CN105188752A - 与aip2结合的抗感染结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明公开涉及或来源于抗AIP2抗体的组合物和方法。更具体地，公开结合AIP2的全人抗体、这些抗体的AIP2-结合片段和衍生物，以及包含这些片段的AIP2-结合多肽。进一步地，公开编码这些抗体、抗体片段和衍生物，以及多肽的核酸，包含这些多聚核苷酸的细胞，制备这些抗体、抗体片段和衍生物以及多肽的方法，和使用这些抗体、抗体片段和衍生物，以及多肽的方法；使用这些抗体、抗体片段和衍生物，以及多肽的方法包括对患有AIP2相关病症或症状的受试者进行治疗或诊断。本发明还公开通过服用在此公开的抗AIP2抗体治疗金黄色葡萄球菌感染的方法。

Description

与AIP2结合的抗感染结合蛋白
技术领域
本发明提供涉及或来源于抗自动诱导肽(AIP)2的抗体的组合物和方法。更具体地，本发明提供结合AIP2的人抗体、这些抗体的AIP2-结合片段和衍生物，以及包含这些片段的AIP2-结合多肽。进一步地，本发明提供编码这些抗体、抗体片段和衍生物，以及多肽的核酸，包含这些多聚核苷酸的细胞，制备这些抗体、抗体片段和衍生物以及多肽的方法，和使用这些抗体、抗体片段和衍生物，以及多肽的方法；使用这些抗体、抗体片段和衍生物，以及多肽的方法包括治疗或诊断患有AIP2相关细菌感染(包括通常由金黄色葡萄球菌引起的感染，特别是由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))的受试者。
本发明得到美国国立卫生研究院(NIH)资助1R42AI098182的部分支持。联邦政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
自从金黄色葡萄球菌最早于1880年由AlexanderOgston爵士发现以来，其能够引起多种感染，已被视为对人类健康的严重威胁。在20世纪60年代和70年代耐抗生素菌株的兴起，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的兴起，引起另外的治疗挑战。目前，在美国，MRSA菌株占引起临床疾病的所有金黄色葡萄球菌>50％菌株。与其它国家(比如，法国为14.5％而荷兰为3.1％)相比，这是高得多的比例。回顾来自西欧的31项观察性研究，作者发现在金黄色葡萄球菌中临床分离的MRSA百分比范围在5％至54％之间，但其受到在研究中使用的不同方法的限制。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是造成人类几个难治疗的感染的细菌。它也被称为多重耐药性金黄色葡萄球菌和耐苯唑西林金黄色葡萄球菌(ORSA)。MRSA是已经发展成对β-内酰胺抗生素，包括青霉素(比如甲氧苯青霉素、dicloxam、萘夫西林和苯唑西林)和头孢菌素耐受的金黄色葡萄球菌的任何菌株。无法抵抗这些抗生素的菌株被归类为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)。相比没有抗生素抗性的金黄色葡萄球菌菌株，这种抗性的发展不会导致有机体在本质更致命，但抗性确实使MRSA感染更难以用标准型抗生素治疗，因而更危险。MRSA在医院、监狱、学校、养老院中特别麻烦，具有开放性伤口的患者、侵入性装置和虚弱的免疫系统具有比公众更大的感染风险。
MRSA菌株是普遍存在的细菌病原体，其引起保健和社区相关的感染。对常用的抗生素增加抗性使得MRSA在世界各地严重威胁公众健康。MRSA的USA300菌株一直是造成社区相关感染(大部分涉及皮肤及软组织，但也涉及更严重的侵入性症状，比如肺炎，严重的脓毒症和心内膜炎)在美国流行的原因。MRSA菌株是具有包括毒素、粘附素、酶和免疫调节剂的致病机制的特别严重和潜在的致命病原体。其中之一是潘顿—瓦伦丁杀白细胞素(PVL)——与脓肿形成和严重的坏死性肺炎相关的毒素。
起初，MRSA菌株折磨住院患者和患有慢性疾病的患者。二十世纪九十年代观察到社区相关MRSA(CA-MRSA)菌株在不同的健康个体(通常是儿童)的出现主要引起皮肤及软组织感染(SSTI)。这些菌株迅速导致CA-MRSA感染(包括具有严重后果的一些感染，例如，具有高死亡率的社区获得性肺炎)的流行。在美国，在感染的MRSA菌株之间，CA-MRSA的高患病率主要是由于潘顿—瓦伦丁杀白细胞素(PVL)阳性USA300克隆，而在欧洲，CA-MRSA的主要菌株是PVL阳性ST80克隆。数学模型预测，由于社区储主扩大，CA-MRSA将成为在医院占主导地位的MRSA菌株，CA-MRSA菌株比医院相关类型更适应(较高的复制能力)并且CA-MRSA感染会越来越严重(D’Agata等人，Clin.Infect.Dis.48,274–284,2009)。
针对MRSA菌株的致病机制的药剂相比抗生素具有若干优势。首先，将不会对其它非病原性共生细菌施加选择压力。第二，可以避免抗生素的相关毒性(例如，过敏反应、肾毒性和艰难梭菌感染)。第三，限制抗生素可能减少抗药性细菌的进化。抗病毒疗法与传统抗生素的结合有可能改变对付MRSA感染的规范。因为细菌存活并不受它的致病机制的作用的影响，使对抗致病疗法的耐受放慢发展是可能的。潜在的策略是抑制agr操纵子。体外实验表明，自动诱导肽(AIP)的变体抑制AgrC功能。体内研究证明同时施用AIP-2与agr1型菌株降低脓肿的形成(Wright等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102,1691–1696,2005)。然而，agr抑制剂可促进生物膜的形成，这可能导致慢性金黄色葡萄球菌感染(Beenken等人，PLoSONE5,e10790,2010)。因此，需要对这种方法进行进一步的研究。
另一种用于装置的策略是利用纳米材料以防止生物膜的形成(Taylor&Webster,Int.J.Nanomedicine6,1463–1473,2011)，纳米材料定义为至少一个尺寸小于100nm的材料。在临床实践中使用SilverPage内衬导尿管和中心静脉导管，以降低保健相关的感染风险(Raad等人,Antimicrob.AgentsChemother.56,935–941,2012)。银粒径降低到纳米范围增大了表面积，改善了材料的抗菌活性(Taylor&Webster,Int.J.Nanomedicine6,1463–1473,2011)。葡萄金黄色素是金黄色葡萄球菌的色素，其帮助金黄色葡萄球菌抵抗活性氧类比如由嗜中性粒细胞释放的活性氧类。葡萄金黄色素生产的早期步骤类似于胆固醇生产的步骤。人类鲨烯合酶抑制剂阻断葡萄金黄色素在体外的生物合成，产生无色素的细菌，在小鼠模型中，该无色素的细菌更易被人血液杀死并由先天免疫系统清除(Liu等人,Science319,1391–1394,2008)。他汀类药物被证明通过由人和鼠嗜中性粒细胞，巨噬细胞和单核细胞产生基于抗菌DNA的胞外诱捕网增强吞噬细胞对金黄色葡萄球菌的清除(Chow等人,CellHostMicrobe8,445–454,2010)。
对于CA-MRSA感染，一个具体的靶是PVL毒素，并且正在调查研究针对CA-MRSA的抗体作为潜在的疫苗。然而，在针对PVL阳性MRSA感染儿童的PVL的抗体水平研究中，针对PVL的中和抗体不能防止原发性或复发性CA-MRSA皮肤感染(Hermos等人，Clin.Infect.Dis.51,1138–1146,2010)。使用皮肤坏死症(dermonecrosis)小鼠模型的其它研究者评估人C5a的激动剂(称为EP67)诱导宿主对CA-MRSA免疫的能力(Sheen等人，Vaccine30,9–13,2011)。EP67通过促进细胞因子合成和中性粒细胞流入有效限制感染。可能需要在人中进一步调查这个充满希望的发现。
肽聚糖(PG)包含金黄色葡萄球菌大约50％的细胞壁。针对金黄色葡萄球菌的基于PG的疫苗，A170PG，被证明在小鼠模型中预防MRSA的若干菌株，包括A174、A175、A176和RIMD31092(Capparelli等人，PLoSONE6,e28377,2011)。该防护与存活增加和定植减少相关并持续至少40周。该研究的一注意事项是所用的小鼠菌株不能密切模仿人感染，因为小鼠没有预先存在的金黄色葡萄球菌的抗体。2011年6月，Merck和Intercell宣布含有金黄色葡萄球菌抗原IsdB(位于细胞表面的铁调节蛋白)的亚单位疫苗V170的发展终止于II/III期(Etz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,6573–6578,2002)。相比接受无效对照剂的接受者，由于该疫苗接种者总死亡率和多机能障碍增加，引起安全问题。
发明内容
本发明提供以至少10-6M的结合亲和力结合至AIP2表位的IgG类全人抗体，其重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2(在此称为A9)、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4(在此称为C7)、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6(在此称为D3)、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8(在此称为E7)、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10(在此称为F7)、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12(在此称为G3)、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14(在此称为G4)、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16(在此称为H1)及其组合。
本发明提供全人抗体Fab片段，其具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可变结构域，其中该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
本发明提供单链人抗体，其具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可变结构域，以及连接该重链和轻链可变结构域的肽接头，其中该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该人全长单链抗体具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该人全长单链抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
本发明进一步提供用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，该方法包括服用抗AIP2多肽，其中该全人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸具有至少95％一致性；
其中该全人抗体Fab片段的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性；并且
其中该单链人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2(在此称为A9)、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4(在此称为C7)、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6(在此称为D3)、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8(在此称为E7)、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10(在此称为F7)、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12(在此称为G3)、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14(在此称为G4)、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16(在此称为H1)及其组合。优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2(在此称为A9)、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4(在此称为C7)、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6(在此称为D3)、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8(在此称为E7)、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10(在此称为F7)、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12(在此称为G3)、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14(在此称为G4)、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16(在此称为H1)及其组合。优选地，该人全长单链抗体具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该人全长单链抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
优选地，用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法是治疗或预防由MRSA金黄色葡萄球菌引起的感染。
附图说明
图1展示人抗AIPmAbsC7和E7降低腹膜内感染USA100的小鼠的死亡率。通过对数秩检验确定P≤.0006和.0008分别和对照IgG和E7或C7的对比。
图2展示了人抗AIPmAbsC7和E7降低感染USA100的小鼠的脓肿尺寸。通过配对T检验测试在每一天P≤.01-.04，E7和对照组的对比。
图3展示了人抗AIPmAbE7降低腹膜内感染MSSARN4850的小鼠的死亡率。
具体实施方式
本发明提供以10-6M或更小的结合亲和力结合至AIP2表位的IgG类全人抗体，其重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2(在此称为A9)、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4(在此称为C7)、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6(在此称为D3)、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8(在此称为E7)、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10(在此称为F7)、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12(在此称为G3)、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14(在此称为G4)、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16(在此称为H1)及其组合。
本发明提供全人抗体Fab片段，其具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可变结构域，其中该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
本发明提供单链人抗体，其具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可变结构域，以及连接该重链和轻链可变结构域的肽接头，其中该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该人全长单链抗体具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该人全长单链抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
本发明进一步提供用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，该方法包括服用抗AIP2多肽，其中该抗AIP2多肽选自IgG类全人抗体、全人抗体Fab片段、单链人抗体，及其组合，该全人抗体以至少10-6M的结合亲和力结合至AIP2表位，该全人抗体Fab片段具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可变结构域，该单链人抗体具有来自重链的可变结构域和来自轻链的可变结构域，以及连接该重链和轻链可变结构域的肽接头；
其中该全人抗体的重链可变结构域序列与选自下组及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与选自SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性；
其中该全人抗体Fab片段的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性；以及
其中该单链人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。优选地，该全人抗体具有重链和轻链，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。优选地，该全人抗体Fab片段具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。优选地，该人全长单链抗体具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该人全长单链抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
优选地，用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法是治疗或预防由MRSA细菌引起的感染。
“抗原结合蛋白”是一种蛋白质，其包括结合至抗原的一部分，和可选地，使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白结合至抗原的构象的骨架或框架部分。抗原结合蛋白的例子包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物，和抗体类似物。该抗原结合蛋白可以包括，例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的可替代的蛋白质骨架或人工骨架。这些骨架包括，但不限于，抗体衍生的骨架(包括引入以例如使抗原结合蛋白的三维结构稳定的突变)以及完全合成的骨架，包括，例如，生物相容性聚合物。参见，例如，Korndorfer等人,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,Volume53,Issue1:121-129；Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用肽抗体类似物(“PAM”)以及基于抗体类似物的骨架(利用纤维连接蛋白组件作为骨架)。
抗原结合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的、约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分限定主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分为κ或λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并定义抗体同型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，并且重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常参见，FundamentalImmunology第7章(Paul,W.,编辑,第二版.Raven出版,N.Y.(1989))(通过引用结合其全部内容用于所有目的)。每条轻/重链的可变区配对形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
天然存在的免疫球蛋白链的可变区显示出相同的一般结构：由三个高变区，也称为互补决定区或CDR，连接相对保守的构架区(FR)。从N端至C端，轻链和重链都包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。每个结构域的氨基酸分配与Kabat等人在SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.,USDept.ofHealthandHumanServices,PHS,NIH,NIH公开号91-3242,1991中的定义一致。免疫球蛋白链的氨基酸的其它编号系统包括IMGT.RTM(国际ImMunoGeneTics信息系统；Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.29:185-203；2005)和AHo(HoneggerandPluckthun,J.Mol.Biol.309(3):657-670；2001)。
可以从比如血清或血浆获得抗体，血清或血浆含有具有各种抗原特异性的免疫球蛋白。如果将这样的抗体进行亲和纯化，其可以通过特定的抗原特异性富集。通常由少于约10％的对特定的抗原具有特定的结合活性的抗体制备这些富集的抗体。这些制备进行若干轮亲和纯化可以增加对抗原具有特定的结合活性的抗体的比例。以这种方式制备的抗体通常称为“单特异性”。单特异性抗体制备可以由约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％，或99.9％对特定抗原具有特定的结合活性的抗体组成。
除非另有说明，“抗体”是指完整的免疫球蛋白或与完整的抗体为特定的结合而竞争的抗原结合部分。可以通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶或化学切割产生抗原结合部分。抗原结合部分包括，特别是，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和多肽(含有足以使抗原特异性结合至所述多肽的免疫球蛋白的至少一部分)。
Fab片段为具有VL、VH、CL和CH1结构域的单价片段；F(ab')2片段为双价片段，其通过在铰链区的二硫键连接2个Fab片段；Fd片段具有VH和CH1结构域；Fv片段具有抗体的单臂的VL和VH结构域；并且dAb片段具有VH结构域、VL结构域，或VH或VL结构域的抗原结合片段(专利号为6,846,634、6,696,245的美国专利，公布号为20/0202512、2004/0202995、2004/0038291、2004/0009507、2003/0039958的美国专利申请和Ward等人，Nature341:544-546,1989)。
单链抗体(scFv)为这样的抗体：VL和VH区通过接头(例如，氨基酸残基的合成序列)连接以形成连续的蛋白链，其中该接头足够长以使得蛋白链自身能够往回折叠并形成单价抗原结合位点(参见，例如Bird等人，1988,Science242:423-26和Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-83)。双抗体为二价抗体，其包含2条多肽链，其中每条多肽链包含由接头连接的VH和VL结构域，该接头太短而不能使相同链上的2个结构域之间配对，因此使得每个结构域与在另一多肽链上的互补结构域配对(参见，例如Holliger等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-48,和Poljak等人，1994,Structure2:1121-23)。如果双抗体的两条多肽链是相同的，那么来源于其配对的双抗体将具有2个相同的抗原结合位点。具有不同序列的多肽链可以用于制备具有2个不同抗原结合位点的双抗体。类似地，三抗体和四抗体分别为包含3条和4条多肽链并分别形成3个和4个抗原结合位点(可以是相同的或是不同的)的抗体。可以利用Kabat等人的上述文献、Lefranc等人的上述文献和/或Honegger和Pluckthun的上述文献描述的系统识别指定抗体的互补决定区(CDR)和框架区(FR)。可以将一个或多个CDR通过共价键或非共价键整合到分子中以使其成为抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以使CDR整合为较大的多肽链的一部分，可以通过共价键将CDR连接至另一条多肽链，或可以通过非共价键整合CDR。CDR使该抗原结合蛋白特异性结合至特定的感兴趣的抗原。
抗原结合蛋白可以具有一个或更多个结合位点。如果多于一个结合位点，那么结合位点可以与另一个结合位点相同或不同。例如，天然存在的人免疫球蛋白通常具有两个相同的结合位点，而“双特性性”或“双功能”抗体具有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括所有具有来自人免疫球蛋白序列的一个或多个可变区和恒定区的抗体。在一个实施例中，所有的可变结构域和恒定结构域来自人免疫球蛋白序列(全人抗体)。这些抗体可以以各种方式制备，例子如下文所述，包括通过用感兴趣的小鼠抗原(通常修饰为表达来源于编码人重链和/或轻链的基因)免疫。
人源化抗体的序列与来源于非人物种的抗体的序列不同，区别在于一个或更多个氨基酸取代、缺失，和/或增加，使得当人受试者服用时，人源化抗体相比非人物种的抗体不太可能诱导免疫应答，和/或诱导不太严重的免疫应答。在一个实施例中，使非人物种抗体的重链和/或轻链的框架和恒定结构域中的某些氨基酸突变以产生人源化抗体。在另一实施例中，来自人抗体的恒定结构域融合至非人物种的可变结构域中。在另一实施例中，改变非人抗体的一个或更多个CDR序列的一个或更多个氨基酸残基以降低当人受试者服用非人抗体时该非人抗体可能的免疫原性，其中改变的氨基酸残基对抗体与其抗原的免疫特异性结合不是关键性的，或对氨基酸序列进行的改变是保守改变，使得人源抗体与抗原的结合不会比非人抗体与抗原的结合明显更差。专利号为6,054,297、5,886,152和5,877,293的美国专利中可以得到如何制备人源化抗体的例子。
术语“嵌合抗体”指的是这样的抗体：含有来自一个抗体的一个或多个区和来自一个或多个其它抗体的一个或更多个区的抗体。在一个实施例中，一个或多个CDR来源于人抗AIP2抗体。在另一实施例中，所有的CDR来源于人抗AIP2抗体。在另一实施例中，来自多于一个人抗AIP2抗体的CDR混合并匹配在嵌合抗体中。例如，嵌合抗体可以包括来自第一人抗PAR-2抗体的轻链的CDR1，来自第二人抗AIP2抗体的轻链的CDR2和CDR3，以及来自第三抗AIP2抗体的重链的CDR。其它组合也是可能的。
此外，框架区可以来源于相同抗AIP2抗体中的一个，来自一个或更多个不同抗体，比如人抗体，或来自人源化抗体。在嵌合抗体的一个例子中，重链和/或轻链的一部分与来自特定物种，或属于特定抗体类或子类，的抗体相同、同源，或来源于该特定物种的抗体，而链的剩余部分与来自另一物种，或属于特定抗体类或子类的抗体相同、同源或来源于该另一物种的抗体。也包含这些抗体中展示预期生物活性(即，特异性结合AIP2的能力)的片段。
“中和抗体”或“抑制性抗体”为当使用比如在此描述的实施例中的试验，过量的抗AIP2抗体降低至少约20％的活性量时，抑制AIP2的蛋白水解活性的抗体。在各种实施例中，抗原结合蛋白降低至少30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％和99.9％AIP2蛋白水解活性量。
本领域普通技术人员根据本说明书的教导并使用本领域已知技术可以容易地制备抗体片段或类似物。优选的片段或类似物氨基端和羧基端出现在功能结构域的边界附近。通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公共或专属序列数据库比较可以识别结构和功能结构域。计算机化的比较方法可用于识别序列基序或预测发生在已知结构和/或功能的其它蛋白质中的蛋白质构象结构域。已知晓识别折叠成已知的三维结构的蛋白序列的方法。参见，Bowie等人,1991,Science253:164。
“CDR移植抗体”是这样的抗体：其包含来源于特定物种的或同种型抗体的一种或更多种CDR和另一相同或不同物种或同种型抗体的框架。
“多特异性抗体”是识别在一个或更多个抗原上的一个以上表位的抗体。该类抗体的子类为“双特异性抗体”，其识别在相同或不同抗原上的2个不同的表位。
如果抗原结合蛋白以1纳摩尔级或更小的解离常数结合至抗原，那么其“特异性结合”至抗原(例如，人AIP2)。
“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或”抗原结合位点”为含有与抗原相互作用并造成抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于特异性结合至其抗原的抗体，这包括其CDR结构域中的至少一个的至少一部分。
“表位”为被抗原结合蛋白(例如，通过抗体)绑定的分子的一部分。表位包括分子非邻近部分(例如在多肽中，在多肽的一级序列中不邻近的氨基酸残基但在多肽的三级和四级结构的情况下彼此足够接近从而能被抗原结合蛋白绑定)。
通过利用GAP计算机程序[GCGWisconsinPackage的一部分，版本10.3(Accelrys，加利福尼亚州圣地亚哥)，使用其默认参数]比较序列确定两条多聚核苷酸或两条多肽序列的“百分比一致性”。
术语“多聚核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”全部可替换地使用并包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如，mRNA)、用核苷酸类似物(例如，肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA类似物，及其杂种。核酸分子可以为单链或双链。在一个实施例中，本发明的核酸分子包括编码抗体的连续开放阅读框，或片段、衍生物、突变体，或变体。
如果两个单链多聚核苷酸的序列可以在反向平行的方向比对，使得在没有引入空隙，并且在任何一条序列的5'或3'端没有不配对的核苷酸的情况下，一个多聚核苷酸中的每个核苷酸与另一多聚核苷酸中的互补核苷酸是相对的，那么该两个单链多聚核苷酸是彼此的“互补物”。如果两个多聚核苷酸可在适度严格的条件下彼此杂交，那么多聚核苷酸可以与另一多聚核苷酸互补。因此，多聚核苷酸可以与另一多聚核苷酸互补而不是其互补物。
“载体”为可以用于将连接至该载体的其它核酸引入细胞的核酸。一类载体为“质粒”，其指的是线性或环形双链DNA分子，可以将另外的核酸片段连接至该双链DNA分子。另一类载体为病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，其中可将另外的DNA片段引入到病毒基因组中。某些载体能够在其所引入的宿主细胞中自主复制(例如，包括细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后被整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。“表达载体”为可以直接表达选定的多聚核苷酸的一类载体。
如果调节序列影响核苷酸序列的表达(例如，表达的水平、时间或位置)，那么核苷酸序列“可操作地连接”至调节序列。“调节序列”为影响其可操作地连接的核酸的表达例如，表达的水平、时间或位置)的核酸。调节序列可以，例如，直接在调节的核酸上，或通过一个或更多个其它分子(例如，结合至该调节序列的多肽和/或核酸的多肽)的作用施加其影响。调节序列的例子包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，多聚腺苷酸信号)。例如，Goeddel,1990,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,Calif.和Baron等人,1995,NucleicAcidsRes.23:3605-06中描述了调节序列的另外的例子。
“宿主细胞”为可以用于表达核酸(例如，本发明的核酸)的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如，大肠杆菌，或其可以是真核细胞，例如，单细胞真核细胞(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞，或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括COS-7系猴肾细胞(ATCCCRL1651)(参见Gluzman等人，1981,Cell23:175)、Lcells、C127cells、3T3cells(ATCCCCL163)、DHFR有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物如素食CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系((参见Rasmussen等人，1998,Cytotechnology28:31)或CHO菌株DX-B11(参见Urlaub等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCCCCL70)(参见McMahan等人，1991,EMBOJ.10:2821)、人胚肾细胞(比如293,293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞，人Colo205细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织、初生外植体的体外培养物的细胞菌株、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。通常，宿主细胞是能够用编码多肽的核酸(其随后可以在宿主细胞中表达)转化或转染的培养的细胞。词组“重组宿主细胞”可以用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以为包含核酸但除非将调节序列引入到该宿主细胞，使该调节序列可操作地连接至该核酸，否则不以想要的水平表达该核酸的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅仅指特定的受试者细胞，还指这种细胞的后代或潜在的后代。由于，例如突变或环境影响，在连续的新一代中可能出现一些修饰，因此实际上，这些后代可以与亲代细胞相同或不同，但都包含在在此使用的术语的范围内。
可以利用本领域已知的任何标准方法产生本发明的多肽。在一个实施例中，通过重组DNA方法，将编码多肽的核酸序列(例如，cDNA)插入到重组表达载体中并且在促进表达的条件下表达DNA序列，产生该多肽。
可以化学合成编码在此公开的各种多肽中的任何一条的核酸。可以选择密码子使用，以提高在细胞中的表达。这些密码子使用取决于选择的细胞类型。已经制定了大肠杆菌和其它细菌，以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞和昆虫细胞中特定的密码子使用模式。参见，例如：Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003100(2):438-42、Sinclair等人，ProteinExpr.Purif.2002(1):96-105、ConnellND.Curr.Opin.Biotechnol.200112(5):446-9、Makrides等人，Microbiol.Rev.199660(3):512-38，和Sharp等人，Yeast.19917(7):657-78。
例如，Sambrook等人，MolecularCloning:ALaboratoryManual,Vols.1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress,2ed.,1989,或F.Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(GreenPublishingandWiley-Interscience:NewYork,1987)中描述并定期更新用于核酸操作的常规技术，其内容通过引用结合于此文中。编码多肽的DNA可操作地连接至来自哺乳动物、病毒或昆虫基因的合适的转录或翻译调控元件。这些调控元件包括转录启动子、可选的控制转录的操纵序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。在宿主中复制的能力通常由复制起点赋予并且另外整合便于识别转化体的选定基因。
重组DNA也可以包括可以用于纯化蛋白质的任何类型的蛋白靶序列。蛋白靶的例子包括，但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签，或GST标签。CloningVectors:ALaboratoryManual,(Elsevier,N.Y.,1985)中可以找到与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。
利用适合于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中。本领域已知将核酸引入宿主细胞的各种方法，包括但不限于：电穿孔、采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染、基因枪法、脂质体转染，和感染(其中载体是传染剂)。合适的宿主细胞包括原核细胞、酵母、哺乳动物细胞，或细菌细胞。
合适的细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，大肠杆菌或杆菌属。酵母，优选来自酵母属物种，比如酿酒酵母，也可用于生产多肽。各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也可以用于表达重组蛋白。Luckow和Summers(Bio/Technology,6:47,1988)评论了在昆虫细胞中用于生产异源蛋白质的杆状病毒系统。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、COS-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚肾细胞、HeLa、293、293T，和BHK细胞系。通过培养合适的宿主/载体系统以表达重组蛋白制备纯化的多肽。对于许多应用，在大肠杆菌中表达在此公开的许多小尺寸多肽作为优选的表达方法。接着从培养基或细胞提取物中纯化蛋白质。
在此公开的蛋白质也可以使用细胞翻译系统产生。为了此类目，必须修饰编码多肽的核酸，从而能够进行体外转录以产生mRNA并且能够利用(真核细胞，比如哺乳动物或酵母无细胞翻译系统，或原核细胞，比如，细菌无细胞翻译系统)在特定的无细胞系统中进行mRNA的无细胞翻译。
也可以通过化学合成产生结合AIP2的多肽(例如，通过在SolidPhasePeptideSynthesis,2nded.,1984,ThePierceChemicalCo.,Rockford,Ill.中描述的方法)。也可以通过化学合成对蛋白进行修饰。
可以通过蛋白化学领域公知的蛋白分离/纯化方法纯化本发明的多肽。非限制性例子包括提取、重结晶、盐析(例如，用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附层析、离子交换层析、疏水层析、正相层析、反相层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析，亲和层析、电泳、逆流分配或其任意组合。纯化后，可以通过本领域已知的各种方法中的任何一种，包括但不限于，过滤和透析使多肽交换到不同的缓冲液和/或浓缩。
纯化后的多肽优选至少85％纯，更优选至少95％纯，并且最优选至少98％纯。无论纯度的确切数值如何，多肽都足够纯以用作药物产品。
多肽的翻译后修饰
在某些实施例中，本发明的结合多肽可以进一步包括翻译后修饰。蛋白翻译后修饰的例子包括磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖基化、泛素化、糖基化、羰基化、SUMO化，生物素化或多肽侧链或疏水基团的添加。结果是，修饰的可溶性多肽可含有非氨基酸元件，例如脂质、多糖或单糖，和磷酸盐。糖基化的优选形式是唾液酸化，其中一个或多个唾液酸部分与多肽结合。唾液酸部分改善溶解性和血清半衰期，同时还减少该蛋白质的可能的免疫原性。参见Raju等人Biochemistry.200131；40(30):8868-76。
在一个实施例中，所述可溶性多肽的修饰形式可以包括将所述可溶性多肽连接至非蛋白质的聚合物。在一个实施例中，该聚合物为聚乙二醇("PEG")、聚丙二醇，或聚氧化烯，如专利号为4,640,835、4,496,689、4,301,144、4,670,417、4,791,192或4,179,337的美国专利所述。
PEG是一种水溶性聚合物，其可在市场上买到或可以根据本领域周知的方法由乙二醇的开环聚合制备(SandlerandKaro,PolymerSynthesis,AcademicPress,NewYork,Vol.3,pages138-161)。术语“PEG”是用于广泛涵盖任何聚乙二醇分子，而不考虑大小或在PEG的一端的修饰，并且可以由下面的分子式表示：X--O(CH2CH2O)n-CH2CH2OH(1)，其中n为20至2300，并且X为H或末端修饰，例如：C1-4烷基。在一个实施例中，本发明的PEG以羟基或甲氧基，即，X为H或CH3("甲氧基PEG")终止于一端。PEG可以包含结合反应所需的另外的化学基团，该化学基团得自分子的化学合成，或者是使分子的各部分具有最佳距离的间隔段。另外，这种PEG可以由一条或更多条连接在一起的PEG侧链组成。具有多于一条PEG侧链的PEG被称为多臂或枝化状PEG。枝化状PEG可以通过，例如，将聚环氧乙烷加入各种多元醇中，包括甘油，季戊四醇，和山梨糖醇。例如，四臂枝化状PEG可以由季戊四醇和环氧乙烷制备。例如，EP-A0473084和专利号为5,932,462的美国专利描述了枝化状PEG。PEG的一种形式是由赖氨酸的伯氨基连接的两个PEG侧链(PEG2)(Monfardinietal.,BioconjugateChem.6(1995)62-69)。
相对于未经修饰的结合多肽的清除率，PEG修饰的多肽的血清清除速率可以降低约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，或甚至90％。PEG修饰的多肽的半衰期(t1/2)相对于未修饰蛋白质的半衰期是增加的。相对于未经修饰的结合多肽的半衰期，结合PEG的多肽的半衰期可以增加至少10％、20％，30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、400％或500％，或者甚至1000％。在一些实施例中，在体外确定蛋白质半衰期，比如，在缓冲盐溶液或在血清中。在其它实施例中，蛋白质半衰期是在体内的半衰期，比如在动物的血清或其它体液中的蛋白质的半衰期。
治疗性制剂和给药方式
本发明的特征为用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，该方法包括服用抗AIP2多肽。给药的技术和剂量根据特定的多肽的类型和待治疗的特定症状而不同，但可以由技术人员轻易确定。通常，管理机构要求用作治疗剂的蛋白质试剂被配制成具有可接受的低水平热原。因此，治疗性制剂与其它治疗的区别通常在于：其基本上无热原，或者至少含有的热原不超过由适当的管理机构(例如，FDA)确定的可接受水平。
可以以单位剂量形式服用本发明的治疗性组合物和药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。作为非限制性的例子，可以在肠胃外(例如，静脉内，皮下)，口服，或局部给药。此外，可以采用任何基因治疗技术(使用编码本发明的多肽的核酸)，例如裸DNA递送，重组基因和载体，基于细胞的递送，包括离体操作患者的细胞等。
该组合物可以是用于口服给药的丸剂、片剂、胶囊、液体，或持续释放片剂、或用于静脉内、皮下或肠胃外给药的液体、或者用于局部给药的凝胶、洗剂、软膏、霜剂，或聚合物或其它持续释放的赋形剂。
例如，在"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy"(20thed.,ed.A.R.GennaroAR.,2000,LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,Pa.)可以找到本领域周知的制备制剂的方法。用于肠胃外给药的制剂可以，例如，含有赋形剂、无菌水、盐水、聚烷撑二醇比如聚乙二醇，植物来源的油，或氢化萘。生物相容的，可生物降解的交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物，或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物可以用于控制化合物的释放。纳米颗粒制剂(例如，可生物降解的纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、脂质体)可用于控制化合物的生物分布。其它有用的潜在的肠胃外递送体系包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒，渗透泵，可植入式输注系统，和脂质体。制剂中的化合物浓度根据许多因素，包括药物的给药剂量和给药途径而不同。
多肽能可选地作为药用可接受的盐，比如在制药工业中常用的无毒的酸加成盐或金属复合物。酸加成盐的例子包括有机酸，比如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸，或三氟乙酸等；聚合酸比如单宁酸、羧甲基纤维素等；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸，等。金属复合物包括锌、铁，等等。在一个实施例中，在乙酸钠存在的情况下配制所述多肽，以增加热稳定性。
口服的制剂包括片剂，该片剂在与药用可接受的无毒赋形剂的混合物中含有活性成分。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖和山梨糖醇)、润滑剂、助流剂和抗粘合剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。
口服的制剂也可以下方式提供：可咀嚼片剂，或硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或软明胶胶囊剂，其中活性成分与水或油介质混合。
治疗有效剂量是指对服用的目的产生治疗效果的剂量。确切的剂量取决于待处理的病症，并且本领域技术人员可以利用已知技术确定。通常，每天服用约0.01μg/kg至约50mg/kg，优选0.01mg/kg至约30mg/kg，最优选0.1mg/kg至约20mg/kg的多肽。可以每天(例如，每天一次、二次、三次或四次)，或优选较低频率地(例如、每周、每两周、每三周、每月或每季度)给予该多肽。此外，如本领域已知，根据年龄以及体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和疾病的严重程度做出调整可能是必要的，并且将由本领域技术人员通过常规实验确定。
典型用途
AIP2结合多肽可单独服用或与一种或多种另外的治疗，例如化学疗法、放射疗法、免疫疗法、外科手术，或这些方法的任何组合联合服用。在如上所述的其它治疗策略的背景下，将服用AIP2结合多肽作为辅助疗法进行长期治疗同样是可能的。
在这些方法的某些实施例中，可以一起(同时地)或在不同时间(依次)服用一种或多种多肽治疗剂。此外，多肽治疗剂可以与另一类型的化合物一起服用以治疗癌症或抑制血管生成。在某些实施例中，可以单独使用本发明的抗AIP2抗体药剂。
在某些实施例中，为了诊断的目的，可以标记或不标记抗AIP2抗体片段的结合多肽。通常诊断分析需要检测结合多肽与AIP2的结合引起的配合物的形成。与抗体类似，可以直接标记该结合多肽或片段。可以采用各种标记，包括，但不限于：放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(如，生物素、半抗原)。本领域技术人员已知许多合适的免疫分析法(参见，例如，专利号为3,817,827、3,850,752、3,901,654，和4,098,876的美国专利)。当不标记时，该结合多肽可以用于分析中，比如凝聚分析。不标记的结合多肽也可以与其它(一种或多种)合适的试剂结合使用，该试剂可以用于检测该结合多肽，比如，与该结合多肽反应的标记的抗体或其它合适的试剂(例如，标记的蛋白质A)。
在一个实施例中，可以在酶免疫分析法中利用本发明的结合多肽，其中所述多肽可以连接至酶。当包含AIP2蛋白的生物样品与所述结合多肽合并时，在所述结合多肽和AIP2蛋白之间发生结合。在一个实施例中，含有表达AIP2蛋白的细胞(例如，内皮细胞)的样品与所述抗体合并，并且在该结合多肽和携带被该结合多肽识别的AIP2蛋白的细胞之间发生结合。这些绑定的细胞可以与未绑定的试剂分离并且可以确定特异地绑定细胞的结合多肽-酶轭合物的存在，例如，通过用酶的底物(当受到酶的作用时，底物产生颜色变化或其它可检测的变化)接触该样品。在另一实施例中，所述结合多肽可以不标记，并且可以加入识别所述结合多肽的、标记的第二多肽(例如，抗体)。
在某些方面，还可以制备用于检测AIP2蛋白在生物样品中的存在的试剂盒。这些试剂盒将包括结合至AIP2蛋白或所述受体的一部分的AIP2结合多肽，以及一种或多种适于检测该结合多肽和受体蛋白或其一部分之间的配合物的存在的辅助试剂。本发明的多肽组合物可以单独或与专门用于其它表位的另外的抗体联合制备成冻干形式。该结合多肽和/或抗体(可以标记或不标记)可以与附加成分(例如，缓冲剂，比如Tris，磷酸盐和碳酸盐、稳定剂、赋形剂、抗微生物剂和/或惰性蛋白质，例如，牛血清白蛋白)包含在该试剂盒中。例如，该结合多肽和/或抗体可以与附加成分一起制备成冻干混合物，或可以单独地提供该附加成分用于使用者组合。一般地，这些附加材料重量以占活性结合多肽或抗体的量小于约5％存在，通常以占多肽或抗体浓度至少约0.001％重量的总量存在。当采用能结合至该结合多肽的第二抗体时，可以在该试剂盒中，例如在单独的小瓶或容器中，提供这些抗体。该第二抗体，如果存在，通常是标记的，并且可以以与上文描述的抗体制剂相似的方式配制。
使用标准的一个或三个字母的缩写表示多肽序列。除非另有说明，每条多肽序列的氨基端在左而羧基端在右；每条单链核酸序列，和每条双链核酸序列的顶链，的5'端在左，而3'端在右。还可以通过解释特定多肽序列与参考序列如何不同描述该特定多肽序列。
除非另有说明，以下术语应该理解为具有下面的意思：
术语“肽”、“多肽”和蛋白质各指的是包括两个或多个氨基酸残基通过肽键彼此结合的分子。这些术语包含，例如，天然和人造蛋白、蛋白序列的蛋白片段和多肽类似物(比如突变体、变体，和融合蛋白)以及翻译后，或以其它方式通过共价键或非共价键修饰的蛋白。肽、多肽或蛋白质可以为单体或聚合物。
多肽的“变体”包括这样的氨基酸序列：其中相对于另一多肽序列，该氨基酸序列中插入、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基。公开的变体包括，例如，融合蛋白。
多肽的“衍生物”为已经进行化学修饰的多肽(例如，抗体)，例如，通过另一化学部分(比如，聚乙二醇或白蛋白，例如，人血清白蛋白)、磷酸化和糖基化。除非另有说明，术语“抗体”除了包括2条全长重链和两条全长轻链的抗体之外，包括其衍生物、变体、片段或突变体，其例子在下文有描述。
“抗原结合蛋白”是一种蛋白质，其包括结合至抗原的一部分，和可选地，使抗原结合部分采用促进抗原结合蛋白结合至抗原的构象的骨架或框架部分。抗原结合蛋白的例子包括抗体、抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体衍生物，和抗体类似物。该抗原结合蛋白可以包括，例如，具有移植的CDR或CDR衍生物的可替代的蛋白质骨架或人工骨架。这些骨架包括，但不限于，抗体衍生的骨架(包括引入以例如使抗原结合蛋白的三维结构稳定的突变)以及完全合成的骨架，包括，例如，生物相容性聚合物。参见，例如，Korndorfer等人,2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,Volume53,Issue1:121-129；Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。此外，可以使用肽抗体类似物(“PAM”)以及基于抗体类似物的骨架(利用纤维连接蛋白组件作为骨架)。
抗原结合蛋白可以具有，例如，天然存在的免疫球蛋白的结构。“免疫球蛋白”是四聚体分子。在天然存在的免疫球蛋白中，每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一条“轻”(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包括主要负责抗原识别的、约100至110或更多个氨基酸的可变区。每条链的羧基端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分为κ或λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α或ε，并定义抗体同型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。优选地，在此公开的抗EGFR抗体的特征在于在重链VH和轻链VL氨基酸序列中的其可变结构域序列。优选的抗体为A6，A6为κIgG抗体。在轻链和重链内，可变和恒定区通过约12或更多个氨基酸的“J”区连接，并且重链还包括约10个或更多个氨基酸的“D”区。通常参见，FundamentalImmunology第7章(Paul,W.,编辑,第二版.Raven出版,N.Y.(1989))。每条轻/重链的可变区配对形成抗体结合位点，使得完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。
“多特异性抗体”是识别在一个或更多个抗原上的一个以上表位的抗体。该类抗体的子类为“双特异性抗体”，其识别在相同或不同抗原上的2个不同的表位。
如果抗原结合蛋白以1纳摩尔级或更小的解离常数结合至抗原，那么其“特异性结合”至抗原(例如，人AIP2)。
“抗原结合结构域”、“抗原结合区”或”抗原结合位点”为含有与抗原相互作用并造成抗原结合蛋白对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(或其它部分)的抗原结合蛋白的一部分。对于特异性结合至其抗原的抗体，这包括其CDR结构域中的至少一个的至少一部分。
“表位”为被抗原结合蛋白(例如，通过抗体)绑定的分子的一部分。表位包括分子非邻近部分(例如在多肽中，在多肽的一级序列中不邻近的氨基酸残基但在多肽的三级和四级结构的情况下彼此足够接近从而能被抗原结合蛋白绑定)。
通过利用GAP计算机程序[GCGWisconsinPackage的一部分，版本10.3(Accelrys，加利福尼亚州圣地亚哥)，使用其默认参数]比较序列确定两条多聚核苷酸或两条多肽序列的“百分比一致性”。
“宿主细胞”为可以用于表达核酸的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如，大肠杆菌，或其可以是真核细胞，例如，单细胞真核细胞(例如，酵母或其它真菌)、植物细胞(例如，烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如，人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞，或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的例子包括COS-7系猴肾细胞(ATCCCRL1651)(参见Gluzman等人，1981,Cell23:175)、Lcells、C127cells、3T3cells(ATCCCCL163)、DHFR有缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物如素食CHO和在无血清培养基中生长的相关细胞系((参见Rasmussen等人，1998,Cytotechnology28:31)或CHO菌株DX-B11(参见Urlaub等人，1980,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216-20)、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系、来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCCCCL70)(参见McMahan等人，1991,EMBOJ.10:2821)、人胚肾细胞(比如293,293EBNA或MSR293)、人表皮A431细胞，人Colo205细胞、其它转化的灵长类细胞系、正常二倍体细胞、来源于初生组织、初生外植体的体外培养物的细胞菌株、HL-60、U937、HaK或Jurkat细胞。通常，宿主细胞是能够用编码多肽的核酸(其随后可以在宿主细胞中表达)转化或转染的培养的细胞。词组“重组宿主细胞”可以用于表示已经用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞也可以为包含核酸但除非将调节序列引入到该宿主细胞，使该调节序列可操作地连接至该核酸，否则不以想要的水平表达该核酸的细胞。应该理解，术语宿主细胞不仅仅指特定的受试者细胞，还指这种细胞的后代或潜在的后代。由于，例如突变或环境影响，在连续的新一代中可能出现一些修饰，因此实际上，这些后代可以与亲代细胞相同或不同，但都包含在在此使用的术语的范围内。
抗原结合蛋白
抗原结合蛋白(例如，抗体、抗体片段、抗体衍生物、抗体突变体，和抗体变体)为结合至AIP2的多肽。
包含一个或多个抗原结合蛋白的低聚体可以用作AIP2拮抗剂。低聚体可以为共价连接或非共价连接的二聚体，三聚体，或更高的低聚体的形式。可考虑使用包含两个或更多个抗原结合蛋白的低聚体，一个例子是同二聚体。其它低聚体包括异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等。
一个实施例针对包括通过在融合至该抗原结合蛋白的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接的多个抗原结合蛋白的低聚体。这种肽可以是肽接头(间隔段)，或具有促进低聚化的性质的肽。亮氨酸拉链和来源于抗体的某些多肽是能够促进附着至该肽的抗原结合蛋白的低聚化的肽，如下文更详细的描述。
在具体实施例中，低聚体包括两个至四个抗原结合蛋白。低聚体的抗原结合蛋白可以是任何形式的，如上述的任何形式，例如，变体或片段。优选地，该低聚体包括具有AIP2结合活性的抗原结合蛋白。
在一个实施例中，使用来源于免疫球蛋白的多肽制备低聚体。例如，在Ashkenazietal.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:10535、Byrnetal.,1990,Nature344:677，和Hollenbaughetal.,1992"ConstructionofImmunoglobulinFusionProteins",inCurrentProtocolsinImmunology,补充本4，第10.19.1-10.19.11页中已经描述了包含融合至抗体衍生的多肽的各个部分的某些异源多肽的融合蛋白的制备。
一个实施例针对包括两个融合蛋白的二聚体，该两个融合蛋白通过将抗AIP2抗体的AIP2结合片段融合至抗体的Fc区产生。可以通过如下步骤制备该二聚体：例如，将编码该融合蛋白的融合基因插入合适的表达载体中，在用重组表达载体转化的宿主细胞中表达该融合基因，并且使该表达的融合蛋白能够非常像抗体分子一样组装，因此在Fc部分之间形成链间二硫键以产生二聚体。
术语“Fc多肽”包括从抗体的Fc区衍生的、天然和突变形式的多肽。也包括含有促进二聚化的铰链区的、截尾形式的这种多肽。包括Fc部分的融合蛋白(以及由该融合蛋白形成的低聚体)具有如下优势：易于通过在蛋白A或蛋白G柱子上的亲和层析纯化。
制备低聚化抗原结合蛋白的另一方法涉及使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进发现该亮氨酸拉链结构域的蛋白质的低聚化的肽。亮氨酸拉链最初在若干DNA结合蛋白中识别(Landschulzetal.,1988,Science240:1759)，并且已经在各种不同的蛋白发现。已知的亮氨酸拉链中有二聚化或三聚化的天然存在的多肽及其衍生物。WO94/10308描述了适于产生可溶性低聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的例子，并且Hoppeetal.,1994,FEBSLetters344:191中描述了来源于肺表面活性蛋白-D(SPD)的亮氨酸拉链。Fanslowetal.,1994,Semin.Immunol.6:267-78中描述了修饰的亮氨酸拉链的使用，该修饰的亮氨酸拉链使与该亮氨酸拉链融合的异源蛋白能进行稳定的三聚化。在一种方法中，在合适的宿主细胞中表达包括抗AIP2抗体片段、融合至亮氨酸拉链肽的重组融合蛋白或衍生物，从培养物的上清液中回收可溶性低聚化抗AIP2抗体片段或其形成的衍生物。
可以通过常规技术产生本发明的抗原结合蛋白的抗原结合片段。这些片段的例子包括，但不限于Fab和F(ab')2片段。
本发明提供结合至AIP2的单克隆抗体。可以利用本领域已知的任何技术，例如，在完成免疫计划后，通过使从转基因动物中收集的脾细胞永生化，产生单克隆抗体。可以使用本领域已知的任何技术使脾细胞永生化，例如，通过使脾细胞与骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。在产生杂交瘤的融合步骤中使用的骨髓瘤细胞优选为不产生抗体的，具有高融合效率，和酶缺陷，使该骨髓瘤细胞不能在某些仅支持期望的融合细胞(杂交瘤)生长的选择培养基中生长。在小鼠融合中使用的合适的细胞系的例子包括Sp-20,P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；在大鼠融合中使用的细胞系的例子包括R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和48210。用于细胞融合的其它细胞系为U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6。
例如，在体外或体内检测AIP2多肽的存在的试验中，可以使用针对AIP2的抗原结合蛋白。也可以采用该抗原结合蛋白通过免疫亲和层析纯化AIP2蛋白。在此公开的方法中可以使用阻断性抗原结合蛋白。可以采用作为AIP2拮抗剂的抗原结合蛋白治疗任何AIP2诱导的症状，包括但不限于各种癌症。
在体外过程中可以采用抗原结合蛋白，或体内服用该抗原结合蛋白以抑制AIP2诱导的生物活性。因此，可以治疗由AIP2的蛋白水解活化作用(直接或间接)引起或恶化的病症，在此提供了例子。在一个实施例中，本发明提供治疗方法，该治疗方法包括使需要抗原结合蛋白的哺乳动物体内服用有效降低AIP2诱导的生物活性的量的阻断AIP2的抗原结合蛋白。
抗原结合蛋白包括抑制AIP2的生物活性的人全长单克隆抗体。
可以通过许多常规技术的任何一种制备抗原结合蛋白。例如，可以从天然表达该抗原结合蛋白的细胞中纯化该抗原结合蛋白(例如，可以从产生抗体的杂交瘤中纯化该抗体)，或利用本领域已知的任何技术，在重组表达体系中产生该抗原结合蛋白。参见，例如，MonoclonalAntibodies,Hybridomas:ANewDimensioninBiologicalAnalyses,Kennetetal.(编辑),Plenum出版社,纽约(1980)；和Antibodies:ALaboratoryManual,HarlowandLand(编辑),ColdSpringHarborLaboratory出版社，冷泉港实验室,纽约(1988)。
可以使用本领域已知的任何表达体系制备本发明的重组多肽。通常，用包括编码想要的多肽的DNA的重组表达载体转化宿主细胞。可以采用的宿主细胞为原核细胞、酵母或较高等真核细胞。原核细胞包括革兰氏阴性或革兰氏阳性有机体，例如，大肠杆菌或杆菌。较高等真核细胞包括昆虫细胞和哺乳动物来源的已建立的细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的例子包括COS-7系猴肾细胞(ATCCCRL1651)(Gluzmanetal.,1981,Cell23:175)、L细胞、293细胞、C127细胞、3T3细胞(ATCCCCL163)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、BHK(ATCCCRL10)细胞系和如McMahan等人，1991,EMBOJ.10:2821所述的来源于非洲绿猴肾细胞系CV1的CV1/EBNA细胞系(ATCCCCL70)。Pouwelsetal.(CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,N.Y.,1985)描述了与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适的克隆和表达载体。
可以在促进多肽表达的条件下培养转化细胞，并且通过常规蛋白纯化过程回收该多肽。一种这样的纯化过程包括使用亲和层析，例如在所有或部分绑定AIP2的基质上的亲和层析。在此考虑使用的多肽包括本质上同源的、基本上没有污染内源物质的哺乳动物抗AIP2重组抗体。
可以通过许多已知的技术的任何一种制备并筛选具有想要性质的抗原结合蛋白。某些技术涉及分离编码感兴趣的抗原结合蛋白的多肽链(或其一部分)的核酸，和通过重组DNA技术操纵该核酸。例如，该核酸可以融合至感兴趣的另一核酸，或被改变(例如，通过突变或其它常规技术)从而添加、缺失或取代一个或多个氨基酸残基。
可以通过氨基酸桥(短肽接头)连接重链和轻链可变结构域(Fv区)片段得到单条多肽链，形成单链抗体。通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间制备这些单链Fv(scFv)。取决于在两个可变结构域之间的柔性接头的长度，得到的多肽本身可以往回折叠以形成抗原结合单体，或其可以形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)(Korttetal.,1997,Prot.Eng.10:423；Korttetal.,2001,Biomol.Eng.18:95-108)。通过不同的包含VL和VH的多肽的结合可以形成结合至不同表位的多聚体scFv(Kriangkumetal.,2001,Biomol.Eng.18:31-40)。为生产单链抗体而开发的技术包括在美国专利4,946,778；Bird,1988,Science242:423；Hustonetal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879；Wardetal.,1989,Nature334:544,deGraafetal.,2002,MethodsMol.Biol.178:379-87中描述的那些技术。
已知用于从感兴趣的抗体得到不同亚类或同型的抗体，即，亚类转换，的技术。因此，例如，可以从IgM抗体得到IgG抗体，并且可以从IgG抗体得到IgM抗体。这些技术使这样的新抗体的制备能够进行：该新抗体具有给定抗体(亲本抗体)的抗原结合性质，但也展示不同于亲本抗体的抗体同型或亚类相关的生物性质。可以采用重组DNA技术。在这些过程中可以采用编码特定抗体多肽的克隆DNA，例如，编码想要的同型抗体的恒定结构域的DNA(Lanttoetal.,2002,MethodsMol.Biol.178:303-16)。此外，如果想要IgG4，那么在铰链区引入点突变(CPSCP->CPPCP)(Bloometal.,1997,ProteinScience6:407)以减缓形成内部H链二硫键(可以导致IgG4抗体异质性)的趋势也可能是理想的。
在特定的实施例中，本发明的抗原结合蛋白对AIP2的结合亲和力(Ka)为至少106。在其它实施例中，该抗原结合蛋白的Ka为至少107、至少108、至少109，或至少1010。在另一实施例中，该抗原结合蛋白的Ka与实施例中描述的抗体的Ka基本上相同。
在另一实施例中，本发明提供对AIP2具有低解离速率的抗原结合蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的Koff为1×10-4～-1或更低。在另一实施例中，该Koff为5×10-5～-1或更低。在另一实施例中，该Koff与在此描述的抗体的Koff基本上相同。在另一实施例中，该抗原结合蛋白以与在此描述的抗体的Koff基本上相同的Koff结合至AIP2。
在另一方面，本发明提供抑制AIP2的活性的抗原结合蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的IC50为1000nM或更低。在另一实施例中，该IC50为100nM或更低；在另一实施例中，该IC50为10nM或更低。在另一实施例中，该IC50与在实施例中描述的抗体的IC50基本上相同。在另一实施例中，该抗原结合蛋白以与在此描述的抗体的IC50基本上相同的IC50抑制AIP2的活性。
在另一方面，本发明提供结合至在细胞表面上表达的人AIP2的抗原结合蛋白，当这样绑定时，在不会使在细胞表面上的AIP2的量显著下降的情况下抑制AIP2在细胞中的信号传递活性。可以使用任何确定或评估在细胞表面上和/或内部的AIP2的量的方法。在其它实施例中，该抗原结合蛋白结合至表达AIP2的细胞使少于约75％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％、1％，或0.1％的细胞表面的AIP2内在化。
在另一方面，本发明提供在体外或体内(例如，使人受试者服用时)半衰期为至少一天的抗原结合蛋白。在一个实施例中，该抗原结合蛋白的半衰期为至少三天。在另一实施例中，该抗原结合蛋白的半衰期为四天或更长。在另一实施例中，该抗原结合蛋白的半衰期为八天或更长。在另一实施例中，该抗原结合蛋白是衍生的或修饰的使得其相比未衍生或未修饰的抗原结合蛋白具有较长的半衰期。在另一实施例中，该抗原结合蛋白含有一个或多个点突变以增加血清半衰期，比如在WO00/09560中所述，该文献通过引入并入本文。
本发明进一步提供多特异性抗原结合蛋白，例如，双特异性抗原结合蛋白，例如，通过两个不同的抗原结合位点或区域结合至2个不同的AIP2表位，或结合至AIP2的表位和另一分子的表位的抗原结合蛋白。此外，在此公开的双特异性结合蛋白可以包括来自在此描述的抗体的AIP2结合位点和来自在此描述的另一抗体(包括在此引用的其它公布文献中描述的那些抗体)的第二AIP2结合位点。可替换地，双特异性抗原结合蛋白可以包括来自在此描述的抗体之一的抗原结合位点和来自本领域已知的另一AIP2抗体，或来自通过已知的方法或在此描述的方法制备的抗体的第二抗原结合位点。
本领域已知许多制备双特异性抗体的方法。这些方法包括Milsteinetal.,1983,Nature305:537一文中描述的杂交-杂交瘤和抗体片段的化学交联(Brennanetal.,1985,Science229:81；Glennieetal.,1987,J.Immunol.139:2367；U.S.专利6,010,902)的使用。此外。可以通过重组手段产生双特性抗体，例如，利用亮氨酸拉链部分(即，来自Fos和Jun蛋白，其优先形成异源二聚体；Kostelnyetal.,1992,J.Immunol.148:1547)或如专利号为5,582,996的美国专利中描述的其它相互作用的“锁和钥匙”结构域结构。另外的有用技术包括专利号为5,959,083和5,807,706的美国专利中描述的技术。
在另一方面，该抗原结合蛋白包括抗体的衍生物。衍生的抗体可以包括任何赋予该抗体想要的性质(比如，在特定用途中增加半衰期)的分子或物质。该衍生的抗体可以包括，例如，可检测(或标记)部分(例如，放射性的、比色的、抗原的或酶分子)、可检测珠[例如，磁珠或电子致密(例如，黄金)珠]、或结合至其它分子(例如生物素或链霉亲和素)的分子、治疗或诊断部分(例如，放射性的、细胞毒素的或在药学上有活性的)，增加抗体对特定用途(例如，使受试者，比如人受试者服用，或其它体内或体外用途)的适用性的分子。可以用于衍生抗体的分子的例子包括白蛋白(例如，人血清白蛋白)和聚乙二醇(PEG)。可以利用本领域周知的技术制备连接白蛋白的和聚乙二醇化的抗体衍生物。在一个实施例中，该抗体缀合或以其他方式连接至转甲状腺素蛋白(TTR)或TTR变体。TTR或TTR变体可以用选自如下的化学制品进行化学修饰，例如，葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯烷酮)、聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇和聚乙烯醇。
实施例1
在CM5传感芯片上使用标准的NHS/EDC偶联方法固定抗体。所有的测量在HBS-EP缓冲液中以30μL/min的流速进行。稀释AIP2以获得一系列浓度。用1:1(朗缪尔)结合模型拟合数据。
表1
mAb Kon Koff Kd
C7 3.08E+5 0.016 52nM
D3 5.22E+5 0.0254 49nM
E7 1.15E+6 0.0736 64nM
实施例2
该实施例展示了使用驱动金黄色葡萄球菌agr的YFP报告基因菌株的群体感应淬灭。(用报告质粒pDB59转化的)金黄色葡萄球菌菌株代表agr组I(USA300/LAC),agr组II(USA100)，和agr组IV(MnTG)。所有的金黄色葡萄球菌报告基因菌株在补充10μg/mL氯霉素的大豆胰蛋白酶肉汤中37℃摇晃过夜生长。对于抗体抑制测试，将培养物在新鲜培养基中稀释100倍，在37℃孵化1小时，并且将180μL分配至96孔微量滴定板的孔中。将抗AIP2mAb在PBS中稀释为3mg/mL的工作浓度，并且在PBS中产生3倍连续稀释液，使得最终浓度为4.6×10-4mg/mL。将20μL各抗体稀释液加入微量滴定板中的报告基因培养物中，一式三份，得到另外的10倍稀释液。作为对照，将PBS用作模拟处理的样品(没有抗体)。板在37℃，以250rpm摇晃孵化22h。使用485nm的激发波长和530nm的发射波长在板读数器上测量吸光度和荧光。
表2
实施例3
该实施例展示了MRSA致死性腹膜炎感染模型的减轻。在中间指数生长期收集金黄色葡萄球菌菌株USA100，在无菌杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中洗涤，并重新悬浮于无菌DPBS中。为了测试抗AIP2抗体对金黄色葡萄球菌菌株USA100的致死挑战的功效，通过腹膜内(i.p.)接种，用1mg抗体对小鼠进行1小时预处理。在进行预处理之后，用100μL5.5x107菌落形成单元(CFU)感染所有小鼠，以感染USA100。对于前48h，每3h对小鼠进行监测，接着每天监测2次，持续72小时。如果该动物动弹不得，或不能吃或喝，那么对其实施安乐死。用C7和E7进行预处理导致致死率下降(图1)。显然，相比在对照IgG和PBS对照组中的0和10％存活，用E7预处理的小鼠存活率为80％。
实施例4
该实施例展示了在小鼠模型中，MRSA皮肤和软组织感染(SSTI)减轻。对于SSTI模型，将BALB/c小鼠(每个处理组8只小鼠)剃毛，并用与1mgC7、E7、对照mAb或PBS混合的2x106USA100进行皮下注射感染该小鼠。每天测量感染面积，持续10天。在所有测试日期中，用E7处理引起脓肿尺寸明显减小(图2)。
实施例5
该实施例展示了MSSA腹膜炎感染模型的减轻。在中间指数生长期收集产生AIP4的金黄色葡萄球菌菌株RN4850，在无菌杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)中洗涤，并重新悬浮于无菌DPBS中。为了测试抗AIP2抗体对产生AIP4的金黄色葡萄球菌RN4850的致死挑战的功效，通过腹膜内(i.p.)接种，用1mg抗体对小鼠进行1小时预处理。在进行预处理之后，用100μL2x108菌落形成单元(CFU)感染所有小鼠，以感染RN4850。对于前48h，每3h对小鼠进行监测，接着每天监测2次，持续72小时。如果该动物动弹不得，或不能吃或喝，那么对其实施安乐死。用E7进行预处理导致致死率下降(图3)。显然，相比在对照IgG和PBS对照组中的10％和0存活，用E7预处理的小鼠存活率为50％。这些数据证明抗AIP2mAbE7对产生AIP4的金黄色葡萄球菌菌株起到交叉保护作用。
序列表

Claims (12)

1.一种IgG类全人抗体，其以至少10-6M的结合亲和力结合至AIP2表位，所述全人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15、及其组合的氨基酸序列至少95％一致，并且所述全人抗体的轻链可变结构域序列与SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16、及其组合的氨基酸序列至少95％一致。
2.根据权利要求1所述的全人抗体，其特征在于，所述抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2(在此称为A9)、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4(在此称为C7)、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6(在此称为D3)、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8(在此称为E7)、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10(在此称为F7)、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12(在此称为G3)、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14(在此称为G4)、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16(在此称为H1)、及其组合。
3.一种全人抗体Fab片段，其具有来自重链的重链可变结构域和来自轻链的轻链可变结构域，其中该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。
4.根据权利要求3所述的全人抗体Fab片段，其特征在于，所述抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
5.一种单链人抗体，其具有来自重链的重链可变结构域和来自轻链的轻链可变结构域，以及连接该重链和轻链可变结构域的肽接头，其中该重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。
6.根据权利要求5所述的全人单链抗体，其特征在于，所述单链全人抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
7.根据权利要求5所述的全人单链抗体，其特征在于，所述全人单链抗体具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该全人单链抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
8.一种用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，该方法包括服用有效量的抗AIP2多肽，其中该抗AIP2多肽选自：以至少10-6M的结合亲和力结合至AIP2表位的IgG类全人抗体，具有来自重链的重链可变结构域和来自轻链的轻链可变结构域的全人抗体Fab片段，具有来自重链的重链可变结构域、来自轻链的轻链可变结构域以及连接该重链和轻链可变结构域的肽接头的单链人抗体，及其组合；
其中所述全人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且所述全人抗体的轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性；
其中所述全人抗体Fab片段的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且所述全人抗体Fab片段的轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性；以及
其中所述单链人抗体的重链可变结构域序列与选自SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6、SEQIDNO.7、SEQIDNO.9、SEQIDNO.11、SEQIDNO.13、SEQIDNO.15及其组合的氨基酸序列具有至少95％一致性，并且所述单链人抗体的轻链可变结构域序列与由SEQIDNO.2、SEQIDNO.4、SEQIDNO.6、SEQIDNO.8、SEQIDNO.10、SEQIDNO.12、SEQIDNO.14、SEQIDNO.16及其组合组成的氨基酸序列具有至少95％一致性。
9.根据权利要求8所述的用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其特征在于，所述全人抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
10.根据权利要求8所述的用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其特征在于，所述全人抗体Fab片段具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中该抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
11.根据权利要求8所述的用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其特征在于，所述全人单链抗体具有重链可变结构域和轻链可变结构域，其中所述全人单链抗体的重链/轻链可变结构域序列选自SEQIDNO.1/SEQIDNO.2、SEQIDNO.3/SEQIDNO.4、SEQIDNO.5/SEQIDNO.6、SEQIDNO.7/SEQIDNO.8、SEQIDNO.9/SEQIDNO.10、SEQIDNO.11/SEQIDNO.12、SEQIDNO.13/SEQIDNO.14、SEQIDNO.15/SEQIDNO.16及其组合。
12.根据权利要求8所述的用于治疗或预防金黄色葡萄球菌感染的方法，其特征在于，所述金黄色葡萄球菌感染是由MRSA引起的。
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