CN101965403A

CN101965403A - A型肉毒杆菌毒素中和组合物及人抗a型肉毒杆菌毒素抗体

Info

Publication number: CN101965403A
Application number: CN2009801071001A
Authority: CN
Inventors: 东成见; 高桥元秀; 小崎俊司; 向本雅郁; 幸田知子; 黑泽仁; 黑泽良和
Original assignee: INST ANTIBODIES CO Ltd; National Institute of Infectious Diseases; Osaka Prefecture University PUC
Current assignee: Medical and Biological Laboratories Co Ltd; National Institute of Infectious Diseases
Priority date: 2008-01-29
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2011-02-02
Anticipated expiration: 2029-01-23
Also published as: CN101965403B; EP2246426A1; WO2009096162A1; US8540987B2; JPWO2009096162A1; JP5432727B2; US20110014211A1; EP2246426A4

Abstract

本发明的课题在于提供一种对于肉毒杆菌中毒疾病和其中毒发病的预防有效的方法。本发明提供表位不同的多种人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。另外，本发明还提供将它们组合的、中和活性高的A型肉毒杆菌毒素中和组合物。

Description

A型肉毒杆菌毒素中和组合物及人抗A型肉毒杆菌毒素抗体

技术领域

本发明涉及对于A型肉毒杆菌毒素具有结合活性且具有完全人可变区的基因重组抗体、编码该抗体的核酸分子、生产该抗体的转化体、使用该转化体的抗体制备方法以及使用该抗体的A型肉毒杆菌毒素中和组合物等。

背景技术

肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生的毒素根据血清型的不同分类为A型～G型。A、B、E、F型毒素对人健康有重大影响。在人的肉毒杆菌中毒疾病中，有“食物性肉毒杆菌病(肉毒杆菌食物中毒)”、“婴儿肉毒杆菌病”、“创伤型肉毒杆菌病”和“感染型肉毒杆菌病”4种。A型毒素与肉毒杆菌食物中毒的26％有关。A型毒素与肉毒杆菌食物中毒的26％有关。B和E型次之，F型毒素与肉毒杆菌食物中毒的相关比例比较低。另外，有报告创伤型肉毒杆菌中毒只由A型或B型毒素引起(非专利文献1)。

成人的肉毒杆菌食物中毒通常为，菌或芽孢在食品中增殖，结果产生的毒素经口摄取而发病，另一方面，在新生儿肉毒杆菌病中，在蜂蜜等的食品中存在的菌或芽孢经口摄取，结果菌在肠管发育、增殖，并产生毒素，由此引起中毒症状。食物中毒的原因毒素根据国家的不同而异，但有报告A型、B型和E型引起的病例。另外，婴儿肉毒杆菌病的一大半是A型、B型，但也有报告C.butiricum引起的E型毒素、引起的F型毒素。

肉毒杆菌毒素是重链和轻链S-S键合(二硫键)的结构的分子。肉毒杆菌毒素阻滞向肌肉的神经传递，由此引起弛缓性麻痹。如果肉毒杆菌毒素进入气道、呼吸肌，则引起致死性的呼吸障碍。肉毒杆菌中毒导致的死亡率为12％，在特定的危险人群中，死亡率更高(非专利文献3)。

另一方面，由于肉毒杆菌毒素作为生物学毒素是致死性最高的毒素(纯化的A型毒素对70kg的人的致死量为，静注或肌肉注射时为0.09-1.5μg，在吸入时为0.70-0.90&micro；g，经口时为70μg(JAMA.2001Feb28；285(8)：1059-70)，因此除了通常的中毒以外，具备用于生物恐怖的特殊性，在社会上也受到广泛关注。

作为对于肉毒杆菌毒素的中和剂，在日本得到批准的物质是以马血清为原材料的制剂。该制剂为源自马血清的球蛋白，即由于对人是以异种蛋白作为主成分，因此存在引起过敏反应等的免疫反应的危险性。另外，还存在未知病毒感染、血清病的问题。而且，也难以稳定地供给。进而，该制剂的制备需要1年以上，因此存在难以应对生物恐怖等非常时期的情况。此外，由于马的饲养管理存在问题，因此该制剂不适用于储备目的。

对于婴儿肉毒杆菌病，为了避免过敏反应等的严重的副作用，现实情况是不进行利用该马球蛋白制剂的治疗。在美国，利用由使健康人对肉毒杆菌类毒素免疫而得到的中和抗体效价高的血浆调制的人球蛋白制剂，进行对于婴儿肉毒杆菌病的特异性治疗。实际上，“BabyBIG”的商品名下，以婴儿肉毒杆菌病为对象的药品在美国FDA是作为罕用药而批准制造许可的。但是，该方法除了伦理上的问题以外，还存在得到原材料、生物危害的问题，而且从确保安全性的观点考虑，有在制造时必须进行各种病毒检查这样的问题等。另外，在日本，该制剂未得到批准，不能使用。

有报告成功制作对于A型毒素的重组中和嵌合体抗体(专利文献1).但是，在使用该抗体时，必须解决HACA(人抗嵌合体抗体)出现的问题、过敏反应等的问题。

另一方面，在美国，特别是从具备生物恐怖威胁的角度考虑而进行毒素中和的研究开发，尝试由对肉毒杆菌毒素五聚物免疫的人的B淋巴细胞制作噬菌体抗体文库，由其中选择期望的完全人中和抗体的方法。但是，对于A型病毒，没有成功取得单独发挥充分的中和活性的抗体克隆。因此，通过在由噬菌体呈现筛选的结果得到的1种人抗体中，混合源自XENO小鼠的克隆1种，进而混合将通过小鼠免疫得到的小鼠抗体人化得到的抗体(寡克隆化)，从而必须使中和活性强化，尚未达到期望的目的，即通过完全人中和抗体引起的毒素中和(专利文献2、3，非专利文献4、5、6)。

专利文献1：日本特开2006-311857号公报

专利文献2：国际公开第2005/016232号小册子

专利文献3：国际公开第2007/094754号小册子

非专利文献1：H.Sugiyama，Microbiol.Rev.44：419，1980

专利文献2：S.Arnon，Epidemiol.Rev.3：45，1981

非专利文献3：C.O.Tacket et al.，Am.J.Med.76：794，1984

非专利文献4：P.Amersdorfer et al.，Infect.Immun.65(9)：3743，1997

非专利文献5：P.Amersdorfer et al.，Vaccine 20：1640，2002

非专利文献6：A.Nowakowski et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99(17)：11346，2002

发明内容

本发明鉴于以上的背景，提供中和A型肉毒杆菌毒素的有效的组合物，从而解决以往技术中的各种问题(过敏反应，异种蛋白、病毒的混入等)。另外，鉴于在现有的重组抗体的检测法中难以客观地评价中和活性的情况，本发明的课题还在于，作为其它方面，在提供A型肉毒杆菌毒素中和组合物时，通过适合于国际标准的数值表示中和活性。

本发明人首先仿效现有技术，构建人噬菌体抗体文库，尝试分离特异性识别肉毒杆菌毒素A的抗体克隆。在重复实施筛选时，可知虽然通过每次筛选选择多个抗体克隆，但反复选择表位相同的抗体。对于产生该现象的原因进行研究，结果认为，存在抗原性极高的表位，其引起表位的重叠。依据该假设，将该表位封闭是用于有效地取得表位不同的抗体的有效方法。因此，确立了以下的策略：通过添加用多次筛选重复取得的抗体的片段，将抗原性强的表位封闭(遮蔽)以后，使噬菌体抗体文库与肉毒杆菌A型毒素反应。通过依照该策略再次实施筛选，成功取得表位不同的多个抗体克隆。对成功取得的各抗体的表位进行分析，结果根据表位的不同，分类为4种。即，判明成功取得与4个表位相关的特异性抗体克隆。

接着，依据国际标准(以日本药局法在医药品各条记录的生物学制剂医药品中记载的“干燥肉毒杆菌马抗毒素(干燥肉毒杆菌抗毒素)”项3.2.7“效价试验”为基准)，进行比较和评价将这些抗体3种或4种组合时的中和活性。结果发现，作为提供高中和活性的抗体克隆的组合，有3种抗体克隆的组合。另外，表明如果进一步组合1种抗体克隆，则中和活性提高。

以上，本发明人成功取得多个对于A型肉毒杆菌毒素具有高中和活性的抗体克隆，同时明确被该抗体识别的4种表位与中和活性的关系。本发明主要基于这些成果，如下所示。

[1]A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其含有：

识别具有由序列编号4的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号8的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体的表位的第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体，

识别具有由序列编号36的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号40的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体的表位的第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体，和

识别具有由序列编号44的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号48的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体的表位、或者具有由序列编号52的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号56的基酸序列构成的轻链可变区的抗体的表位的第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。

[2]根据[1]所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是选自下述(1)～(3)中任一种的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是下述(4)或(5)的抗体，

第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是选自下述(6)～(8)中任一种的抗体：

(1)具有由序列编号1的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号2的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号3的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号5的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号6的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号7的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体；

(2)具有由序列编号9的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号10的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号11的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号13的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号14的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号15的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体；

(3)具有由序列编号17的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号18的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号19的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号21的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号22的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号23的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体；

(4)具有由序列编号25的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号26的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号27的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号29的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号30的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号31的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体；

(5)具有由序列编号33的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号34的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号35的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号37的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号38的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号39的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体；

(6)具有由序列编号41的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号42的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号43的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号45的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号46的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号47的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体；

(7)具有由序列编号49的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号50的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号51的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号53的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号54的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号55的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体；

(8)具有由序列编号57的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号58的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号59的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号61的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号62的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号63的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体。

[3]根据[2]所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是选自所述(1)～(3)中任一种的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(4)或(5)的抗体，

第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(6)的抗体，

进一步含有所述(7)或(8)的抗体作为第4人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。

[4]根据[2]所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，

第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(1)的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(5)的抗体，

第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(6)的抗体。

[5]根据[4]所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，进一步含有所述(7)的抗体作为第4人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。

[6]根据[2]所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，

第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(1)的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(5)的抗体，

第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(7)的抗体。

[7]根据[6]所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，进一步含有所述(4)的抗体作为第4人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。

[8]根据[2]～[7]任一项所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，

所述(1)的抗体的重链可变区具有序列编号4的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号8的氨基酸序列，

所述(2)的抗体的重链可变区具有序列编号12的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号16的氨基酸序列，

所述(3)的抗体的重链可变区具有序列编号20的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号24的氨基酸序列，

所述(4)的抗体的重链可变区具有序列编号28的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号32的氨基酸序列，

所述(5)的抗体的重链可变区具有序列编号36的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号40的氨基酸序列，

所述(6)的抗体的重链可变区具有序列编号44的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号48的氨基酸序列，

所述(7)的抗体的重链可变区具有序列编号52的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号56的氨基酸序列，

所述(8)的抗体的重链可变区具有序列编号60的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号64的氨基酸序列。

[9]一种分离的人抗A型肉毒杆菌毒素抗体，其包含[2]规定的(1)～(8)中任一种的抗体。

[10]根据[9]所述的分离的人抗A型肉毒杆菌毒素抗体，其中，

[11]一种分离的核酸分子，编码[10]所述的抗体的重链可变区和/或轻链可变区。

[12]一种载体，保持[11]所述的核酸分子。

[13]一种转化体，用[12]所述的载体进行转化而得到的。

[14]一种人抗A型肉毒杆菌毒素抗体的制备方法，其包含：

培养[13]所述的转化体，生产人抗A型肉毒杆菌毒素抗体的工序，

回收培养上清液，由培养上清液纯化人抗A型肉毒杆菌毒素抗体的工序。

(用语)

为了方便说明，对于用于本说明书的用语的一部分，总结其定义如下所示。

在本说明书中，用语“包含～”或“包含～而成”用作也包括“由～构成”的意思的表达。因此，例如在记载“含有多个要素(构件)而构成的物质(或者方法)”时，作为其意思，也当然可考虑为“由该多个要素(构件)构成的物质(或者方法)”。

“分离”的意思是指，由其本来的环境(例如，为天然物质时是天然的环境)取出的状态，即，通过人为的操作，以与本来的存在状态不同的状体存在。

“分离的抗体”中不包括天然且未实施任何另外操作(人为操作)的抗体，即，不包括在某个个体体内产生，在其中停留状态的抗体。应予说明，分离的抗体典型的是不与其它种类的抗体混合存在的状态，即，单独(作为同种抗体的集合)存在。

对于“互补决定区(CDR)”，依据kabat等(参照Sequences of Proteinsof Immunological Interest，4th edition US Department of Health andHuman Services(1987))的定义。

“A型肉毒杆菌毒素中和组合物”是指，含有多种抗体作为有效成分，对于A型肉毒杆菌毒素表现出中和活性的药学上的混合物。

本发明中的“抗毒素效价”只要没有特别提及，以国际单位表示。“抗毒素效价”依据日本药局法在医药品各条记录的生物学制剂医药品中记载的“干燥肉毒杆菌马抗毒素(干燥肉毒杆菌抗毒素)”项3.2.7“效价试验”确定。

在本说明书中，根据需要，依据习惯使用以下简写(括号内)。

重链(H链)，轻链(L链)，重链可变区(VH)，轻链可变区(VL)，互补决定区(CDR)，互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)，互补决定区3(CDR3)，重链互补决定区1(VH CDR1)，重链互补决定区2(VH CDR2)，重链互补决定区3(VH CDR3)，轻链互补决定区1(VLCDR1)，轻链互补决定区2(VL CDR2)，轻链互补决定区3(VL CDR3)

附图说明

图1：抗体文库的构成。

图2：在筛选实验1取得的抗体的结合活性。将在对于无毒成分蛋白质的ELISA中表现出ABS492＜0.2的克隆作为阳性克隆(箭头)。

图3：以在筛选实验1取得的抗体为样本的中和试验(动物实验)的结果。表中的符号(+、-等)表示症状的强度。按±、+、++的顺序症状增强。

图4：在筛选试验2采用的、表位遮蔽法的概要。

图5：在筛选实验2取得的抗体的结合活性(图5下(4th))和在筛选实验3取得的抗体的结合活性(图5上(3rd-2))。

图6：在筛选试验3取得的抗体的氨基酸序列的比对。由上方开始依次为BT-058的VH序列(序列编号20)、BT-047的VH序列(序列编号12)、BT-015的VH序列序列编号4)、BT-058的VL序列(序列编号24)、BT-047的VL序列(序列编号16)、BT-015的VL序列(序列编号8)。

图7：在筛选实验4取得的抗体的结合活性。将在此所示的全部的抗体克隆作为阳性克隆。

图8：以在筛选实验4取得的抗体为样本的中和试验(动物实验)的结果。表中的符号(+、++等)表示症状的强度。按++、+++的顺序症状增强。d表示“小鼠死亡”。

图9：使用肉毒杆菌类毒素的筛选过程。

图10：在筛选实验5取得的抗体的结合活性。

图11：在筛选实验5取得的抗体的结合活性。

图12：在筛选实验6取得的抗体的结合活性。

图13：在筛选实验6取得的抗体的结合活性。

图14：以在筛选实验5和6取得的抗体为样本的中和试验(动物实验)的结果。表中的符号(+、++等)表示症状的强度。按±、+、++、+++的顺序症状增强。d表示“小鼠死亡”。

图15：使用神经毒素的筛选过程(神经毒素特异性抗体的浓缩)。

图16：在筛选实验1～6取得的抗体的氨基酸序列的比对。由上方开始依次为BT-175的VH序列(序列编号36)、NT-221的VH序列(序列编号28)、NT-320的VH序列(序列编号44)、NT-539的VH序列(序列编号60)、BT-015的VH序列(序列编号4)、NT-523的VH序列(序列编号52)、NT-320的VL序列(序列编号48)、NT-539的VL序列(序列编号64)、NT-221的VL序列(序列编号32)、BT-175的VL序列(序列编号40)、BT-015的VL序列(序列编号8)、NT-523的VL序列(序列编号56)。应予说明，与种系(Germline)的同源性也一并表示。

图17：利用Biacorel的结合常数分析的结果(样品为BT-015的Fab-PP型抗体)。

图18：利用Biacorel的结合常数分析的结果(样品为BT-015的IgG型抗体)。

图19：利用Biacorel的结合常数分析的结果(样品为BT-175的Fab-PP型抗体)。

图20：利用Biacorel的结合常数分析的结果(样品为BT-175的IgG型抗体)。

图21：利用Biacorel的结合常数分析的结果(样品为NT-221的Fab-PP型抗体)。

图22：利用Biacorel的结合常数分析的结果(样品为NT-320的Fab-PP型抗体)。

图23：利用Biacorel的竞争实验的结果(与BT-015的竞争)。表示BT-015与NT-221竞争。

图24：利用Biacorel的竞争实验的结果(与BT-175的竞争)。表示BT-175与NT-221竞争。

图25：利用Biacorel的竞争实验的结果(与NT-221的竞争)。由于NT-539在250秒附近发生强噪音，因此删除该区域。

图26：利用Biacorel的竞争实验的结果(与NT-320的竞争)。

图27：利用Biacorel的竞争实验的结果(与NT-523的竞争)。表示NT-523与NT-539竞争。

图28：以5种抗体克隆(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523)为样品的中和试验的结果。表中的符号(+、++等)表示症状的强度。按+、++、+++的顺序症状增强。-表示“未发现症状”，d表示“小鼠死亡”。图29：利用ELISA的抗体的表位分析和对于毒素亚型A2毒素的反应性。更详细地分析6种中和抗体(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)的表位，另外，同时为了还确认对于作为其亚型的A2型的神经毒素(CHIBA-H)的反应性，使用下述抗原实施ELISA。每个克隆以表形式表示OD492nm处的值。

图30：利用免疫印迹法的表位分析。对于神经毒素(NT)和重链C末端侧的神经细胞结合区域(Hc，大肠杆菌重组体蛋白质)，利用免疫印迹法进行表位分析，示出其结果。对于各抗体克隆，稀释到2种浓度(50μg/ml(实线的泳道)、5μg/ml(虚线的泳道))，使其反应。确认NT-523为Hc区域的一级结构。另一方面，在该实验中，对于其它抗体未检出条带。图31：利用免疫沉淀的表位分析。使用3种抗原(神经毒素、H链、L链)进行各克隆的免疫沉淀，进行表位分析的结果。对照为直接将H链、L链进行上层电泳，使其与亲和纯化的兔抗A型肉毒杆菌神经毒素抗体(稀释1000倍)反应。BT-015、NT-523、NT-539识别H链(实线圆)、BT-175识别L链的可能性高(虚线圆)。另一方面，由该实验不能判断NT-221、NT-320识别H链和L链中的哪一个。

图32：总结表位分析的结果，分类6种抗体的表位的表。综合地判断表位分析的结果，在表的最下端总结抗体表位候补。应予说明，对于各克隆的结合性(表位候补)，与神经毒素具有结合性时用NT表示，具有H链结合性时用H表示，与H链C末端侧的神经细胞结合区域具有结合性时用Hc表示，与L链具有结合性时用L表示。(-)表示不能判断。

具体实施方式

本发明的第一方面涉及A型肉毒杆菌毒素中和组合物(以下，也称为“本发明的组合物”)。在本发明的组合物中，至少使用3种抗体。该3种抗体都是识别A型肉毒杆菌毒素的人抗体。在本说明书中，该3种抗体称为“第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体”、“第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体”、“第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体”。此外，为了方便说明，以下将“第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体”简称为“第1抗体”，将“第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体”简称为“第2抗体”，将“第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体”简称为“第3抗体”。

本发明人成功取得有效中和A型肉毒杆菌毒素的人抗体克隆(BT-015、BT-047、BT-058、NT-221、BT-175、NT-320、NT-523、NT-539)(参照实施例栏)。另外，成功取得的抗体克隆基于表位的异同，示出分类为4种。第1抗体为，对应于如果与其它抗体克隆组合使用则表现出有效中和A型肉毒杆菌毒素的抗体克隆BT-015的抗体，抗体克隆BT-015的特征在于，即识别“具有由序列编号4的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号8的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体”的表位。由于第1抗体的表位与抗体克隆BT-015的表位一致，因此如果使第1抗体和抗体克隆BT-015同时与A型肉毒杆菌毒素反应，则发现竞争。因此，作为第1抗体的适认性可以通过利用抗体克隆BT-015的竞争实验进行确认。

第2抗体为，对应于如果与其它抗体克隆组合使用则表现出有效中和A型肉毒杆菌毒素的抗体克隆BT-175的抗体，抗体克隆BT-175的特征在于，即识别“具有由序列编号36的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号40的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体”的表位。应予说明，对于作为第2抗体的适认性，可以与第1抗体的情况同样地进行确认。

第3抗体为，对应于如果与抗体克隆BT-015和抗体克隆BT-175组合使用则表现出有效中和A型肉毒杆菌毒素的抗体克隆(NT-320或NT-523)的抗体，抗体克隆NT-320的特征在于，即识别“具有由序列编号44的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号48的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体”的表位，另外，抗体克隆NT-523的特征在于，即识别“具有由序列编号52的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号56的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体”的表位。应予说明，对于作为第3抗体的适认性，可以与第1抗体的情况同样地进行确认。

在本发明的一个方式中，第1抗体是选自下述(1)～(3)中任一种的抗体。第2抗体是下述(4)或(5)的抗体。第3抗体是选自下述(6)～(8)中任一种的抗体。

(1)具有由序列编号1的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号2的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号3的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号5的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号6的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号7的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(2)具有由序列编号9的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号10的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号11的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号13的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号14的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号15的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(3)具有由序列编号17的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号18的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号19的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号21的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号22的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号23的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(4)具有由序列编号25的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号26的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号27的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号29的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号30的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号31的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(5)具有由序列编号33的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号34的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号35的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号37的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号38的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号39的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(6)具有由序列编号41的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号42的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号43的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号45的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号46的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号47的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(7)具有由序列编号49的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号50的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号51的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号53的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号54的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号55的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(8)具有由序列编号57的氨基酸序列构成的重链互补决定区1、由序列编号58的氨基酸序列构成的重链互补决定区2、由序列编号59的氨基酸序列构成的重链互补决定区3、由序列编号61的氨基酸序列构成的轻链互补决定区1、由序列编号62的氨基酸序列构成的轻链互补决定区2和由序列编号63的氨基酸序列构成的轻链互补决定区3的抗体

(1)对应于人抗体克隆BT-015，(2)对应于人抗体克隆BT-047，(3)对应于人抗体克隆BT-058，(4)对应于人抗体克隆NT-221，(5)对应于人抗体克隆BT-175，(6)对应于人抗体克隆NT-320，(7)对应于人抗体克隆NT-523，(8)对应于人抗体克隆NT-539。以下，表示各克隆的序列信息。

(BT-015)

VH CDR1：序列编号1

VH CDR2：序列编号2

VH CDR3：序列编号3

VH：序列编号4

VL CDR1：序列编号5

VL CDR2：序列编号6

VL CDR3：序列编号7

VL：序列编号8

(BT-047)

VH CDR1：序列编号9

VH CDR2：序列编号10

VH CDR3：序列编号11

VH：序列编号12

VL CDR1：序列编号13

VL CDR2：序列编号14

VL CDR3：序列编号15

VL：序列编号16

(BT-058)

VH CDR1：序列编号17

VH CDR2：序列编号18

VH CDR3：序列编号19

VH：序列编号20

VL CDR1：序列编号21

VL CDR2：序列编号22

VL CDR3：序列编号23

VL：序列编号24

(NT-221)

VH CDR1：序列编号25

VH CDR2：序列编号26

VH CDR3：序列编号27

VH：序列编号28

VL CDR1：序列编号29

VL CDR2：序列编号30

VL CDR3：序列编号31

VL：序列编号32

(BT-175)

VH CDR1：序列编号33

VH CDR2：序列编号34

VH CDR3：序列编号35

VH：序列编号36

VL CDR1：序列编号37

VL CDR2：序列编号38

VL CDR3：序列编号39

VL：序列编号40

(NT-320)

VH CDR1：序列编号41

VH CDR2：序列编号42

VH CDR3：序列编号43

VH：序列编号44

VL CDR1：序列编号45

VL CDR2：序列编号46

VL CDR3：序列编号47

VL：序列编号48

(NT-523)

VH CDR1：序列编号49

VH CDR2：序列编号50

VH CDR3：序列编号51

VH：序列编号52

VL CDR1：序列编号53

VL CDR2：序列编号54

VL CDR3：序列编号55

VL：序列编号56

(NT-539)

VH CDR1：序列编号57

VH CDR2：序列编号58

VH CDR3：序列编号59

VH：序列编号60

VL CDR1：序列编号61

VL CDR2：序列编号62

VL CDR3：序列编号63

VL：序列编号64

在优选的一个方案中，(1)的抗体的重链可变区具有序列编号4的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号8的氨基酸序列。对于(2)的抗体，重链可变区具有序列编号12的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号16的氨基酸序列。对于(3)的抗体，重链可变区具有序列编号20的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号24的氨基酸序列。对于(4)的抗体，重链可变区具有序列编号28的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号32的氨基酸序列。对于(5)的抗体，重链可变区具有序列编号36的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号40的氨基酸序列。对于(6)的抗体，重链可变区具有序列编号44的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号48的氨基酸序列。对于(7)的抗体，重链可变区具有序列编号52的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号56的氨基酸序列。对于(8)的抗体，重链可变区具有序列编号60的氨基酸序列，轻链可变区具有序列编号64的氨基酸序列。

各抗体的来源、种类、级别、形态等没有限定。优选的是，作为完全人IgG抗体而调制各抗体。此时，规定区域的种类没有特别限定。即，重链不限定于γ链，还可以是μ链、α链或ε链。同样地，轻链可以是κ链，也可以是λ链。

可以调制各抗体作为Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv或dsFv抗体等的抗体片段。Fab是通过将IgG抗体在半胱氨酸存在下进行木瓜蛋白酶消化而得到的，由L链和H链可变区以及由CH1区和铰链部的一部分构成的H链片段构成的分子量约5万的片段。如果有期望的IgG抗体，可以通过将其进行木瓜蛋白酶消化得到Fab。另外，还可以将编码H链的一部分和L链的DNA重组入适当的载体，使用该载体通过转化了的转化体调制Fab。

Fab’是通过将后述的F(ab’)₂的H链间的二硫键切断而得到的分子量约为5万的片段。如果有期望的IgG抗体，可以通过将其进行胃蛋白酶消化，使用还原剂切断二硫键而得到Fab’。另外，与Fab相同地，还可以使用编码Fab’的DNA进行基因工程上的调制。

F(ab’)₂是将IgG抗体进行胃蛋白酶消化而得到的，由L链和H链可变区以及由CH1区和铰链部的一部分构成的H链片段构成的片段(Fab’)以二硫键结合的分子量约10万的片段。如果有期望的IgG抗体，可以通过将其进行胃蛋白酶消化得到F(ab’)₂。另外，与Fab相同地，还可以使用编码F(ab’)₂的DNA进行基因工程上的调制。

scFv是将由H链可变区和L链可变区构成的Fv通过将一方的链的C末端与另一方的N末端以适当的连接肽连接而单链化的抗体片段。作为连接肽，例如可以使用柔软性高的(GGGGS)₃等。例如，可以使用编码H链可变区和L链可变区的DNA和编码连接肽的DNA构建编码scFv抗体的DNA，将其重组入适当的载体，使用该载体通过转化了的转化体调制scFv。

dsFv是在H链可变区和L链可变区的适当位置引入Cys残基，通过二硫键使H链可变区和L链可变区稳定化的Fv片段。在各链中的Cys残基的导入位置可以基于利用分子模型预测的立体结构而确定。例如，可以由H链可变区和L链可变区的氨基酸序列预测立体结构，基于所述立体结构，构建分别编码导入了变异的H链可变区和L链可变区的DNA，将其重组入适当的载体，并且使用该载体通过转化了的转化体调制dsFv。

其中，在本发明的组合物中，作为优选的抗体组合，可以列举以下的组合。该组合对应于在后述的实施例所示的中和试验中发现非常高的中和活性的组合。

第1抗体：(1)的抗体

第2抗体：(5)的抗体

第3抗体：(6)的抗体

在采用上述组合时，优选并用(7)的抗体作为第4人抗A型肉毒杆菌毒素抗体(第4抗体)。这样得到的4种抗体的组合对应于在后述的实施例所示的中和试验中发现最高的中和活性的抗体的组合。

优选的抗体组合的其它例子如下所示。该组合对应于在后述的实施例所示的中和试验中发现非常高的中和活性的组合。

第1抗体：(1)的抗体

第2抗体：(5)的抗体

第3抗体：(7)的抗体

应予说明，在有效成分的抗体限于3种时，在A型毒素中，对于其亚种的A2毒素，优选使用保持比(7)更强的结合性的(8)抗体作为上述第3抗体。

在采用上述组合时，优选并用(4)的抗体作为第4人抗A型肉毒杆菌毒素抗体(第4抗体)。

并用4种抗体时的组合不限于上述的两个例子。以下，表示并用4种抗体时的优选的组合。

第1抗体：选自(1)～(3)中任一种的抗体

第2抗体：(4)或(5)的抗体

第3抗体：(6)的抗体

第4抗体：(7)或(8)的抗体

(1)～(8)的抗体用作对于A型肉毒杆菌毒素表现出高中和活性的组合物的有效成分，其自身具有高效价。因此，作为本发明的第2方面，提供包含(1)～(8)任一项的抗体的A型肉毒杆菌毒素中和抗体。另外，作为本发明的第3方面，提供编码该抗体的重链可变区和/或轻链可变区的、分离的核酸分子。以下，示出对应于(1)～(8)的抗体克隆的碱基序列(重链可变区和轻链可变区)。

(BT-015)

VH：序列编号65

VL：序列编号66

(BT-047)

VH：序列编号67

VL：序列编号68

(BT-058)

VH：序列编号69

VL：序列编号70

(NT-221)

VH：序列编号71

VL：序列编号72

(BT-175)

VH：序列编号73

VL：序列编号74

(NT-320)

VH：序列编号75

VL：序列编号76

(NT-523)

VH：序列编号77

VL：序列编号78

(NT-539)

VH：序列编号79

VL：序列编号80

应予说明，即使对于作为A型的亚种的A2毒素，上述各(1)～(8)的抗体也可以保持强结合性，形成表现出强中和活性的组合物的有效成分。

本发明的抗体((1)～(8)的抗体)可以以基因工程的方法以各抗体克隆序列信息为基础进行调制。即，典型的是，可以通过一系列工序调制本发明的抗体，该一系列工序包括：编码目的抗体的基因表达构建物的调制、利用适当表达体系的表达和表达产物的回收。

表达体系没有特别限定。即，只要使目的重组抗体得到表达，可以使用任意的表达体系。其中，使IgG型的重组抗体表达时，可以使用利用动物细胞的表达体系。另外，使源自可变区的Fab、Fab’、F(ab’)₂、scFv或dsFv等的抗体片段表达时，除了动物细胞之外，还可以使用利用大肠杆菌、酵母等微生物的表达体系。根据使用的宿主，可以使用适当的表达载体。如果利用信号肽，可以使目的重组抗体分泌到细胞外，输送至周质区域，或在细胞内储留。

以下，对于最一般的利用动物细胞的表达方法，进行详细叙述。首先，将编码目的抗体的重链可变区(VH)的DNA通过化学合成、生化切断/再结合等进行制作。将得到的编码H链可变区的DNA与编码人H链规定区域的DNA进行连接，重组入表达用载体，得到H链表达载体。用同样的方法制作L链表达载体。应予说明，在夹着CDR区域而存在的FR(框架区域)中，还可以使用导入了若干变异的可变区。即，由于CDR区域全部相同的抗体识别相同的表位，因此最终得到的抗体识别A型肉毒杆菌毒素，只要表现出充分的结合活性，可以改变FR。

其中，如果氨基酸序列明确，则可以预测可变区的立体结构(空间配置)，还可以预测对FR施加特定的改变引起的立体结构的变化。另外，还可以利用计算机程序ENCAD(Energy Calculation and Dynamics)，构建可变区的分子模型，或者可以确定为了与CDR潜在地相互作用而充分接近的、FR中的氨基酸等(例如，参照WO97/002290)。另外，还可以利用定量地评价各氨基酸残基是否处于适当的环境中的计算机程序Verify-3D、免疫球蛋白专用的模型方法(WAM-Web Antibody Modeling或OxfordMoleclelar公司的AbM)等。可变区的变异的最优化可以通过利用随机PCR、噬菌体呈现法等常规的操作进行。(参照Manuel B，et al J.Biol ChemVol.272 no.16 10678“Antibody humanization using monovalent pagedisplay”、WO2007/094754等)。

所改变的氨基酸的数量优选为FR全体的15％以下，进一步优选为FR全体的10％以下，进一步更优选为FR全体的5％以下，最优选为FR全体的1％以下。

“表达载体”是指，可以将插入其的核酸导入目的细胞(目标细胞)内，且在该细胞内使其表达的核酸性分子，包括病毒载体和非病毒载体。使用病毒载体的基因导入法巧妙地利用病毒对细胞的感染现象，得到高基因导入效率。作为病毒载体，可以示例SV40virus based载体、EB virusbased载体、BPV(牛乳头瘤病毒)based载体等，但不限定于这些。作为非病毒载体，开发有脂质体、正电荷型脂质体(Felgner，P.L.，Gadek，T.R.，Holm，M.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，84：7413-7417，1987)、HVJ(Hemagglutinating virus of Japan)-脂质体(Dzau，V.J.，Mann，M.，Morishita，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，93：11421-11425，1996、Kaneda，Y.，Saeki，Y.&Morishita，R.，Molecular Med.Today，5：298-303，1999)等。表达载体还可以构建为这样的非病毒载体。

作为在表达载体中所含的启动子，利用SV40早期启动子、SV40晚期启动子、巨细胞病毒启动子、鸡β肌动蛋白启动子等。

准备H链表达载体和L链表达载体后，使用它们对宿主细胞进行共转化。作为宿主细胞，优选使用CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)(A.Wright&S.L.Morrison，J.Immunol.160，3393-3402(1998))、SP2/0细胞(小鼠骨髓瘤)(K.Motmans et al.，Eur.J.Cancer Prev.5，512-519(1996)，R.P.Junghans et al.，Cancer Res.50，1495-1502(1990))等。在转化中优选使用脂质体转染法(R.W.Malone et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，6077(1989)，P.L.Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84，7413(1987)、电穿孔法、磷酸钙法(F.L.Graham&A.J.van der Eb，Virology52，456-467(1973))、DEAE-Dextran法等。

对H链表达载体和L链表达载体的比例、导入的时机等没有特别地限定。两载体的比例(H链表达载体：L链表达载体(摩尔比))例如为1∶0.5～5，优选为1∶0.8～1.2。对于导入的时机，可以将H链表达载体和L链表达载体同时导入宿主细胞，还可以首先导入任一种。另外，如上所述，还可以不分别构建H链表达载体和L链表达载体，而构建重组了编码VH的DNA和编码VL的DNA两者的表达载体，用该表达载体对宿主细胞进行转化。

作为用于转化体的选择的标记(选择标记)，可以利用氨基糖苷-3’-磷酸转移酶(neo)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因、嘌呤霉素耐性酶基因、谷氨酰胺合成酶(GS)基因等一般的标记基因(例如参照MichaelKriegler著、加藤郁之进监译、实验室手册动物细胞的基因工程、宝酒造(1994))。

通过转化体的细胞内或培养液回收(分离、纯化)抗体。抗体的回收依照常规方法即可。即，利用离心分离、硫酸铵分级、盐析、超滤、亲和层析(使用蛋白质A树脂、蛋白质G树脂等)、离子交换层析、凝胶过滤层析等，回收抗体。

如上得到的抗体用作本发明的组合物的有效成分。构成本发明的组合物时的制剂化依照常规方法即可。在制剂化时，可以含有制剂上容许的其它成分(例如，载体、赋型剂、崩解剂、缓冲剂、乳化剂、悬浊剂、去痛剂、稳定剂、保存剂、防腐剂、生理盐水等)。作为赋型剂，可以列举水、生理食盐水溶液、林格氏溶液、葡萄糖溶液、各种缓冲液(磷酸缓冲液、重碳酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液等)、乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露醇、白糖等。作为崩解剂，可以使用淀粉、羧甲基纤维素、碳酸钙等。作为缓冲剂，可以使用磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐等。作为乳化剂，可以使用阿拉伯树胶、海藻酸钠、黄蓍胶等。作为悬浊剂，可以使用单硬脂酸甘油酯、单硬脂酸铝、甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟甲基纤维素、十二烷基硫酸钠等。作为去痛剂，可以使用苄醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作为稳定剂，可以使用丙二醇、亚硫酸二乙酯、抗坏血酸等。作为保存剂，可以使用苯酚、苯扎氯铵、苄醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯等。作为防腐剂，可以使用苯扎氯铵、对羟基苯甲酸、氯丁醇等。

进行制剂化时的剂型也没有特别限定，但优选注射剂、外用剂或栓剂等有即效性的制剂处方。

作为有效成分的各抗体的混合比没有特别限定，但典型的是，使各抗体的存在量相同(每种等摩尔混合)。应予说明，对于本领域技术人员来说，通过与后述的实施例所示的中和试验相同的试验，可以使混合比最优化。

另外，各抗体的级别或形态等是任意的。因此，本发明的组合物可以以不同级别的抗体混合的状态，或者不同形态的抗体混合的状态而构成。

优选本发明的组合物中的抗体浓度在参考最终的给药形态和给药方案后，反向计算而确定。

本发明的组合物的状态也没有特别限定。例如，将本发明的组合物调制为液状或干燥状态(优选冻干状态)。例如，在冻干时，可以在调整浓度后进行冻干，以使在用溶剂溶解后的最终1mL中作为有效成分的抗毒素效价为500单位以上。应予说明，依照在日本药局法医药品各条记录的生物学制剂医药品中记载的“干燥肉毒杆菌马抗毒素(干燥肉毒杆菌毒素)”的项5.2“小容器的含有单位数”，优选使小容器的含有单位数为抗毒素效价10000单位以上。

本发明的组合物典型的是用于肉毒杆菌中毒疾病的治疗和预防。本发明的组合物根据其形态，通过口服给药或非口服给药(静脉内、动脉内、皮下、肌肉、腹腔内注射、直接导入目标细胞等)用于对象(患者)。

本发明的组合物的给药量根据症状、患者年龄、性别以及体重等而异，但本领域技术人员可以设定适宜的适当给药量。例如，以成人(体重约60kg)为对象可以进行适当设定，以使每一次的抗毒素的给药量为10000单位～100000单位。在给药量、方案的设定中，可以以马抗毒素时的使用量、方案(日医杂志第128卷，第1号/平成14(2002)年7月1日)为参考，参照本发明的组合物和马抗毒素的相对效价，考虑患者的病症、效果的持续时间等。

为了使其适用于国际使用，优选以国际标准评价本发明的组合物的抗毒素效价。以日本药局方在医药品各条记录的生物学制剂医药品中记载的“干燥肉毒杆菌马抗毒素(干燥肉毒杆菌抗毒素)”项、详细为生物学制剂基准的“干燥肉毒杆菌马抗毒素”3.2.7“效价试验”为基准进行检测，就可以算出基于国际标准的抗毒素效价。

实施例

1.肉毒杆菌类毒素免疫抗体文库的制作

1-1.肉毒杆菌类毒素对人志愿者的接种

培养各A、B、E和F型菌，以纯化得到的毒素而得到的毒素为材料，进行类毒素的调制。特别是A型为，将用作现在治疗用毒素的由肉毒杆菌97株(C.botulinum 97)或62A株(C.botulinum 62A)产生的神经毒素依据在B型神经毒素中进行的方法(Infect.Immun.18：761-766，1977)进行纯化。纯化的各型毒素用福尔马林使其失活，与铝佐剂混合得到沉淀ABEF型多元混合类毒素。以该多元类毒素为基础免疫，以3～4周间隔皮下注射0.5mL 3次，进一步约12个月后皮下注射0.5mL 1次。进一步10年后，20年后追加注射，进一步在以下的成分采血时约3周前注射相同量。

1-2.抗体文库的制作

由接种了ABEF型肉毒杆菌类毒素人通过成分采血采取相当于3升血液的单核细胞成分血(约50ml)。用PBS稀释2倍，回收血细胞后，以10ml/试管分装的Ficoll Paque PLUS(GE Healthcare Bioscience)上重层，在400g、RT、30分钟的条件下进行离心处理，只对单核细胞部分再纯化，分离1.8×10⁹细胞。使用0.9×10⁹细胞进行总RNA的提取(RNA ExtractionKit：Amersham)，回收1.89mg。使用随机引物调制cDNA后(Super ScriptII：Invitrogen)，使用对抗体的H链(VH)特异性的引物组(参照下述)和对抗体的L链(VLCL：κ链、λ链)特异性的引物组(参照下述)，扩增目的抗体基因。H链重组入pscFvCA-E8VHd载体(利用Sfil-Xhol)，L链重组入噬菌粒载体(pFCAH9-E8d：参照再表01/062907，利用SfiI-AscI)，得到H链文库、κ链文库和λ链文库。文库的大小是，H链文库为7.05×10⁹，κ链文库为5.87×10⁸，λ链文库为5.05×10⁸。

(1)对VH特异性的引物组

人抗体重链基因的取得用5’末端侧引物(VH1～VH7)和3’末端侧引物(将human JH引物4种(697～700)等量混合的引物)

用于各VH家族的扩增的引物

人VH引物(SfiI位点用下划线表示)

628hVH1a(序列编号81)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG

629hVH2a(序列编号82)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG

630hVH3a(序列编号83)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

631hVH4a(序列编号84)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG

632hVH5a(序列编号85)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC

633hVH6a(序列编号86)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG

629-2hVH2a-2(序列编号87)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGAAGGAGTCTGGTCC

631-2hVH4a-2(序列编号88)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG

632-2hVH5a-2(序列编号89)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG

712hVH7(序列编号90)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGGGTCTGAGT

人JH引物(BstPI，XhoI位点用下划线表示)

697hJH1-2(序列编号91)：

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTGC

698hJH3(序列编号92)：

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCATTGTCC

699hJH4-5(序列编号93)：

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTTC

700hJH6(序列编号94)：

GGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACCGTGGTCC

(2)对L链(VLCL：κ链、λ链)特异性的引物组

轻链基因取得用VL的在5’侧芳基化的引物(κ1～κ6、λ1～λ6)和在Cκ、Cλ的3’侧芳基化的引物(hCKASC引物或hCLASC引物)

L链(VLCL：κ链、λ链)

5’-引物κ1～κ6

hVK1a(序列编号95)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCCAGATGACCCAGTCTCC

hVK2a(序列编号96)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATGTTGTGATGACTCAGTCTCC

hVK3a(序列编号97)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCC

hVK4a(序列编号98)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCGTGATGACCCAGTCTCC

hVK5a(序列编号99)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAACGACACTCACGCAGTCTCC

hVK6a(序列编号100)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC

5’-引物λ1～λ6

hVL1(序列编号101)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGCC

hVL2(序列编号102)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGC

hVL3a(序列编号103)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCCTATGTGCTGACTCAGCCACC

hVL3b(序列编号104)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCTCTTCTGAGCTGACTCAGGACCC

hVL4(序列编号105)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCACGTTATACTGACTCAACCGCC

hVL5(序列编号106)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGCTGTGCTCACTCAGCCGCC

hVL6(序列编号107)：

GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA

3’-引物hCKASC(序列编号108)：

TCGACTGGCGCGCCGAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTG

3’-引物HCLASC(序列编号109)：

TCGACTGGCGCGCCGAACATTCTGTAGGGGCCACTGTCTTCTC

由H链文库用HindIII、XhoI切出H链基因，重组入将κ链文库和λ链文库等摩尔混合而制作的L链文库，最终得到文库大小为1.3×10¹⁰的抗肉毒杆菌毒素筛选用Fab型抗体文库(图1)。认为抗体的种类由VH的CDR3的多样性而产生，此次制作的巨大的抗体文库充分覆盖分离的抗体基因的多样性。

2.使用A型肉毒杆菌类毒素和肉毒杆菌毒素的无毒成分蛋白质的抗体文库的筛选

2-1.筛选实验1

(1)特异性克隆的选择、回收

为了取得中和抗体，理想的是筛选在具有神经毒的活性的神经毒素部位结合的抗体。但是，对献血志愿者免疫毒素全长制作的类毒素，与无毒成分蛋白质结合的抗体(在此时不需要的抗体)也在体内产生。另外，取得具有神经毒的活性的神经毒素也是受限制的。因此，采用以下的筛选策略：最初使无毒成分蛋白质和人抗体文库反应，将不需要的抗体吸收至无毒成分蛋白质后，回收反应上清液，接着使肉毒杆菌类毒素与未吸收至无毒成分蛋白质的人抗体文库反应。

首先，在微型杯(Nunc公司制，Maxisorp)6孔分别分装用PBS调制至10μg/ml的浓度的肉毒杆菌类毒素和无毒成分蛋白质各100μl，在4℃反应过夜并固相化。除去溶液后，分别分装1％BSA/PBS各200μl，在37℃下进行1小时封闭。将制作的人抗体文库1.0×10¹³克隆当量首先分装(130μl/孔)入最初将无毒成分蛋白质固相化的微型杯，在37℃下反应2小时。之后，回收反应上清液重新分装入将肉毒杆菌类毒素固相化的微型杯，在37℃下反应2小时。反应完毕后，除去反应液，用PBS洗净5次。分装0.1M HCl(溶解甘氨酸调制为pH2.2)100μl/孔，在室温下反应15分钟，回收与抗原结合了噬菌体抗体。

将其对OD 0.5的大肠杆菌DH12S 20ml进行1小时感染，添加至60ml的SBGA培养基(在SB培养基(将MOPS 10g、Typtone 30g和Yeast Extract20g溶解，用3N NaOH调节至pH7后，使最终溶液量为1升)作为最终浓度添加125μg/ml氨苄青霉素硫酸盐和0.5％glucose)，在37℃下培养2小时后，添加至500ml的SBA培养基进一步在37℃下培养2小时。接着，添加1×10¹²当量的辅助噬菌体K07，在37℃下培养2小时后，添加卡那霉素以使终浓度为50μg/ml，在30℃下培养18小时。将其以8000rpm进行10分钟离心处理，回收上清液，在其中混合110ml的PEG液(20％聚乙二醇6000，2.5M NaCl)充分搅拌混合后，以8500rpm进行15分钟离心处理，使噬菌体沉淀。将其在2.5ml的PBS中悬浊，使用其一部分研究大肠杆菌感染数。这样，得到第一次(1st)筛选的噬菌体(第一次噬菌体)。

第二次(2nd)筛选为，除了使用第一次噬菌体400μl和使PBS洗净次数为20次以外，在与第一次筛选相同的条件下实施。第三次(3rd)筛选为，除了使用第二次噬菌体400μl以外，在与第二次筛选相同的条件下实施。在第三次筛选后，提取46克隆。

(2)抗体克隆的碱基序列确定

将通过筛选得到的大肠杆菌稀释，撒在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的普通琼脂培养基上。挑取得到的菌落(相当于上述(1)的46克隆)，以2xYTGA培养基在30℃下培养过夜后，以PI-50(仓敷纺织株式会社)提取DNA，用双脱氧法确定碱基序列。

(3)各抗体克隆的cp3融合蛋白质的表达、调制

将通过筛选得到的大肠杆菌稀释，撒在添加了氨苄青霉素(100μg/ml)的普通琼脂培养基上。挑取得到的菌落(相当于上述(1)的46克隆)，以2xYTGA培养基在30℃下培养过夜后，将20μl接种至2ml的0.05％葡萄糖2xYTA(2xYT，100μg/ml氨苄青霉素硫酸盐，0.05％葡萄糖)。在30℃下培养3小时后，添加1M IPTG20μl，进一步培养20小时。接着，以微量离心机以15000rpm离心处理5分钟，回收上清液。在上清液中含有各抗体克隆的cp3融合蛋白质。使用该上清液进行与类毒素、无毒成分的ELISA。

(4)与肉毒杆菌类毒素以及无毒成分的ELISA反应

以使用肉毒杆菌类毒素以及无毒成分蛋白质的ELISA判定抗体的结合能力。只与肉毒杆菌类毒素反应的抗体是分离目的的抗体(即中和抗体)。

首先，在微型杯(Nunc公司制，Maxisorp)分别分装用PBS调制至10μg/ml的浓度的肉毒杆菌类毒素和无毒成分蛋白质各100μl，在4℃反应过夜并固相化。除去溶液后，分别分装1％BSA/PBS各200μl，在37℃下进行1小时封闭。分装在(3)得到的上清液(含有抗体的cp3融合蛋白质)各100μl，在37℃下反应1小时。除去溶液后，用PBS洗净，将用PBS稀释为2.5μg/ml的兔抗cp3抗体(MBL)在37℃下反应1小时。除去溶液后，用PBS洗净，将用PBS稀释10000倍的HRP标记山羊抗兔IgG抗体(MBL)在37℃下反应1小时。除去溶液后，用PBS洗净，在室温下使100μl的OPD液反应5分钟。以2N硫酸使反应停止，以SPECTRAmax340PC(Molecular Devices)测定492nm处的吸光度。

如上所述，研究在(1)回收的46克隆的结合能力的结果为，40克隆(作为氨基酸序列不同的为22种)对于肉毒杆菌类毒素表现出反应性。另外，对于肉毒杆菌毒素的无毒成分蛋白质，19种反应。

(5)抗体蛋白质的调制

另一方面，在以上述肉毒杆菌类毒素为抗原的筛选中得到的抗体中，对于肉毒杆菌毒素的无毒成分蛋白质不表现出反应性，而与肉毒杆菌类毒素反应的抗体有3种(图2)。应予说明，以对于无毒成分蛋白质的ABS＜0.2为判定标准。用箭头表示的BT-015、37、39、44中，BT-037和与无毒成分蛋白质反应的BT-014的氨基酸序列相同)。以限制酶SalI将这些噬菌粒DNA消化后，使其自身再结合，转变为ProteinA融合抗体(Fab-pp型抗体)，使用其对DH12S进行转化。转化后，以25ml的2xYTGA在30℃下培养过夜。将该培养液20ml与2升的2xYTA混合培养3小时后，添加2ml的1M IPTG，在30℃下培养20小时。将培养液在4℃、8000rpm条件下进行10分钟的离心处理，回收上清液。在回收的上清液中缓慢加入1122g的硫酸铵，在室温下搅拌混合1小时后，在4℃、8500rpm条件下进行30分钟的离心处理。将沉渣放入100ml的加有Complete(Roche公司制)的PBS中悬浊。接着，对于PBS，在4℃下透析过夜后，在4℃、10000rpm条件下进行10分钟的离心处理。回收上清液，将其添加至填充了3ml的IgG琼脂糖(GE Healthcare Bioscience)的柱，在室温下以自然滴下的方式使其通过柱内。用300ml的PBS洗净柱后，用6ml的0.2M甘氨酸(pH3)、3ml的0.2M甘氨酸(pH2.5)、10ml的0.2M甘氨酸(pH3)洗脱。将洗脱液分别以2M Tris调节pH至7.0后，装入透析浓缩用管中(Millipore公司制，Amicon Ultra-15，4℃、转速5530rpm)，对PBS进行透析，浓缩。之后进行SDS-PAGE，算出蛋白质浓度。

(6)利用动物试验的抗体评价

通过将分离、调制的Fab-pp型抗体与毒素混合皮下给药后，观察小鼠的麻痹等的症状这样的半定量试验法，评价各抗体的中和能力。方法以参考文献(M.Takahashi et al.，International Journal of Food Microbiology，11，271-278，1990.Jpn.J.Med.Sci.Biol.，43.163-170，1990)为标准。作为比较对照，将A型肉毒杆菌毒素抗毒素日本标准品(10单位/ml)稀释10倍，得到作为储备溶液的抗毒素原液(1单位/ml)，进一步调制将其用PBS进行每次3倍的6步稀释而得到的的溶液(以下，称为“标准稀释”)。另一方面，将在(5)得到的抗体溶液用PBS稀释5倍制成抗体原液，进一步进行每次5倍的4步稀释，得到样本(以下称为“样本稀释液”)。

另外，将肉毒杆菌神经毒素(3.8×10⁵LD50/ml)稀释400倍得到储备溶液(950LD50/ml)，进一步稀释500倍制作试验毒素(1.9LD50/ml)。准确量取试验毒素0.25ml、各标准稀释以及样本稀释液0.25ml，充分混合在室温下反应1小时后，对1组2只的小鼠进行每只0.2ml的皮下接种，观察3天。根据试验组的小鼠的临床症状(完全缓解、麻痹的程度)，判定样本的效价。结果，BT-015表现出中和能力(图3)。

2-2.筛选实验2

在筛选实验1取得的抗体中，用以下的方法调制混合了判断为阴性(与无毒素部位也反应的抗体)的19克隆的抗体蛋白质的抗体。

首先，将该19克隆的DNA混合，以限制酶SalI消化后，使其自身再结合，转变为Fab-pp型抗体，使用其对DH12S进行转化。转化后，以100ml的2xYTGA在30℃下培养过夜。将该培养液40ml与4升的2xYTA混合培养3小时后，添加4ml的1M IPTG，在30℃下培养20小时。将培养液在4℃、8000rpm条件下进行10分钟的离心处理，回收上清液。在回收的上清液中缓慢加入2244g的硫酸铵，在室温下搅拌混合1小时后，在4℃、8500rpm条件下进行30分钟的离心处理。将沉渣放入200ml的加有Complete(Roche公司制)的PBS中悬浊。接着，对于PBS，在4℃下透析过夜后，在4℃、10000rpm条件下进行10分钟的离心处理。回收上清液，将其添加至填充了3ml的IgG琼脂糖(GE Healthcare Bioscience)的柱，在室温下以自然滴下的方式使其通过柱内。用500ml的PBS洗净柱后，用6ml的0.2M甘氨酸(pH3)、3ml的0.2M甘氨酸(pH2.5)、10ml的0.2M甘氨酸(pH3)洗脱。将洗脱液分别以2M Tris调节pH至7.0后，装入透析浓缩用管中(Millipore公司制，Amicon Ultra-15，4℃、转速5530rpm)，对PBS进行透析，浓缩。之后进行SDS-PAGE，算出蛋白质浓度。

将以上的方法调制的抗体混合蛋白质以230μg/ml添加来遮蔽抗原后(参照图4)，用与筛选实验1相同的方法实施筛选。结果，回收46克隆。用ELISA分析各抗体克隆，结果可知类毒素特异性反应的新型抗体克隆含有27种。这样，通过将抗原遮蔽，大幅减少与无毒素部位反应的抗体(2/46)，提高筛选效率(图5下方(第四次(4th)))。

2-3.筛选实验3

由于在筛选实验1的第三次筛选中判断为阴性的克隆数多，因此认为在该阶段已经产生偏差，中和抗体的存在比例降低。因此，使用筛选中途阶段的第二次筛选后的噬菌体抗体(第二次噬菌体)，实施筛选(第三次-2)。首先，在微型杯(Nunc公司制，Maxisorp)6孔分别分装用PBS调制至10μg/ml的浓度的肉毒杆菌类毒素100μl，在4℃反应过夜并固相化。除去溶液后，分别分装1％BSA/PBS 200μl，在37℃下进行1小时封闭。除去封闭溶液后，以30μg/孔分装在2-2.调制的抗体混合蛋白质，在37℃下反应1小时来遮蔽抗原。除去抗体蛋白质溶液后，将第二次噬菌体3.6×10¹³当量和在2-2.调制的抗体混合蛋白质180μg混合后，分装入微型杯，在37℃下反应2小时。以后的操作与上述筛选实验1相同。

最后挑取46克隆，用ELISA确认它们的结合能力。结果，类毒素特异性反应的新型抗体克隆有20种。通过将抗原遮蔽，大幅减少与无毒素部位反应的抗体(1/46)，提高筛选效率(图5上方(第三次-2))。

由这些各抗体克隆调制抗体蛋白质，实施毒素的中和试验。结果，两个克隆(BT-058、BT-047)表现出中和活性，但它们的H链的氨基酸序列与在筛选实验1取得的克隆BT-015的H链的氨基酸序列基本相同(图6)。因此，认为这3个克隆的表位相同。

2-4.筛选实验4(同时实施利用抗体群共存的群体排除和利用抗体共存的相同克隆排除)

通过使判断为阴性的抗体与筛选系共存，进行改善，以有效地取得类毒素特异性抗体克隆，但只能取得与在筛选实验1取得的抗体克隆BT-015相同或类似的抗体克隆。因此，为了取得新型抗体克隆，采取以下的策略：除了判断为阴性的抗体克隆19种的抗体蛋白质以外，也使抗体克隆BT-015的抗体蛋白质共存，由此遮蔽这些抗体克隆的表位(第四次-2筛选)。

首先，在微型杯6孔分别分装用PBS调制至10μg/ml的浓度的肉毒杆菌类毒素100μl，在4℃反应过夜并固相化。除去溶液后，分别分装1％BSA/PBS 200μl，在37℃下进行1小时封闭。除去封闭溶液后，分装在2-2.调制的抗体混合蛋白质和由抗体克隆BT-015调制的抗体蛋白质(各自30μg/孔)，在37℃下反应1小时来遮蔽抗原。除去抗体蛋白质溶液后，将在筛选实验3得到的噬菌体(第三次-2噬菌体)7.2×10¹²当量和在2-2.调制的抗体混合蛋白质180μg以及由抗体克隆BT-015调制的抗体蛋白质180μg混合后，分装入微型杯，在37℃下反应2小时。以后的操作与上述筛选实验1相同。

挑取94克隆，用ELISA确认它们的结合能力，全都与类毒素特异性反应(图7)。在这些克隆中，具有新型氨基酸序列的克隆有26种。另外，不含有与抗体克隆BT-015相同或类似的抗体。应予说明，以上的筛选过程如图9所示。

接着，通过观察与毒素混合进行皮下给药时小鼠的生死、麻痹等的症状这样的简易的试验方法，评价各抗体克隆的中和能力。具体的试验方法以参考文献(日本生物学制剂基准厚生劳动省)为标准。在试验中，使用由各抗体克隆调制的Fab-pp型抗体。作为比较对照，将A型肉毒杆菌毒素抗毒素日本标准品(10单位/ml)稀释10倍，得到作为储备溶液的抗毒素原液(1单位/ml)，将其用PBS稀释调制成0.1单位的溶液进一步调制进行每次2倍的5步稀释的溶液(以下，称为“标准稀释”)。样本直接使用调制的原液。

将肉毒杆菌神经毒素稀释400倍，得到储备溶液(950LD50/ml)，进一步稀释10倍，制作试验毒素(95LD50/ml)。准确量取试验毒素0.25ml和各标准稀释以及样本0.25ml，充分混合在室温下反应1小时后，对1组2只的小鼠进行每只0.2ml的皮下接种，观察4天。根据试验组的小鼠的临床症状(完全缓解、麻痹的程度)，判定样本的效价。结果，抗体克隆BT-175表现出中和能力(图8)。

2-5.筛选实验5(使用A型肉毒杆菌神经毒素的筛选)

由肉毒杆菌62A株，依照文献INFECTION AND IMMUNITY，Vol.12，No.6Dec.1975，p.1262-1270，由纯化的肉毒杆菌毒素除去无毒成分蛋白质，纯化调制的神经毒素(毒素的活性中心150kDa)。实施以其为抗原的筛选，尝试取得识别与抗体克隆BT-015、BT-175不同的表位的中和抗体。

首先，在微型杯6孔分别分装用PBS调制至10μg/ml的浓度的肉毒杆菌神经毒素100μl，在4℃反应过夜并固相化。除去溶液后，分别分装1％BSA/PBS 200μl，在37℃下进行1小时封闭。除去封闭溶液后，分装人抗体文库1.0×10¹³(130μl/孔)，在37℃下反应2小时。以后的操作与上述筛选实验1相同(实施到第四次筛选为止。在第四次筛选使用第三次噬菌体400μl)。

实施第四次筛选后，挑取188克隆，用ELISA确认它们的结合能力的结果为，类毒素特异性反应的克隆有6种(图10、11)。其中，大量含有与至此取得的2种抗体克隆(BT-015、BT-175)相同或相似的克隆(对于BT-015为6克隆，对于BT-175为5克隆)。

2-6.筛选实验6(利用BT-015和BT-175抗体共存的相同克隆排除)

在以神经毒素为抗原的筛选(2-5.)中，以排除大量的所取得的抗体克隆(与BT-015或BT-175相同或类似的克隆)为目的，进一步实施筛选实验。

首先，在微型杯8孔分别分装用PBS调制至10μg/ml的浓度的神经毒素100μl，在4℃反应过夜并固相化。除去溶液后，分别分装1％BSA/PBS200μl，在37℃下进行1小时封闭。除去封闭溶液后，分装由抗体克隆BT-015及BT-175调制的抗体蛋白质(各自30μg/孔)，在37℃下反应1小时来遮蔽抗原。除去抗体蛋白质溶液后，将在筛选实验5的第三次筛选得到的噬菌体(第三次噬菌体)2.0×10¹³和由抗体克隆BT-015以及BT-175调制的抗体蛋白质(各180μg)混合后，分装入微型杯，在37℃下反应2小时。挑取188克隆，用ELISA确认它们的结合能力，与神经毒素特异性反应的新型克隆有24种(图12、13)。应予说明，以上的筛选过程如图15所示。

2-7.利用动物试验的抗体评价

由在以神经毒素为抗原的筛选(筛选实验5和6)取得的30种的抗体克隆调制Fab-pp型抗体。对于各Fab-pp型抗体，通过与毒素混合进行皮下给药观察小鼠的生死、麻痹等的症状这样的试验方法，判断中和能力。试验方法以参考文献(生物学制剂基准厚生劳动省日本药局方)为标准，样本的效价作为对于日本标准品的相对效价求出。将A型肉毒杆菌抗毒素日本标准品(10单位/ml)稀释10倍，得到作为储备溶液的抗毒素原液(1单位/ml)，将其用PBS稀释调制成0.1单位/ml的溶液进一步调制进行每次2倍的5步稀释的溶液(以下，称为“标准稀释”)。样本直接使用调制的原液。

将肉毒杆菌神经毒素稀释400倍，得到储备溶液(950LD50/ml)，进一步稀释10倍，制作试验毒素(95LD50/ml)。准确量取试验毒素0.25ml和各标准稀释以及样本0.25ml，充分混合在室温下反应1小时后，对1组2只的小鼠进行每只0.2ml的皮下接种，观察40天。根据试验组的小鼠的临床症状(完全缓解、麻痹的程度)，判定样本的效价。结果，4种抗体克隆(NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)表现出中和能力(图14)。

3.抗体序列的比较

在以上的筛选(筛选实验1～6)取得的抗体的序列信息如下所示。应予说明，在图16中，比较这些抗体(其中，除去BT-015的类似克隆，即BT-047和BT-058)的氨基酸序列，同时示出与种系的同源性。

(1)BT-015

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号1

VH CDR2：序列编号2

VH CDR3：序列编号3

VH：序列编号4

VL CDR1：序列编号5

VL CDR2：序列编号6

VL CDR3：序列编号7

VL：序列编号8

(碱基序列)

VH：序列编号65

VL：序列编号66

(2)BT-047

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号9

VH CDR2：序列编号10

VH CDR3：序列编号11

VH：序列编号12

VL CDR1：序列编号13

VL CDR2：序列编号14

VL CDR3：序列编号15

VL：序列编号16

(碱基序列)

VH：序列编号67

VL：序列编号68

(3)BT-058

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号17

VH CDR2：序列编号18

VH CDR3：序列编号19

VH：序列编号20

VL CDR1：序列编号21

VL CDR2：序列编号22

VL CDR3：序列编号23

VL：序列编号24

(碱基序列)

VH：序列编号69

VL：序列编号70

(4)NT-221

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号25

VH CDR2：序列编号26

VH CDR3：序列编号27

VH：序列编号28

VL CDR1：序列编号29

VL CDR2：序列编号30

VL CDR3：序列编号31

VL：序列编号32

(碱基序列)

VH：序列编号71

VL：序列编号72

(5)BT-175

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号33

VH CDR2：序列编号34

VH CDR3：序列编号35

VH：序列编号36

VL CDR1：序列编号37

VL CDR2：序列编号38

VL CDR3：序列编号39

VL：序列编号40

(碱基序列)

VH：序列编号73

VL：序列编号74

(6)NT-320

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号41

VH CDR2：序列编号42

VH CDR3：序列编号43

VH：序列编号44

VL CDR1：序列编号45

VL CDR2：序列编号46

VL CDR3：序列编号47

VL：序列编号48

(碱基序列)

VH：序列编号75

VL：序列编号76

(7)NT-523

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号49

VH CDR2：序列编号50

VH CDR3：序列编号51

VH：序列编号52

VL CDR1：序列编号53

VL CDR2：序列编号54

VL CDR3：序列编号55

VL：序列编号56

(碱基序列)

VH：序列编号77

VL：序列编号78

(8)NT-539

(氨基酸序列)

VH CDR1：序列编号57

VH CDR2：序列编号58

VH CDR3：序列编号59

VH：序列编号60

VL CDR1：序列编号61

VL CDR2：序列编号62

VL CDR3：序列编号63

VL：序列编号64

(碱基序列)

VH：序列编号79

VL：序列编号80

4.抗体的分析

4-1.IgG抗体的调制

由在Fab-pp型抗体中观察到中和活性的抗体克隆(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523)调制IgG抗体。首先，对于各抗体克隆，将编码VH的基因片段与人γ1链规定区域DAN连接后，重组入表达载体“BCMGS Neo载体”(鸟山一“牛乳头状瘤病毒载体”，村松正实和冈山博人编，实验医学别册基因工程手册，羊土社，pp.297-299(1991)，制作伴有规定区域的H链载体。同样地，将各抗体克隆的L链全长基因重组入载体，得到L链表达抗体表达载体。

使用脂质转染法将抗体表达载体转染入中国仓鼠卵巢细胞株CHO-K1，在37℃下培养规定时间后，移入96孔板，选择高表达细胞。使用无血清培养基(CHO-S-SFM II：Invitrogen公司制，1％(v/v)青霉素-链霉素溶液：Sigma-Aldrich公司制，700&micro；g/ml G418：Sigma-Aldrich公司制)，将选择的各细胞在大量培养烧瓶(BectonDickinson公司制CELLine 1000烧瓶)中培养2周。回收培养上清液，供给Protein G结合亲和柱。用PBS洗净柱后，用甘氨酸盐酸缓冲液(pH2.7)洗脱，用Tris盐酸缓冲液(pH8.9)进行中和。接着，将洗脱液放入透析浓缩用管(Millipore公司制，Amicon Ultra-15)对PBS进行透析浓缩。将这样得到的IgG型抗体用于以后的实验。

4-2.利用Biacore的结合常数分析

分析使用Biacore3000生物传感器装置。首先将神经毒素880RU在传感器芯片(CM5)上固相化后，依次改变浓度(1.9nM～1μM)注入(40μl，2分钟)Fab-pp型或IgG型抗体。分析结果如图17(BT-015的Fab-PP型抗体)、图18(BT-015的IgG型抗体)、图19(BT-175的Fab-PP型抗体)、图20(BT-175的IgG型抗体)、图21(NT-221的Fab-PP型抗体)、图22(NT-320的Fab-PP型抗体)所示。分析的结果为，都是具有强结合力的抗体。

4-3.利用Biacore的表位分析

调制对于A型肉毒杆菌毒素表现出中和活性的6种抗体克隆(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)的Fab-PP型抗体，使用其进行Biacore的竞争实验。将神经毒素800RU固化于传感器芯片(CM5)后，以以下的浓度依次注射抗体，测定有无竞争。注射为每次流过40μl(2分钟)。所有的分析实验都是在HBS-EP流速20μl/分钟HBS-EP(Biacore)中，在25℃下进行。再生是将100mM Glycine-HCl(pH2.0)以20μl(流速60μl/分钟，20秒)进行的。

[表1]

表1：抗体的注射浓度(单独或混合、最终浓度)

利用Biacore的竞争实验的结果如图23～27所示。另一方面，利用ELISA确认抗体间有无竞争。由ELISA的结果确认，BT-015与NT-221没有竞争，并且BT-175与NT-221有竞争。综合地判断Biacore和ELISA的结果，结果为6种抗体根据表位的不同分为4种。应予说明，BT-047和BT-058的H链的氨基酸序列与克隆BT-015的H链的氨基酸序列基本相同，预想这3种克隆的表位相同。

[表2]

表2表位的分类

4-4.中和试验(利用IgG抗体的中和试验。L+/20水平)

使用由各抗体克隆调制的IgG型抗体，依据生物学制剂标准进行中和试验。

首先，稀释肉毒杆菌A型国内标准品，制作在0.25ml中包含以0.050单位为中心而考虑试验精度的适当的间隔浓度单位的5阶段稀释(以下称为“标准稀释”)。另外，稀释IgG型抗体，制作同样的稀释(以下称为“被检测稀释”)。进一步，稀释A型试验毒素，制作在0.25ml中含有1试验毒素量的溶液(以下称为“毒素稀释”)。分别等量准确量取各标准稀释以及被检测稀释、和各毒素稀释，充分混合放置1小时。以23～29日龄的小鼠4只为一组，对于各混合液分别使用1组，对于每1只在腹腔内注射混合液0.5ml，观察3天，计算相对于标准品的相对值。

在6种抗体克隆中，在IgG型抗体的表达良好且容易调制的5种抗体克隆(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523)中，在单独给药IgG型抗体时未发现完全的中和。因此，实施能找出可以完全中和A型肉毒杆菌毒素的抗体组合的抗毒素制剂评价试验。即，判明与单独给药相比，通过混合表现出协同效果，且准备以表位明显不同的BT-015和BT-175为基础的各种组合(样本)，比较中和活性。

[表3]

等量混合调制为1mg/ml的抗体，以调制的抗体溶液为样本原液。对样本原液进行每次3倍的分步稀释，制作至81倍稀释的样本稀释液。在样本稀释液0.25ml中加入PBS 0.38ml，制成0.63ml，与试验毒素0.63ml充分混合，在室温下反应1小时后，对1组2只的小鼠的腹腔内每只接种0.5ml，观察40天。

比较对照为A型肉毒杆菌抗毒素日本标准品(10单位/ml)，用PBS稀释，制作包含以0.50单位/ml为中心而考虑试验精度的适当的间隔浓度单位的5阶段稀释(以下称为“标准稀释”。表4)。另外，稀释对应于各抗毒素的肉毒杆菌神经毒素，制作试验毒素(214ipLD50/ml)。准确量取试验毒素0.63ml和各标准稀释以及样本稀释液0.63ml，充分混合在室温下反应1小时后，对1组2只的小鼠的腹腔内每只接种0.5ml，观察40天。样本的效价作为相对于日本标准品的相对效价而求出。

[表4]

表4标准稀释

日本标准品抗毒素0.5单位/ml	PBS
		0.30ml	0.33ml
0.28ml	0.35ml
		0.25ml	0.38ml
0.23ml	0.40ml
		0.21ml	0.42ml

中和试验的结果(图28)为，通过混合以下的3种抗体，即BT-015、BT-175和NT-320(样品6)，成功地完全中和，表现出最强活性的是将以下的4种抗体，即BT-015、BT-175、NT-320和NT-523混合的情况(样本4)。并用4种抗体时的活性为12单位/mg(＝12单位/ml)。另一方面，在将BT-015、BT-175和NT-523混合时(样本7)也表现出高的中和活性。另外，如果在这3种抗体中混合NT-221(样本3)，则显示中和活性提高。

应予说明，在现行的治疗用干燥肉毒杆菌抗毒素(A、B、E、F4种混合)中含有A型毒素抗体10000单位/vial，在用4种抗体代替时，通过混合每种约210mg的各抗体，得到同等的活性。

4-5.利用ELISA的抗体表位分析和对于毒素亚型A2毒素的反应性

为了更详细地分析6种中和抗体(BT-015、BT-175、NT-221、NT-320、NT-523、NT-539)的表位，另外，同时也确认对于作为其亚型的A2型神经毒素(CHIBA-H)的反应性，使用如下所示的各抗原实施ELISA。

·A型毒素62A神经毒素(NT)(BoNT/A1)

·神经毒素重链(H链)

·神经毒素轻链(L链)

·A2亚型毒素神经毒素CHIBA-H(BoNT/A2)

操作顺序如下所示。用PBS稀释各抗原(NT：10μg/ml、H链：7μg/ml、L链：3.5μg/ml)，以100μg/孔分装于微型板。在37℃下反应2小时后，除去溶液。接着，在用PBS稀释至0.5％的BSA中反应过夜，进行封闭。除去溶液后，以100μl/孔分装分步稀释至以下浓度的6种IgG型中和抗体，反应2小时。应予说明，如下所示，通过预试验设定每种抗体的最适稀释浓度。

·BT-015、BT-175、NT-221：1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml

·NT-320、NT-523、NT-539：10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml

接着，用PBS洗净后，在37℃下将使用PBS稀释20000倍的HRP标记山羊抗人IgG抗体(BIO-RAD)反应2小时。除去溶液后，用PBS洗净，在37℃下使150μl的OPD液(o-phenylendiamine 0.4mg/ml)反应30分钟。添加5N硫酸50μl使反应停止，测定492nm处的吸光度。测定结果如图29的表所示。应予说明，表示由2孔的平均值减去阴性类型对照(无关的抗体)的人IgG(各浓度)的OD值。另外，OD值在3.5以上时不能测定，在表中记载为“＞3.500”。ND表示不能测定。

图29所示的结果解释如下。

·由于NT-320识别H链，因此NT-320的表位存在于H链。

·NT-523与H链、L链两者反应。

·其它4种与H链、L链都不反应。

·BT-015、BT-175、NT-539对于BoNT/A1、BoNT/A2具有相同程度的反应性。

·NT-221、NT-320、NT-523对于BoNT/A2的反应性比BoNT/A1低。

如果综合以上的解释，则暗示对于A2毒素的中和，NT-539比NT-523优异的可能性。

4-6.利用免疫印迹的表位分析

接着，对于神经毒素(NT)和重链C末端侧的神经细胞结合区域(Hc、大肠杆菌重组蛋白质)，利用免疫印迹进行表位分析。使用丙烯酰胺的浓度为10％的凝胶，进行SDS-PAGE(神经毒素：1.5μg/泳道、Hc：0.5μg/泳道)，转印至膜、封闭后，稀释为2种浓度(50μg/ml(实线的泳道)、5μg/ml(虚线的泳道))，使6种IgG型中和抗体各200μl反应。用PBS洗净后，使用PBS稀释20000倍的HRP标记山羊抗人IgG抗体。用PBS洗净，对显色基质使用DAB，进行检测(图30)。

对于重链C末端侧的神经细胞结合区域(Hc)的反应性的结果解释如下。

·NT-532识别Hc域的一级结构。

·其它的抗体未检测出条带，因此认为是识别毒素的高级结构的抗体。

4-7.利用免疫沉淀的表位分析

进一步使用3种抗原(神经毒素、H链、L链)，利用免疫沉淀进行表位分析。使IgG型中和抗体各5μg与蛋白质G琼脂糖100μl反应，制作6种抗体珠。在4℃下使抗原(神经毒素：0.6μg/100μl、H链：0.4μg/100μl、L链：0.4μg/μl)与抗体珠反应过夜。洗净后，使用丙烯酰胺的浓度为10％的凝胶，进行SDS-PAGE，转印至膜、封闭后，使亲和纯化的兔抗A型肉毒杆菌神经毒素抗体(稀释1000倍)反应。用PBS洗净后，将使用PBS稀释2000倍的HRP标记山羊抗兔IgG抗体(BIO-RAD)在37℃下反应。用PBS洗净后，对显色基质使用DAB，进行检测(图31)。

图31的结果解释如下。

·BT-015、NT-523、NT-539识别H链(实线圆)。

·BT-175识别L链的可能性高(虚线圆)。

·不能判断NT-221、NT-320识别H链和L链中的哪一个。

如果综合在4-5.～4-7.记载的表位分析的结果，6种抗体的表位分类如图32所示。应予说明，对于各克隆的结合性(表位候补)，与神经毒素具有结合性时用NT表示，与H链具有结合性时用H表示，与H链C末端侧的神经细胞结合区域具有结合性时用Hc表示，与L链具有结合性时用L表示。(-)表示不能判断。

产业上的可应用性

本发明的A型肉毒杆菌毒素中和组合物含有表位不同的多种抗体，发挥高的中和活性。本发明的有效成分为具有完全人可变区的抗体。根据该特征，可以解决制造耗费时间、难以稳定地供给、而且具有混入未知病毒的危险等现有的制剂(马抗毒素制剂、中和嵌合体抗体等)具有的问题。这样，本发明可以使安全且经济的抗A型肉毒杆菌毒素制剂实用化，对肉毒杆菌中毒患者的治疗和预防作出大的贡献。

另一方面，本发明提供适合毒素中和试验的国际标准的A型肉毒杆菌毒素中和组合物。因此，对于在储备体制不完备的发展中国家中的中毒症，特别是突发性爆发的中毒症、生物恐怖等，作为在国际上可以使用的治疗、预防方法，本发明是极其有用的。

本发明不受上述发明的实施方式和实施例说明的任何限定。在不脱离本申请要求保护的范围的记载、本领域技术人员容易想到的范围内的各种变化方式也包含在本发明中。

在本说明书中明示的论文、公开专利公报和专利公报等的内容是援引其所有内容的引用。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其含有：

识别具有由序列编号44的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号48的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体的表位、或者具有由序列编号52的氨基酸序列构成的重链可变区和由序列编号56的氨基酸序列构成的轻链可变区的抗体的表位的第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。

2.根据权利要求1所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是选自下述(1)～(3)中任一种的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是选自下述(4)或(5)的抗体，

3.根据权利要求2所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是选自所述(1)～(3)中任一种的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(4)或(5)的抗体，

第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(6)的抗体，

4.根据权利要求2所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，

第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(1)的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(5)的抗体，

第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(6)的抗体。

5.根据权利要求4所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，进一步含有所述(7)的抗体作为第4人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。

6.根据权利要求2所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，

第1人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(1)的抗体，

第2人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(5)的抗体，

第3人抗A型肉毒杆菌毒素抗体是所述(7)的抗体。

7.根据权利要求6所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，进一步含有所述(4)的抗体作为第4人抗A型肉毒杆菌毒素抗体。

8.根据权利要求2～7中任一项所述的A型肉毒杆菌毒素中和组合物，其中，

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12.(删除)

13.(删除)

14.(删除)