CN102120759B - 一种多肽及其衍生物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多肽疫苗的设计方式及应用。所述多肽疫苗的氨基酸分子骨架结构式为(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)x＞Lys-His-Gly；所述AAN为病毒蛋白多肽抗原片段。本发明阐述的多肽疫苗在制备和应用过程中消除了病毒污染传播的危险隐患，使疫苗的制备和使用更加快捷、便利、安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽及其衍生物与应用，特别是涉及有关抗病毒多肽疫苗的设计方式及应用，具体为抗鸭肝炎病毒多肽疫苗的设计、制备与应用。
背景技术
鸭病毒性肝炎一年四季均可发生，其发病急、传播迅速和死亡率高。自然爆发时仅发生于雏鸭，发病率可高达100％，主要为3周龄以内的雏鸭，以4-8日龄最为易感；雏鸭的死亡率则差别很大，从20％到100％，随着雏鸭日龄的增长与机体免疫水平的提高，死亡率逐渐降低。4周龄以后的雏鸭发病率和死亡率均很低。成年鸭呈隐性感染，无临床症状且不影响产蛋率，但能排毒。该病可通过消化道和呼吸道感染，主要的传播途径是与病鸭的直接接触感染，也可通过病鸭的粪便、食具、饮水等间接传播。目前，对鸭病毒性肝炎病还缺少特效药物，因此重在预防。同时，在国内市场上还没有获得批准的针对鸭病毒性肝炎的有效疫苗(包含活疫苗和灭活疫苗)，因此开发预防鸭肝炎病毒的疫苗无论从安全性和实用性均更切合需求。
传统疫苗包括能诱发免疫力却不致病的灭活疫苗和减毒疫苗，但由于在制备该类疫苗时，需要足够多的活病毒做灭活或减毒处理，在这一过程中如果操作不当将存在严重的安全隐患。
多肽疫苗是根据病毒蛋白或从病毒基因组编码的蛋白中选取具有抗原表位特性的多肽片段，通过采用化学合成技术制备出抗病毒多肽疫苗。由于多肽疫苗完全是人工合成，不存在毒力回升或灭活不全的问题，在制备和使用的过程中不存在传播的危险，因此消除了以往灭活疫苗或减毒疫苗存在的安全隐患。
发明内容
本发明提供了一种多肽疫苗的设计方式及其衍生物的应用，其目的是提供一种对病毒性疾病的预防所采取的一项措施。采用病毒蛋白中具有抗原表位特性的多肽片段制备抗病毒多肽疫苗以抵抗病毒对机体的侵害，具体到采用此设计方式制备抗鸭肝炎病毒多肽疫苗为实例，阐述多肽疫苗的设计与应用。
法氏囊是鸟类动物所特有的免疫器官，是B淋巴细胞最早发生的场所，对B细胞的发育、成熟和迁移具有重要作用。1986年人们首次从鸡法氏囊抽提液中纯化出一种三肽物质，赖氨酸-组氨酸-甘氨酰胺(Lys-His-Gly-Amide，或KHG-NH2)并被命名为囊素。囊素主要是由法氏囊滤泡的上皮细胞合成和分泌。囊素不仅存在于鸟类动物的法氏囊中、胸腺Hassall小体中、腔上囊中，而且还广泛存在于哺乳类动物(包括人)的骨髓和肝胆上皮细胞中，它对鸟类动物及哺乳动物的体液免疫和细胞免疫具有重要的促进作用，具有促进B淋巴前体的分化、增殖、提高巨噬细胞的吞噬能力，显著提高B淋巴细胞应答和免疫功能的作用(江倩等“囊素的研究进展”，中国畜牧兽医文摘2007年，第3期36页)。
根据获得的鸭肝炎病毒基因组信息，根据其编码的蛋白从中选取具有抗原表位特性的多肽片段。本发明采用将多拷贝病毒多肽抗原片段通过具有双活性氨基的赖氨酸与生物活性分子囊素相连接，使合成产物不仅克服了单一拷贝病毒多肽抗原片段分子量低，抗原性差的缺点，同时通过囊素提升机体免疫功能，使囊素与多肽抗原产生协同作用，提高机体对多拷贝多肽抗原的免疫应答反应。
氨基酸的特点是具有一个氨基和一个羧基，比如甘氨酸(Gly，或G)的氨基与赖氨酸(Lys，或K)的羧基经活化后进行缩合反应，使Lys与Gly形成肽键相连接形成Lys-Gly合成产物。多肽固相合成的原理是将所要合成的目的多肽的羧基末端氨基酸的羧基与固相树脂共价连接，使该氨基酸的氨基被活化后再与所需要连接的氨基酸的活化羧基进行缩合反应(连接上羧基末端的第二个氨基酸)，如此反复多次地进行下去。因此固相肽合成的顺序是从多肽的羧基端向氨基端逐个氨基酸地连接延伸肽链，待合成结束后将合成多肽从固相树脂上裂解下来，经过高效液相色谱分离纯化后可得到高纯度的多肽合成产物。由于多肽固相合成技术目前已经非常成熟并有多肽自动化合成仪辅助，有关合成步骤和方法在此不再累述，参见“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis：A PracticalApproach”；W.C.Chan(Editor)，Peter D.White(Editor)；Publisher：OxfordUniversity Press，New York，USA；1Edition(March 2，2000)。由于多肽合成工艺稳定，因此不仅能够高纯度、大批量地制备抗病毒多肽疫苗，而且由于疫苗的整个制备过程中杜绝了与活病毒的接触，有效避免了病毒的污染和扩散，使疫苗制备和应用过程中安全性得到了有效保障。
本发明所阐述的是采用具有双活化氨基的赖氨酸(＞Lys-或＞K-)作为多肽合成底物，由于＞Lys-具有两个活化氨基，因此可以同时连接上两个氨基酸，并往下继续连接氨基酸延长肽链，形成分支状多肽结构，使得在生物活性片段KHG-NH2的氨基端继续往下延伸，将8个拷贝的病毒多肽抗原片段与囊素寡肽片段有机地连接起来，形成本发明所揭示的多肽疫苗分子骨架，氨基酸序列与结构式如下；
(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly，所述AAN为病毒多肽抗原片段，＞Lys-(或＞K-)代表具有双活性氨基的赖氨酸
本发明所提供的多肽疫苗分子骨架经在其羧基端酰胺化后得到衍生物结构如下；
(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2；
实例中AAN为鸭肝炎病毒蛋白多肽抗原片段：
Lys-Glu-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-His-Trp-Lys-Ser-Tyr-Ala-Pro-Thr(15肽)
或将氨基酸序列表达为：KEIAKLKHWKSYAPT。
序列表达式为：(KEIAKLKHWKSYAPT)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2；
结构式如下：
依据本发明所提供的多肽疫苗分子骨架制备而成的多肽疫苗还包括采用所述多肽疫苗分子骨架经过化学加工与修饰形成的衍生物：
1.如在其氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端经过酰胺化、氨基化、羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化所形成的衍生物；
2.根据所述方式制备的多肽产物与酸或碱反应所形成的盐类化合物；
3.在所述多肽疫苗分子骨架中的“＞Lys-”之间、AAN与＞Lys-之间、或＞Lys与His-Gly之间插入连接一个或几个任意氨基酸所形成的衍生物。
4.在多肽的羧基端连接一个或几个任意氨基酸所形成的衍生物。
5.所述的多肽疫苗骨架分子上添加任意化学元素所形成的衍生物。
本发明的另一个目的是提供所述多肽及其衍生物的应用方式，将(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2中的AAN可替换成其它任意病毒蛋白的多肽抗原片段，以此方式制备抗病毒多肽疫苗。
所述多肽及其衍生物可制备成疫苗，所述疫苗在应用中可单独使用，或可与佐剂联合使用。
根据本发明所述制备的鸭肝炎病毒多肽疫苗的免疫原性高，纯度高、可大批量制备，在制备和应用过程中由于不接触活病毒因此不存在病毒污染传播的潜在危险，整个制备和使用过程更加安全。
具体实施方式
1.合成多肽：
采用多肽有机固相合成方式合成如下多肽产物：
多肽#1：一个单链的鸭肝炎病毒多肽抗原片段(15肽)：
Lys-Glu-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-His-Trp-Lys-Ser-Tyr-Ala-Pro-Thr；
多肽#2：
一个8拷贝无关多肽抗原片段(A型流感病毒多肽片段)通过具有双活化氨基的赖氨酸与囊素寡肽片段Lys-His-Gly连接，并在羧基端进行酰胺化修饰，得到：
(Ser-Leu-Leu-Thr-Glu-Val-Glu-Thr-Pro-Ile-Arg-Asn-Glu-Trp-Gly)8-(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2；
多肽#3：
一个8拷贝鸭肝炎病毒多肽抗原片段通过具有双活化氨基的赖氨酸与非相关短肽Lys-Gly-Gly连接，并在羧基端进行酰胺化修饰，得到：
(Lys-Glu-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-His-Trp-Lys-Ser-Tyr-Ala-Pro-Thr)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-Gly-Gly-NH2；
多肽#4：
一个8拷贝鸭肝炎病毒多肽片段通过具有双活化氨基的赖氨酸与囊素寡肽片段Lys-His-Gly连接，并在羧基端进行酰胺化修饰，得到：
(Lys-Glu-Ile-Ala-Lys-Leu-Lys-His-Trp-Lys-Ser-Tyr-Ala-Pro-Thr)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2；
采用多肽有机合成、高效液相色谱的纯化最后可得到纯度＞97％的多肽#1、多肽#2、多肽#3和多肽#4。
多肽#1、多肽#2、多肽#3和多肽#4经冻干后呈现白色絮状蓬松状态，溶解性良好。
2.合成多肽疫苗效力试验：
取200只1日龄麻鸭雏鸭，平均体重约为60g，不含有鸭肝炎母源抗体，随机分为5组，每组40只。
组别：
空白对照组：小鸭不作任何处理；
#1组：每只小鸭皮下接种200ug多肽#1；
#2组：每只小鸭皮下接种200ug多肽#2；
#3组：每只小鸭皮下接种200ug多肽#3；
#4组：每只小鸭皮下接种200ug多肽#4。
免疫后各组雏鸭生活正常，未观察到任何不良反应。免疫后10天，各组雏鸭均用鸭肝炎强毒进行攻毒，每只鸭颈部皮下注射106.5ELD50强毒，观察10天，记录发病及死亡情况。
攻毒后，雏鸭死亡时间集中在24小时到48小时之间，死亡时间符合鸭肝炎病毒的特征。所有死亡的雏鸭，死亡前头颈背向，呈角弓反张。解剖观察发现死亡鸭肝脏肿大，质地脆弱，稍黄，表面有出血性斑点，个别鸭肝有坏死灶。攻毒后各组雏鸭死亡情况记录于表1：
表1、攻毒后各组雏鸭死亡情况
| 组别 | 攻毒鸭数(只) | 攻毒后死亡数(只) | 保护率 |
| 空白对照组(无任何处理) | 40 | 23 | 42.5％ |
| #1组(单拷贝肝炎肽) | 40 | 22 | 45％ |
| #2组(8拷贝流感肽-囊素) | 40 | 21 | 47.7％ |
| #3组(8拷贝肝炎肽-无关肽) | 40 | 12 | 70％ |
| #4组(8拷贝肝炎肽-囊素) | 40 | 5 | 87.5％ |
结果分析：
空白对照组：
未做任何处理的雏鸭由于体内不具备抵抗鸭肝炎病毒的特异抗体，经过攻毒后生存率为42.5％；
#1组：
使用单拷贝鸭肝炎病毒多肽抗原片段KEIAKLKHWKSYAPT免疫的雏鸭，由于免疫的15肽片分子量仅为1800.13道尔顿，难以在雏鸭体内激发出有效的特异抗体，因此经攻毒后的保护率为45％与无处理对照组相接近。
#2组：
将8拷贝A型流感病毒多肽抗原片段SLLTEVETPIRNEWG(15肽，1743.95道尔顿)通过具有双活性氨基赖氨酸与囊素相连接，制备出(SLLTEVETPIRNEWG)8＞K4＞K2＞KHG-NH2多肽疫苗(分子量14878.99道尔顿)，由于多肽抗原片段与鸭肝炎病毒无关，尽管与相囊素连接，经免疫后在雏鸭体内不能激发出针对鸭肝炎病毒的特异性抗体，因此攻毒后的生存保护率与未做任何处理的对照组没有显著差异为47.7％。
#3组：
将鸭肝炎病毒多肽抗原片段通过双活性氨基赖氨酸与囊素分子相近的非相关性寡肽GGG-NH2连接，制备出(KEIAKLKHWKSYAPT)8＞K4＞K2＞KGG-NH2多肽疫苗并免疫雏鸭，经攻毒后的生存保护率达到70％。结果说明8拷贝鸭肝炎病毒多肽抗原片段形成的多肽抗原的分子量达到15248.34道尔顿，可有效激发雏鸭体内产生对鸭肝炎病毒的免疫应答反应。
#4组：
将鸭肝炎病毒多肽抗原片段通过双活性氨基赖氨酸与囊素分子连接，制备出(KEIAKLKHWKSYAPT)8＞K4＞K2＞KHG-NH2多肽疫苗(分子量15328.43道尔顿)并免疫雏鸭，经攻毒后的生存保护率达到87.5％。
结果说明：
1.根据本发明所述制备的病毒性多肽疫苗必须是具有抗原表位特性的多肽片段，具体到实例中为选取的是鸭肝炎病毒多肽抗原片段。但凭一段单拷贝的病毒抗原片段由于其分子量较小不足以激发机体对其产生有效的抗原抗体反应。
2.在选用多肽抗原片段的前提下，采用8拷贝多肽抗原的设计使其分子量＞10000道尔顿足以激发机体对多肽抗原的免疫应答。
3.实验证明在相同的条件下，8拷贝15肽A型流感病毒多肽抗原片段与囊素连接的产物对鸭肝炎病毒并不产生特异性的免疫保护作用。当选用鸭肝炎病毒多肽抗原片段制备成的8拷贝多肽抗原疫苗可显示出免疫保护作用，而8拷贝多肽抗原经与囊素连接后免疫效果得到有效提升。
总结：
实验表明，本发明所阐述的一种多肽疫苗的氨基酸序列与结构(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly设计方式合理，应用在针对抗鸭肝炎病毒方面行之有效。AAN代表鸭肝炎病毒多肽抗原片段可拓展至AAN可以是任何一种病毒的多肽抗原片段。(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly可成为制备抗病毒多肽疫苗的通用分子骨架。
根据本方式设计制备的多肽疫苗还包含在此分子骨架的基础上所做的化学加工与修饰，如在其氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行胺基化、酰氨化、羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等所得到的衍生物；以及所述分子骨架中的Lys-His-Gly两端所连接额外的1个或多个任意氨基酸所形成的衍生物；或在分子骨架中的双活性氨基＞Lys-之间或两端额外地插入连接1个或多个任意氨基酸所形成的衍生物；按照本发明所述方式制备的产物与酸或碱所形成的盐类化合物。
本发明所阐述的多肽疫苗设计与制备方式，所提供的多肽疫苗分子骨架(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly及其化学衍生物(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2可成为一种多肽疫苗的通用骨架，可将其中AAN替换成为任意需要制备的病毒多肽抗原或抗原表位片段。
Claims (3)
1.一种多肽，其特征在于，
所述多肽的结构特征如下：
(AAN)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2；
所述AAN为鸭肝炎病毒蛋白多肽抗原片段，序列为KEIAKLKHWKSYAPT；所述＞Lys-代表具有双活性氨基的赖氨酸；
氨基酸序列和结构表达式为：
(KEIAKLKHWKSYAPT)8(＞Lys)4(＞Lys)2＞Lys-His-Gly-NH2。
2.一种多肽疫苗，其特征在于，该疫苗的活性物质为权利要求1所述的多肽。
3.根据权利要求1所述的多肽在制备鸭病毒性肝炎疫苗中的应用。
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