CN1520423A - 来源于IgE的Cε3或Cε4区的抗原决定基或拟表位,其拮抗物,及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供一种用于变应性疾病的治疗，预防或改善的新药物。特别是，该新药物是来源于IgE的Cε3或Cε4区的抗原决定基或拟表位。这些新区可以是用于被动和主动的免疫预防或免疫治疗的靶。本发明进一步涉及该药物，含它们的药物组合物的生产方法及它们在药物中的用途。也形成本发明一方面的是配体，特别是单克隆抗体，其能够结合本发明的IgE区，及它们作为被动免疫治疗或免疫预防在药物中的用途。

Description

来源于IgE的Cε3或Cε4区的抗原决定 基或拟表位，其拮抗物，及其治疗用途
本发明涉及提供一种用于变应性疾病的治疗，预防或改善的新药物。特别是，该新药物是来源于IgE的Cε3或Cε3区的抗原决定基或拟表位(mimotope)。这些新区可以是用于被动和主动的免疫预防或免疫治疗的靶。本发明进一步涉及该药物，含它们的药物组合物的生产方法和它们在药物中的用途。也形成本发明一方面的是配体，特别是单克隆抗体，其可以结合本发明的IgE区，及它们作为被动免疫治疗或免疫预防在药物中的用途。
在变态反应中，通常与变态反应相关的症状是由于变应性介质，如组胺从免疫细胞释放进周围组织和血管结构中所导致的。组胺通常贮藏在肥大细胞和嗜碱性粒细胞中，直到由于与变应原特异性IgE相互作用而引发释放。人们已经熟知IgE在变态反应，如哮喘，食物过敏，遗传过敏性皮炎，I-型超敏反应，过敏性鼻炎中的间介作用。在遇到抗原，如花粉或尘螨性变应原的时候，B-细胞开始变应原特异性IgE的合成。然后，变应原特异性IgE在嗜碱性粒细胞和肥大细胞上结合FcεRI受体(高亲和IgE受体)。通过相邻IgE/FcεRI复合体的交联，与变应原的任何后来的相遇导致引发组胺从肥大细胞或嗜碱性粒细胞中释放(Sutton and Gould，Nature，1993， 366：421-428；EP0 477 231B1)。
IgE，像所有的免疫球蛋白一样，包含两个重链和两个轻链。ε重链包括5个区：一个可变区(VH)和四个恒定区(Cε1-Cε4)。IgE的分子量大约为190,000Da，重链大约为550个氨基酸长。IgE的结构在Padlan和Davis(Mol.Immunol.，23，1063-75，1986)和Helm etal.，(2IgE model structure deposited2/10/90 with PDB(ProteinData Bank，Research Collabarotory for StructuralBioinformatics；http：\pdb-browsers.ebi.ac.uk))中论述。每个IgE区均包括伸展的多肽片段的七个反平行链(β-)的压制筒(squashedbarrel)，其中这七个反向平行链被标记为a-f，并分成两个β-折叠。四个β-链(a，b，d & e)形成一个折叠，其堆积在三个链(c，g & g)的第二个折叠上(见图8)。每个β-折叠的形状是通过来源于每个折叠内的相邻反向-平行链氨基酸残基侧-链的侧面堆积而保持的(并通过这些链之间的主-链氢-键而进一步稳定)。形成非-伸展(非-β-)构象的残基环在一个折叠内或在相反的折叠之间连接反向平行β-链。将从链a至链b的连接标记为A-B环，诸如此类。A-B和d-e环拓扑上属于四-链折叠，环f-g属于三-链折叠。一对相反折叠之间的界面提供疏水的球形区内部。此水-难以进入的，主要地疏水核心起因于残基侧-链的紧密堆积，其从相反的β-折叠互相相对。过去，已经调查研究了许多被动或主动的免疫治疗方法，该方法被设计为干扰IgE-间介的组胺释放的机理。这些方法包括干扰结合FcεRI或FcεRII(低亲和IgE受体)受体的IgE或变应原/IgE复合物，或者干扰被动给予的抗体，或干扰来源于肽的IgE的被动给予，以竞争性地结合受体。此外，一些作者已经描述了来源于主动免疫中的IgE的特异性肽促进抑制免疫反应的组胺释放的用途。
在它们的调查研究过程中，本领域早先的工作人员已经遇到了许多需要考虑的事情，和问题，当设计新的抗-变态反应的治疗时，其不得不被考虑。其中最危险的一个问题是组胺释放信号中的IgE交联。通常，主动接种过程中抗-IgE抗体的产生，能够在没有变应原的情况下，通过相邻IgE-受体复合物的交联而引发组胺自身的释放。把此现象称为变应原性。实际上，通常很多用于IgE检测试验的商业上使用的抗-IgE单克隆抗体，是过敏原性的，因此如果将其给予患者，则是无效的且潜在危险的。
抗体是否是过敏原性的，取决于IgE分子上靶抗原决定基的位置。然而，基于这方面知识的目前状况，尽管有极大的科学兴趣和努力，对于任何抗体或抗原决定基可能具有的特性和它是否对患者有积极或消极的临床效果仍然有很少或没有可预测性。
因此，为了安全有效，被动地给予，或诱导的疫苗，抗体必须在能够干扰组胺引发途径的IgE区结合，自身没有变应原性。本发明实现了所有这些目的，并提供能够培养抑制组胺释放的非-过敏原性抗体的药物。这些药物可以形成活性疫苗的主要成分，或培养用于被动免疫治疗的适当的抗体，或为了治疗作用而使其自身被动地给予。
本领域的那些技术人员已经进行了许多工作以鉴定特异性抗-IgE抗体，该抗体对IgE-间介的变态反应确实具有某些有益效果(WO90/15878，WO89/04834，WO93/05810)。人们已经进行了试验以鉴定用这些有效抗体识别的抗原决定基，以制造这种抗原决定基的肽拟表位，并使用那些作为免疫原以生产抗-IgE抗体。
WO97/31948描述了此类研究的一个实施例，并进一步描述了用于活性接种目的的IgE肽，该肽来源于缀合到载体分子上的Cε3和Cε4区。可以将这些免疫原用于接种研究中，且据说其能够产生随后抑制体内组胺释放的抗体。在此研究中，还描述了单克隆抗体(BSW17)，据说其能够结合包含在Cε3区中的IgE肽，其对于活性接种是有益的。
EP0 477 231 B1描述了来源于IgE的Cε4区的免疫原(残基497-506，也称为Stanworth decapeptide)，被缀合到用于活性接种免疫预防中的钥孔血蓝蛋白(KLH)上。WO96/14333是EP 0 477 231 B1研究的继续。
其他方法是基于来源于Cε3或Cε4的肽的鉴定，其自身争夺在嗜碱性粒细胞或肥大细胞上结合高或低亲和受体的IgE(WO93/04173，WO98/24808，EP 0 303 625 B1，EP 0 341 290)。
本发明是用于主动或被动免疫预防或治疗中的IgE新序列的鉴定。这些序列前未先与抗-变态反应治疗相联系。本发明提供肽，自身，它结合特异性的分离抗原决定基，其来源于已鉴定为表面暴露的IgE连续部分，且进一步提供这些新鉴定的抗原决定基的拟表位。这些肽或拟表位可单独用于变态反应的治疗，或将其用于疫苗，以在变态反应的主动免疫预防或免疫治疗过程中诱导自身抗-IgE抗体，以在接种的受试者中限制，降低或消除变应症状。
令人惊奇地，本发明肽诱导的抗-IgE抗体是非-过敏原性的，且能够阻断自肥大细胞和嗜碱性粒细胞的IgE-间介的组胺释放。
为本发明的肽，且可以提供肽修饰基础的人IgE区是：
                             表1
 肽  序列 位置序列和IgE区  SEQID NO.
 P5  RASGKPVNHSTRKEEKQRNGTL  Cε3  1
 P6  GTRDWIEGE  Cε3  2
 P7  PHLPRALMRSTTKTSGPRA  Cε3/Cε4  3
 P8  PEWPGSRDKRT  Cε4(Pro451-Thr461)  4
 P9  EQKDE  Cε4  5
 P200  LSRPSPFDLFIRKSPTITC  Cε3  6
 P210  WLHNEVQLPDARHSTTQPRKT  Cε4  7
 1-90N  LFIRKS  Cε3  81
 2-90N  PSKGTVN  Cε3  82
 3-90N  LHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGS  Cε4  83
 4-90N  SVNPGK  Cε4  84
结合这些抗原决定基的肽形成本发明的优选方面。拟表位具有与这些抗原决定基相同的特性，且包含这种拟表位的免疫原也形成本发明的一个方面，其在IgE分子范围内与IgE抗原决定基交叉作用，发生免疫反应。
本发明，因此，包括围绕这些IgE抗原决定基自身的分离的肽，及其任一的拟表位。将拟表位的含义定义为一种实体，其与天然IgE抗原决定基足够相似，以致能够用识别天然IgE抗原决定基的抗体来识别；(Gheysen，H.M.，et al.，1986，Synthetic peptides asantigens.Wiley，Chichester，Ciba foundation symposium119，p130-149；Gheysen，H.M.，1986，MolecularImmunology，23，7，709-715)；或能够培养抗体，当被偶联到适当的载体上时，抗体与天然IgE抗原决定基交叉反应。
本发明的拟表位可以是肽的或非-肽的。前面鉴定的表面暴露IgE抗原决定基的肽拟表位，可以正好是与天然抗原决定基相同的序列。可以将这种分子描述为抗原决定基的拟表位，因为虽然这两个分子共有相同的序列，但是拟表位不会以整个IgE区结构的语境(context)存在，拟表位可以具有与天然IgE抗原决定基稍微不同的构象。对于本领域的技术人员是很清楚的，即上面鉴定的线形序列(P1-P7)，当在IgE的三维结构中时，可与其它在IgE的初级序列相隔遥远的其它区紧密相邻。因而，例如，P1的拟表位可以是连续的或不连续的，因 为它包含或模拟P1的片段以及由这些相隔遥远的氨基酸残基组成的片段。
本发明的拟表位模拟IgE结构的表面暴露区，然而，在那些区内，本发明人认为主要方面是表面暴露区内的那些区，该表面暴露区与环状结构相关。IgE区的结构在“Introduction to protein Structure”(page 304，2nd Edition，Branden and Tooze，Garland Publishing，NewYork，ISBN 0 8153 2305-0)中描述，且其表现为由两个相对的反-平行β-折叠组成的β-桶形式(见图8)。拟表位 可以包含，因此，具有N或C末端伸展的环，其可以是来源于相邻折叠的天然氨基酸残基。例如，P100包含Cε3的A-B环，P8包含Cε4的A-B环，P5包含Cε3的C-D环，P110包含Cε4的C-D环。因此，这些环的拟表位形成本发明的一个方面。特别优选的环是Cε3或Cε4的C-D环，和Cε4的A-B环。
可以通过增加，删除或替换所选择的氨基酸而将上面-鉴定的IgE抗原决定基的肽拟表位就特殊目的而设计。因而，为了容易缀合蛋白质载体的目的，可以修饰本发明的肽。例如，就某些化学缀合方法，期望某些末端半胱氨酸包括在IgE抗原决定基中。此外，期望缀合到蛋白质载体上的肽包括距离肽缀合末端较远的疏水末端，这样肽的未缀合末端保持与载体蛋白质表面相连。这降低了肽自由度的构象程度，并因此增加肽存在于构象中的可能性，即，其与在整个IgE分子语境下发现的IgE肽最类似。例如，可以改变肽以具有N-端半胱氨酸和C-末端疏水酰胺化的尾部。可选择地，可以进行一种或多种氨基酸的D-立体异构体形式的添加或取代，以产生有益的衍生物，例如提高肽的稳定性。本领域的技术人员将会认识到这种修饰的肽或，拟表位，可以是整个的或部分的非-肽拟表位，其中组成的残基不是必须被限制为20种天然存在的氨基酸。此外，这些可以通过本领域已知的技术环化，以便当肽序列在整个IgE分子的语境下时，将肽结合成与其形状非常相似的构象。环化肽的优选方法包含加入一对半胱氨酸以形成二硫化物桥。
另外，本领域的那些技术人员将会认识到本发明的免疫原或拟表位可以大于上面-鉴定的抗原决定基，且可以包含此处公开的序列。因此，本发明的拟表位可以包括在一个或两个末端的许多其它天然残基的N和/或C端伸展片段的加入。肽拟表位还可以是天然IgE序列的反向序列，其中该序列的定位是逆反的；或可选择地，该序列可以完全地或至少部分地由D-立体异构体氨基酸(反向序列inverso sequences)组成。而且，该肽序列的特性可以是retro-inverso的，其中该序列的定位是反向的，且氨基酸是D-立体异构体形式。这种retro或retro-inverso肽具有非-自身的优点，且可以在免疫系统(例如P14c)中克服自体耐受的问题。
可选择地，可以使用抗体鉴定肽拟表位，使用某种技术，如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)该抗体自身可以结合本发明的IgE抗原决定基。此技术，产生了大量的肽序列，其模拟天然肽的结构，因此，能够结合抗-天然肽抗体，但自身不是必须共有与天然IgE肽同源的主要序列。通过使鉴定具有增强的免疫原性能的肽成为可能，此方法可以具有显著的优点来(如与IgE受体或抗-IgE抗体较高的亲和结合特性，或能够降低多克隆免疫反应，该抗体以较高亲和性与IgE结合)，或可以克服任意潜在的自体-抗原耐受问题，其可能与天然肽序列的使用有关。另外，由于在识别的拟表位序列中共有化学性能，允许此技术用于每个天然-肽的识别模式鉴定。
这种拟表位的实施例为：
                             表2
 肽 序列  种类 SEQ ID NO.
 P11 CRASGKPVNHSTRKEEKQRNGLL  P5拟表位 8
 P11a (Ac)GKPVNHSTGGC  P5拟表位 9
 P11b (Ac)GKPVNHSTRKEEKQRNGC  P5拟表位 10
 P11c CGKPVNHSTRKEEKQRNGLL(NH2)  P5拟表位 11
 P11d (Ac)RASGKPVNHSTGGC  P5拟表位 12
 P12 CGTRDWIEGLL  P6拟表位 13
 P12a CGTRDWIEGETL(NH2)  P6拟表位 14
 P12b (Ac)GTRDWIEGETGC  P6拟表位 15
 P13 CHPHLPRALMLL  P7拟表位 16
 P13a CGTHPHLPRALM(NH2)  P7拟表位 17
 P13b (Ac)THPHLPRALMRSC  P7拟表位 18
 P13c (Ac)GPHLPRALMRSSSC  P7拟表位 19
 P14 APEWPGSRDKRTC  P8拟表位 20
 P14a (Ac)APEWPGSRDKRTLAGGC  P8拟表位 21
 P14b CGGATPEWPGSRDKRTL(NH2)  P8拟表位 22
 P14c CTRKDRSGPWEPA(NH2)  P8retro 23
 P14d*(环状的) (Ac)APCWPGSRDCRTLAG  P8拟表位 24
 P14d(环状的) (Ac)ACPEWPGSRDRCTLAG  P8拟表位 25
 C-1C14 CATPEWPGSRDKRTLCG  P8拟表位 26
 C-1C13 CATPEWPGSRDKRTCG  P8拟表位 27
 C3C12 TPCWPGSRDKRCG  P8拟表位 28
 P9a CGAEWEQKDEL(NH2)  P9拟表位 29
 P9b (Ac)AEWEQKDEFIC  P9拟表位 30
 P9b* (Ac)GEQKDEFIC  P9拟表位 31
 P9a* CAEGEQKDEL(NH2)  P9拟表位 32
 Car11 CPEWPGCRDKRTG  P8拟表位 85
 Car12 TPEWPGCRDKRCG  P8拟表位 86
可选择地，可以由于这种目的而生产肽拟表位，即通过增加其与抗-IgE肽多克隆抗体的亲和性而增加肽的免疫原性，其效果可以通过本领域的已知技术，如(Biocore实验)来测量。为了实现这一点，该肽序列可以按照下列通用规则而被选择性地改变：
*为了保持结构性结合，不能替换脯氨酸和甘氨酸。
*其它位置可以用具有相似的物理化学性质的氨基酸替换。
同样地，每个氨基酸可以用最近似的氨基酸代替。如下表所描述的，例如，A可以用V，L，I替换。
  原始残基 示范的取代 优选的取代
 A  V，L，I  V
 R  K，Q，N  K
 N  Q，H，K，R  Q
 D  E  E
 C  S  S
 Q  N  N
 E  D  D
 G  A  A
 H  N，Q，K，R  N
 I  L，V，M，A，F  L
 L  I，V，M，A，F  I
 K  R，Q，N  R
 M  L，F，I  L
 F  L，V，I，A，Y，W  W
 P  A  A
 S  T  T
 T  S  S
 W  Y，F  Y
 Y  W，F，T，S  F
 V  I，L，M，F，A  L
特别优选的IgE肽是P8及其变种(如P14或P14a)。这些肽，当被偶联到载体上时，其在诱导抗-IgE免疫反应中是有效的，其中该反应能够抑制组胺从人嗜碱性粒细胞释放。首先将P8的变种，或拟表位，描述为基于免疫原的任一肽，其中该免疫原能够诱导免疫反应，该反应能够识别P8。不限制本发明的范围，可以通过通式描述P8的某些变种，其中特定的氨基酸可以用其最接近的对应物代替。使用这一技术，P8肽拟表位可以通过通式来描述：
P，X1，X2，P，X3，X4，X5，X6，X5，X5
或，
P，X1，X2，P，G，X4，R，D，X5，X5
其中；X1是选自E，D，N或Q的氨基酸；X2是选自W，Y或F的氨基酸；X3是选自G或A的氨基酸；X4是选自S，T或M的氨基酸；X5是选自R或K的氨基酸；X6是选自D或E的氨基酸。
还可以使用噬菌体标记技术(EP 0 552 267 B1)，用自身能够结合P8的抗体鉴定P8拟表位。在这一点上，单克隆抗体如P14/23，P14/31和P14/33是特别适当的。
本发明，因此，提供新的抗原决定基，及其拟表位，和它在制造用于变态反应治疗或预防的药物组合物中的用途。免疫原包含至少一种本发明的抗原决定基或拟表位，并提供用于变态反应免疫预防或治疗的疫苗中的载体分子。因此，提供用于药物中，和变态反应疾病的药物治疗或预防中的本发明的免疫原，或抗原决定基，拟表位。本发明优选的疫苗或免疫原包含IgE抗原决定基P8，或其拟表位，包括P14。
本发明人已经证明有抗原决定基或拟表位存在的不同方法对于在接种之后，结合单克隆抗体和免疫反应有显著的效果。例如，当使用环化肽时，改变环型和环长时，可以对环化拟表位与P14单克隆抗体(P14/23，P14/31或P14/33)的结合活性有显著的效果。本发明人已经研制了一种选择环化部位的新系统，由此增加环化肽保持在恰当的环状结构中的可能性，其中该恰当的环状结构包含恰当的氨基酸残基。因此，肽可能被结合在最近似于如果它们处在整个IgE区的语境之下将普遍采用的构象。因此，不限制本发明，遵循这些新规则的环化拟表位形成本发明的一个优选方面。与这些通式不一致的推断的拟表位序列仍然可以培养有益的抗血清(例如P14和P11)，下列实施例仅仅是本发明拟表位的亚型。
符合这些新定义的结构规则的优选肽的实施例是：
                     表3
 肽序列  Mimotope of SEQ ID NO.
 CSRPSPFDLFIRKSPTITC  A-B loop of Cε3  33
 CSRPSPFDLFIRKSPTC  A-B loop of Cε3  35
 CPSPFDLFIRKSPTITC  A-B loop of Cε3  41
 CPSPFDLFIRKSPC  A-B loop of Cε3  43
 CTWSRASGKPVNHSTC  C-D loop of Cε3  58
 CTWSRASGKPVNHC  C-D loop of Cε3  60
 CSRASGKPVNHSTC  C-D loop of Cε3  66
 CSRASGKPVNHC  C-D loop of Cε3  68
 CYAFATPEWPGSRDKRTLAC  A-B loop of Cε4  45
 CYAFATPEWPGSRDKRTC  A-B loop of Cε4  47
 CFATPEWPGSRDKRTLAC  A-B loop of Cε4  53
 CFATPEWPGSRDKRTC  A-B loop of Cε4  55
 CQWLHNEVQLPDARHC  C-D loop of Cε4  70
 CQWLHNEVQLPDAC  C-D loop of Cε4  72
 CLHNEVQLPDARHC  C-D loop of Cε4  78
 CLHNEVQLPDAC  C-D loop of Cε4  80
本发明的拟表位会比较小，这样它们模拟从发现天然抗原决定基的整个IgE区中选择出来的一个区。肽拟表位，因此，应当是少于100个氨基酸长，优选短于75个氨基酸，更优选少于50个氨基酸，最优选在4-25个氨基酸长的范围内。优选肽拟表位的特殊实施例是P14和P11，其分别为13个和23个氨基酸长。以分子体积形式来看，非-肽拟表位相对于它们的肽对应物较小。
使用某些技术来确定落在本发明范围内的拟表位的特殊结构的情形，对于本领域的技术人员来说是很明显的。这种技术包括，但不限制于，下列技术。测定推定的拟表位以确定该结构的免疫原性能，其中抗血清是通过推定的拟表位与天然IgE分子交叉作用而培养的，且其在阻断变应性介质从变应性效应细胞中释放中是有用的。这些反应的特异性可以通过竞争试验来确定，即阻断抗血清与拟表位自身或天然IgE，和/或已知在IgE内结合抗原决定基的特异性单克隆抗体的活性。这种用于竞争试验的单克隆抗体的特殊实施例包括P14/23，P14/31或P14/33，其可以确定像P8的拟表位那样的推定拟表位的情况。
在本发明的其中一个实施方案中，至少一种IgE抗原决定基或拟表位被连接到载体分子上以形成用于接种方案的免疫原，优选地，其中的载体分子与天然IgE分子无关。该拟表位可以经由化学共价缀合或通过基因工程融合配偶体的表达，任意地经由连接体序列而连接。作为其中的一个实施方案，本发明的肽是在具有融合配偶体的融合分子中表达的，其中的肽序列是在融合配偶体的一级序列中发现的。
可以本领域熟知的方式进行肽与免疫原载体的共价偶联。因而，例如，可以利用碳化二亚胺，戊二醛或(N-[γ-马来酰亚氨基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯，利用商业上普遍使用的杂二官能连接物，如CDAP和SPDP(使用制造说明))用于直接的共价偶联。偶联作用之后，可以通过透析方法，凝胶过滤方法，分级分离方法等来分离和纯化免疫原。
在优选的实施方案中，本发明人已经发现可以通过制备酰基肼肽衍生物而将肽，特别是环化肽缀合到载体上。
可以按照下列生产肽/蛋白质载体结构。酰基肼肽衍生物可以按照下列流程图1固相肽合成，而在固体相上制备。
流程图1
这些肽衍生物可以通过使用熟知的‘Fmoc’过程，利用全自动设备中的聚酰胺或聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持体，通过本领域熟知的技术[在‘Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach’byE.Atherton and R.C.Sheppard，published by IRL at OxfordUniversity Press(1989)中描述的用于固相合成的技术和过程]而制备。酸间介的解裂提供线性的，脱保护的，修饰的肽。其可以被很容易地氧化和纯化，以使用在‘Methods in MolecularBiology，Vol.35：Peptide Synthesis Protocols(ed.M.W.Penningtonand B.M.Dunn)chapter 7，pp91-171 by D.Andreau et al.中概述的工艺生产二硫化物-桥连的修饰肽。
可以使用下列技术将这样合成的肽缀合到蛋白质载体上。
芳基醛功能性的引入利用了按照流程图2(进一步详述见WO98/17628)制备的琥珀酰亚胺基活性酯。直到50％的载体，例如BSA(牛血清清蛋白)氨基功能的取代常规地提供可溶性修饰蛋白。BSA的更多取代导致不溶性结构。在等摩尔浓度的DMSO/缓冲液(见流程图)中混合BSA和BAL-Osu 2小时。按照荧光胺试验所判断的，此实验性导出的方案提供～50％的BSA取代以用于下列流程图2/3-修饰载体的制备中的游离氨基酸。
流程图2
流程图3
修饰肽和衍生载体的简单结合提供肽载体结构，其可以通过透析-流程图4-肽/载体缀合物而很容易地分离：
流程图4
Figure A0080675600172
对于本领域的技术人员来说，可以很容易地知道用于本发明免疫原中的载体类型。载体功能将提供细胞因子的辅助，以相对于IgE肽辅助诱导免疫反应。可用于本发明的载体的非-穷举列表包括：匙孔血蓝蛋白(KLH)，血清清蛋白如牛血清清蛋白(BSA)，灭活的细菌毒素如破伤风或白喉毒素(TT和DT)，或其重组片段(例如，TT的片段C的1区，或DT的易位区)，或结核菌素(PPD)的纯化的蛋白质衍生物。可选择地，拟表位或抗原决定基可被直接缀合到脂质体载体上，其可以附加地包含能够提供T-细胞辅助的免疫原。优选地，拟表位与载体的比例在1∶1-20∶1的范围内，且优选每个载体应当携带3-15个肽。
在本发明的实施方案中，优选的载体是来源于流感嗜血杆菌的D蛋白(EP 0 594 610)。D蛋白是一种来源于流感嗜血杆菌的IgD-结合蛋白，且已经由Forsgren要求专利保护(WO91/18926，EP0594610B1授权)。在某些环境中，例如在重组免疫原表达系统中，可以使用D蛋白的片段，例如D蛋白1/3rd(包含D蛋白的N-端100-110个氨基酸(GB9717953.5))。
给出本发明IgE肽的另一个优选方法是在重组融合分子的语境之下。例如，EP 0 421 635 B描述了嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原颗粒在病毒样颗粒中对存在的外源肽序列的用途。本发明的免疫原可以包含存在于嵌合颗粒中的IgE肽，其中该嵌合颗粒是由乙型肝炎核心抗原组成的。另外，重组融合蛋白可以包含本发明的拟表位和载体蛋白，如流感病毒的NS1。对于形成本发明部分的任何重组表达的蛋白，编码所述免疫原的核酸也形成本发明的一个方面。
用于本发明中的肽可以通过本领域熟知的固相过程而很容易地合成。适当的合成可以通过利用“T-boc”或“F-moc”过程而进行。环化肽可以通过固相过程来合成，该固相过程在全自动设备中使用熟知的“F-moc”过程和聚酰胺树脂。可选择地，本领域的那些技术人员应当知道必需的实验室过程以进行人工处理。用于固相合成的技术和过程在‘Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach’byE.Atherton and R.C.Sheppard，published by IRL at OxfordUniversity Press(1989))中描述。可选择地，该肽可以通过重组方法生产，包括在细菌的或哺乳动物的细胞系中编码拟表位的核酸分子，接下来纯化表达的拟表位。用于肽和蛋白质重组表达的技术在本领域中是已知的，且在Maniatis，T.，Fritsch，E.F.and Sambrook etal.，Molecular cloning，a laboratory manual，2nd Ed.；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中描述。
本发明的免疫原可以包含前述的肽，包括拟表位或其类似物，或其可以是免疫交叉反应的衍生物或片段。也形成本发明一部分的是核酸部分，其编码本发明的免疫原或肽，或其衍生物或拟表位。
本发明，因此，提供新的抗原决定基或mimitopes(像上面所定义的)在制造用于变态反应预防或治疗的药物组合物中的用途。包含本发明肽或拟表位，和载体分子的免疫原也可以用于变态反应免疫预防或治疗的疫苗中。因此，本发明的免疫原拟表位，或肽可以用于药物中，和变应性疾病的药物治疗或预防中。
本发明的疫苗，可以有益地包括辅剂。用于本发明疫苗的适当辅剂包含那些能够提高相对于IgE肽免疫原的抗体反应的辅剂。辅剂是本领域所熟知的(Vaccine Design-The Subunit and AdjuvantApproach，1995，PharmaceuticalBiotechnology，Volume6，Eds.Powell，M.F.，and Newman，M.J.mPlenumPress，New York and London，ISBN 0-306-44867-X)。与本发明的免疫原一起使用的优选辅剂包括铝或钙盐(氢氧化物或磷酸盐)。
通常可以给予本发明疫苗的致敏或加强剂量。要求加强剂量应适当间隔地给予，或优选每年给予或在循环抗体的水平低于所期望的水平时给予。加强剂量可以包括原始载体分子不存在时的肽。这种加强结构可能包含一种选择的载体或没有任何载体。
在本发明的又一个方面中，提供一种此处描述的用于药物中的免疫原或疫苗。
通过经由全身或粘膜途径给予所述的疫苗，本发明的疫苗制品可用于保护或治疗对变态反应易感的或正在遭受变态反应的哺乳动物。这些给药方法可以包括经由肌肉内，腹膜内，真皮内，或皮下途径的注射；或经由粘膜给予口腔/消化道，呼吸道或泌尿生殖道。给药的优选途径是经由外皮途径，例如通过皮肤贴剂给予。因此，提供一种用于变态反应治疗的方法，包含将本发明的配体，免疫原或肽给予正在遭受变态反应或对变态反应易感的患者。
选择每个疫苗剂量中的蛋白质，其中该量在没有典型疫苗中显著的副作用下，诱导免疫保护反应。这种量可以根据所使用的特异性免疫原或它是怎样给出的而变化。通常，期望每个剂量包含1-1000μg蛋白质，优选1-500μg，更优选1-100μg，1-50μg是最优选的范围。特定疫苗的最佳用量可以通过标准研究来确定，该标准研究包括受试者中适当免疫反应的观察。初始接种之后，受试者可以适当间隔地接受一次或几次加强免疫。
本发明的相关方面是能够结合本发明肽的配体。这种配体的实施例是抗体(或Fab片段)。还提供配体在药物中和在制造用于变态反应治疗的药物中的用途。此处的术语“抗体”是用于指具有有效的抗原结合特异性的分子。那些本领域的技术人员会很容易地理解此术语还可以包含多肽，其是仍然可以显示相同或近似功能性的抗体的衍生物或片段。这种抗体片段或衍生物假设被包含在此处使用的术语抗体之内。
特别优选的配体是单克隆抗体。例如，P14/23，P14/31或P14/33是识别P8的单克隆抗体(其是通过用P14免疫原接种而培养的)。这些抗体的杂交瘤按照布达佩斯条约专利保藏于2000年1月26日，在ECACC(European Collection of Cell Cultures，Vaccine Research andProduction Laboratory，Public Health Laboratory Service，Centrefor Applied Microbiology Research，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 OJG，UK)保藏，保藏登记号分别为第00012610，00012611，00012612。也形成本发明一个重要方面的是这些单克隆抗体在IgE新拟表位的鉴定及随后的变态反应治疗中的用途，和在制造用于变态反应治疗或预防的药物中的用途。所有这些单克隆抗体均在体外抑制组胺自人嗜碱性粒细胞释放中起作用，且P14/23和P14/31已经显示出在体内抑制被动的皮肤过敏。
因此，能够结合P14/23，P14/31或P14/33的IgE Cε4的拟表位，和包含这些拟表位的免疫原，形成本发明的一个重要方面。包含能够结合P14/23，P14/31或P14/33的拟表位的疫苗在变态反应的治疗中是有效的。
另外，通过用本发明的免疫原或肽接种而在动物中诱导的抗体可以被纯化并被动地给予另一动物以用于变态反应的治疗或预防。通过本领域已知的技术，本发明的肽还可以用于单克隆抗体杂交瘤(使用已知的技术，例如，Khler and Milstein，Nature，1975，256，p495)，人源化单克隆抗体或CDR嫁接单克隆的生产。这种抗体可用于被动免疫预防或免疫治疗，或用于IgE肽拟表位的鉴定。
因为本发明的配体可用于变态反应的预防或治疗，因而提供一种包含本发明配体的药物组合物。用于变态反应治疗或预防的优选药物组合物包含单克隆抗体P14/23，P14/31或P14/33。
本发明还可以用于诊断试验。例如，识别本发明不同肽的一组配体可以用于测定在从患者中采集的血清中存在的抗-IgE的滴度。此外，肽自身可以用于分类循环抗体。它可以在某些环境中适当地测定循环抗体水平，例如在特异反应性患者中，且本发明的这种肽和多/单-克隆抗体可以用于遗传性过敏症的诊断。此外，在血再一灌注进患者中前，该肽可用于从患者的血中亲和除去循环抗-IgE。
形成本发明另一方面的是鉴定肽免疫原的方法，其中该肽免疫原用于变态反应的免疫预防或治疗，该方法包含使用IgE结构的计算机模型，并鉴定那些表面暴露的IgE的肽。可将这些区配制成免疫原，并将其用于药物中。因此，P14/23，P14/31或P14/33在肽的鉴定中的用途形成本发明的一部分，其中该肽用于变态反应的免疫预防或治疗。
通常在New Trends and Developments in Vaccines，edited byVoller et al.，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978中描述疫苗制品。蛋白质和大分子的缀合由Likhite，美国专利4,372,945 and Armor et al.，美国专利4,474,757公开。
附图描述
图1，从Padlan和Davis模型1986计算人IgE的Cε3或Cε4的表面暴露。
图2，P14抗血清的过敏原性和组胺释放抑制。在稀释1/100和1/500(终值)的抗-BSA血清中加入1μg/ml的用作阳性对照的单克隆抗体，PtmAb0005和PtmAb0011以1/100和1/500的最终稀释度加入抗-P14血清。自对禾本科植物的花粉敏感的变应性患者采集细胞，通过用此禾本科植物的花粉培养而引发组胺释放。
图3，抗-P14抗血清的过敏原性和组胺释放抑制。加入不同稀释度(80X或40X)的来源于不同小鼠的P14抗血清，以便通过IgE受体-结合ELISA测量，大约含有1μg/ml的抗-IgE抗体。所使用的三个阴性对照是：抗-BSA抗血清，非-特异性IgG1和在抗-BSA抗血清中稀释的非-特异性IgG1的混合物。mAb11是一种已知的抑制组胺释放的单克隆抗体，且其被用作阳性对照(以2μg/ml加入)。
图4，抗-P14抗血清的过敏原性和组胺释放抑制。以1/50的最终稀释度加入来源于不同小鼠的抗-P14抗血清。将2μg/ml的单克隆Abs加入到试验缓冲液或抗-BSA血清稀释物1/50中。所使用的3个阴性对照是：抗-BSA抗血清，非-特异性IgG1和稀释在抗-BSA抗血清中的非-特异性IgG1的混合物中。mAb11是一种已知的抑制组胺释放的单克隆抗体，且其被用作阳性对照(以2μg/ml加入)。
图5，抗体应答抗-P11。4℃时，肽P11在1μg/ml的碳酸盐缓冲液中包被过夜。在平板饱和之后，加入血清的两-步连续稀释物，并在37℃培养1小时。结合IgG是用生物素酰化抗-小鼠Ab，链霉抗生物素蛋白-POD和TMB底物检测的。在下列时间点测量：A.接种1次后14天，和接种2次后14天；B.接种3后14天。
图6，抗-人IgE抗-P11 IgG滴度。在1μg/ml包被人IgE。在37℃培养血清的两-步连续稀释物(“BSA集合体”是对照组的集合体)或PTmAb0005(阳性对照单克隆抗体)1小时。用生物素酰化的抗-小鼠Ab检测结合IgG。
图7，在由尘螨变应性患者(A10和A11)和禾本科植物花粉的变应性患者(G8和G4)提供的变应性嗜碱性粒细胞上，使用抗-P14单克隆抗体的组胺释放抑制的研究。PT11(PTmAb0011)被用作阳性对照，非-特异性IgG2a被用作用于P14/23，P14/31和P14/33的同种型对照。
图8，IgE区结构。(A)每个区是由两个相对的β-折叠，如图所示，即4个反-平行β-链(标记为4)，和3个反-平行β-链(标记为3)组成的。(B)这七个链用标记a-f的实箭头表示，且如所示的被分隔在两个折叠之间。链的环-连接性是用曲箭头表示的：实-箭头是内-折叠环，虚-箭头是间-折叠环。在IgG1 Fc区结构中，短的c’链形成形成C-D环的一部分，像对IgE Fc所预测的那样。
图9，(A)人IgE区Cε2，3或4的A-B环序列的预测结构排列，其具有与来源于晶体确定的人IgG1 Fc(Cγ2 & Cγ3区)结构相等的片段。在IgG1结构中的β-链下面划线并标记为a和b；计算每个序列片段末端的氨基酸残基。序列区下的垂直箭头指向预知的最佳环化位置，如图10b所示用虚线或实线连接并标记。(B)人IgE Cε2，3&4的c_d环的预测结构排列，其具有人IgG1 Fc。在IgG1结构中的β-链下面划线并标记为c，c’和d；编号每个序列片段末端的氨基酸残基。用阴影部分突出的残基形成(Cγ2 & Cγ3)或预测形成(Cε2，同源物模型的精制和试验，Cε3，Cε4，同源物-模型)环内受保护的核心。预测plainbold boxes内的残基通过受体和/或抗体而包含在识别中。序列区下的垂直箭头指向预测的最佳环化位置，如图11b所示用虚线或实线连接并标记。
图10，(A)在Ig恒定区的折叠-折叠夹层的A-B发夹的示意结构。相邻的反-平行β-链用实箭头表示，标记为a和b。沿着链a的残基标记为i，那些沿着链b的标记为j。残基i+n & j+m，其中n和m都是零或偶数，形成区内折叠-折叠夹层的一部分。残基i+n & j+m，其中n和m是都奇数，形成区的溶剂-暴露表面部分。A-B环用黑箭头表示。(B)图3a中的A-B发夹的示意结构，具有通过虚的或实的哑铃连接的用于环化的最佳残基部位。
图11，(A)C-D发夹(环加支持β-链)的示意结构，其位于Ig恒定区的折叠-折叠夹层的边缘。用实箭头表示相反的反-平行β-链，标记为c和d。)沿着链c的残基标记为i，那些沿着链d的标记为j。残基i+n & j+m，其中n是奇数，m是偶数，形成区内折叠-折叠夹层的一部分。残基i+n & j+m，其中n是零或偶数，m是奇数，形成区的溶剂-暴露表面部分。c_d环，包含短c’链，用黑箭头表示。(B)c_d发夹的示意结构，具有通过虚的或实的哑铃连接的用于环化的最佳残基位置。
本发明通过下列实施例举例说明，但不限制为下列实施例。
部分1.活性接种的研究
实施例
1.1肽的鉴定
肽是通过下列技术鉴定的。Padlan和Davies(Mol.Immunol.，23，1063-75，1986)已经描述了人IgE的模拟结构。鉴定肽，它们都是连续的及溶剂暴露的。这是通过使用分子模拟软件(MSI)计算每个IgE氨基酸的可接近性而完成的，可接近的表面平均有五个残基的滑动窗，并由此鉴定IgE肽的区，其具有大于80A2的平均5-mer。
试验结果在图1中表示。
结果
图1有许多天然肽，其可被用作培养IgE抗体的免疫原。
表4，使用1986 Padlan and Davies模型的连续的IgE肽和天然暴露表面。
 肽  序列 位置序列和IgE区  SEQID NO.
 P5  RASGKPVNHSTRKEEKQRNGTL  Cε3  1
 P6  GTRDWIEGE  Cε3  2
 P7  PHLPRALMRSTTKTSGPRA  Cε3/Cε4  3
 P8  PEWPGSRDKRT  Cε4(Pro451-Thr461)  4
 P9  EQKDE  Cε4  5
 P200  LSRPSPFDLFIRKSPTITC  Cε3  6
 P210  WLHNEVQLPDARHSTTQPRKT  Cε4  7
除了上面鉴定的那些肽之外，下列肽是通过使用与Helm et al.IgE模型相同的选择标准(于2/10/90在PDB保藏的2IgE模型结构(Protein Data Bank，Research Collabarotory for StructuralBioinformatics；http：\pdb-browsers.ebi.uk)鉴定的。
表5，使用Helm et al.1990模型鉴定的肽
  名称   序列  位置 SEQ ID NO.
 1-90N  LFIRKS  Cε3  81
 2-90N  PSKGTVN  Cε3  82
 3-90N  LHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGS  Cε4  83
 4-90N  SVNPGK  Cε4  84
这些肽，或其拟表位，被合成及缀合到载体蛋白上以用于免疫原性的研究。
1.2使用琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联剂的IgE肽/D蛋白缀合物的合成
通过使用琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联剂，可以将D蛋白直接缀合到IgE肽上，以形成本发明的抗原。通过固定琥珀酰亚胺基，此化学过程可使载体残基的可控NH2活化。马来酰亚胺基团是半胱氨酸-结合位点。因此，对于下列实施例来说，缀合的IgE肽需要加入N-端半胱氨酸。
偶联试剂是一种选择性的异基双功能交联剂，化合物的一端通过琥珀酰亚胺基酯活化蛋白载体的氨基，另一端通过马来酰亚胺基基偶联肽的sulhydryl基。反应流程图如下所示：
a.通过赖氨酸和琥珀酰亚胺基酯之间反应的蛋白质的活化：
Figure A0080675600251
b.通过与马来酰亚胺基反应的活化蛋白质和肽半胱氨酸之间的偶联：
1.3 IgE肽-D蛋白缀合物的制备
将D蛋白溶解在2.5mg/ml浓度，PH7.2的含盐磷酸缓冲液中。在102.5mg/ml的DMSO中溶解偶联试剂(N-[γ-马来酰亚氨基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯-GMBS)，并将偶联试剂加入到蛋白质溶液中。1mg的D蛋白使用1.025mg的GMBS。在室温培养该反应溶液1小时。通过脱盐步骤在聚丙烯酰胺葡聚糖200HR渗透凝胶上除去副产品。所用的洗脱液是含盐的磷酸盐缓冲液吐温80 0.1％PH6.8。收集合并活化的蛋白质。在0.1M醋酸中，以4mg/ml溶解肽(如表4或5中鉴定的，或其拟表位或衍生物)以避免二-硫键的形成。将每1份活化的D蛋白以2-20肽的摩尔比用于偶联。将肽溶液慢慢地加入到蛋白质中，并在25℃培养混合物1小时。在偶联的过程中保持PH值在6.6。猝灭步骤是通过半胱氨酸的加入(0.1mg半胱氨酸/在0.1M的醋酸中，以4mg/ml溶解的活化PD mg)进行的，25℃，PH6.5，30分钟。对于NaCL 150mM吐温80 0.1％进行两次透析以除去多余的半胱氨酸或肽。
最后一步是穿过0.22μm膜的无菌过滤。终产品是在4℃保藏的澄明的可过滤溶液。肽/PD的最终比例可以通过氨基酸分析来确定。
在类似的形式中，本发明的肽可以被缀合到包括BSA的其它载体上。预先-活化的BSA商业上可以从Pierce Inc.购买。
合成P8(P14，SEQ.ID NO.20；CLEDGQVMDVDLL)和P5(P11，SEQ IDNO.8；CRASGKPVNHSTRKEEKQRNGLL)，其是使用上述技术而被缀合到D蛋白和BSA上的。
1.4 ELISA方法
抗-肽或抗-肽载体ELISA
使用下面概述的ELISA技术探究抗-肽和抗-载体免疫反应。微量滴定板(Nunc)是在PBS(4℃过夜)中，用特异性抗原，或用：2μg/ml链霉抗生物素蛋白(接下来在37℃时用生物素酰化肽(1μM)培养1小时)，用PBS-吐温20 0.1％洗3次。在37℃，用PBS-BSA 1％-吐温20 0.1％(盐缓冲液)饱和板。在两步稀释(在盐缓冲液中)中加入1抗体＝血清，37℃培养1小时30分钟。洗涤3X。加入偶联到HRP上的2抗-小鼠Ig(或抗-小鼠同型特异性单克隆抗体)。37℃培养1小时。洗涤5X。在室温的黑暗条件下用TMB(BioRad)显色10分钟。用0.4N H2SO4阻断反应。
在小鼠血清(IgE平板束缚ELISA)中检测抗-人IgE反应活性的方法
ELISA平板是37℃时用人嵌合IgE在1μg/ml的PH9.6的碳酸盐/二碳酸盐包被缓冲液中或在4℃过夜而包被的。37℃时，用含5％w/vMarvel奶粉的PBS/0.05％吐温-20阻断非-特异性结合位点1小时。然后在37℃时，加入PBS/0.05％吐温-20/1％w/v BSA/4％New Born Calf中的小鼠血清连续稀释物1小时。用山羊抗-小鼠IgG-生物素(1/2000)和链霉抗生物素蛋白(1/1000)检测多克隆血清的结合。用TMB底物在450nm检测缀合抗体。PtmAb0011的标准曲线包括在每个平板上，这样可以μg/ml计算血清样品中的抗-IgE反应活性。
IgE与拟表位肽，可溶性IgE或PtmAb0011结合的竞争
在前-阻断的聚丙烯96-孔平板中，将多克隆小鼠血清的单一稀释液与单一浓度的mimiotope肽或人IgE混合。37℃培养混合物1小时，然后在37℃时将其加入到IgE-包被的ELISA平板中1小时。用山羊抗-小鼠IgG-生物素(1/2000)和链霉抗生物素蛋白(1/1000)检测多克隆血清的结合。用TMB底物在450nm检测缀合抗体。为了血清和用于IgE结合的PtmAb0011之间的竞争，将血清和PtmAb0011-生物素的混合物加入到IgE-包被的ELISA平板中。用链霉抗生物素蛋白-HRP(1/1000)检测PtmAb0011结合。
1.5人嗜碱性粒细胞的测试
用人嗜碱性粒细胞(HBA)进行两类测试，一类用于确定单克隆抗体的过敏原性，包括向分离的PBMC中加入抗体；第二类是测量组胺释放引发的Lol PI(较强的变应原)抑制，其是使用单克隆抗体HBA的前-培养。
通过静脉穿刺术从变应性供血者中采集血，放入含肝素的试管中，提纯非-红细胞。在HBH/HAS中清洗细胞一次，计数，并在每毫升2.0×106细胞密度的HBH/HAS中重悬浮。将100μl细胞悬浮液加入到V-底96-孔平板的孔中，其中该平板含100μl稀释的试验样品或单克隆抗体。每个试验样品都是在用于每次稀释的一排6个孔的稀释液中试验的。37℃时，使用平板摇动器简单地混合孔内容物30分钟。
3个孔中的每个血清稀释液均是通过加入10μl的Lol pI提取物(最终稀释1/10000)而引发的，且3个孔均具有用于变应原性测试所加入的10μlHBH/HSA。培养前，37℃时，用平板摇动器简单地混合孔内容物30分钟。通过500g离心5分钟终止培养。为了组胺的测试，使用商业用的组胺EIA测量试剂盒(Immunotech)除去上清液。含细胞的没有试验样品的对照孔用于确定自发的和引发的释放。细胞样品通过2X冷冻/解冻而溶解，以测试包含在细胞中的总的组胺。
结果如下所示：
变应原性测试
试验样品的组胺的释放＝自试验样品的处理过的细胞的组胺释放％-自发的组胺释放％。
阻断测试
可以使用公式计算组胺释放抑制的程度
用自发释放校正的值。
实施例2，使用P14缀合物(P14-BSA，P14-BSA)的小鼠免疫诱导抗-人IgE抗体的产生。
将在实施例1中描述的，含拟表位P14(25μg蛋白质/剂量)的缀合物给予10只BalbC小鼠，用WO95/17210中描述的含QS21和3D-MPL的水包油乳液为辅剂。在第14，24和72天进行激发，并在每次免疫之后14天采集血清。
在实施例1中描述了使用ELISA方法的免疫反应抗-肽和抗-平板束缚IgE。测试抗血清的抑剂人变应性嗜碱性粒细胞的组胺释放的功能活性和过敏原性(如实施例1中描述的方法)。
免疫原性的结果
缀合物，PD-P14和BSA-P14均能够诱导抗-P14和抗-IgE免疫反应。抗肽和抗-IgE反应的结果，是通过BSA-P14缀合物诱导的，是在第3次或第4次接种后的第14天测量的，在表6中表示。PtmAb0011是已知的结合IgE Cε2区的单克隆抗体，并用于以μg/ml量化抗-IgE反应。
表6，BSA-P14缀合物的免疫原性结果
抗-肽反应(3次后约14天)中点滴度       抗-IgE反应(3次后约14天)(μm/mlPTmAb0011)          抗-IgE反应(3次后约14天)(μm/mlPTmAb0011)
    AV     SD    GM   AV   SD     GM     AV    SD     GM
  25974   22667   15492   9.9   2.18     0.7    22.9    33.5     4.8
表的脚注：AV(平均值)，SD(标准偏差)，GM(几何平均数)
作为对照的，单独用BSA接种的小鼠未产生任何可检测到的抗-肽或抗-IgE反应。
功能活性结果
人们发现用P14接种培养的抗血清是功能性的，因为它在用变应原引发之后，自变应性人嗜碱性粒细胞的组胺释放的抑制中是有效的(见图2，3，和4)。而且，发现血清不是过敏原性的。
概述
P14(P8的mimiotope)能够在小鼠中培养高滴度的抗-P14和抗-IgE抗体。随后显示出这些抗体是功能性的，因为它们抑制自变应性的人嗜碱性粒细胞的组胺释放，且不是过敏原性的。P14和P8，因此，可用于变态反应的预防或治疗。
实施例3，使用P11缀合物(P11-BSA，P11-BSA)的小鼠的免疫诱导抗-人IgE抗体的产生。
人IgE抗原决定基肽P11被偶联到马来酰亚胺-活化的BSA(Pierce)(BSA-CRASGKPVNHSTRKEEKQRNGLL)上。在第0，14和28天，将在SBAS2中形成的25μg缀合物IM注射到8个雌性的BALB/c小鼠中。用BSA/SBAS2注射一组对照小鼠。在每次注射后14天采集血液样品(在3次之后的第24天进行第四次采血以增加血清的可得性)。如实施例1中所描述的，用ELISA测量通过接种而培养的抗-肽和抗-IgE抗体。
结果
同源的IgG抗-P11反应已经可以在一次注射之后检测，但是其在第二次和第三次注射之后进一步增加(图5a和5b)。第三次注射之后，所有的小鼠均显示抗-IgE反应(在mAb005当量中表达的28-244μg/ml)(图6)。
部分2.抗原决定基特异性单克隆抗体的功能活性
实施例4，培养的抗P14的单克隆抗体的功能活性
使用本领域的已有技术已经生产出了特异性识别P8及其拟表位的单克隆抗体。简单地说，将这些部分1的实施例中所描述的P14-BSA缀合物及含QS21和3D-MPL的o/w辅剂注射进Balb/C小鼠中。采集脾细胞，并用SP2/O B-细胞肿瘤细胞系融合，筛选上清液以用于P14肽和IgE的反应活性。产生了许多细胞系，其中P14/23，P14/31，P14/33按照布达佩斯条约专利保藏于26/1/00在ECACC保藏，其保藏登记号分别为第00012610，00012611，00012612。通过ELISA结合试验，和相对于结合IgE的单克隆抗体的P14竞争试验，确定了所有三个单克隆抗体均与IgE，特别是P14结合。
如实施例1所描述的，这些单克隆抗体的功能活性是在人嗜碱性粒细胞的组胺释放抑制试验中测试的。
结果
在自四个不同的变应性患者采集的嗜碱性粒细胞上试验所有的P14单克隆抗体(A患者对尘螨性抗原是变应性的，G患者对禾本科植物的花粉是变应性的)。PT11(PTmAb0011)作为阳性对照抗体，其已知抑制体外组胺释放。所有3个P14单克隆抗体(23，31和33)在抑制自变应性嗜碱性粒细胞的组胺释放中是有效的。
实施例5，在猴皮肤过敏模型中，使用缀合物免疫之后，在小鼠中诱导的抗-IgE能够阻断局部变应性反应。
也试验P14/23和P14/31的体内活性。简单地说，将非洲绿猴的局部皮肤肥大细胞削下，并通过将100ng的抗-NP IgE(从Serotech购买的人IgE抗-硝基苯乙酰(NP))皮内注射进两臂而使其致敏。24小时之后，将受测试的单克隆抗体的剂量范围，注射在与一只手臂上的与人IgE相同的注射点位中。同一动物相反手臂上的对照部位接受磷酸盐缓冲盐(PBS)或非特异性人IgE(对人巨细胞病毒(CMV)或人免疫缺乏病毒(HIV)是特异性的))。5小时之后，静脉内注射10mg的BSA-NP缀合物(从Biosearch Laboratories购买)。15-30分钟之后，对照动物显示一很容易观察到的源于过敏反应的粗环性水肿，其是以毫米测量的。结果是以三个猴的平均水肿直径表达的，或以与PBS对照组相比的抑制百分比表达的。PtmAb0011，是用作阳性对照的单克隆抗体。SbmAb0006用作阴性对照。
表7，P14/23的结果
试验的样品量(μg) 水肿约平均直径(mm)
 P14/23  mAb0011  mAb0006
 20  0  ND  12/15
 10  0  0  17/19
 1  15/13  0  20/20
 0.1  15/12  ND  ND
 0.05  15/15  ND  ND
 0  15/15  ND  17/17
ND＝未处理。
表8，P14/31的结果
试验的样品量(μg) 水肿约平均直径(mm)
 P14/31  mAb0011  mAb0006
 20  0  ND  15/15
 10  0  0  15/15
 1  22/25  0  20/20
 0.1  22/25  ND  ND
 0.05  25/25  ND  ND
 0  20/25  ND  20/25
用高剂量的单克隆抗体可以观察到过敏反应的完全抑制，当体内给药时，这些抗体本身不是过敏原性的。
实施例6，IgE mimiotopes的结构方面
本发明人已经证明本发明拟表位或抗原决定基的构象对于抗-拟表位抗体的识别，和肽产生较强的抗-IgE免疫应答的能力是非常重要的。本发明人已经提出了预测肽环化最佳位置的结构规则。使用这些环化位置的肽形成本发明的优选方面。
因为还没有确定IgE Fc的全部结构，本发明人使用已知的IgG1(Deisenhofer J.，1981.Biochemistry，20，2361-2370)的Cγ2和Cγ3结构改进了目前使用的模型(Helmet al.supra，Padlan and Davissupra)。此外，Cε2区的模型已经通过与已知的Ig折叠-单位结构对照而建立了。本发明人已经设计了这些IgF Fc的同源物模型，并由此预测了IgE Fc区中的间-折叠环(C-D环，图9B)和内-折叠(A-B环，图9A)的总的结构和末端。已经定义了所预测的IgE Fc A-B和C-D环和它们的支持β-链，通过沿着邻接的β-链所选择的特异性残基之间的共价环化，环的mimiotopes可以是来源于每个环的野生-型(WT)一级序列。优选通过末端半胱氨酸之间二硫键的形成实现环化，其因此结合而变成胱氨酸。
根据我们的结构排列(图9A & 9B)，我们已经得出简单的预测规则，以便提高拟表位所采用的构象，在与适当的载体分子缀合之后，与那些母体抗原决定基相似的可能性。
规则1
疏水的胱氨酸基团应该取代WT β-链残基，其属于Ig恒定区的水-不易接近的核心，通过两个β-折叠之间的界面形成。
规则2i
对于内-折叠环(例如A-B环)来说，胱氨酸基团应当取代WT残基，其来源于相邻的反向平行β-链(见图8)并一并在折叠的同一侧面侧向堆积。遵照规则1，其将位于折叠的区-内侧上。A-B环的此规则的结构推导在图10A和10B中示意性地表示。
规则2ii
对于间-折叠环(例如C-D环)来说，胱氨酸基团应当在反平行β-链，来源于任一折叠的一个链上取代WT残基。遵照规则1，形成最佳成对堆积的残基，均来源于相对的β-链，因而形成折叠之间的界面部分。C-D环的此规则的结构推导在图11A和图11B中示意性地表示。在推定的拟表位序列片中，预测为最佳设计的是加下划线的。在每个序列区下，虚线和实线连接为所选择的最佳环化残基位置，其以相同的方式在图10B(A-B环)和图11B(C-D环)中表示。
使用图9A和9B中所列出的序列排列，及上述规则，本发明人已经设计出了列于表9-12中的下列肽。加下划线(实线或虚线)的肽是根据上述鉴定规则的最佳肽，相同的线在图10B和图11B中表示。未加下划线的序列是拟表位。
表9，IgE Cε3 A-B环序列
肽序列(下面划实线和虚线的是最佳的) SEQ ID NO.
    341                              357C S R P S P F D L F I R K S P T I T CC S R P S P F D L F I R K S P T I CC  S  R  P  S  P  F  D  L  F  I  R  K  S  P  T  CC S R P S P F D L F I R K S P CC R P S P F D L F I R K S P CC R P S P F D L F I R K S P T CC R P S P F D L F I R K S P T I CC R P S P F D L F I R K S P T I T CC  P  S  P  F  D  L  F  I  R  K  S  P  T  I  T  CC P S P F D L F I R K S P T I CC P S P F D L F I R K S P T CC P S P F D L F I R K S P C 333435363738394041424344
表10，IgE Cε4 A-B环序列
肽序列(下面划实线和虚线的是最佳的) SEQ ID NO.
     446                               463C Y A F A T P E W P G S R D K R T L A CC Y A F A T P E W P G S R D K R T L CC  Y  A   F  A  T  P  E  W  P  G  S  R  D  K  R  T  CC Y A F A T P E W P G S R D K R CC A F A T P E W P G S R D K R CC A F A T P E W P G S R D K R T CC A F A T P E W P G S R D K R T L CC A F A T P E W P G S R D K R T L A CC  F  A  T  P  E  W  P  G  S  R  D  K  R  T  L  A  CC F A T P E W P G S R D K R T L CC F A T P E W P G S R D K R T CC F A T P E W P G S R D K R C 454647484950515253545556
表11，IgE Cε3 C-D环序列
 肽序列(下面划实线和虚线的是最佳的) SEQ ID NO.
     373                         387C T W S R A S G K P V N H S T R CC T W S R A S G K P V N H S T CC T W S R A S G K P V N H S CC  T  W  S  R  A  S  G  K  P  V  N  H  CC W S R A S G K P V N H CC W S R A S G K P V N H S CC W S R A S G K P V N H S T CC W S R A S G K P V N H S T R CC S R A S G K P V N H S T R CC  S  R  A  S  G  K  P  V  N  H  S  T  CC S R A S G K P V N H S CC S R A S G K P V N H C 575859606162636465666768
表12，IgE Cε4 C-D环拟表位序列
 肽序列(下面划实线和虚线的是最佳的)  SEQ ID NO.
     477                         491C Q W L H N E V Q L P D A R H S CC Q W L H N E V Q L P D A R H CC Q W L H N E V Q L P.D A R CC  Q  W  L  H  N  E  V  Q  L  P  D  A  CC W L H N E V Q L P D A CC W L H N E V Q L P D A R CC W L H N E V Q L P D A R H CC W L H N E V Q L P D A R H S CC L H N E V Q L P D A R H S CC  L  H  N  E  V  Q  L  P  D  A  R  H  CC L H N E V Q L P D A R CC L H N E V Q L P D A C 697071727374757677787980
                           序列表
<110>SmithKline Beecham Biolicals s.a.
     Peptide Therapeutics Ltd
<120>疫苗
<130>B45173
<160>86
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>22
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>1
Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys
 1               5                  10                  15
Gln Arg Asn Gly Thr Leu
            20
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>2
Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu
 1               5
<210>3
<211>19
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>3
Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly
 1               5                  10                  15
Pro Arg Ala
<210>4
<211>11
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>4
Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr
 1               5                  10
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>5
Glu Gln Lys Asp Glu
 1               5
<210>6
<211>19
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>6
Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr
 1               5                  10                  15
Ile Thr Cys
<210>7
<211>21
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>7
Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr
 1               5                  10                  15
Gln Pro Arg Lys Thr
            20
<210>8
<211>23
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>8
Cys Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu
 1               5                  10                  15
Lys Gln Arg Asn Gly Leu Leu
            20
<210>9
<211>11
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>9
Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Gly Gly Cys
 1               5                  10
<210>10
<211>18
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>10
Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn
 1               5                  10                  15
Gly Cys
<210>11
<211>20
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>11
Cys Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg
 1               5                  10                  15
Asn Gly Leu Leu
            20
<210>12
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>12
Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Gly Gly Cys
 1               5                  10
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>13
Cys Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Leu Leu
 1               5                  10
<210>14
<211>12
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>14
Cys Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Leu
 1               5                  10
<210>15
<211>12
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>15
Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Gly Cys
 1               5                  10
<210>16
<211>12
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>16
Cys His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Leu Leu
 1               5                  10
<210>17
<211>12
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>17
Cys Gly Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met
 1               5                  10
<210>18
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>18
Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Cys
 1               5                  10
<210>19
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>19
Gly Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Ser Ser Cys
 1               5                  10
<210>20
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>20
Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Cys
 1               5                  10
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>21
Ala Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Gly Gly
 1               5                  10                  15
Cys
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>22
Cys Gly Gly Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr
 1               5                  10                  15
Leu
<210>23
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>23
Cys Thr Arg Lys Asp Arg Ser Gly Pro Trp Glu Pro Ala
 1               5                  10
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>24
Ala Pro Cys Trp Pro Gly Ser Arg Asp Cys Arg Thr Leu Ala Gly
 1               5                  10                  15
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>25
Ala Cys Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Arg Cys Thr Leu Ala Gly
 1               5                  10                  15
<210>26
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial  sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>26
Cys Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Cys
 1               5                  10                  15
Gly
<210>27
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>27
Cys Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Cys Gly
 1               5                  10                  15
<210>28
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>28
Thr Pro Cys Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Cys Gly
 1               5                  10
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>29
Cys Gly Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Leu
 1               5                  10
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>30
Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys
 1               5                  10
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>31
Gly Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys
 1               5
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>32
Cys Ala Glu Gly Glu Gln Lys Asp Glu Leu
 1               5                  10
<210>33
<211>19
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>33
Cys Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr
 1               5                  10                  15
Ile Thr Cys
<210>34
<211>18
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>34
Cys Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr
 1               5                  10                  15
Ile Cys
<210>35
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>35
Cys Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr
 1               5                  10                  15
Cys
<210>36
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>36
Cys Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Cys
 1               5                  10                  15
<210>37
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>37
Cys Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Cys
 1               5                  10                  15
<210>38
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>38
Cys Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Cys
 1               5                  10                  15
<210>39
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>39
Cys Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile
 1               5                  10                  15
Cys
<210>40
<211>18
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>40
Cys Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile
 1               5                  10                  15
Thr Cys
<210>41
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>41
Cys Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr
 1               5                  10                  15
Cys
<210>42
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>42
Cys Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Cys
 1               5                  10                  15
<210>43
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>43
Cys Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Cys
 1               5                  10                  15
<210>44
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>44
Cys Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Cys
 1               5                  10
<210>45
<211>20
<212>PRT
<213>Human and artificia1 sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>45
Cys Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg
 1               5                  10                  15
Thr Leu Ala Cys
            20
<210>46
<211>19
<212>PRT
<213>Human and artificial  sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>46
Cys Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg
 1               5                  10                  15
Thr Leu Cys
<210>47
<211>18
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>47
Cys Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg
 1               5                  10                  15
Thr Cys
<210>48
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>48
Cys Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu TrP Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg
 1               5                  10                  15
Cys
<210>49
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>49
Cys Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Cys
 1               5                  10                  15
<210>50
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>50
Cys Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr
 1               5                  10                  15
Cys
<210>51
<211>18
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>51
Cys Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr
 1               5                  10                  15
Leu Cys
<210>52
<211>19
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>52
Cys Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr
 1               5                  10                  15
Leu Ala Cys
<210>53
<211>18
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>53
Cys Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
 1               5                  10                  15
Ala Cys
<210>54
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>54
Cys Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
 1               5                  10                  15
Cys
<210>55
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>55
Cys Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Cys
 1               5                  10                  15
<210>56
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>56
Cys Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Cys
 1               5                  10                  15
<210>57
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>57
Cys Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg
 1               5                  10                  15
Cys
<210>58
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>58
Cys Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Cys
 1               5                  10                  15
<210>59
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>59
Cys Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Cys
 1               5                  10                  15
<210>60
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>60
Cys Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Cys
 1               5                  10
<210>61
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>61
Cys Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Cys
 1               5                  10
<210>62
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>62
Cys Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Cys
 1               5                  10
<210>63
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>63
Cys Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Cys
 1               5                  10                  15
<210>64
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>64
Cys Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Cys
 1               5                  10                  15
<210>65
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>65
Cys Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Va1 Asn His Ser Thr Arg Cys
 1               5                  10                  15
<210>66
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>66
Cys Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Cys
1                5                  10
<210>67
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>67
Cys Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Cys
 1               5                  10
<210>68
<211>12
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>68
Cys Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Cys
 1               5                  10
<210>69
<211>17
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>69
Cys Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser
 1               5                  10                  15
Cys
<210>70
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>70
Cys Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Cys
 1               5                  10                  15
<210>71
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>71
Cys Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg Cys
 1               5                  10                  15
<210>72
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>72
Cys Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Cys
 1               5                  10
<210>73
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>73
Cys Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Cys
 1               5                  10
<210>74
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>74
Cys Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg Cys
 1               5                  10
<210>75
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>75
Cys Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Cys
 1               5                  10                  15
<210>76
<211>16
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>76
Cys Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Cys
 1               5                  10                  15
<210>77
<211>15
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>77
Cys Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Cys
 1               5                  10                  15
<210>78
<211>14
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>78
Cys Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Cys
 1               5                  10
<210>79
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>79
Cys Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg Cys
 1               5                  10
<210>80
<211>12
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>80
Cys Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Cys
 1               5                  10
<210>81
<211>6
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>81
Leu Phe Ile Arg Lys Ser
 1               5
<210>82
<211>7
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>82
Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn
 1               5
<210>83
<211>23
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>83
Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln
 1               5                  10                  15
Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser
            20
<210>84
<211>6
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>84
Ser Val Asn Pro Gly Lys
 1               5
<210>85
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>85
Cys Pro Glu Trp Pro Gly Cys Arg Asp Lys Arg Thr Gly
 1               5                  10
<210>86
<211>13
<212>PRT
<213>Human and artificial sequence
<214>人序列，且为人工序列
<400>86
Thr Pro Glu Trp Pro Gly Cys Arg Asp Lys Arg Cys Gly
 1               5                  10

Claims (35)

1.一种肽，其包含IgE Cε3区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是P5(SEQ ID No.1)，或其拟表位。
2.一种肽，其包含IgE Cε3区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是P6(SEQ ID No.2)，或其拟表位。
3.一种肽，其包含跨越IgE Cε3和Cε4域的区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是P7(SEQ ID No.3)，或其拟表位。
4.一种肽，其包含IgE Cε4区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是P8(SEQ ID No.4)，或其拟表位。
5.一种肽，其包含IgE Cε4区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是P9(SEQ ID No.5)，或其拟表位。
6.一种肽，其包含IgE Cε3区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是P200(SEQ ID No.6)，或其拟表位。
7.一种肽，其包含IgE Cε3区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是P210(SEQ ID No.7)，或其拟表位。
8.一种肽，其包含IgE Cε3区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是2-90N(SEQ ID No.82)，或其拟表位。
9.一种肽，其包含IgE Cε4区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是3-90N(SEQ ID No.83)，或其拟表位。
10.一种肽，其包含IgE Cε4区的分离的表面暴露抗原决定基，其中该肽是4-90N(SEQ ID No.84)，或其拟表位。
11.一种如权利要求1-10中任意一项所要求的拟表位，其中该拟表位是肽。
12.一种如权利要求4中所要求的肽，其中P8的拟表位是通式P，X1，X2，P，X3，X4，X5，X6，X5，X5的肽
其中；X1是选自E，D，N或Q的氨基酸；X2是选自W，Y或F的氨基酸；X3是选自G或A的氨基酸；X4是选自S，T或M的氨基酸；X5是选自R或K的氨基酸；X6是选自D或E的氨基酸。
13.一种如权利要求12中所要求的肽，其中P8的拟表位是通式P，X1，X2，P，G，X4，R，D，X5，X5的肽
其中；X1是选自E，D，N或Q的氨基酸；X2是选自W，Y或F的氨基酸；X4是选自S，T或M的氨基酸；X5是选自R或K的氨基酸；X6是选自D或E的氨基酸。
14.一种用于变态反应治疗的免疫原，其包含权利要求1-13中任意一项所要求的肽或拟表位，另外还包含载体分子。
15.一种如权利要求14中所要求的免疫原，其中载体分子选自D蛋白或乙肝病毒核心抗原。
16.一种如权利要求14或15中所要求的免疫原，其中免疫原是肽或拟表位的化学缀合物，或其中的免疫原表达为融合蛋白。
17.一种如权利要求14-16中任意一项所要求的免疫原，其中肽或肽拟表位在载体的一级序列内存在。
18.一种用于变态反应治疗的疫苗，其包含权利要求14-17中任意一项所要求的免疫原，而且还包含辅剂。
19.一种能够识别权利要求1-13中任意一项所要求的肽的配体。
20.一种权利要求19中所要求的配体，其中配体选自P14/23，P14/31或P14/33；其按照布达佩斯条约专利保藏，于26/1/00日在ECACC保藏，保藏登记号分别为第00012610，00012611，00012612。
21.一种药物组合物，其包含权利要求19中所要求的配体。
22.一种药物组合物，其包含权利要求20中所要求的配体。
23.一种用于药物中的，如权利要求1-13中任意一项所要求的肽。
24.一种用于药物中的，如权利要求18中所要求的疫苗。
25.一种用于药物中的，如权利要求14-17中任意一项所要求的免疫原。
26.一种如权利要求1-13中任意一项所要求的肽在制造用于变态反应治疗或预防的药物中的用途。
27.一种用于药物中的，能够识别权利要求1-13中任意一项所要求的肽的配体。
28.一种配体在制造用于变态反应治疗或预防的药物中的用途，该配体能够识别权利要求1-13中任意一项所要求的肽。
29.P14/23，P14/31或P14/33在P8的拟表位鉴定中的用途；其按照布达佩斯条约专利保藏，于26/1/00在ECACC保藏，保藏登记号分别为第00012610，00012611，00012612。
30.一种能够被P14/23，P14/31或P14/33识别的肽；其中P14/23，P14/31和P14/33按照布达佩斯条约专利保藏，于26/1/00日在ECACC保藏，保藏登记号分别为第00012610，00012611，00012612。
31.一种包含权利要求30中所要求的肽的疫苗。
32.一种生产疫苗的方法，包含权利要求14-17中任意一项所要求的免疫原的生产，和用辅剂配制免疫原。
33.一种用于治疗正在遭受变态反应或对变态反应易感的患者的方法，包含给予患者权利要求1-13中任意一项所要求的肽。
34.一种用于治疗正在遭受变态反应或对变态反应易感的患者的方法，包含给予患者权利要求24或31中所要求的疫苗。
35.一种用于治疗正在遭受变态反应或对变态反应易感的患者的方法，包含给予患者权利要求21或22中任意一项所要求的药物组合物。
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