CN104395337A - IgE肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够用于预防或治疗人或犬等除小鼠以外的动物的变态反应性疾病的IgE肽疫苗。肽，该肽包含下述的氨基酸序列(i)或(ii)：(i)SEQIDNO:28所表示的氨基酸序列、(ii)包含SEQIDNO:28所表示的氨基酸序列中的连续的至少10个氨基酸的氨基酸序列，对动物给予该肽时，该肽与该动物的IgE抗体的CH3区特异性结合，能够阻止上述IgE抗体与IgE受体结合。

Description

IgE肽疫苗
技术领域
本发明涉及能够用于预防或治疗变态反应性疾病的小鼠IgE的部分肽和含有该部分肽的IgE肽疫苗。
背景技术
肽疫苗疗法是指，通过将肿瘤等的抗原或其表位部分和佐剂一同给药，诱导针对上述肿瘤等的抗原的细胞性免疫和体液性免疫这两种免疫，其临床应用正在推进。
IgE参与变态反应、特别是I型变态反应。近年来，在作为宠物来饲养的犬中，和人一样变态反应性疾病在增加。
作为I型变态反应的治疗方法，考虑使用与血清中的IgE结合、并抑制IgE与肥大细胞的结合的化合物，作为这样的化合物，暗示能够使用与IgE的Fc区结合的抗体(参照专利文献1)。
为了治疗变态反应而采用上述的肽疫苗疗法，并使用由IgE的CH3区诱导的抗原性肽作为肽疫苗，已有关于这方面的报道(参照专利文献2)。但是，为了治疗犬的变态反应而诱导抗犬IgE的抗体，为此使用同种来源的IgE的抗原性肽作为疫苗。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-151880号公报；
专利文献2：日本特开2005-102701号公报。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明以提供能够用于预防或治疗人或犬等除小鼠以外的动物的变态反应性疾病的IgE肽疫苗为目的。
用于解决课题的手段
本发明人等对犬的变态反应的治疗方法进行了研究，最初制作了大鼠抗犬IgE单克隆抗体，发现存在识别犬IgE、小鼠IgE和猫IgE的单克隆抗体。这暗示识别例如小鼠IgE的特定表位的抗体也能够识别其他动物种的IgE。根据该认知，本发明人考虑能否将小鼠IgE的部分肽用于诱导抗其他动物种的IgE的抗体、即能否将其用作对其他动物种进行给药的变态反应治疗用肽疫苗，进行了深入研究。
其结果，发现了对犬给予与犬的序列同源性未必高的部分肽时，在犬体内诱导出抗该部分肽的抗体，该抗体不仅识别肽还识别IgE，而且与犬自身的IgE的Fc区结合，阻止了IgE与肥大细胞的结合。
其结果，发现了小鼠IgE的部分肽能够用作用于治疗IgE介导性的变态反应的疫苗，从而完成了本发明。
不仅是对于犬、对于包括人在内的除小鼠或与小鼠类缘的啮齿类以外的动物，该肽也可被用作肽疫苗。
即使不使用佐剂，只将该肽进行皮下给药，即可作为疫苗来使用。
即，本发明如下。
[1] 肽，该肽包含下述的氨基酸序列：
(i) SEQ ID NO: 28所表示的氨基酸序列、或
(ii) 包含SEQ ID NO: 28所表示的氨基酸序列中的连续的至少10个氨基酸的氨基酸序列，
对动物给予该肽时，其与该动物的IgE抗体的CH3区特异性结合，能够阻止上述IgE抗体与IgE受体结合。
[2] [1]所述的肽，该肽包含下述的氨基酸序列：
(i) SEQ ID NO: 27所表示的氨基酸序列、或
(ii) 包含SEQ ID NO: 27所表示的氨基酸序列中的连续的至少10个氨基酸的氨基酸序列，
对动物给予该肽时，其与该动物的IgE抗体的CH3区特异性结合，能够阻止上述IgE抗体与IgE受体结合。
[3] [1]所述的肽，该肽包含选自SEQ ID NO: 22、23、24、25和26的氨基酸序列。
[4] [2]所述的肽，该肽包含选自SEQ ID NO: 29～92的氨基酸序列。
[5] [4]所述的肽，该肽包含选自SEQ ID NO: 29、31、34、38、43、49、56、64、72、82、30、33、37、42、48、55、63、71、81和92的氨基酸序列。
[6] [4]所述的肽，该肽包含SEQ ID NO: 45所表示的氨基酸序列。
[7] 肽，该肽包含[1]～[6]中任一项所述的肽的氨基酸序列中有1～3个氨基酸被缺失、取代、添加而获得的氨基酸序列，对动物给予该肽时，其与该动物的IgE抗体的CH3区特异性结合，能够阻止上述IgE抗体与IgE受体结合。
[8] IgE介导性疾病用疫苗或治疗药，其中包含[1]～[7]中任一项所述的肽。
[9] [8]所述的疫苗或治疗药，其中，IgE介导性疾病选自特应性皮炎、花粉病、食物过敏、过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性结膜炎、螨过敏性疾病、荨麻疹、过敏性休克和肺嗜酸性粒细胞浸润(pulmonary infiltration with eosinophilia，PIE)综合征。
[10] 预防或治疗IgE介导性疾病的方法，该方法包括：对非人动物给予包含[1]～[7]中任一项所述的肽的IgE介导性疾病用疫苗或治疗药。
[11] [10]所述的预防或治疗IgE介导性疾病的方法，其中，IgE介导性疾病选自特应性皮炎、花粉病、食物过敏、过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性结膜炎、螨过敏性疾病、荨麻疹、过敏性休克和PIE(肺嗜酸性粒细胞浸润)综合征。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本国专利申请2012-136944号的说明书和/或附图中记载的内容。
发明效果
本发明的肽在犬、人等其他种哺乳类中可以诱导抗IgE抗体(IgG)的形成，该抗IgE抗体与已诱导抗体的动物种的IgE结合，可以阻止IgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体结合。因此，本发明的小鼠IgE的CH3区的部分肽可以用作引起抗IgE的IgG抗体的、用于预防或治疗IgE介导性的变态反应性疾病等疾病的IgE肽疫苗。
附图说明
图1-1是显示犬IgE CH3区合成肽地图的图。
图1-2是显示犬IgE CH3区和小鼠IgE CH3区氨基酸序列的比对的图。
图2是显示表位分析结果的图。
图3-1是显示血清中肽特异性IgG浓度的测定结果的图。
图3-2是显示血清中IgE特异性IgG浓度的测定结果的图。
图4是显示血清中Der f 2特异性IgE浓度的测定结果的图。
图5是显示血清中IgE浓度测定中的肽非给药组和给药组的ELISA反应系统的反应方式的图。
图6-1是显示是否存在固相化抗原与检测抗原的非特异反应的图。
图6-2是显示抗原(IgE肽和人IgE)与抗犬IgG抗体的反应性分析结果的图。
图6-3是显示抗原(IgE肽、人IgE和犬IgE)与抗犬IgG1抗体的反应性分析结果的图。
图6-4是显示抗原(IgE肽和人IgE)与抗犬IgG2抗体的反应性分析结果的图。
图6-5是显示给予肽后用Der f 2和Alum佐剂一同进行免疫(人工致敏)后的Der f 2特异性IgE的反应性分析结果的图。
图6-6是显示用Der f 2和Alum佐剂一同进行免疫(人工致敏)后犬血清中的人IgE特异性犬IgG、IgG1和IgG2的值的图。
图7是显示Prausnitz-Kustner (P-K)试验中的血清的给药方法的图。图中，带圆圈的数字的1～4分别显示血清1～血清4。
图8是显示Prausnitz-Kustner (P-K)试验中的抗原液以及阳性对照和阴性对照的给药方法的图。图中，带圆圈的数字的1～4分别显示血清1～血清4。
图9是显示Prausnitz-Kustner (P-K)试验的结果之一例的图。图中，带圆圈的数字的1～4分别显示血清1～血清4。
图10是显示在Prausnitz-Kustner (P-K)试验中，在具有相同浓度的Der f 2特异性IgE的血清1和血清2中产生分数差的理由的图。
图11-1是显示用肽进行了免疫(人工致敏)的兔血清与犬IgE的反应性的图。
图11-2是显示用肽进行了免疫(人工致敏)的兔血清与犬IgG的反应性的图。
图11-3是显示用肽进行了免疫(人工致敏)的兔血清与小鼠IgE的反应性的图。
图11-4是显示用肽进行了免疫(人工致敏)的兔血清与人IgE的反应性的图。
图11-5是显示用肽进行了免疫(人工致敏)的兔血清与猫重组CH3的反应性的图。
图12-1是显示20种肽对大鼠的疫苗效果的图。
图12-2是显示20种肽中的肽No.1～4对大鼠的疫苗效果的图(将血清稀释100倍后测定)。
图12-3是显示20种肽中的肽No.5～8对大鼠的疫苗效果的图(将血清稀释100倍后测定)。
图12-4是显示20种肽中的肽No.9～12对大鼠的疫苗效果的图(将血清稀释100倍后测定)。
图12-5是显示20种肽中的肽No.13～16对大鼠的疫苗效果的图(将血清稀释100倍后测定)。
图12-6是显示20种肽中的肽No.17～20对大鼠的疫苗效果的图(将血清稀释100倍后测定)。
图13是显示使用大鼠的静脉给药试验方案的图。
图14是显示对大鼠静脉给予肽时的抗IgE抗体效价上升的图。
图15是显示使用大鼠的皮下给药试验方案的图。
图16是显示预防实验方案的图。
图17是显示对大鼠皮下给予肽时的抗IgE抗体效价的上升变化和最终的抗体效价的图。
图18是显示对大鼠皮下给予肽时每一个体的抗IgE抗体效价的上升的图。
图19是显示对大鼠皮下给予肽时Der f 2特异性IgE测定结果的图。
图20是显示对大鼠皮下给予肽时每一个体的Der f 2特异性IgE测定结果的图。
图21是显示使用犬的肽给药试验(其一)方案的图。
图22是显示对犬皮下给予肽时抗IgE抗体效价的上升的图。
图23是显示使用犬的肽给药试验(其二)方案的图。
图24是显示对犬皮下给予肽时抗IgE抗体效价的上升的图。
图25是显示使用粉尘螨(コナヒョウダニ)人工致敏犬的治疗实验方案的图。
图26是显示对粉尘螨人工致敏犬皮下给予肽时抗IgE抗体效价的上升的图。
图27是显示对粉尘螨人工致敏犬皮下给予肽时粉尘螨(コナヒョウヒダニ)抗原特异性IgE的测定结果的图。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
本发明的变态反应性疾病的治疗用肽疫苗中使用的肽是小鼠IgE的部分肽。具体而言，是包含小鼠IgE肽的CH3(Cε3)区的NVTWNQEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI TSILPV (SEQ ID NO: 28)所表示的氨基酸序列的肽、或该肽的部分肽，所述部分肽包含至少6个、7个、8个或9个、优选至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个、进一步优选至少25个连续的氨基酸序列。作为这样的部分肽，例如可以列举：包含SEQ ID NO: 22 (NVTWNQEKKTSVSAS)、SEQ ID NO: 23 (QEKKTSVSASQWYTK)、SEQ ID NO: 24 (SVSASQWYTKHHNNA)、SEQ ID NO: 25 (QWYTKHHNNATTSIT)、SEQ ID NO: 26 (HHNNATTSITSILPV)和SEQ ID NO: 27所表示的氨基酸序列的部分肽。其中，优选包含QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 27)所表示的氨基酸序列的肽、或该肽的部分肽，所述部分肽包含至少6个、优选至少10个连续的氨基酸序列，作为这样的部分肽，可以列举包含SEQ ID NO: 23、24和25所表示的氨基酸序列的部分肽。而且，还可以适当地使用包含QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 27)所表示的氨基酸序列的肽的部分肽，该部分肽包含15～24个连续的氨基酸序列。作为身为包含QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 27)所表示的氨基酸序列的肽的部分肽、且包含15～24个连续的氨基酸序列的部分肽，可以列举包含下述的氨基酸序列的肽。
QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI (SEQ ID NO: 29)、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 30)、
QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS (SEQ ID NO: 31)、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI (SEQ ID NO: 32)、
KKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 33)、
QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT (SEQ ID NO: 34)、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATTS (SEQ ID NO: 35)、
KKTSVSASQWYTKHHNNATTSI (SEQ ID NO: 36)、
KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 37)、
QEKKTSVSASQWYTKHHNNAT (SEQ ID NO: 38)、
EKKTSVSASQWYTKHHNNATT (SEQ ID NO: 39)、
KKTSVSASQWYTKHHNNATTS (SEQ ID NO: 40)、
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SQWYTKHHNNATTSI (SEQ ID NO: 91)、以及
QWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 92)。
上述的部分肽包含构成IgE的表位的氨基酸序列。
上述的部分肽均可用作变态反应性疾病的治疗用肽疫苗，但优选例如以下的肽。
(1) QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI (SEQ ID NO: 29)
(2) QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS (SEQ ID NO: 31)
(3) QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT (SEQ ID NO: 34)
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(6) QEKKTSVSASQWYTKHHNN (SEQ ID NO: 49)
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(9) QEKKTSVSASQWYTKH (SEQ ID NO: 72)
(10) QEKKTSVSASQWYTK (SEQ ID NO: 82)
(11) EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 30)
(12) KKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 33)
(13) KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 37)
(14) TSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 42)
(15) SVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 48)
(16) VSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 55)
(17) SASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 63)
(18) ASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 71)
(19) SQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 81)
(20) QWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 92)
进一步更优选以下的肽。
(1) QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI (SEQ ID NO: 29)
(2) QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS (SEQ ID NO: 31)
(3) QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT (SEQ ID NO: 34)
(4) QEKKTSVSASQWYTKHHNNAT (SEQ ID NO: 38)
(5) QEKKTSVSASQWYTKHHNNA (SEQ ID NO: 43)
(7) QEKKTSVSASQWYTKHHN (SEQ ID NO: 56)
(8) QEKKTSVSASQWYTKHH (SEQ ID NO: 64)
(10) QEKKTSVSASQWYTK (SEQ ID NO: 82)
(11) EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 30)
(13) KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 37)
(14) TSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 42)
(15) SVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 48)
(16) VSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 55)
另外，含有从包含SEQ ID NO: 27所表示的氨基酸序列的肽中除去1～3个、例如2个N末端氨基酸、或者除去1～3个、例如3个C末端氨基酸后的氨基酸序列的肽也可以适当地用作肽疫苗。作为这样的肽，可以列举包含KKTSVSASQWYTKHHNNATT (SEQ ID NO: 45)所表示的氨基酸序列的肽。
而且，还包括如下的部分肽，所述部分肽包含：为NVTWNQEKKTSVSAS QWYTKHHNNATTSITSILPV (SEQ ID NO: 28)或QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT (SEQ ID NO: 27)所表示的氨基酸序列或该氨基酸序列的上述的部分氨基酸序列，且在至少6个、优选至少10个连续的氨基酸序列中，有1～3个、优选1或2个、进一步优选1个氨基酸被缺失、取代、添加而获得的氨基酸序列。
虽然上述的小鼠IgE的部分肽与犬或人等其他的罹患变态反应性疾病的动物的IgE的氨基酸序列同源性低，但显示出交叉反应性。即，上述的抗小鼠IgE的部分肽的抗体也识别犬IgE或人IgE并与其结合。
而且，由于序列同源性低，所以例如对犬给予上述的小鼠IgE部分肽时，不会被识别为自身抗原，而是在犬体内产生抗小鼠IgE的IgE特异性IgG抗体，产生的IgG抗体与犬自身的体内的IgE的CH3区结合，阻止IgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞的IgE受体结合，防止变态反应症状的发生。因此，可以将上述部分肽用作变态反应性疾病的预防或治疗用IgE肽疫苗，本发明包含：含有上述部分肽的变态反应性疾病的预防或治疗用IgE肽疫苗。该IgE肽可以只包含一种、也可以包含多种上述的小鼠IgE的部分肽。本发明的肽疫苗，即使不使用佐剂，只将肽通过皮下给药等进行给药，也能够发挥作为疫苗的效果。
SEQ ID NO: 1显示犬IgE的CH3区的氨基酸序列、SEQ ID NO: 21显示小鼠IgE的CH3区的氨基酸序列。上述的SEQ ID NO: 27所表示的序列相当于SEQ ID NO: 21所表示的氨基酸序列的第45～70位的氨基酸序列。另外，图1-2显示两个氨基酸序列的比对。
本发明的IgE肽疫苗，可以以犬、猫、人等除小鼠以外的能够罹患变态反应性疾病等IgE介导性疾病的哺乳动物为对象进行给药。
变态反应性疾病有IgE介导性的疾病和非IgE介导性的疾病，作为IgE介导性的变态反应性疾病，可以列举过敏性皮炎、特应性皮炎、花粉病、食物过敏、过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性结膜炎、螨(房尘螨、ハウスダストマイト)过敏性疾病、荨麻疹、过敏性休克、PIE(肺嗜酸性粒细胞浸润)综合征等。作为螨过敏性疾病，例如可以列举由蚍螨科尘螨属(チリダニ科ヒョウダニ属)的粉尘螨(コナヒョウダニ)或屋尘螨(ヤケヒョウダニ)等引起的螨过敏性疾病。
本发明的IgE肽疫苗的给药量可以根据给药的动物种而改变，1次数十ng～数mg。可以单次给药，也可以以2天～8周的间隔多次给药。
本发明的IgE肽疫苗可以是无菌的水性或非水性的溶液、悬浮液、或乳剂的形态。而且，可以包含盐、缓冲剂、佐剂等药学上可接受的稀释剂、助剂、载体等。疫苗可以通过经口、经鼻、经粘膜、肌肉内或皮下、鼻腔内、气管内、皮肤、经皮、皮内或静脉等各种途径进行接种。其中，优选经口接种、经鼻接种、经粘膜接种、皮下给药、静脉给药。作为佐剂，以弗氏的完全或不完全佐剂为代表，可以使用细菌及其菌体成分、分枝杆菌、革兰氏阴性菌和菌体成分、革兰氏阳性菌和菌体成分、非细菌性物质、植物或真菌的多糖体、脂溶性维生素类、矿物油等公知的佐剂。作为非细菌性物质，可以列举Alum (氢氧化铝)佐剂、磷酸钙佐剂、磷酸铝佐剂、明矾等。另外，本发明的疫苗可以以包含在饮料水或饵中的状态让犬等动物摄取。本发明还包含：含有疫苗的饮料水和饵。
而且，本发明还包含下述方法：对动物、优选非人动物给予上述的IgE肽疫苗，在该动物中产生与该动物的IgE特异性结合的IgG抗体，阻止IgE与肥大细胞或嗜碱性粒细胞结合，从而预防或治疗该动物中的IgE介导性变态反应性疾病的方法。
实施例
通过下述实施例来具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
实施例1　IgE的CH3区肽的分析
进行与犬IgE抗体结合的小鼠单克隆抗体、以及与犬和小鼠的IgE抗体结合的大鼠单克隆抗体的表位分析。以由使用犬IgE的CH3(Cε3)区基因进行了免疫的小鼠制作的小鼠抗犬IgE抗体(克隆名：CCH3-4、CCH5-5、CCH3-12、CCH3-13、CCH3-14、CCH3-15)、由使用犬和小鼠IgE的CH3(Cε3)区基因进行了免疫的大鼠制作的抗IgE单克隆抗体(克隆名：X-1、X-2、CCH3-21和CCH3-22)为样品，合成包含图1-1所示的序列的犬和小鼠IgE肽的CH3(Cε3)区的合成肽(SEQ ID NO: 2～20和22～26)，通过ELISA进行表位分析。确认到使用大鼠制作的克隆X-1和X-2与小鼠IgE和犬IgE两者均反应。将各肽以100ng/孔固相化在ELISA板上，使小鼠抗犬IgE单克隆抗体(图2所示的CCH3-4、CCH5-5、CCH3-12、CCH3-13、CCH3-14、CCH3-15)、大鼠抗犬·小鼠IgE单克隆抗体(图2所示的X-1和X-2)、以及大鼠抗犬IgE单克隆抗体(图2所示的CCH3-21和CCH3-22)与其反应，关于使用小鼠作为二次抗体制作的抗犬IgE抗体，使用抗小鼠IgG HRP(辣根过氧化物酶)标记抗体来检测与肽反应的抗犬IgE单克隆抗体，而关于使用大鼠作为二次抗体制作的抗犬IgE抗体，使用抗大鼠IgG HRP标记抗体来检测与肽反应的抗犬IgE单克隆抗体。
图2显示表位分析结果的例子。在犬IgE中，可知在图1-1的序列中在SEQ ID NO: 9～15的带有下划线的部位存在表位。另外，在小鼠IgE中，可知在图1-1的序列中在SEQ ID NO: 22～26的带有下划线的部位存在表位。
由该结果可知：包含小鼠IgE肽的CH3(Cε3)区的QEKKTSVSASQWYTKHHNN ATTSIT (SEQ ID NO: 27)所表示的氨基酸序列的肽是存在表位的区域肽。
实施例2　IgE肽疫苗在犬中的抗体应答
(1) 肽
使用小鼠CH3-4-17-11 (小鼠的CH3区氨基酸序列) (SEQ ID NO: 27)作为肽。将2mL (500μg)该肽的溶解液(浓度为250μg/mL)和2mL完全佐剂(DIFCO ADJUVANT COMPLETE FREUND、日本ベクトン?ディッキンソン株式会社)分别注入微管中，使用高速振荡机振荡15分钟，使用所得的乳化液体(每只4mL)作为IgE肽疫苗。
(2) 疫苗的给药
所用动物是5～7月龄的比格犬，雄性1只、雌性7只，给药组有4只(08-33、08-42、08-43、08-44)和非给药组有4只(08-45、08-46、08-47、08-48)。
在第0天(试验开始日)、第14天、第28天进行肽的给药，作为第1疗程，再于第106天、第117天进行肽的给药，作为第2疗程。在给药组的4只比格犬的颈部皮下给予受试物质。非给药组未作处置。
(3) 利用房尘螨(ハウスダストマイト)抗原(Der f 2)进行的人工致敏
在第1疗程的肽给药4周后(试验开始第56天、试验开始第70天)，对所有比格犬实施人工致敏。以300μg Der f 2(批号3、1465μg/mL、由药剂研究组制备)和50mgAlum佐剂(SIGMA(注册商标)氢氧化铝IgEl、13mg/mL)的混合液体(每只4.0mL)作为致敏液，第1次致敏进行腹腔内给药，第2次致敏进行颈部皮下给药。
(4) 人工致敏的加强(ブースト，强化)
在第2疗程的肽给药4周后(试验开始第145天)实施人工致敏的加强。使用生理盐水将300μg Der f 2 (批号3：1465μg/mL、0.205mL)调制至1mL，使用所得液体对所有比格犬进行颈部皮下给药。
(5) 血清中IgG浓度的测定
按照下述方法给予肽，测定进行了人工致敏的犬受试体的血清中IgG浓度。
在第0、14、28、42、56、70、77、84、98、106、117、131、145、152天(非给药组则第0、14、28、42天的4时间点除外)，使用注射器从各个体的颈静脉采集血液，分离血清后，使用血清进行血清中的肽特异性IgG浓度和IgE特异性IgG浓度的测定。
使用固相化缓冲液(0.05M的碳酸缓冲液 pH9.6)将抗原蛋白(测定肽特异性IgG时是小鼠CH3-4-17-11、测定IgE特异性IgG时是人IgE)调制至1μg/mL，在ELISA板的每孔中添加100μL，在4℃下放置一夜。用0.05%的PBS-T清洗固相化板1次，在每孔中添加200μL封闭液(4×Block Ace 雪印乳液公司：UK-B80)，在37℃下培养1.5小时，进行封闭。血清用稀释液(PBS-T: Block Ace=9:1)稀释5000倍后使用。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，将作为二次抗体的抗犬IgG抗体(BETHYL公司：A40-118P)用稀释液稀释至5000倍，添加100μL。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，以100μL/孔向板中添加底物液(在枸橼酸缓冲液中加入1片TMBZ片(Sigma公司：T-3405)，临使用前再加入2μL 30%的H2O2而得到的溶液)，反应10分钟，以50μL/孔加入2N的硫酸，使反应停止。之后，使用酶标仪(BIO-RAD：型号680)进行测定(dual：测定450nm、对照570nm)。
需要说明的是，在IgE特异性IgG浓度的测定中，若在ELISA的固相化抗体中使用犬IgE，则二次抗体的犬IgG特异性多克隆抗体有时还会与固相化抗体结合并发生非特异性反应，所以使用人IgE作为固相化抗体。
在血清中Der f 2特异性IgE浓度的测定中，使用第70、77、106、117、131、145、152天的血清，进行血清中Der f 2特异性IgE浓度测定(依赖于动物变态反应检测株式会社)。
(6) 结果
血清中肽特异性IgG浓度的测定结果(O.D.值)见图3-1。给药组的平均值在第0天～第106天在0.16～0.30之间变化，但在第2疗程的第117天以后，仅08-44这1只显示出1.0以上的值，给药组的平均值在0.46～0.66之间变化。非给药组的平均值在0.14～0.23之间变化。在第77天给药组相对于非给药组明显高(p<0.05)。
血清中IgE特异性IgG浓度的测定结果(O.D.值)见图3-2。给药组的平均值在0.27～0.46之间变化。非给药组的平均值在0.24～0.34之间变化。在第77天给药组相对于非给药组明显高(p<0.05)。
血清中Der f 2特异性IgE浓度的测定结果见图4。从第1次致敏起2周后的第70天，给药组为1528.8±1823.6ng/mL(有2只为0)、非给药组为1486.3±1736.1ng/mL(有2只为0)。第77天、第106天给药组、非给药组均上升，第106天给药组的最高浓度为3091.8±1542.6ng/mL、非给药组的最高浓度为2968.3±649.8ng/mL，之后直至第145天下降。在致敏加强7天后的第152天，给药组再次上升至3972.5±1216.5ng/mL、非给药组再次上升至4426.7±1015.7ng/mL。在所有时间点在给药组与非给药组之间都不存在显著差异。
血清中肽特异性IgG浓度测定的结果，在第77天给药组的肽特异性IgG浓度与非给药组相比明显高，由此确认：在给予了IgE肽疫苗的犬中，血清中产生了肽特异性IgG。在第2疗程中在给药组的1只(08-44)中肽特异性IgG急剧上升，由此认为：在这1只中第2疗程的受试物质给药发挥了致敏加强的效果。
另外，在血清中IgE特异性IgG浓度的测定中，给药组与非给药组相比也显示出高的趋势，在第77天给药组与非给药组相比明显高，由此认为：给药组中产生的肽特异性IgG是交叉识别与肽具有类似结构的IgE的CH3区的抗体。
血清中Der f 2特异性IgE浓度测定的结果，在给药组与非给药组之间没有确认到显著差别。在给药组中，虽然认为血清中产生抗肽IgG，并与血清中IgE结合，但就血清中Der f 2特异性IgE而言在给药组与非给药组之间没有确认到显著差别，认为理由在于：由于每个IgE有两处CH3区，所以即使一处的CH3区被IgG封闭，也能够与检测中使用的抗犬IgE抗体(识别IgE的CH3区的抗体)结合，在ELISA中的显色上有可能确认不到差异(图5)。
由本实施例的结果可知以下内容。
1) 通过给予以小鼠的CH3区为模板制作的IgE肽疫苗，产生了抗肽抗体(IgG)。
2) 该抗体识别犬IgE的CH3区并与其结合。因此，认为该抗体也与通过Der f 2的致敏而产生的Der f 2特异性IgE结合，但通过本试验中使用的ELISA系统检测到了IgE-IgG复合体，在血清中Der f 2特异性IgE浓度方面没有确认到与非给药组的组间差。
3) 此时在尝试通过皮内反应试验进行的效果确认时，若血清中Der f 2特异性IgE上升，则认为IgE与皮肤的肥大细胞表面结合，数月间具有对抗原的反应性，所以此时即使实施皮内反应试验，认为也有可能不会产生组间差。
4) 认为通过与供试犬的肥大细胞状态无关而能够定性地评价IgE的Prausnitz-Kustner(P-K)试验(使用未致敏犬)，有可能可以在体内证明IgE-IgG复合体的形成。
虽然本试验的血清中Der f 2特异性IgE浓度最高高达5000ng/mL以上的高浓度，但对血清中Der f 2特异性IgE浓度与变态反应患畜相同程度(10～1000ng/mL左右)的个体给予受试物质时，血清中的IgG与IgE结合的比例变得更高，认为在本试验所使用的IgE检测系统中也有可能确认到差异。
接着，分析固相化抗原(IgE肽和IgE)与检测抗原(抗犬IgG抗体、抗犬IgG1抗体和抗犬IgG2抗体)的反应性，确认不存在非特异反应的抗原(图6-1的“○”)和存在非特异反应的抗原(图6-1的“×”)，通过没有确认到非特异反应的组合来确认反应性。
而且，图6-2显示抗原(IgE肽和人IgE)与抗犬IgG抗体的反应性分析结果，图6-3显示抗原(IgE肽、人IgE和犬IgE)与抗犬IgG1抗体的反应性分析结果，图6-4显示抗原(IgE肽和人IgE)与抗犬IgG2抗体的反应性分析结果。而且，图6-5显示在给予肽后用Der f 2和Alum佐剂一起进行免疫(人工致敏)后的Der f 2特异性IgE的反应性分析结果。图6-6显示用Der f 2和Alum佐剂一起进行免疫(人工致敏)后的犬血清中人IgE特异性犬IgG、IgG1和IgG2的值，显示肽疫苗给药组和非给药组中的结果的比较。另外，同时还显示完全没有进行处置的健康犬血清的结果。
由上述结果判明：通过给予肽疫苗，在犬体内抗肽IgG抗体和抗IgE的IgG抗体同时上升，而且，之后产生IgE时，在肽疫苗给药中抑制了IgE的产生。
实施例3　IgE肽疫苗效果的研究
IgE　在实施例2中，虽然认为肽疫苗给药组中产生的、与血清中IgE具有结合能力的IgG与通过致敏产生的Der f 2特异性IgE结合，但与非给药组之间在血清中Der f 2特异性IgE浓度上没有确认到显著差异。认为其理由在于：在实施例2的ELISA法中，认为与没有结合IgG的IgE一样，也有可能检测到结合有IgG的IgE。另外，认为此时即使实施皮内反应试验也不会产生差异。
于是，为了证明在给药组中IgG与血清中Der f 2特异性IgE结合，计划了Prausnitz-Kustner(P-K)试验。在给药组的血清中，由于IgG与IgE结合，所以阻碍了IgE与肥大细胞表面结合，预测在P-K试验中有可能不易发红(脱颗粒得到抑制)，为此实施本试验。
(1) P-K试验的概要
P-K试验是定性地评价受试血清中的抗原特异性IgE的方法，使用未被抗原致敏的其他个体。概要如下。
1) 作为P-K试验供试动物，准备未被抗原致敏的动物。
2) 对P-K试验供试动物皮内给予受试血清和健康动物(对照)的血清。当受试血清中存在抗原特异性IgE时，IgE在给药后48小时之间与P-K试验供试动物皮肤的肥大细胞表面结合。
3) 给予血清48小时后，在同一部位皮内给予抗原液。当受试血清中存在抗原特异性IgE时，抗原与结合于肥大细胞表面的抗原特异性IgE结合，形成IgE的交联。以此为契机，发生肥大细胞的脱颗粒，确认到皮肤发红。
(2) 材料
在本实施例的P-K试验中，第77天(从第2次致敏起7天后)给药组与非给药组的血清中Der f 2 特异性IgE浓度之差最大，判断是受试物质的效果最大的时间点，但给药组的08-43的血清中Der f 2特异性IgE浓度突出地高达组平均的2倍以上，判断受试物质的效果没有体现，所以将其除外，使用其他的混合血清。非给药组使用其中所有只的混合血清。另外，为了比较IgE的功能，将非给药组的血清中Der f 2特异性IgE调制至与给药组相同的浓度后使用。
实施例1中采集的血清和健康犬血清
血清1：非给药组第77天的混合血清(用生理盐水调制成与血清2中的Der f 2特异性IgE浓度相等)
血清1的制备如下进行。给药组(除08-43之外的3只)的血清中Der f 2特异性IgE浓度的平均值为1352.3ng/mL，非给药组(4只)的平均值为2879.3ng/mL。用生理盐水稀释非给药组的混合血清调制成Der f 2特异性IgE浓度达到1352.3ng/mL。
血清2：给药组(08-43除外)第77天的混合血清
血清3：非给药组第77天的混合血清
血清4：10只健康犬的混合血清
将上述的血清1～血清4的血清用生理盐水稀释5倍和10倍，将得到的稀释血清作为用于研究最适条件的试剂。制备Der f 2 (批号3、1465μg/mL)作为抗原液(原液)。
(3) P-K试验供试犬
使用迄今为止没有Der f 2相关试验的供试经历的5～6岁龄的比格犬，2只雄犬(02-97和03-48)、1只雌犬(04-14)。在试验前，为了确认没有发生皮内给药的非特异性反应，用生理盐水(“动物用生食V注射液”：日本全药工业株式会社)稀释Der f 2调制成10μg/mL，将得到的0.05mL液体进行皮内给药，确认了没有发红。
(4) P-K试验的方法
(i) 血清的给予
在给予抗原液的2天前进行。对P-K试验供试犬臀部肌肉内给予盐酸美托咪啶(塩酸メデトミジン) (“ドミトール(注册商标)”：日本全药工业株式会社、0.03mL/kg)和咪达唑仑(ミダゾラム) (“ドルミカム(注册商标)”：山之内制药、0.06mL/kg)的混合物，进行镇静处置。用剃毛器剃去腹部侧面的毛，使用油性万能笔在给药部位作上记号。
使用B-D一次性微量注射筒(日本ベクトン?ディッキンソン株式会社)，以0.05mL×2处分别皮内给予上述的血清1～血清4的原液、5倍稀释和10倍稀释的血清(图7)。
对于给药结束的个体，在臀部肌肉内给予盐酸阿替美唑(塩酸アチパメゾール) (“アンチセダン(注册商标)”：日本全药工业株式会社、0.03mL/kg)，将其唤醒。
(ii) 抗原液的给药和判定
自给予血清起2天后，在给予血清的同一部位实施抗原液的皮内给药。镇静和唤醒处置与上述(i)同样进行。抗原液使用将Der f 2用生理盐水调制至10μg/mL和5μg/mL的液体，在(i)中的血清给药部位分别进行皮内给药。另外，在其他部位分别皮内给予作为阳性对照的组胺溶液(0.0275mg/mL)、作为阴性对照的生理盐水(图8)。
给予抗原液后，随时间多次计测发红部分的直径直至15分钟后，并拍摄照片。其中，肉眼判定发生了最明显发红的时间点。按照下述基准给发红打分。
发红直径打分基准
“+++”　　与阳性对照的发红直径同等或其以上；
“++”　　与阳性对照?阴性对照的平均同等或其以上；
“+”　　　小于阳性对照?阴性对照的平均且大于阴性对照；
“-”　　　阴性对照以下。
(iii) 最适条件的设定
为了设定研究给药组与非给药组之差的最适条件，在改变了血清稀释倍率和Der f 2溶液浓度的以下6种条件下进行。
血清原液+Der f 2　10μg/mL
血清原液+Der f 2　5μg/mL
血清5倍稀释液+Der f 2　10μg/mL
血清5倍稀释液+Der f 2　5μg/mL
血清10倍稀释液+Der f 2　10μg/mL
血清10倍稀释液+Der f 2　5μg/mL
其中，采用3只P-K试验供试犬中有2只以上满足以下基准的条件。
1) 健康犬的血清(血清4)的给药部位的分数为“-”。
2) 非给药组的血清(血清1和血清3)的给药部位的分数为“+”以上。
(5) 结果
结果见表1～6。
另外，在所拍摄的照片中作为代表的03-48的结果见图9。
[表1]
[表2]
[表3]
[表4]
[表5]
[表6]
在表1～6中，带圆圈的数字的1～4分别显示血清1～血清4。
(i) 最适条件的设定
将6种条件下的结果与上述(4)之“(iii)最适条件的设定”中所示的基准进行对照。
1) 健康犬的血清(血清4)的给药部位的分数为“-”。
6种条件均符合。
2) 非给药组的血清(血清1和血清3)的给药部位的分数为“+”以上。
符合“血清原液+Der f 2　10μg/mL”(表1)、“血清原液+Der f 2　5μg/mL”(表2)、“血清5倍稀释液+Der f 2　10μg/mL”(表3)这3种条件。
而且，在“血清原液+10μg/mL的Der f 2”的条件下，3只P-K试验供试犬在血清1和血清2的分数上均无差别，虽然原因尚不明确，但该条件是血清原液和抗原液(Der f 2 10μg/mL)的高浓度之间的组合，还有可能非特异性地发红，判断有可能无法进行适当的评价，所以也将该条件舍弃。
因此，对“血清原液+Der f 2　5μg/mL”、“血清5倍稀释液+Der f 2　10μg/mL”这两种条件进行结果的考察。
(ii) 血清原液+Der f 2　5μg/mL的结果(表2)
在02-97和03-48中，血清1和血清3均为“+”以上的分数，血清2和血清4的分数为“-”。在04-14中，血清1～血清4的分数均为“-”。
(iii) 血清5倍稀释液+Der f 2　10μg/mL的结果(表3)
在02-97和03-48中，血清1和血清3的分数为“++”，血清2和血清4的分数为“-”。在04-14中，血清1的分数为“++”，血清2～血清4的分数为“-”。
(6) 考察
在“血清原液+Der f 2　5μg/mL”的条件下，3只P-K试验供试犬中有2只的血清1(非给药组的血清)给药部位的分数为“++”、血清2(给药组的血清)给药部位的分数为“-”，而在“血清5倍稀释液+Der f 2　10μg/mL”的条件下3只均为上述结果。在具有相同浓度的Der f 2特异性IgE的血清1和血清2中产生分数差的理由见图5。在血清1的给药部位，所给予的IgE以较高频率与存在于P-K试验供试犬皮肤中的肥大细胞结合，所以建立了基于Der f 2的IgE的交联，发生了肥大细胞的脱颗粒，但在血清2的给药部位，由于IgG与IgE的CH3区结合，所以妨碍了IgE与肥大细胞结合，因此认为难以建立基于Der f 2的IgE的交联，有可能不发生反应(图10)。
另外，在P-K试验供试犬中，04-14在“血清原液+Der f 2　10μg/mL”的条件下仅血清3显示出发红、在“血清5倍稀释液+Der f 2　10μg/mL”的条件下仅血清1显示出发红，在其他4种条件下完全没有确认到发红。由此可知：04-14的皮肤发红反应较其他个体弱。
由以上的结果可知：在给予了由小鼠CH3-4-17-11构成的IgE肽疫苗的犬中，在血清中产生了交叉识别肽和犬IgE的IgG，妨碍了IgE与肥大细胞的结合。
实施例4
将实施例2中使用的2mL 250μg/mL的肽(总计500μg)和等量的完全佐剂混合(总计4mL)，在第0天、第2周、第4周、第6周、第8周以500μg的肽量对兔进行皮下给药，进行免疫。在第8周的给药后，5周后采血(第0天～第13周)，再从第0天～第14周进行加强免疫，在其后的2周后采血(第0天～第16周)。通过ELISA测定所采集的血液中的抗体效价。使用没有给予肽的兔血清作为对照。
ELISA按照下述方法进行。将1000μg/mL的犬IgE、人IgE、小鼠IgE、犬IgG和猫IgE的重组CH3的各溶液以100μL/孔进行固相化(100ng/孔)。使用从上述的进行了免疫的兔中采集的血清作为一次抗体，(×200～×102400)，使用酶标记抗兔IgG抗体(ZYMED公司)作为二次抗体。
图11-1显示犬IgE的结果，图11-2显示犬IgG的结果，图11-3显示小鼠IgE的结果，图11-4显示人IgE的结果，图11-5显示猫CH3的结果。
使用犬IgG作为固相化抗原时，与给予了肽的兔血清、未给予肽的兔血清均未发生反应。使用犬IgE、人IgE、小鼠IgE和猫IgE作为固相化抗原时，与给予了肽的兔血清发生了反应，但与未给予肽的兔血清没有发生反应。
由本实施例的结果判明：本发明的肽对于广泛品种的动物种均可用作肽疫苗。
实施例5　各种肽的疫苗效果的研究
到实施例4为止的试验中，认为肽序列(QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT：SEQ ID NO: 27、M 4-17-11)较为重要。
为了进一步缩小序列，合成了以下的肽。这些肽是从N末端和C末端消除了10个残基的肽的20种肽。用其对大鼠进行免疫，评价对于犬IgE的抗体应答。
合成的肽(最初的括号内的数字显示肽编号)：
(1)　QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSI(SEQ ID NO: 29)
(2)　QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTS(SEQ ID NO: 31)
(3)　QEKKTSVSASQWYTKHHNNATT(SEQ ID NO: 34)
(4)　QEKKTSVSASQWYTKHHNNAT(SEQ ID NO: 38)
(5)　QEKKTSVSASQWYTKHHNNA(SEQ ID NO: 43)
(6)　QEKKTSVSASQWYTKHHNN(SEQ ID NO: 49)
(7)　QEKKTSVSASQWYTKHHN(SEQ ID NO: 56)
(8)　QEKKTSVSASQWYTKHH(SEQ ID NO: 64)
(9)　QEKKTSVSASQWYTKH(SEQ ID NO: 72)
(10)　QEKKTSVSASQWYTK(SEQ ID NO: 82)
(11)　EKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 30)
(12)　KKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 33)
(13)　KTSVSASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 37)
(14)　TSVSASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 42)
(15)　SVSASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 48)
(16)　VSASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 55)
(17)　SASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 63)
(18)　ASQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 71)
(19)　SQWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 81)
(20)　QWYTKHHNNATTSIT(SEQ ID NO: 92)
供试动物：
使用大鼠(wistar-ST/7周/雌性)，将40只大鼠分成20组，每组2只。
免疫：
将合成的200μg (500μg/mL)肽(KLH缀合物)与等量的完全佐剂混合，以2周的间隔进行2次皮下给药。
评价方法：
从第2次免疫起2周后采集血清，通过ELISA评价抗犬IgE的IgG抗体。
ELISA的方案如下。
将犬IgE蛋白(BETHYL公司；P115)、小鼠IgE蛋白(BD Bioscienses, San Jose, CA, USA)、人IgE蛋白(Athens Research And Technology公司；16-16-090705-ML)用固相化缓冲液(0.05M的碳酸缓冲液 pH9.6)调制至1μg/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.2ng/mL、15.6ng/mL、7.8ng/mL、3.9ng/mL、1.95ng/mL、0.97ng/mL，在ELISA板的每孔中添加100μL，在4℃下放置一夜。固相化板用0.05%的PBS-T清洗1次，每孔中添加200μL封闭液(4×Block Ace 雪印乳液公司：UK-B80)，在37℃下培养1.5小时，进行封闭。血清用稀释液(PBS-T: Block Ace=9:1)稀释2000倍后使用。同样地稀释未免疫的大鼠血清，将其用作阴性对照。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，将作为二次抗体的HRP标记抗大鼠IgG抗体(invitrogen公司619520)用稀释液稀释至2000倍，添加100μL。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，以100μL/孔向板中添加底物液(在枸橼酸缓冲液中加入1片TMBZ片(Sigma公司：T-3405)，临使用前再加入2μL 30%的H2O2而得到的溶液)，反应10分钟，以50μL/孔加入2N的硫酸，使反应停止。之后，使用酶标仪(BIO-RAD：型号680)进行测定(dual：测定450nm、对照570nm)。
结果：
结果见图12-1。图12-1A显示上述的20种肽中No.1～10的肽的结果，图12-1B显示No.11～20的肽的结果。图12-1A和B的下方显示使用的肽的序列。图12-1A和B上方的曲线的纵轴显示OD值，横轴显示已固相化的犬IgE的量。另外，图12-2～12-6显示用各肽进行了免疫的大鼠的血清稀释了100倍时的反应性(SEQ ID NO: 27、进行了免疫的肽本身、犬IgE、小鼠IgE、人IgE)。图12-2显示肽编号1～4(图中分别为A～D)的结果、图12-3显示肽编号5～8(图中分别为A～D)的结果、图12-4显示肽编号9～12(图中分别为A～D)的结果、图12-5显示肽编号13～16(图中分别为A～D)的结果、图12-6显示肽编号17～20(图中分别为A～D)的结果。在100倍稀释的高浓度下，即使用任一种肽进行免疫，在血清中均可确认到产生了抗IgE的IgG抗体。在图12-2～12-6中，CH3-4-17-11肽是包含SEQ ID NO: 27所表示的氨基酸序列的肽。
如图12-1～12-6所示，消除N末端时，对于犬IgE的抗体应答变弱，由此认为：N末端侧包含认为是重要的序列。
实施例6　使用大鼠的静脉给药试验
根据实施例5的结果，合成了从SEQ ID NO: 27 (QEKKTSVSASQWYTKHHNNATTSIT)的N末端侧消除了2个残基、从C末端侧消除了3个残基的20残基的肽。
新合成的肽序列(肽名称：M4-7-11)为KKTSVSASQWYTKHHNNATT (SEQ ID NO: 45)。
在没有佐剂的情况下用其对大鼠进行免疫，评价对于犬IgE的抗体应答。
供试动物：
使用大鼠(wistar-ST/7周/雌性)，将20只大鼠分成4组，每组4只(图13)。
免疫：
将肽M4-7-11 (KKTSVSASQWYTKHHNNATT) (SEQ ID NO: 45) (没有KLH缀合物)用生理盐水调整至1mg/mL、500μg/mL、100μg/mL、50μg/mL的浓度，以2周的间隔进行3次静脉给药，每次给药1mL。
评价方法：
从给药开始日起每2周进行采血，从第3次免疫开始直至8周后进行采血。采集血清，通过ELISA评价抗犬IgE的IgG抗体(图13)。
用于测定抗犬IgE的IgG的ELISA方法与实施例6相同。
针对房尘螨变应原(ハウスダストマイトアレルゲン) Der f 2的IgE的测定按照下述方法进行。
使用固相化缓冲液(0.05M的碳酸缓冲液 pH9.6)将Der f 2调制至1μg/mL，在ELISA板的每孔中添加100μL，在4℃下放置一夜。固相化板用0.05%的PBS-T清洗1次，每孔中添加200μL封闭液(4×Block Ace 雪印乳液公司：UK-B80)，在37℃下培养1.5小时，进行封闭。血清用稀释液(PBS-T: Block Ace=9:1)稀释20倍后使用。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，将作为二次抗体的抗大鼠IgE抗体(兔抗大鼠IgE HRP; invitrogen公司 61-9520)用稀释液稀释至1000倍，添加100μL。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，以100μL/孔向板中添加底物液(在枸橼酸缓冲液中加入1片TMBZ片(Sigma公司：T-3405)，临使用前再加入2μL 30%的H2O2而得到的溶液)，反应10分钟，以50μL/孔加入2N的硫酸，使反应停止。之后，使用酶标仪(BIO-RAD：型号680)进行测定(dual：测定450nm、对照570nm)。
结果：
结果见图14。图14A显示大鼠IgG抗体随时间的上升，在图14B中注射器的图显示此时给予肽。图14B显示IgE抗体效价。如图14所示，在所有组中均确认到抗犬IgE的IgG抗体的上升。
图14B显示最后一天(从第3次的疫苗给药日起8周后)的大鼠血清中抗犬IgE的IgG抗体效价。在所有组中抗体效价均上升至3000倍。
实施例7　使用大鼠的皮下给药试验
在实施例6中，由于通过50μg的3次给药确认到抗犬IgE的抗体的上升、又由于是静脉给药，所以为了确认通过容易进行给药的皮下给药抗体是否上升，设定了皮下给药试验。
进行了免疫的肽序列(肽名称：M4-7-11)为KKTSVSASQWYTKHHNNATT (SEQ ID NO: 45)。
在没有佐剂的情况下用其对大鼠进行免疫，评价对于犬IgE的抗体应答。
供试动物：
使用大鼠(wistar-ST/7周/雌)，将12只分成3组，每组4只(图15)。
在本实施例中，进行了预防实验。预防实验是指，在给予疫苗后，用房尘螨抗原(ハウスダストマイト抗原) (Der f 2)和Alum佐剂一同进行免疫使IgE上升，评价抑制IgE上升的方法(图16)。
免疫：
使用生理盐水将肽M4-7-11(KKTSVSASQWYTKHHNNATT(SEQ ID NO: 45))(没有KLH缀合物)调整至50μg/mL的浓度，以2周的间隔进行3次静脉和皮下给药，每次给药1mL。
评价方法：
从给药开始日起每2周进行采血，从第3次免疫起4周内以1周的间隔将房尘螨抗原(Der f 2：50μg)和Alum佐剂(2.5mg：SIGMA公司)一起进行4次腹腔给药。从第4次致敏起2周后只将50μg的Der f 2进行腹腔给药。之后进行采血。采集血清，通过ELISA评价抗犬IgE的IgG抗体(图16)。ELISA的方法与实施例5相同。
结果：
抗犬IgE的大鼠IgG抗体的上升确认结果见图17。图17A显示大鼠IgG抗体随时间的上升，在图17A中，注射器的图显示在该时间点给予肽。图17B显示IgE抗体效价。如图17所示，通过肽疫苗(M4-7-11)的静脉和皮下给药，确认到了抗犬IgE的大鼠IgG抗体的上升。
另外，各组的每个个体的数据见图18。图18A、B和C分别显示1组、2组和3组的结果。
而且，Der f 2特异性IgE测定的结果(各组的平均值)见图19，每个个体的结果见图20。图20A、B和C分别显示1组、2组和3组的结果。如图19和20所示，在肽疫苗(M4-7-11)的静脉和皮下给药中，与对照组(生理盐水)相比，确认到了IgE的产生抑制。在皮下给药组(2组)中，明显确认到了IgE的产生抑制。
实施例8　使用犬的试验(其一)
通过使用大鼠的皮下给药试验，确认到了抗犬IgE的IgG抗体的上升，因此实施了使用犬的试验。
使用生理盐水将肽(M4-7-11)调整至2mg/mL的浓度，分别注入每500μL，将其作为疫苗。肽的纯度为98.1%，其合成依赖于北海道システムバイオサイエンス公司。确认了在疫苗中没有混入内毒素。疫苗的给药方法是每次皮下给药1mg，以2周为间隔给药5次。在这次的试验中，还实施了疫苗给药次数的研究。
试验方法：
犬：使用4只健康比格犬(8月龄、雄性2只、雌性2只)。
疫苗：只使用M4-7-11肽，没有缀合物。
给药方法：每次给药1mg(2mg/mL，500μL)，以2周为间隔皮下给药5次。
评价：约1周采集血清一次，通过ELISA测定抗人IgE的IgG抗体。由于犬IgE非特异性地与抗犬IgG抗体反应，所以在ELISA中使用不存在非特异性反应的人IgE。
试验明细表见图21。
ELISA法如下。
使用固相化缓冲液(0.05M的碳酸缓冲液 pH9.6)将人IgE(Athens Research And Technology公司：IgE，人骨髓瘤血浆)调制至1μg/mL，在ELISA板的每孔中添加100μL，在4℃下放置一夜。固相化板用0.05%的PBS-T清洗1次，每孔添加200μL封闭液(4×Block Ace 雪印乳液公司：UK-B80)，在37℃下培养1.5小时，进行封闭。血清用稀释液(PBS-T: Block Ace=9:1)稀释1000倍后使用。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，将作为二次抗体的抗犬IgG抗体(绵羊抗犬IgG HRP、BETHYL公司:A40-118P)用稀释液稀释至2000倍，添加100μL。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，以100μL/孔向板中添加底物液(在枸橼酸缓冲液中加入1片TMBZ片(Sigma公司：T-3405)，临使用前再加入2μL 30%的H2O2而得到的溶液)，反应10分钟，以50μL/孔加入2N的硫酸，使反应停止。之后，使用酶标仪(BIO-RAD：型号680)进行测定(dual：测定450nm、对照570nm)。
需要说明的是，在IgE特异性IgG浓度的测定中，若在ELISA的固相化抗体中使用犬IgE，则有时二次抗体的犬IgG特异性多克隆抗体还与固相化抗体结合，并发生非特异性反应，所以使用人IgE作为固相化抗体。
结果：
对犬皮下给予肽疫苗(M4-7-11)时，通过ELISA实施抗IgE的IgG抗体的产生评价的结果见图22。在图22中，注射器的图显示在该时间点给予肽。如图22所示，通过给予疫苗，在犬中确认到抗IgE的IgG抗体的上升。而且，暗示给药次数在4次以下足以。
实施例9　使用犬的试验(其二)
通过实施例8，对4只犬给予疫苗(M4-11-17)，确认了抗IgE的IgG抗体的上升。为了确认重现性，使用包括对照组(生理盐水)在内的8只犬进行试验。另外，这次使用的犬是2岁以上的成犬。
试验方法如下。
犬：使用8只健康比格犬(24月龄、雄性4只、雌性4只)。
疫苗：只使用M4-7-11肽，没有缀合物。
给药方法：每次给药1mg(2mg/mL，500μL)，以2周为间隔皮下给药5次。
评价：约1周采集血清一次，通过ELISA测定抗人IgE的IgG抗体。由于犬IgE非特异性地与抗犬IgG抗体反应，所以在ELISA中使用不存在非特异性反应的人IgE。试验明细表见图23。ELISA的方法与实施例8相同。
结果：
对犬皮下给予肽疫苗(M4-7-11)时，通过ELISA实施抗IgE的IgG抗体的产生评价的结果见图24。图24A显示将肽作为疫苗进行给药的组与对照组的平均抗体效价。图24B和图24C分别显示疫苗给药组和对照组(非给药组)的各个体的抗体效价。
如图24所示，通过给予疫苗，在犬中确认到抗IgE的IgG抗体的上升。另外，与实施例8一样，在成犬中也进行了确认。而且，再次确认了给药次数在4次以下足以。
实施例10　使用人工致敏犬的治疗实验
在实施例8和9中，使用健康犬，通过肽疫苗(M4-7-11)的皮下给药，确认了抗IgE的IgG抗体的产生，所以使用粉尘螨人工致敏犬进行治疗实验。
试验方法如下。
试验方法：
犬：使用8只人工致敏比格犬(1岁～8岁、雄性4只、雌性4只)。8只比格犬的年龄和编号如下。
8岁龄：04-78(给药组)、04-95(给药组)、04-60(对照组)；
5岁龄：08-64(给药组)；
4岁龄：09-63(对照组)；
2岁龄：10-70(对照组)；
1岁龄：11-12(给药组)、11-40(对照组)。
人工致敏：将400μg粉尘螨抗原(GREER公司)和1mgAlum佐剂(LSL公司)以2周的间隔进行皮下给药，通过ELISA确认抗粉尘螨抗原的IgE。
分组：根据ELISA的IgE的结果，分成2组，每组4只，使IgE值均等、并且年龄均等。
疫苗：只使用M4-7-11肽，没有缀合物。
给药方法：每次给药1mg(2mg/mL、500μL)，以2周为间隔皮下给药5次。
评价：采集血清，通过ELISA测定抗人IgE的IgG抗体。由于犬IgE非特异性地与抗犬IgG抗体发生反应，所以在ELISA中使用不存在非特异性反应的人IgE。另外，通过ELISA评价抗粉尘螨的IgE抗体。
试验明细表见图25。
ELISA法如下。
抗IgE的IgG测定方法与实施例8和9相同。
抗粉尘螨抗原的犬IgE的测定方法如下。
使用固相化缓冲液(0.05M的碳酸缓冲液 pH9.6)将粉尘螨(Dermatophagoides farinae)抗原调制至5μg/mL，在ELISA板的每孔中添加100μL，在4℃下放置一夜。固相化板用0.05%的PBS-T清洗1次，每孔添加200μL封闭液(4×Block Ace 雪印乳液公司：UK-B80)，在37℃下培养1.5小时，进行封闭。血清用稀释液(PBS-T: Block Ace=9:1)稀释20倍后使用。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，将作为二次抗体的抗犬IgE抗体(山羊抗犬IgE HRP、BETHYL公司：A40-125P)用稀释液稀释至2000倍，添加100μL。在37℃下反应1.5小时，用0.05%的PBS-T清洗3次，以100μL/孔在板中添加底物液(在枸橼酸缓冲液中加入1片TMBZ片(Sigma公司：T-3405)，临使用前再加入2μL 30%的H2O2而得到的溶液)，反应10分钟，以50μL/孔加入2N的硫酸，使反应停止。之后，使用酶标仪(BIO-RAD：型号680)进行测定(dual：测定450nm、对照570nm)。
结果：
对犬皮下给予肽疫苗(M4-7-11)时，通过ELISA实施抗IgE的IgG抗体的产生评价的结果见图26。图26A显示将肽作为疫苗进行给药的组和对照组的平均抗体效价。图26B和图26C分别显示疫苗给药组和对照组(非给药组)的各个体的抗体效价。如图26所示，通过给予疫苗，和试验4和试验5一样，使用犬在成犬的人工致敏犬中确认到了抗IgE的IgG抗体的上升。而且，迄今为止同样确认了给药次数在4次以下足以。
粉尘螨抗原特异性IgE的ELISA测定结果见图27。图27A显示将肽作为疫苗进行给药的组和对照组的平均抗体效价。图27B和图27C分别显示疫苗给药组和对照组(非给药组)的各个体的抗体效价。如图27所示，在疫苗(M4-7-11)给药组的1只犬(04-95)中，确认到血清中的IgE减少。由此认为：通过给予疫苗(M4-7-11)，有可能使血清中的IgE减少。
产业实用性
本发明的小鼠IgE的部分肽可以用作用于预防或治疗动物的IgE介导性变态反应性疾病的药物。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考而纳入本说明书。

Claims (11)

1.肽，该肽包含下述的氨基酸序列：
(i) SEQ ID NO: 28所表示的氨基酸序列、或
(ii) 包含SEQ ID NO: 28所表示的氨基酸序列中的连续的至少10个氨基酸的氨基酸序列，
对动物给予该肽时，该肽与该动物的IgE抗体的CH3区特异性结合，能够阻止上述IgE抗体与IgE受体结合。
2.权利要求1所述的肽，该肽包含下述的氨基酸序列：
(i) SEQ ID NO: 27所表示的氨基酸序列、或
(ii) 包含SEQ ID NO: 27所表示的氨基酸序列中的连续的至少10个氨基酸的氨基酸序列，
对动物给予该肽时，该肽与该动物的IgE抗体的CH3区特异性结合，能够阻止上述IgE抗体与IgE受体结合。
3.权利要求1所述的肽，该肽包含选自SEQ ID NO: 22、23、24、25和26的氨基酸序列。
4.权利要求2所述的肽，该肽包含选自SEQ ID NO: 29～92的氨基酸序列。
5.权利要求4所述的肽，该肽包含选自SEQ ID NO: 29、31、34、38、43、49、56、64、72、82、30、33、37、42、48、55、63、71、81和92的氨基酸序列。
6.权利要求4所述的肽，该肽包含SEQ ID NO: 45所表示的氨基酸序列。
7.肽，该肽包含权利要求1～6中任一项所述的肽的氨基酸序列中有1～3个氨基酸被缺失、取代、添加而获得的氨基酸序列，对动物给予该肽时，该肽与该动物的IgE抗体的CH3区特异性结合，能够阻止上述IgE抗体与IgE受体结合。
8.IgE介导性疾病用疫苗或治疗药，其中包含权利要求1～7中任一项所述的肽。
9.权利要求8所述的疫苗或治疗药，其中，IgE介导性疾病选自特应性皮炎、花粉病、食物过敏、过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性结膜炎、螨过敏性疾病、荨麻疹、过敏性休克和肺嗜酸性粒细胞浸润综合征。
10.预防或治疗IgE介导性疾病的方法，该方法包括：对非人动物给予包含权利要求1～7中任一项所述的肽的IgE介导性疾病用疫苗或治疗药。
11.权利要求10所述的预防或治疗IgE介导性疾病的方法，其中，IgE介导性疾病选自特应性皮炎、花粉病、食物过敏、过敏性鼻炎、支气管哮喘、过敏性结膜炎、螨过敏性疾病、荨麻疹、过敏性休克和肺嗜酸性粒细胞浸润综合征。
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