(构象抗体H16.V5，H16.E70和线性表位结合抗体H16.J4)和抗-M2抗体与CM5型传感器片表面上化学固定的大鼠抗-小鼠Fcγ抗体结合。

通过测定M2-HPV VLP偶联物和A/Q HPV VLP与线性和构象抗-HPV小鼠抗体(mAB)的结合，进一步研究抗原的空间分布。发现对于构象或中和抗体H16.V5和H16.E70的结合亲和性显著降低，而与线性抗体H16.J4的结合只是稍微受偶联作用影响。构象抗体H16.V5和H16.E70的结合中涉及的表位包括Phe 50(White等，″Characterization ofa Major Neutralizing Epitope on Human Papillomavirus Type 16L1″，J.Virol.，Vol.73(6)，pp.4882-4889，1999)。如图25所示，有6个Lys残基，其在Phe 50侧翼。可能是，肽与Phe 50周围任何Lys残基的偶联会干扰抗体结合。H16.J4结合VLP中L1蛋白质顶部的环。沿着这个环只有一个Lys，它不会与肽偶联，因为在M2-HPVVLP中不改变与H16.J4结合。

一个关注点是肽在载体表面是否以正确的3-D构象存在。M2蛋白质是甲型流感病毒的整合膜蛋白，并且选择的抗原序列代表M2的胞外部分。M2蛋白质是通过两个二硫键键合的二聚体的同四聚体(Tian等，″Initial structural and dynamic characterization of theM2 protein transmembrane and amphipathic helices in lipidbilayer″，Prot.Sci.，Vol.12，pp.2597-2605，2003)，根据我们的知识，文献中关于M2的胞外片段没有报道详细的3D-结构。CD和荧光测定提示溶液中没有偶联的肽主要是随机结构构象。虽然这些发现不赞成VLP表面上肽以确定的结构构象存在，但是表面等离子共振获得的初步结果指明M2-HPV VLP偶联物结合抗-M2抗体L18.H12和P6C8。在相似条件下使用HPV VLPs或(A/Q)HPV VLP没有检测到与抗-M2抗体的结合。

实施例23

体内免疫学评价

从CHARLES RIVER LABORATORIES(Wilmington，MA)获得4-10周的雌性Balb/c小鼠。间隔四周两次注射用0.1mL I.M.送递的吸附在Merck Aluminum Adjuvant(MAA)上的不同肽剂量的M2-HPVVLP。第二次注射后三周侵袭小鼠。3、30和300ng肽剂量相当于大约5、50和500ng的HPV VLP。每次注射送递的MAA剂量是45mcg。每次注射后两周测定抗-M2几何平均滴度。对于M2抗体ELISA，每孔用50微升的M2肽，浓度是每毫升50mM碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6中4微克，在4℃下将96-孔板包被过夜。平板用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤并且在含有0.05％Tween-20(乳-PBST)的PBS中用3％脱脂乳封闭。用PBST将试验样品稀释4倍。各个孔中加入100微升稀释的样品，培养板在24℃下温育2小时后用PBST洗涤。每孔加入50微升乳PBST中的HRP-偶联的二抗的预定的稀释液，培养板在24℃下温育1小时。洗涤培养板并且每孔加入100微升的100mM柠檬酸钠，pH 4.5中的1mg/ml邻-苯二胺二盐酸。24℃下温育30分钟之后，通过加入100微升的1N H₂SO₄终止反应，并且使用ELISA平板读数器在490nm下对平板读数。抗体滴度定义为给出高于偶联物对照孔平均值加两个标准差的OD490nm值的最高稀释度的倒数。对于病毒侵袭，小鼠适应的病毒A/Puerto Rico/8/34(PR8；H1N1)和X-31(H3N2)，PR8和A/Aichi/68(H3N2)之间的重分配体，在10天龄胚胎卵的尿囊液中繁殖。用氯胺酮/塞拉嗪麻醉小鼠。20微升带有1LD90的病毒滴入到鼻孔中。侵袭之后，每天记录小鼠成活率。如下计算死亡率：(具体这天小鼠数目/第0天小鼠数目)×100％。

每次免疫之后两周采取的血样的ELISA测定结果表明偶联物激发高抗-M2抗体应答(图29A)。虽然滴度增加以系统方式随M2肽剂量从3ng增加至300ng而增加，最低和最高剂量之间滴度的差异在一个对数单位之内。这些结果表明纳克剂量的抗原性肽当在合适的载体上呈递时能诱导显著免疫应答。值得注意的是，当M2肽在较大的载体上偶联时，如上所述的脑膜炎奈瑟氏球菌(Neiserria meningitidis)的外膜蛋白质复合体(OMPC)，在小鼠中发现相似的滴度。

图29B给出小鼠抗致命侵袭的存活率。接受最低剂量(3ng)肽的组只显示60％存活率，而接受更高剂量30或300ng肽的组的保护作用是100％。对照物侵袭之后没有发现存活，证实病毒侵袭和疫苗保护都是有效的。正如上文对于M2-OMPC偶联物疫苗所见到的，即使100％存活率的组侵袭之后也观察到体重有一定程度减轻。结论是，用M2-HPV VLP偶联物疫苗对Balb/c小鼠接种有效保护动物抵抗活病毒侵袭。

文献中描述过载体-诱导的表位-特异性抑制(Rauly等，1999)。因此，未来试验应该测定体内抗-载体抗体的存在怎样影响偶联物的免疫原性。使用M2-OMPC偶联物疫苗的实施例26的试验表明预先接触载体不消除但是稍微减小对流感肽偶联物疫苗的应答。然而，它提示接下来的加强会克服预先存在的抗-载体抗体的任何有害作用。

尽管用载体预先免疫表现出损害抗体应答占绝大多数情况，人们不能简单提出这样一个因果关系，即抗-载体抗体的存在对偶联物疫苗的免疫原性有副作用。据报道，对载体的预先免疫(破伤风类毒素)是有益的，不管是对抗-hCG(人绒毛膜促性腺激素(Shah等，“Priorimmunity to a carrier enhances antibody responses to hCG inrecipients of an hCG-carrier conjugate vaccine″，Vaccine，Vol.17，pp.3116-3123，1999)，还是对疟疾肽(Lise等，″Enhancedepitopic response to a synthetic human malarial peptide bypreimmunization with tetanus toxid carrier″，Infect.Immun.，Vol.55，pp.2658-2661，1987)应答。在描述重组鞭毛作为流感肽表位的载体的不同情况下，发现预先暴露于载体没有作用(Ben-Yedidia和Arnon，″Effect of pre-existing immunity on theefficacy of synthetic influenza vaccine″，Immunol.Lett.，Vol.64，pp.9-15，1998)。现在还没有确定，在HPV VLPs情况下，预先暴露于没有处理形式(作为抗-HPV疫苗)或处理形式(作为载体呈递不同抗原)的载体，在动物模型中是否有任何差异。发现H16.V5抗体完全阻断反应性人血清的75％以上(Wang等，″A monoclonalantibody against intact human papillomavirus type 16 capsidsblocks the serological reactivity of most human sera″，J.Gen.Virol.，Vol.78，pp.2209-2215，1997)。偶联的M2-HPV VLP确实表现出H16.V5抗体结合的构象表位的事实提示，对于预先暴露于HPV的情况来说，抗原和作为载体的HPV VLPs之间通过化学偶联制备的疫苗的载体抑制不是主要要考虑的。

这里给出的使用M2-OMPC的试验证明，抗流感病毒致死侵袭的保护作用能通过施用免疫的动物血清而被动转移，表明中和抗体足以带来保护作用。因为相同的抗原与HPV载体偶联，预期使用M2-HPV VLP偶联物免疫可引发相似的体液应答。关于细胞应答，先前的实验表明，根据通过CD4+T细胞IL-4产生所测定的，HPV 16型VLPs诱导强Th2应答(Tobery等，″Effect of vaccine delivery system on theinduction of HPV16 L1-specific humoral and cell-mediatedimmune responses in immunized rhesus macaques″，Vaccine，Vol.21，pp.1539-1547，2003)。还提出，HPV VLPs I呈递的非构象抗原序列可能增强细胞介导的免疫应答(Greenstone等，1998)。

实施例24

血细胞凝集素-衍生的肽与VLP的偶联作用

肽Cys-A/H3/HA0-22与HPV VLP偶联

SEQ ID NO：	名称	肽序列	MW
				113	Cys-A/H3/HA0-22	Ac-CEGPEKQTRGIFGAIAGFIEE-OH	2293

Cys-A/H3/HAO0-22的肽序列相应于跨越甲型流感共有序列，H3亚型的血细胞凝集素蛋白质前体HA₀的切割位点的区。粗体表示的是分别在N-末端和在C-末端实现不同功能所要求的残基：在N-末端，作为间隔区的甘氨酸，作为pI-修饰基团的谷氨酸(如这里描述的)，和作为与马来酰亚胺活化的HPV VLP载体反应，通过硫醚键生成肽-VLP偶联物的配体的半胱氨酸；在C-末端：作为pI-修饰基团的谷氨酸。

Cys-A/H3/HA₀-22的肽合成

在先锋肽合成仪(APPLIED BIOSYSTEMS，Foster City，CA)上利用Fmoc/t-Bu化学通过固相法合成肽。为了制备肽C-末端酸，在事先用DIPCDI/HOBt作为活化剂用4-羟甲基苯氧基乙酸接头衍生化的Champion PEG-PS树脂(BIOSEARCH TECHNOLOGIES，INC.，Novato，CA)上合成肽。第一个氨基酸，谷氨酸，在催化量的DMAP(二甲基氨基吡啶)存在下，用DIPC(二异丙基碳二亚胺)将其活化为对称酸酐，并且酯化成树脂。通过在DMF中与10倍过量的乙酸酐反应在组装的肽末端进行酰化反应。

所有的酰化反应用比树脂游离氨基4倍过量的活化氨基酸进行60分钟。用等摩尔量的HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基尿鎓六氟磷酸酯)和2倍摩尔过量的DIEA(N，N-二异丙基乙胺)活化氨基酸。一般侧链保护基团是：对于Asp，Glu，Ser，Thr和Tyr是叔丁基；对于Cys，Asn，His和Gln是三苯甲基；对于Arg是2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；对于Lys，Trp是叔丁氧羰基。在组装完成时，室温下，用88％TFA，5％苯酚，2％三异丙基硅烷和5％水(Sole，N.A.，和Barany，G.(1992)J.Org.Chem.，57，5399-5403)对干燥肽-树脂处理1.5小时。

将树脂过滤，为了使肽沉淀，向冷的甲基叔丁基醚加溶液。将肽离心之后，用新鲜的冷的甲基叔丁基醚洗涤肽沉淀物，去除有机清除剂。将该过程重复两次。将最终的沉淀物干燥，重新悬浮于H₂O，20％乙腈，并且冻干。

利用半制备RCMDELTA-PAK^TM(WATERS MILORD，MA)C₁₈柱(40×200mm，15微米)通过反相HPLC纯化粗制肽，使用洗脱剂(A)0.1％三氟乙酸水溶液和(B)0.1％三氟乙酸的乙腈溶液。我们使用下面的B梯度：30％-45％经20分钟，流速80ml/min。在ULTRASHPERE(BECKMAN，FULLERTON，CA)，C₁₈柱，25×4.6mm，5微米上进行分析HPLC，用下面的B梯度：30％-45％B，以20′，流速1ml/min。通过在PERKIN-ELMER(WELLESLEY，MA)API-100上进行电子喷射质谱来表征纯化的肽：理论平均mw是2293.4Da，实测值2293.8Da。

肽Cys-A/H3/HA₀-22与HPV VLP的偶联

以0.5M NaCl，20mM His缓冲液，0.026％PS80，pH 6.2中0.869mg/ml的浓度制备HPV VLP16无菌贮存液。使用300K MWCODISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES INC.，Rancho DominguezCA)，使用2升的0.5M NaCl，0.026 PS80的6-缓冲液改变(每2小时)4℃下将2.5ml HPV VLP贮存液等份透析，以去除可能干扰活化反应的His缓冲液。向HPV VLP溶液(0.474mg/mL，4.58mL)加入0.5MNaHCO₃(0.506mL)，达到50mM，pH 8.2的最终浓度。向该溶液滴加0.156mL的20μM杂双功能交联剂溶液，交联剂是4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(sSMCC，PIERCE CHEMICALCO，ROCKFORD，IL)，其相当于比可利用的赖氨酸残基过量4倍。溶液在4℃下避光老化2小时之后，使用300K MWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES INC.，Rancho Dominguez CA)，使用2升的10mM His缓冲液，0.5M NaCl，0.015％PS80，pH 6.2的6-缓冲液改变(至少每2小时)4℃下将活化的HPV VLP透析，去除过量试剂。透析后回收共6.1mL，0.356mg/m1活化的HPV VLP(aVLP)。

在脱气的0.1M His，0.5M NaCl，0.015％PS80 pH 7.2溶液中制备0.5mg/ml含有Cys肽配体Cys-A/H3/HA₀-22的原液，并且0.2微米过滤。通过Ellman分析(Ellman，G.L.(1959)，Arch.Biochem.Biophys.，82，70)测定肽溶液的硫醇含量，并且显示218μM的-SH滴度。

为了确定能安全掺入VLP上并且不引起沉淀的肽配体的最大量，首先以小规模试验进行偶联反应，其中VLP与渐增量的肽配体一起温育。VLP上能掺入的马来酰亚胺基团最大数目受到其外表面上展示的从而对于化学修饰可获得的赖氨酸残基数目的限制。根据L1蛋白质的X-射线结构，对于偶联可获得0.36微摩尔赖氨酸/毫克VLP。如果考虑对于VLP是20×10⁶Da平均MW，这相当于7200赖氨酸摩尔/VLP摩尔。VLP与每VLP摩尔以下摩尔过量的肽一起温育：1000，2000，4000，6000。1小时之后，样品与VLP样品相比较，检查任何沉淀的存在或者浊度。只有当使用至多1000摩尔过量(Cys-肽摩尔数/VLP摩尔)进行1小时温育反应时，偶联反应得到可溶性产物。高于该比例，发生VLP溶液的完全沉淀。

以这些发现为基础进行大规模反应：向3.5mL(1.25mg)的10mMHis，0.5M NaCl，加入56微升NaOH 0.25M，将pH提高至7.2。向其中加入2.08mL的肽原液，轻轻涡流下滴加，相当于1000摩尔过量的肽摩尔数/VLP摩尔。马来酰亚胺活化的VLP溶液样品留作测定最终偶联物的肽载荷量的空白样品。让偶联反应混合物4℃下避光老化17小时。然后4℃下避光用β-巯基乙醇将VLP上所有残留的马来酰亚胺基团淬灭1小时至15mM终浓度(加入4微升总体积)。4℃下使用300KMWCO DISPODIALYZER(SPECTRUM LABORATORIES，INC.，RANCHODOMINGUEZ，CA)，用1升0.5M NaCl，0.015％PS80将溶液透析4次，5小时/更换一次，去除没有偶联的肽和β-巯基乙醇。通过BCA-分析(PIERCE CHEMICAL CO.，ROCKFORD，IL)测定浓度，对于VLP-A/H3/HA₀-22是0.131mg/mL(4.5mL)。

110℃下用共沸HCl，在抽空的密封玻璃试管中将偶联物和OMPC样品水解70小时。通过氨基酸分析测定氨基酸成分。通过将偶联物氨基酸组成与VLP载体的和肽配体的相比较，并且通过对数据的多重回归分析，最小二乘分析(Shuler等Journal of Immunological Methods，156，(1992)137-149)，测定肽与OMPC蛋白质的偶联载荷量。对于VLP和A/H3/HA₀-22之间的偶联，获得770的摩尔比(肽/VLP摩尔/摩尔)。

实施例25

M2偶联物疫苗对病毒脱落的抑制

对如实施例5所描述的用M2肽SEQ ID NO：1制备M2-KLH偶联物疫苗评价其对小鼠呼吸道中病毒复制的影响(图30)。在第0、14和18天，用20微克偶联物疫苗M2-KLH加20微克QS21(M2-KLH/QS21)或者只有20微克QS21(QS21)对每组Balb/c小鼠肌内接种。第三次接种之后三周，用75 TCID50的A/HK/68重分配体的鼻内侵袭小鼠。侵袭之后，在第1，3，5，7或9天解剖每组的8只小鼠，收集鼻和肺清洗物。测定各时间点的病毒滴度。与对照小鼠相比，接受免疫的小鼠鼻和肺样品中有总的较低的病毒滴度。肺中病毒脱落减少更明显。对照组和疫苗组之间肺内病毒脱落差异是统计学显著的(p＜0.05)。

实施例26

恒河猴的M2偶联物疫苗的免疫原性

对根据实施例5用M2肽SEQ ID NO：2制备的M2-OMPC偶联物进行未接触过抗原的和OMPC-免疫恒河猴试验(图31)。OMPC用作几种细菌多糖偶联物疫苗的载体，包括许可的嗜血杆菌流感疫苗(PEDVAXHIB，MERCK & CO.，INC.，WEST POINT，PA)。因此，该项实验分析了对OMPC预先存在的免疫性是否明显影响流感疫苗有效性。

将三十只猴子分成两组，每组15只。为了诱导抗-OMPC抗体应答，用两个人剂量的PEDVAXHIB对其中的一组预先接种。接受PEDVAXHIB免疫的猴子在M2-OMPC免疫之前六周产生14,703的OMPC GMTs。

然后将OMPC-免疫的猴子和未接触过抗原的猴子分别分成五组，每组三只猴子，并且用在明矾中配制的10微克，30微克，100微克，和300微克的M2-OMPC偶联物疫苗(以总的偶联物蛋白质为基础的剂量)，或者100微克在明矾加QS21中配制的疫苗肌内接种。应用0-，8-和25-周方案进行免疫。以4-5周间隔采集血样，共33周。

单次接种之后，M2-OMPC疫苗激发显著M2-特异性滴度。在第二次和第三次接种之后，这些应答进一步加强。在OMPC-免疫的和未接触过OMPC-的猴子中没有明显的剂量影响，最低剂量，10微克，激发M2-特异性滴度，和最高剂量300微克激发的相当。在明矾加QS21中配制的疫苗表现出比相同剂量的在单独的明矾中配制的偶联物的抗体滴度高5-10倍。另外，接受明矾加QS21中配制的疫苗的猴子的抗体滴度表现出比接受在单独的明矾中配制的疫苗的猴子更低的减弱速度。

当比较OMPC-免疫的和未接触过OMPC的猴子时，第一次注射之后，前者表现出比未接触过抗原的猴子低大约10倍的滴度。这表明预先存在载体的抗体对M2-OMPC偶联物疫苗的免疫原性没有负面影响。然而，预先存在的对载体的免疫性的有害影响通过接下来的加强免疫而被克服。第二次和第三次接种之后，两个研究方向的组达到相当的抗-M2滴度。因此，结果表明，M2-OMPC疫苗对于非人灵长类是免疫原性的，不管是否预先存在载体的抗体。在另一项猴子研究中，我们还分析了涉及PEDVAXHIB和M2-OMPC偶联物疫苗共同给药的情况，并且发现对反应于M2肽的总的抗体应答没有负面影响。因此，这种疫苗能对预先使用过其他基于OMPC的偶联物疫苗的群体使用。

序列表

<110>Merck & Co.，Inc.

     Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P.Angeletti S.P.A.

<120>流感病毒疫苗

<130>20963Y

<150>60/530,690

<151>2003-12-18

<150>60/452,749

<151>2003-03-07

<160>168

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>1

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

 1               5                  10                  15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>2

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>2

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>3

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>3

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>4

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>4

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>5

<211>57

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>5

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

 1               5                  10                  15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Met Lys Gln Ile Glu Asp Lys

            20                  25                  30

Leu Glu Glu Ile Leu Ser Lys Leu Tyr His Ile Glu Asn Glu Leu Ala

        35                  40                  45

Arg Ile Lys Lys Leu Leu Gly Glu Arg

    50                  55

<210>6

<211>44

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>6

Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

 1               5                  10                  15

Cys Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser Ile

            20                  25                  30

Ile Gly Ile Leu His Leu Ile Leu Trp Ile Leu Asp

        35                  40

<210>7

<211>30

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>7

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

 1               5                  10                  15

Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp Pro Leu Val Val Ala Ala Ser

            20                  25                  30

<210>8

<211>16

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>8

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys

 1               5                  10                  15

<210>9

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>9

Ser Ser Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

 1               5                  10                  15

<210>10

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>10

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

 1               5                  10                  15

<210>11

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>11

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

 1               5                  10                  15

<210>12

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>12

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

 1               5                  10                  15

<210>13

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>13

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

 1               5                  10                  15

<210>14

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>14

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly

 1               5                  10                  15

<210>15

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>15

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Asn Gly

            20

<210>16

<211>29

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>16

Arg Val Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu

 1               5                  10                  15

Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys

            20                  25

<210>17

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>17

Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu

 1               5                  10                  15

Asn Gln His Thr

            20

<210>18

<211>12

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>18

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn

 1               5                  10

<210>19

<211>14

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>19

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

 1               5                  10

<210>20

<211>13

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>20

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu

 1               5                  10

<210>21

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>21

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ala Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>22

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>22

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Ala Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>23

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>23

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>24

<211>12

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>24

Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

 1               5                  10

<210>25

<211>13

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>25

Leu Thr Glu Val Glu Thr Ala Pro Ile Arg Asn Glu Trp

 1               5                  10

<210>26

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>26

Ser Leu Leu Thr Glu Val Ala Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>27

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>27

Ser Leu Leu Thr Glu Ala Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>28

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>28

Ala Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>29

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>29

Ser Leu Ala Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>30

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>30

Ser Ala Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>31

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>31

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Ala Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>32

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>32

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Ala

            20

<210>33

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>33

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ala Asp

            20

<210>34

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>34

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ala Ser Asp

            20

<210>35

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>35

 Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

  1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Ala Ser Ser Asp

            20

<210>36

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>36

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Ala Asp Ser Ser Asp

            20

<210>37

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>37

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ala Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>38

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>38

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>39

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>39

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>40

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>40

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>41

<211>12

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>41

Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp

 1               5                  10

<210>42

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>42

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Ala Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>43

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>43

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Ala Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>44

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>44

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Ala Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>45

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>45

Ser Leu Leu Thr Ala Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>46

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>46

Ser Leu Leu Ala Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>47

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>47

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Ala Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>48

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>48

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ala

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>49

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>49

Ser Leu Leu Thr Glu Val Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Ser Arg Ser

 1               5                  10                  15

Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>50

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>50

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ala Arg Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>51

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>51

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Ala Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>52

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>52

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Ala Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>53

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>53

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Ala Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>54

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>54

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Ala Asn Glu Trp Gly Ser

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp

            20

<210>55

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>55

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Asp

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ala Cys

            20                  25

<210>56

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>56

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Asp

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ala Cys

            20                  25

<210>57

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>57

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Asp

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ala Cys

            20                  25

<210>58

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>58

Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Asp

 1               5                  10                  15

Arg Ser Asn Asp Ser Ser Asp Ala Cys

            20                  25

<210>59

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>59

Cys Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu

 1               5                  10                  15

Glu Asn Gln His Thr

            20

<210>60

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>60

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

             20

<210>61

<211>27

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>61

Cys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe

 1               5                  10                  15

Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Glu

            20                  25

<210>62

<211>27

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>62

Cys Glu Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe

 1               5                  10                  15

Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Glu

            20                  25

<210>63

<211>27

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>63

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

 1               5                  10                  15

Met Ile Asp Gly Gly Cys Gly Lys Lys Lys Lys

            20                  25

<210>64

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>64

Cys Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu

 1               5                  10                  15

<210>65

<211>36

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>65

Cys Arg Val Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys

 1               5                  10                  15

Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val

            20                  25                  30

Glu Asp Thr Lys

        35

<210>66

<211>24

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>66

Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu

 1               5                  10                  15

Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Cys

            20

<210>67

<211>69

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>67

Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Glu Lys Thr Asn Glu

 1               5                  10                  15

Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile

            20                  25                  30

Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser

        35                  40                  45

Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp

    50                  55                  60

Leu Lys Gly Gly Cys

65

<210>68

<211>72

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>68

Cys Gly Gly Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile Glu Lys

 1               5                  10                  15

Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu Val Glu

            20                  25                  30

Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys Ile Asp

        35                  40                  45

Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn Gln His

    50                  55                  60

Thr Ile Asp Leu Lys Gly Gly Cys

65                  70

<210>69

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>69

Cys Arg Thr Arg Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn

 1               5                  10                  15

Gly Ala Phe Lys Ile Tyr

            20

<210>70

<211>35

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>70

Cys Gly Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys

 1               5                  10                  15

Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn

            20                  25                  30

Gln His Thr

        35

<210>71

<211>2l

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>71

Cys Gly Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln

 1               5                  10                  15

Ala Ala Asp Leu Lys

            20

<210>72

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>72

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Cys Glu

 1               5                  10                  15

<210>73

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>73

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Cys Glu

 1               5                  10                  15

<210>74

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>74

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Cys Glu

 1               5                  10                  15

<210>75

<211>16

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>75

Cys Gly Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Glu

 1               5                  10                  15

<210>76

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>76

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

 1               5                  10                  15

Met Val Asp Gly Cys Glu

            20

<210>77

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>77

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

 1               5                  10                  15

Met Val Asp Gly Cys Glu

            20

<210>78

<211>19

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>78

Cys Gly Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu

 1               5                  10                  15

Asn Gly Glu

<210>79

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>79

Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

 1               5                  10                  15

Met Val Asp Gly Cys Glu

            20

<210>80

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>80

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly

 1               5                  10                  15

Met Ile Asp Gly Cys Glu

            20

<210>81

<211>24

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>81

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly

 1               5                  10                  15

Met Val Asp Gly Lys Lys Cys Glu

            20

<210>82

<211>24

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>82

Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly

 1               5                  10                  15

Met Ile Asp Gly Lys Lys Cys Glu

            20

<210>83

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>83

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Asn Gly

            20

<210>84

<211>26

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>84

Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

 1               5                  10                  15

Glu Asn Gly Gly Cys Gly Lys Lys Lys Lys

            20                  25

<210>85

<211>17

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>85

Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

 1               5                  10                  15

Cys

<210>86

<211>13

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>86

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala

 1               5                  10

<210>87

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>87

Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile

 1               5                  10                  15

Glu Asn Gly Cys

            20

<210>88

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>88

Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala

 1               5                  10                  15

Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Cys

            20                  25

<210>89

<211>12

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>89

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly

 1               5                  10

<210>90

<211>11

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>90

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe

 1               5                  10

<210>91

<211>10

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>91

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu

 1               5                  10

<210>92

<211>9

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>92

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly

 1               5

<210>93

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>93

Cys Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly

 1               5                  10                  15

Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly

            20                  25

<210>94

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>94

Cys Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly

 1               5                  10                  15

Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly

            20                  25

<210>95

<211>12

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>95

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly

 1               5                  10

<210>96

<211>11

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>96

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe

 1               5                  10

<210>97

<211>10

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>97

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu

 1               5                  10

<210>98

<211>9

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>98

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly

 1               5

<210>99

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>99

Cys Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly

 1               5                  10                  15

Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly

            20                  25

<210>100

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>100

Cys Gly Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly

            20

<210>101

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>101

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Asn Gly

            20

<210>102

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>102

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Asn Gly Glu

            20

<210>103

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>103

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Asn Gly Glu

            20

<210>104

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>104

Glu Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

 1               5                  10                  15

Ile Glu Asn Gly Cys

            20

<210>105

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>105

Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

 1               5                  10                  15

Ile Glu Asn Gly

            20

<210>106

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>106

Gly Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

 1               5                  10                  15

Ile Glu Gly Gly

            20

<210>107

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>107

Cys Gly Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Gly Gly

            20

<210>108

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>108

Cys Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Asn Gly

            20

<210>109

<211>19

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>109

Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

 1               5                  10                  15

Ile Glu Glu

<210>110

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>110

Glu Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Glu

            20

<210>111

<211>19

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>111

Gly Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

 1               5                  10                  15

Ile Glu Glu

<210>112

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>112

Glu Gly Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Glu

            20

<210>113

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>113

Cys Glu Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Ile Glu Glu

            20

<210>114

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>114

Cys Gly Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly

 1               5                  10                  15

Phe Ile Glu Glu

            20

<210>115

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>115

Cys Glu Gly Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Ile Glu Glu

            20

<210>116

<211>29

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>116

Cys Glu Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Glu

            20                  25

<210>117

<211>19

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>117

Gly Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

 1               5                  10                  15

Ile Glu Glu

<210>118

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>118

Cys Glu Gly Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Ile Glu Glu

            20

<210>119

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>119

Cys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp

 1               5                  10                  15

Thr Gly Met Ile Asp Gly Glu

            20

<210>120

<211>34

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>120

Cys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe

 1               5                  10                  15

Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp

            20                  25                  30

Gly Glu

<210>121

<211>25

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>121

Cys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp

 1               5                  10                  15

Thr Gly Met Ile Asp Gly Lys Lys Glu

            20                  25

<210>122

<211>36

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>122

Cys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe

 1               5                  10                  15

Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Ile Asp

            20                  25                  30

Gly Lys Lys Glu

        35

<210>123

<211>16

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>123

Cys Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Glu

 1               5                  10                  15

<210>124

<211>26

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>124

Glu Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Leu Phe Gly

 1               5                  10                  15

Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Glu

            20                  25

<210>125

<211>26

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>125

Glu Gly Leu Arg Asn Ile Pro Ser Ile Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly

 1               5                  10                  15

Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Glu

            20                  25

<210>126

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>126

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>127

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>127

Cys Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>128

<211>23

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>128

Cys Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala

 1               5                  10                  15

Ile Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>129

<211>21

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>129

Glu Gly Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>130

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>130

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>131

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>131

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>132

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>132

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>133

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>133

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>134

<211>20

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>134

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Leu Glu

            20

<210>135

<211>18

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>135

Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe

 1               5                  10                  15

Leu Glu

<210>136

<211>17

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>136

Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu

 1               5                  10                  15

Glu

<210>137

<211>16

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>137

Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu

 1               5                  10                  15

<210>138

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>138

Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu

 1               5                  10                  15

<210>139

<211>14

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>139

Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu

 1               5                  10

<210>140

<211>13

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>140

Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu

 1               5                  10

<210>141

<211>12

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>141

Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu

 1               5                  10

<210>142

<211>11

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>142

Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Glu

 1               5                  10

<210>143

<211>19

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>143

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe Leu

<210>144

<211>18

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>144

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly Phe

<210>145

<211>17

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>145

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

Gly

<210>146

<211>16

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>146

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile Ala

 1               5                  10                  15

<210>147

<211>15

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>147

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

<210>148

<211>14

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>148

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala

 1               5                  10

<210>149

<211>13

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>149

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly

 1               5                  10

<210>150

<211>12

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>150

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe

 1               5                  10

<210>151

<211>11

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>151

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe

 1               5                  10

<210>152

<211>10

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>152

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly

 1               5                  10

<210>153

<211>9

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>153

Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg

 1               5

<210>154

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>154

Ala Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>155

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>155

Glu Gly Ala Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>156

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>156

Glu Gly Pro Ala Ala Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>157

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>157

Glu Gly Pro Ala Lys Ala Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>158

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>158

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Ala Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

1                5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>159

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>159

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Ala Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>160

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>160

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Ala Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>161

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>161

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Ala Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>162

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>162

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Ala Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>163

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>163

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Ala Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>164

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>164

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ala

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Glu

            20

<210>165

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>165

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Ala Leu Glu Glu

            20

<210>166

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>166

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Ala Glu Glu

            20

<210>167

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>167

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Ala Glu

            20

<210>168

<211>22

<212>PRT

<213>流感病毒

<400>168

Glu Gly Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala Ile

 1               5                  10                  15

Ala Gly Phe Leu Glu Ala

            20

Claims (39)

1.一种M2肽-蛋白质偶联物，或者其药学可接受盐，包含具有甲型流感病毒M2蛋白质的胞外结构域衍生的氨基酸序列的多个肽，所述多个肽与载体蛋白质的表面共价连接，并且每个键位于肽的一个末端和所述蛋白质的表面上的反应位点之间，其中所述载体蛋白质选自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体，破伤风类毒素，乙肝表面抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的L1蛋白。

2.权利要求1的偶联物，其中肽的氨基酸序列选自SEQ ID NOs：1，2，10和39。

3.权利要求2的偶联物，其中所述肽具有SEQ ID NO：39的序列。

4.权利要求1的偶联物，其中所述载体蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体。

5.权利要求4的偶联物，其中所述肽具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列，并且所述免疫原性蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体。

6.权利要求1的偶联物，其中肽与蛋白质通过硫醚接头共价连接。

7.一种用于预防或改善哺乳动物感染甲型流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一种权利要求1的肽-蛋白质偶联物，佐剂和生理可接受载体。

8.权利要求7的疫苗，其中所述佐剂包括含有铝的佐剂。

9.权利要求7的疫苗，其中所述佐剂包括铝和QS21。

10.权利要求7的疫苗，其中所述肽-蛋白质偶联物包括多个具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列的肽，并且所述蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体。

11.一种对患者诱导免疫应答的方法，包括用有效量的权利要求1的偶联物对患者接种的步骤。

12.权利要求11的方法，其中患者是人。

13.一种HA₀肽-蛋白质偶联物，或者其药学可接受盐，包含具有甲型流感病毒HA₀蛋白质衍生的氨基酸序列的多个肽，所述多个肽与载体蛋白质的表面共价连接，并且每个键位于肽的一个末端和所述蛋白质的表面上的反应位点之间。

14.权利要求13的偶联物，其中肽的氨基酸序列选自SEQ ID NOs：59，60，61，和62。

15.权利要求14的偶联物，其中所述肽具有SEQ ID NO：62的序列。

16.权利要求13的偶联物，其中所述载体蛋白质选自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体，破伤风类毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的L1蛋白。

17.权利要求16的偶联物，其中所述肽具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列，并且所述免疫原性蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体。

18.权利要求13的偶联物，其中肽与蛋白质通过硫醚接头共价连接。

19.一种用于预防或改善受试者感染甲型流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一种权利要求13的肽-蛋白质偶联物，佐剂和生理可接受载体。

20.权利要求19的疫苗，其中所述佐剂包括含有铝的佐剂。

21.权利要求19的疫苗，其中所述佐剂包括铝和QS21。

22.权利要求19的疫苗，其中所述肽-蛋白质偶联物包括多个具有SEQ ID NO：62的氨基酸序列的肽，并且所述蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体。

23.一种对患者诱导免疫应答的方法，包括用有效量的权利要求13的偶联物对患者接种的步骤。

24.权利要求23的方法，其中患者是人。

25.一种HA₀肽-蛋白质偶联物，或者其药学可接受盐，包含具有乙型流感病毒的HA₀蛋白质衍生的氨基酸序列的多个肽，所述多个肽与载体蛋白质的表面共价连接，并且每个键位于肽的一个末端和所述蛋白质的表面上的反应位点之间。

26.权利要求25的偶联物，其中肽的氨基酸序列选自SEQ ID NOs：60，126-168。

27.权利要求26的偶联物，其中所述肽具有SEQ ID NO：60的序列。

28.权利要求25的偶联物，其中所述载体蛋白质选自脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体，破伤风类毒素，乙肝表面抗原，乙肝核心抗原，匙孔血蓝蛋白，轮状病毒衣壳蛋白，和牛或人乳头瘤病毒VLP的L1蛋白。

29.权利要求28的偶联物，其中所述肽具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列，并且所述免疫原性蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体。

30.权利要求25的偶联物，其中肽与蛋白质通过硫醚接头共价连接。

31.一种用于预防或改善受试者感染乙型流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一种权利要求25的肽-蛋白质偶联物，佐剂和生理可接受载体。

32.权利要求31的疫苗，其中所述佐剂包括含有铝的佐剂。

33.权利要求31的疫苗，其中所述佐剂包括铝和QS21。

34.权利要求31的疫苗，其中所述肽-蛋白质偶联物包括多个具有SEQ ID NO：60的氨基酸序列的肽，并且所述蛋白质是脑膜炎奈瑟氏球菌的外膜蛋白质复合体。

35.一种对患者诱导免疫应答的方法，包括用有效量的权利要求25的偶联物对患者接种的步骤。

36.权利要求35的方法，其中患者是人。

37.一种用于预防或改善患者感染流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一种权利要求1的肽-蛋白质偶联物，至少一种权利要求13的肽-蛋白质偶联物，佐剂和生理可接受载体。

38.一种用于预防或改善患者感染流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一种权利要求1的肽-蛋白质偶联物，至少一种权利要求25的肽-蛋白质偶联物，佐剂和生理可接受载体。

39.一种用于预防或改善患者感染流感病毒的疫苗，所述疫苗含有至少一种权利要求1的肽-蛋白质偶联物，至少一种权利要求13的肽-蛋白质偶联物，至少一种权利要求25的肽-蛋白质偶联物，佐剂和生理可接受载体。

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