TW202231663A - 抗ｉｌ－４ｒ抗體或其抗原結合片段的複合物及醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本揭露關於抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物及醫藥用途。具體而言，提供特異性結合IL-4R的抗體或其抗原結合片段與毒素共價連接的複合物，含有該複合物的醫藥組成物，及其在製備治療IL-4R介導的疾病或病症的藥物中的用途，尤其在用於製備抗癌藥物中的用途。
Description
本申請要求2020年12月22日提交的中國專利申請202011529235.1的優先權。
本申請關於一種抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，以及其作為抗癌藥物的用途。
惡性腫瘤(癌症)是全球第二位死因，僅排在心臟病之後。神經膠質母細胞瘤(GBM)是最常見的惡性原發性腦瘤。經歷標準療法治療的膠質母細胞瘤患者的中位生存期小於15個月。儘管在腫瘤生物學方面的研究取得進展，但並未轉化成使患者受益的產品或療法。因此，有迫切需求去開發有效的方法用來治療神經膠質母細胞瘤。
IL-4R是白介素4受體，在腦膠質母細胞瘤腫瘤細胞以及浸潤的免疫抑制細胞(如腫瘤相關巨噬細胞(TAM)、髓系來源免疫抑制細胞(MDSC)等)上表達。靶向IL-4R的治療不僅可以殺傷腫瘤細胞，還
可以改善腫瘤微環境。在腦膠質母細胞瘤臨床前動物模型以及早期臨床實驗中，靶向IL-4R的治療均顯示優於傳統治療的效果。
Medicenna公司開發的MDNA55是IL-4與細菌毒素假單胞菌外毒素A(PE38KDEL)形成的融合蛋白，在臨床開發實驗中顯示了積極療效(參見WO9527732、Biochem.J.(1995)307，29-37、CANCER RESEARCH 55，3357-3363，August 1，1995)。
但是第一代的免疫毒素治療存在與靶標親和力不夠強等問題。提高免疫毒素的靶向性和親和力是腫瘤免疫毒素治療研究的重點與難點之一(參見“中國腫瘤臨床年鑑2009”，趙平主編，中國協和醫科大學出版社，2010年07月，第61頁)。
抗體-藥物偶聯物(ADC)旨在將單株抗體(mAbs)的選擇性與化療藥物的細胞毒性潛力結合起來。抗體-藥物偶聯物由“抗體(antibody)”、“接頭(linker)”和“藥物分子(drug)”三個主要組件構成。和傳統的完全或部分人源化抗體或抗體片段相比，抗體-藥物偶聯物因為能在腫瘤組織內釋放高活性的細胞毒素從而理論上療效更高；和融合蛋白相比，具有更高的耐受性或較低的副作用。抗體-藥物偶聯物與靶抗原的親和力影響抗體-藥物偶聯物滲透到腫瘤組織與靶抗原結合過程，並直接影響抗體-藥物偶聯物的黏合效率(參見“生物技術製藥”，馮美卿主編，中國醫藥科技出版社，2016年01月，第209-211頁)。
設計抗體-藥物偶聯物時，最關鍵的因素之一就是抗體的選擇，重要的是對抗原的高特異性。缺乏高特異性並與其他抗原發生交叉反應的抗體可能無法發揮預期作用，例如，藉由與健康組織相互作用而引起
脫靶毒性，或在到達腫瘤部位之前被機體過早清除(參見：“Introduction to Antibody-Drug Conjugates(ADCs)”，Ilona Pysz，Paul J.M.Jackson and David E.Thurston，CHAPTER 1：Introduction to Antibody-Drug Conjugates(ADCs)，in Cytotoxic Payloads for Antibody-Drug Conjugates，2019)。
目前各國已有多家製藥公司正在研發針對IL-4R的單株抗體，相關專利申請如WO2010053751、WO2001092340、WO2008054606、WO2014031610等。發明人的在先申請WO2020038454也關於一類新的抗IL-4R抗體。但是，IL-4R定向的抗體-藥物偶聯物鮮有明確報導，如WO2015188934、WO2014124227、WO2018217227等均僅泛泛提及抗體-藥物偶聯物中抗體可選靶向IL-4R，但均未披露具體的抗IL-4R抗體-藥物偶聯物。
本揭露利用高親和力的抗IL-4R抗體製備靶向遞送藥物的第二代免疫毒素藥物，達到強效殺傷癌細胞的目的，用於滿足癌症治療或延緩癌症進展的需求。
本揭露關於抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物、製備方法及醫藥用途。
複合物
本揭露提供了一種抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其包含：
抗IL-4R抗體或其抗原結合片段以及一個或多個毒素分子。
一些實施方案中，複合物中抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含：
(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
(II)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
和/或，抗體輕鏈可變區包含：
(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(II)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(III)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(IV)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段與該毒素共價或非共價連接。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自以下(I)至(IV)中的任一項：
(I)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(II)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(III)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(IV)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，
重鏈可變區包含：
(I)如SEQ ID NO：1所示或與SEQ ID NO：1具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：9所示或與SEQ ID NO：9具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：43所示或與SEQ ID NO：43具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
和/或，輕鏈可變區包含：
(I)如SEQ ID NO：2所示或與SEQ ID NO：2具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：10所示或與SEQ ID NO：10具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：37所示或與SEQ ID NO：37具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(IV)如SEQ ID NO：41所示或與SEQ ID NO：41具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列。
25G7 HCVR(25G7重鏈可變區)
25G7 LCVR(25G7輕鏈可變區)
7B10 HCVR(7B10重鏈可變區)
7B10 LCVR(7B10輕鏈可變區)
hu25G7-A LCVR(hu25G7-A輕鏈可變區)
hu25G7-B LCVR(hu25G7-B輕鏈可變區)
hu25G7-VH(hu25G7重鏈可變區)
在至少一個實施方案中，該抗IL-4R抗體或抗原結合片段中：
重鏈可變區如序列SEQ ID NO：1所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：2所示；或
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：9所示，輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：10所示；或
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：43所示，輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：37所示；或
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：43所示，輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：41所示；或
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：47所示，輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：48所示。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，
重鏈可變區包含：
(I)如SEQ ID NO：25-27之一所示或與SEQ ID NO：25-27之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：31-33之一所示或與SEQ ID NO：31-33之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；
和/或，輕鏈可變區包含：
(I)如SEQ ID NO：28-30之一所示或與SEQ ID NO：28-30之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：34-36之一所示或與SEQ ID NO：34-36之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列。
hu25G7-VH-a：
hu25G7-VH-b：
hu25G7-VH-c：
hu25G7-VL-a：
hu25G7-VL-b：
hu25G7-VL-c：
hu7B10-VH-a：
hu7B10-VH-b：
hu7B10-VH-c：
hu7B10-VL-a：
hu7B10-VL-b：
hu7B10-VL-c：
在一些具體的實施方案中，重鏈可變區如序列SEQ ID NO：25-27之一所示，和輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：28-30之一所示；或
重鏈可變區序列如SEQ ID NO：31-33之一所示，和輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：34-36之一所示。
在一些實施方案中，重鏈可變區第44位(VH-44)和輕鏈可變區第100位(VL-100)位置的胺基酸可選地突變成半胱胺酸。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含：
(I)如SEQ ID NO：17所示或與SEQ ID NO：17具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：19所示或與SEQ ID NO：19具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：44所示或與SEQ ID NO：44具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；
和/或輕鏈包含：
(I)如SEQ ID NO：18所示或與SEQ ID NO：18具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：20所示或與SEQ ID NO：20具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：45所示或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(IV)如SEQ ID NO：46所示或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列。
hu25G7 HC
hu25G7 LC
hu7B10 HC
hu7B10 LC
hu25G7 HC
hu25G7-A LC
hu25G7-B LC
在至少一個實施方案中，重鏈序列如SEQ ID NO：17所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示；或
重鏈序列如SEQ ID NO：19所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：20所示；或
重鏈序列如SEQ ID NO：44所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示；或
重鏈序列如SEQ ID NO：44所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：46所示。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或抗原結合片段是鼠源抗體、嵌合抗體、全人抗體、人源化抗體或其片段。在一些具體的實施方案中，該抗IL-4R抗體或抗原結合片段是人源化的。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系輕鏈模板IGKV3-11*01(SEQ ID NO：22，用於抗體25G7)
的FR區序列或與其至少有95%同一性的回復突變序列。在一些具體實施方案中，該回複突變選自46P、47W、71Y中的一個或多個。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系重鏈模板IGHV3-48*01(SEQ ID NO：21，用於抗體25G7)的FR區序列或與其至少有95%同一性的回復突變序列。在一些具體實施方案中，該回復突變選自94A、67S、93T中的一個或多個。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系輕鏈模板IGKV2D-29*01(SEQ ID NO：24，用於抗體7B10)的FR區序列或與其至少有95%同一性的回復突變序列。在一些具體實施方案中，該回複突變選自4L和/或58I。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系重鏈模板IGHV1-2*02(SEQ ID NO：23，用於抗體7B10)的FR區序列或與其至少有95%同一性的回復突變序列。在一些具體實施方案中，該回複突變選自69L、71I、73K、94K中的一個或多個。
人種系重鏈模版IGHV3-48*01：
人種系輕鏈範本IGKV3-11*01：
人種系重鏈模版IGHV1-2*02：
人種系輕鏈範本IGKV2D-29*01：
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重鏈恆定區或其變體。一些具體的方案中，包含人源IgG1的重鏈恆定區或其變體。在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含人源κ、λ鏈或其變體的恆定區。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：17所示或與其具有至少85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示或與其具有至少85%序列同一性。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：19所示或與其具有至少85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：20所示或與其具有至少85%序列同一性。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：44所示或與其具有至少
85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示或與其具有至少85%序列同一性。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：44所示或與其具有至少85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：46所示或與其具有至少85%序列同一性。
在一些實施方案中，提供一種分離的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，其特徵在於與如上所述的任一抗IL-4R抗體或其抗原結合片段竞争結合人IL-4R或其表位。
在一些實施方案中，提供一種雙特異性抗體或多特異性抗體，其含有如上所述的任一抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和/或重鏈可變區。
在另一些實施方案中，提供一種單鏈抗體，其含有如上所述的任一抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和/或重鏈可變區。
在一些實施方案中，人源化抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，還包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區、或其變體。在至少一個實施方案中，包含的是人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，因為IgG2或IgG4没有ADCC毒性。在另一個實施方案中，使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。在至少一個實施方案中，變體包含ADCC效應功能降低或缺失的重鏈恆定區突變，例如但不限於IgG1的297A、234A、235A。
在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段可以為抗體變體，該變體在輕鏈有1至10個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、
9、10個)胺基酸變化，和/或重鏈有1至10個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化。
在一些實施方案中，上述變體具有與親本抗IL-4R抗體或其片段相同或相似的生物学功能或效果。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段可以是已知的，如在例如WO2010053751、WO2001092340、WO2008054606、WO2014031610、WO2020038454(其各自藉由引用併入本文)中所描述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包括但不限於Dupixent、PRS-060、AK-120、63 IgG1、CBP201、AMG-317或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段是抗人IL-4R的抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2、線性抗體、scFv(單鏈Fv抗體)、串聯二-scFv、串聯三-scFv、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、sdAb(單域抗體或奈米抗體)、sdFv、肽抗體(peptibody)、結構域抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體)、dsFv(二硫鍵穩定化的Fv)、ScdsFv(二硫鍵穩定化的單鏈Fv抗體)。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或抗原結合片段引入穩定抗體結構的突變，例如一些胺基酸殘基突變為半胱胺酸殘基。在一些具體實施方案中，該突變發生在框架區；在一些具體實施方案中，該突變發生
在重鏈可變區和\或輕鏈可變區；在一些具體實施方案中，該突變發生在重鏈或輕鏈可變區和框架區。
在一些實施方案中，位於選自以下一組或多組位置上的胺基酸殘基突變成半胱胺酸殘基：VL100和VH44；VL101和VH44；VL34和VH100；VL43和VH91；VL43和VH103；VL49和H100；VL87和VH45；VL91和VH98；VL91和VH99；VL96和VH47；VL98和VH45。
在一些具體的實施方案中，位於選自以下一組或多組位置上的胺基酸殘基突變成半胱胺酸殘基：VL100和VH44；VL43和VH91；VL43和VH103；VL98和VH45。
在一個具體的實施方案中，VH44和VL100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
除非另有說明，本揭露的抗IL-4R抗體或其抗原結合蛋白中的胺基酸序列根據Kabat編碼。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或抗原結合片段是scFv或ScdsFv，重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)間用連接肽(linking peptide)L2連接。
在一些實施方案中，連接肽L2大於12個胺基酸殘基的長度，且富含小的、非極性的胺基酸殘基、極性的胺基酸殘基和/或親水的胺基酸殘基，例如，甘胺酸、絲胺酸和蘇胺酸。
在一些實施方案中，連接肽L2可以選自多種現有技術已知的接頭，包括“GS”接頭，例如，(GxS)n、(SxG)n、(GGGGS)n、(G)n，其中x是1-6的整數，且n是1-30的整數。
在一些實施方案中，連接肽L2非限制性例子包括GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO：54)、EGKSSGSGSESKEF(SEQ ID NO：55)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO：56)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO：57)、GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO：58)、SRSSG(SEQ ID NO：59)和SGSSC(SEQ ID NO：60)。
在一些實施方案中，連接肽L2由重複的GGGGS胺基酸序列(SEQ ID NO：61)或其變體組成，例如(GGGGS)n，其中n可以為0、1、2、3、4、5或者更多，例如n為2、3、4，例如n為3。
在一些實施方案中，ScFv的構建形式是VH-L2-VL，表示L2與VH的C端連接並與VL的N端連接；
在一些實施方案中，ScFv的構建形式是VL-L2-VH，表示L2與VL的C端連接並與VH的N端連接；
在一些實施方案中，ScdsFv的構建形式是VH-L2-VL，表示L2與VH的C端連接並與VL的N端連接；
在一些實施方案中，ScdsFv的構建形式是VL-L2-VH，表示L2與VL的C端連接並與VH的N端連接。
在一些實施方案中，毒素選自：細菌毒素、動物毒素或植物毒素。
在一些實施方案中，毒素包括截短型毒素或毒素變體，該毒素變體包含胺基酸缺失、插入、替換或其組合。
在一些實施方案中，毒素包括成孔毒素。
在一些實施方案中，成孔毒素包括嗜水氣單胞菌氣溶素(aerolysin)或氣單胞菌溶素原(proaerolysin)。
在一些實施方案中，毒素包括布加寧(bouganin)、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素(pseudomonas exotoxin、PE)、霍亂毒素(cholera toxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)。
在一些實施方案中，毒素包括但不限於假單胞菌外毒素的細胞毒性片段或細胞毒性變體。在例如美國專利第4,892,827號；第5,512,658號；第5,602,095號；第5,608,039號；第5,821,238號；第5,854,044號；第8,871,906號；第8,907,060號；第8,936,792號；第9,346,859號；第9,206,240號；和第9,388,222號(將其各自藉由引用併入本文)中該PE-LR、PE-LO10R456A、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE24、PE25、PE38QQR、PE38KDEL和PE35中的任一種或多種。
在一些實施方案中毒素包括如SEQ ID NO：49所示的PE38KDEL，也可以使用類似功能的PE38DKEL、PE38RDEL和PE38KNEL等變體。
本揭露的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，可選的進一步包含接頭(linker)L1。
接頭L1連接毒素和抗IL-4R抗體或其抗原結合片段。
合適的接頭L1通常允許本揭露的每個組分以三維結構進行折疊，這種三維結構非常類似於各組分在沒有任何接頭或其它組分的情況下所形成的結構。
在一些實施方案中，接頭L1在細胞外是穩定的，使得ADC在存在於細胞外環境中時保持完整，但在例如癌細胞的細胞中內化時能夠被裂解。
在一些實施方案中，合適的接頭L1可以包括，例如，蛋白酶敏感的、環境氧化還原電位敏感的、pH敏感的、酸可切割的、光可切割的和/或熱敏感的接頭。
在一些實施方案中，接頭L1可以是非蛋白性的，例如，化學接頭。非蛋白性化學接頭的例子包括但不限於：N-琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)-胺基苯甲酸酯，S-(N-琥珀醯亞胺基)硫代乙酸酯(SATA)，N-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-cu-甲基-a-(2-吡啶基二硫基)甲苯(SMPT)，N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基二硫基)-戊酸酯(SPP)，琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷甲酸酯(SMCC或MCC)，磺基琥珀醯亞胺基(4-碘乙醯基)-胺基苯甲酸酯，4-琥珀醯亞胺基-氧基羰基-α-(2-吡啶基二硫基)甲苯，磺基琥珀醯亞胺基-6-(α-甲基-α-(吡啶基二硫醇)-甲苯醯胺基)己酸酯，N-琥珀醯亞胺基-3-(-2-吡啶基二硫基)-丙酸酯(SPDP)，琥珀醯亞胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙醯胺基)己酸酯，磺基琥珀醯亞胺基6(3(-(-2-吡啶基二硫基)-丙醯胺基)己酸酯，馬來醯亞胺基己醯基(MC)，馬來醯亞胺基己醯基-纈胺酸-瓜胺酸-p-胺基苄氧基羰基(MC-vc-PAB)，3-馬來醯亞胺基苯甲酸N-羥基琥珀醯亞胺酯(MBS)，α-烷基衍生物，磺基NHS-ATMBA(磺基琥珀醯亞胺基N-[3-(乙醯基硫基)-3-甲基丁醯基-β-丙胺酸])，磺基二氯苯酚，2-亞胺基硫雜環戊烷(2-
iminothiolane)，3-(2-吡啶基二硫基)-丙醯基醯肼，Ellman氏試劑，二氯三嗪酸和S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱胺酸。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段與毒素形成的複合物是融合蛋白的形式。
在一些實施方案中，接頭L1是蛋白性接頭，包括但不限定於1個或多個胺基酸或多肽。接頭L1典型地包含約2-50個胺基酸殘基，例如約5-30個胺基酸殘基。通常，蛋白性的接頭包含大多數具有極性的、不帶電荷的和/或帶電荷的殘基的胺基酸殘基，例如，蘇胺酸、脯胺酸、穀胺醯胺、甘胺酸和丙胺酸等。蛋白性的接頭的非限制性例子包括丙胺酸-絲胺酸-甘胺酸-甘胺酸-脯胺酸-谷胺酸(ASGGPE)(SEQ ID NO：50)、纈胺酸-甲硫胺酸(VM)、丙胺酸-甲硫胺酸(AM)、AM(G2-4S)xAM，其中G是甘胺酸，S是絲胺酸，且x是1-10的整數。
在一些實施方案中，接頭L1選自以下以標準單字母代碼列出的肽：ASGCGPE(SEQ ID NO：62)、ASGCCGPE(SEQ ID NO：63)、ASGCGSCPE(SEQ ID NO：64)、ASCGTTGCPE(SEQ ID NO：65)、KASGKKYGCKKGPE(SEQ ID NO：66)、KGGGCAGGPE(SEQ ID NO：67)。
本揭露複合物的各個組分，例如抗IL-4R抗體或抗原結合片段、接頭L1和毒素，可以藉由本領域眾所周知的和/或本文描述的方式適當地彼此連接或融合。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或抗原結合片段藉由接頭L1與毒素彼此連接或融合。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或抗原結合片段的C端與接頭L1連接或融合。在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或抗原結合片段的N端與接頭L1連接或融合。在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或抗原結合片段C端和N端分別連接或融合相同或不同的接頭L1。
在一些實施方案中，毒素是假單胞菌外毒素、假單胞菌外毒素的截短型片段或毒素變體。
在一些實施方案中，毒素是假單胞菌外毒素的截短型片段PE38。
在一些實施方案中，毒素是SEQ ID NO：49所示的PE38KDEL，也可以使用類似功能的PE38DKEL、PE38RDEL和PE38KNEL等變體。
在一些實施方案中，L1是蛋白性接頭。
在一些實施方案中，L1選自ASGGPE(SEQ ID NO：50)、ASGCCGPE(SEQ ID NO：63)、ASGCGSCPE(SEQ ID NO：64)、ASCGTTGCPE(SEQ ID NO：65)、KASGKKYGCKKGPE(SEQ ID NO：66)、KGGGCAGGPE(SEQ ID NO：67)、AM(G2-4S)xAM，其中x是1-10的整數。
在一些實施方案中，ScFv特異性結合IL-4R，其中VH和VL間用連接肽L2連接，且VH和VL在框架區引入穩定抗體結構的突變。在一些實施方案中，VH-44、VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
在一些實施方案中，ScFv的構建形式是VH-L2-VL或VL-L2-VH。
L2由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如為(GGGGS)n，其中n可以為0、1、2、3、4、5或者更多，例如n為2、3、4，例如n為3。
在一些實施方案中，上述ScFv中所述VH包含：
(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或
(II)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
和/或該VL包含：
(I)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(II)胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(III)分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
(IV)分別如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，上述ScFv包含選自以下(I)至(IV)中的任一項：
(I)VH，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
VL，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(II)VH，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
VL，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(III)VH，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
VL，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
(IV)VH，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和
VL，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在一些實施方案中，上述ScFv中：
VH包含：
(I)如SEQ ID NO：1所示或與SEQ ID NO：1具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：9所示或與SEQ ID NO：9具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：43所示或與SEQ ID NO：43具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
和/或，VL包含：
(I)如SEQ ID NO：2所示或與SEQ ID NO：2具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：10所示或與SEQ ID NO：10具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：37所示或與SEQ ID NO：37具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或
(IV)如SEQ ID NO：41所示或與SEQ ID NO：41具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列。
視需要地，VH和VL在框架區引入穩定抗體結構的突變，在一些實施方案中，VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
在至少一個實施方案中，該ScFv中VH序列如SEQ ID NO：1所示，VL序列如SEQ ID NO：2所示；或
VH序列如SEQ ID NO：9所示，VL序列如SEQ ID NO：10所示；或
VH序列如SEQ ID NO：43所示，VL序列如SEQ ID NO：37所示；或
VH序列如SEQ ID NO：43所示，VL序列如SEQ ID NO：41所示，
視需要地，VH和VL在框架區引入穩定抗體結構的突變。
在一些實施方案中，VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。VH序列如SEQ ID NO：47所示，VL序列如SEQ ID NO：48所示。
在一些實施方案中，該ScFv，其中，
VH包含：
(I)如SEQ ID NO：25-27之一所示或與SEQ ID NO：25-27之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：31-33之一所示或與SEQ ID NO：31-33之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；
和/或VL包含：
(I)如SEQ ID NO：28-30之一所示或與SEQ ID NO：28-30之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：34-36之一所示或與SEQ ID NO：34-36之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列，
視需要地，VH和VL在框架區引入穩定抗體結構的突變。在一些實施方案中，VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
在一些具體的實施方案中，VH如序列SEQ ID NO：25-27之一所示，和VL如序列SEQ ID NO：28-30之一所示，VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸；或
VH序列如SEQ ID NO：31-33之一所示，和VL序列如SEQ ID NO：34-36之一所示，VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
視需要地，VH和VL在框架區引入穩定抗體結構的突變。在一些實施方案中，VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
在一些實施方案中，該ScFv包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含：
(I)如SEQ ID NO：17所示或與SEQ ID NO：17具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：19所示或與SEQ ID NO：19具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：44所示或與SEQ ID NO：44具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；
和/或輕鏈包含：
(I)如SEQ ID NO：18所示或與SEQ ID NO：18具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(II)如SEQ ID NO：20所示或與SEQ ID NO：20具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(III)如SEQ ID NO：45所示或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；或
(IV)如SEQ ID NO：46所示或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；
視需要地，VH和VL在框架區引入穩定抗體結構的突變。在一些實施方案中，VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
在至少一個實施方案中，重鏈可變區VH序列如SEQ ID NO：17所示，和輕鏈可變區VL序列如SEQ ID NO：18所示；或
VH序列如SEQ ID NO：19所示，和VL序列如SEQ ID NO：20所示，其中VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸；或
VH序列如SEQ ID NO：44所示，和VL序列如SEQ ID NO：45所示，其中VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸；或
VH序列如SEQ ID NO：44所示，和VL序列如SEQ ID NO：46所示，其中VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸。
在一些實施方案中，抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物具有如SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53所示的序列。
本揭露還提供了一種抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其包含：抗IL-4R抗體或其抗原結合片段以及一個或多個毒素；其中，該毒素選自成孔毒素、嗜水氣單胞菌氣溶素、氣單胞菌溶素原、布加寧、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；較佳地，該毒素選自PE-LR、PE-LO10R456A、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE24、PE25、PE38QQR、PE35、PE38KDEL、PE38DKEL、PE38RDEL、PE38KNEL；更佳地，該毒素是如SEQ ID NO：49所示的PE38KDEL。
本揭露提供一種多核苷酸，其編碼本揭露所述的任一種抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物。在其中一些實施方案中，多核苷酸為DNA或RNA。
本揭露提供一種含有如上所述多核苷酸的載體(vector)，其為真核表達載體、原核表達載體或病毒載體。
本揭露提供一種包含如上所述的載體的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞或真核細胞。在至少一個實施方案中，原核細胞選自細菌，例如大腸桿菌。在至少一個實施方案中，真核細胞選自酵母菌或哺乳動物細胞，例如畢赤酵母或CHO細胞或人胚腎(HEK)293細胞。
本揭露提供一種用於製備抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物的方法，包括如下步驟：
在上述宿主細胞中表達抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，以及從該宿主細胞中分離該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物；以及視需要地，純化該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物。
醫藥組成物
本揭露進一步提供一種醫藥組成物，其活性成分含有如上所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其用作藥物。
本揭露的醫藥組成物除活性成分外，可含有一種或多種可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體(vehicle)。醫藥組成物可含有0.1至99重量%的活性成分。
本揭露進一步提供選自以下的任一項或組合在製備藥物中的用途：根據本揭露的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段、抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物、根據本揭露的醫藥組成物；其中，該抗體或其抗原結合片段或其複合物用於治療和/或預防增殖性疾病或延緩增殖性疾病進展。該增殖性病症可以是癌症或腫瘤；例如其中該癌症或腫瘤為與IL-4R表達相關的癌症或腫瘤。該癌症或腫瘤選自前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或復發性間變性大細胞淋巴瘤)、肺癌、腎癌、肝癌(例如，小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、大腸癌(例如結腸癌)、胰腺癌、胃癌、白血病(例如，急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)和腦癌、中樞神經系統腫瘤。
在一些實施方案中，該中樞神經系統腫瘤包括神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質瘤、血管瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、成年母細胞瘤。
在一些實施方案中，該中樞神經系統腫瘤是神經膠質母細胞瘤。
在一些實施方案中，該神經膠質母細胞瘤是復發性或難治性膠質母細胞瘤。
在一些實施方案中，該神經膠質母細胞瘤中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyhransferase，MGMT)表達為陽性或陰性。
治療方法
本揭露提供一種治療和/或預防增殖性疾病或延緩增殖性疾病進展的方法，該方法包括給予需要的受試者治療或延緩疾病有效量的根據本揭露的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段、或根據本揭露的醫藥組成物、或根據本揭露的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物；其中，該增殖性病症可以是癌症或腫瘤。
本揭露提供在患有、疑似患有、易感於細胞增殖性病症的受試者中增強免疫功能的方法。一些實施方案中，該細胞增殖性病症為癌症或腫瘤。
例如，該癌症或腫瘤為與IL-4R表達相關的癌症或腫瘤。該癌症或腫瘤選自前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫內膜癌、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤(例如，霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或複發性間變性大細胞淋巴瘤)、肺癌、腎癌、肝癌(例如，小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、大腸癌(例如結腸癌)、胰腺癌、胃癌、白血病(例如，急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、慢性髓細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)和腦癌、中中神經系統腫瘤。
在一些實施方案中，該中樞神經系統腫瘤包括神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松
果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質瘤、血管瘤、腦膜瘤、神經母細胞瘤、視網膜母細胞瘤、成年母細胞瘤。
在一些實施方案中，該中樞神經系統腫瘤是神經膠質母細胞瘤。
在一些實施方案中，該神經膠質母細胞瘤是復發性或難治性膠質母細胞瘤。
在一些實施方案中，該神經膠質母細胞瘤中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶(O6-methylguanine-DNA methyhransferase,MGMT)表達陽性或陰性。
本揭露治療和/或預防方法中所用化合物(如本揭露的複合物或組成物)的劑量通常將隨疾病的嚴重性、受試者的體重和化合物的相對功效而改變。作為一般性指導，合適的單位劑量可以是0.1mg至1000mg。
如所屬技術領域具有通常知識者所熟知的，藥物的給藥劑量依賴於多種因素，包括但並非限定於以下因素：所用具體化合物的活性、受試者的年齡、受試者的體重、受試者的健康狀況、受試者的行為、受試者的飲食、給藥時間、給藥方式、排泄的速率、藥物的組合等，可以根據公知的治療方案來驗證。
圖1A和圖1B為示例性的複合物的結構示意圖；抗體25G7的scdsFv與毒素PE38KDEL的抗體偶聯藥物25G7-scdsFv-PE38KDEL(圖1A)和25G7-scFv-PE38KDEL(圖1B)。
圖2A和圖2B為複合物25G7-scdsFv-PE38KDEL和25G7-scFv-PE38KDEL純化後的SDS-PAGE圖，其中M為分子量標記(Marker)。
圖3為流式細胞法檢測神經膠質母細胞瘤(GBM)細胞系中的IL-4R表達水準。利用慢病毒系統構建人IL-4R穩轉的LN229、U251、U87腦膠質瘤細胞株，用流式細胞法檢測IL-4R的過表達水準，對照為未轉染人IL-4R構建體的對應細胞。
圖4A至圖4C為流式細胞法檢測複合物在神經膠質母細胞瘤細胞表面的結合。利用流式細胞法測定25G7-scdsFv-PE38KDEL和MDNA55分別在IL-4R穩轉細胞株LN229-IL4R、U251-IL4R、U87-IL4R細胞表面的結合能力。
圖5A至圖5C為複合物在神經膠質母細胞瘤細胞中的內吞效率；利用流式細胞法測定25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)和MDNA55分別在LN229-IL4R、U251-IL4R、U87-IL4R細胞中0至24小時的內吞效率。
圖6A至圖6F為複合物對神經膠質母細胞瘤細胞的體外細胞毒性；用CTG法測定25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)和MDNA55分別對LN229-IL4R、U251-IL4R、U87-IL4R以及對照細胞的體外細胞毒性結果。
圖7A至圖7D為用CTG法比較25G7-scFv-PE38KDEL與25G7-scdsFv-PE38KDEL、MDNA55分別在LN229-IL4R、U251-IL4R以及對照神經膠質瘤細胞的體外細胞毒性結果。
圖8A至圖8C為複合物在U87-MG皮下接種的裸鼠腫瘤模型中體內藥效比較結果；25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)和MDNA55的給藥劑量均為0.5mg/kg(mpk)，瘤內給藥(i.t.)。
圖9A至圖9C為複合物在LN229-IL4R(過表達IL-4R的LN229細胞)皮下接種裸鼠腫瘤模型中的體內藥效比較結果；25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)和MDNA55藥物給藥劑量均為0.25mpk(i.t.)，或25G7-scdsFv-PE38KDEL 0.25mpk(i.v.)。
圖10A至圖10C為複合物在LN229-IL4R皮下接種裸鼠腫瘤模型中的體內藥效結果；25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)藥物給藥劑量為0.1mpk(第二次及以後降為0.05mpk)、0.3mpk(第二次及以後降為0.15mpk)、MDNA55藥物給藥劑量為0.1mpk(第二次及以後降為0.05mpk)，瘤內給藥(i.t.)。
術語
為了更容易理解本申請，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有所屬技術領域具有通常知識者通常理解的含義。
本揭露將專利文本WO2020/038454A1的內容全部引入本申請。
本申請所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
“人IL-4R”(hIL-4R)意指與白細胞介素-4(IL-4)、IL-4Rα特異性結合的人細胞因數受體。hIL-4R旨在涵蓋IL-4R在體內各階段中的各種形式的分子，例如但不限於IL-4R基因在擴增、複製、轉錄、剪接、加工、翻譯、修飾過程中所產生的分子，例如前體IL-4R、成熟IL-4R、天然存在的IL-4R剪接變體、修飾的IL-4R、或其片段。
“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR
區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指輕鏈互補決定區1(LCDR1)，輕鏈互補決定區2(LCDR2)，和輕鏈互補決定區3(LCDR3)；重鏈的3個CDR區指重鏈互補決定區1(HCDR1)，重鏈互補決定區2(HCDR2)和重鏈互補決定區3(HCDR3)。
抗體包括鼠源抗體，嵌合抗體，人源化抗體，全人抗體，其可以是重組獲得的，例如可以是親和力成熟得到的重組全人抗體。
“重組全人抗體”包括藉由重組方法製備、表達、創建或分離的全人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如(1)從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；(2)從經轉化以表達抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；(3)從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及(4)藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表達、創建或分離的抗體。此類重組全人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
“鼠源抗體”在本文中為根據本領域知識和技能製備的對人IL-4R的單株抗體。製備時用IL-4R抗原(或包含表位的多肽)注射試驗物件，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在一些實施方案中，該鼠源結合人IL-4R的抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，或進一步包含鼠源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
“全人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本文的全人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“全人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋白成分，從而誘導的強烈的免疫應答反應。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該人抗體可變區可進行最少反向突變，以保持活性。
“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再要據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後
在真核工業系統或原核工業系統中表達嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1，IgG2，IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，例如包含人源IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。
“抗原結合片段”指具有抗原結合活性的Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段，與人IL-4R結合的Fv片段、scFv片段，以及，包含該片段的多肽或蛋白。該“抗原結合片段”包含本文該抗體的一個或多個CDR區。Fv片段含有抗體重鏈可變區和輕鏈可變區，但沒有恆定區，並具有全部抗原結合位元元點的最小抗體片段。一般地，Fv抗體還包含在VH和VL結構域之間的多肽接頭，且能夠形成抗原結合所需的結構。也可以用不同的連接物將兩個抗體可變區連接成一條多肽鏈，稱為單鏈抗體(single chain antibody)或單鏈Fv(scFv)。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭(或連接肽)連接的重鏈可變結構域(或區域；VH)和輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如包含1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本揭露的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
“與IL-4R結合”，指能與人IL-4R(或其表位、片段)相互作用。本文的術語“抗原結合位點”指由本文抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸形成、或不相鄰的胺基酸藉由三級折疊而形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位被給定抗體所結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人IL-4R作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面電漿共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
“交叉反應”是指本文的抗體與來自不同物種的IL-4R結合的能力。例如，結合人IL-4R的本文的抗體也可以結合另一物種的IL-4R。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗原的特異性反應性，或與生理表達IL-4R的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面電漿共振(SPR)分析，或流式細胞術。
“中和”或“阻斷”抗體意指其與hIL-4R的結合造成對hIL-4和/或hIL-13生物活性抑制的抗體。這種hIL-4和/或IL-13生物活性的抑制可藉由測量本領域眾所周知的一個或多個hIL-4/或hIL-13生物活性指標，如h1L-4/或hIL-13誘導的細胞活化和hIL-4與hIL-4R的結合等指標來評估。例如參見CN103739711A中的。“抑制生長”(例如關於細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
“誘導免疫應答”和“增強免疫應答”可互換使用，並指免疫應答對特定抗原的刺激(即，被動或適應性的)。針對誘導CDC或ADCC的術語“誘導”是指刺激特定的直接細胞殺傷機制。
“ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)”，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表達Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變，如選自IgG1的N297A，L234A，L235A；IgG2/4嵌合體，IgG4的F235E，或L234A/E235A突變。
融合蛋白是一種藉由DNA重組得到的兩個基因共表達的蛋白產物。例如抗IL-4R抗體-PE38KDEL融合蛋白藉由DNA重組，把抗IL-4R抗體和毒素分子PE38KDEL共表達的融合蛋白。生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人IL-4R或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性，純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。本文所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR。人FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。作為一個示例，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。利用分子選殖技術將本文的人源化抗體的序列插入到相應的表達載體中，利用HEK293細胞表達系統表達生產，即可獲得相應的人源化抗體。作為一個示例，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
抗體可以是單株抗體(mAb)，是指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術，合成技術(如CDR-grafting)，或其它現有技術進行重組得到。
抗體可以是單特異、雙特異或多特異抗體。多特異性抗體可對靶標肽的不同表位元顯示特異性，或也可包含對一個以上靶標肽顯示特異性的抗原結合域。人抗IL-4R抗體可被連接到另一個功能分子(如另一個肽或蛋白質)上，或與之共表達。例如，抗體或其片段可功能性地(如藉由化學偶聯、基因融合、非共價結合或其他方式)與一個或多個其他分子(如另一個抗體或抗原結合片段)連接，以產生具有至少一種結合特異性的雙特異或多特異抗體。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施、研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，諸如本文的任一種複合物或組成物，該受試者具有(疑似具有、易感於)一種或多種疾病症狀，而該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群
體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本本的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解單個受試者的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
應用於某個物件的術語“天然存在的”是指這樣的事實，即該物件可在自然界中發現。例如存在於可從自然界來源分離得到的生物體(包括病毒)、且未經人工有意修飾的多肽序列或多核苷酸序列即是天然存在的。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定受試者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在生物、細胞或人體內產生的物質。
“同源性”或“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。本文所述“至少85%序列同一性”是指變體與親本序列相比，兩序列具有至少85%同源，在一些方案中，其具有至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%序列同源；在一些具體的方案中，其具有90%、95%或99%以上；在另一些具體的方案中，其具有至少95%序列同源。該具有至少85%序列同一性的胺基酸序列包括藉由對親本序列進行一個或者多個胺基酸缺失、插入或替換突變獲得。
本文使用的術語“細胞”、“細胞系”、“細胞株”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類術語都包括其後代。因此，術語“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮傳代的次數。還應當理解的是，由於有意或非有意的突變，後代和親本細胞在DNA含量方面不可能精確相同。該術語包括具有與親本細胞相同的功能或生物學活性的突變後代，其中親本細胞是從初始轉化的細胞中篩選所得。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
術語“載體(vector)”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述複合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他組分的混合物，其中該其他組分是例如生理學/可藥用的載體(vehicle)或賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“賦形劑”是在藥物製劑中除活性成分以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑(filler)、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。
術語“稀釋劑(diluent)”又稱填充劑(filler)，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有
油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶纖維素等。
“免疫組織化學評分”是處理免疫組化結果的一種組織學評分方法，將每張切片內陽性的細胞數量及其染色強度轉化為相應的數值，達到對組織染色半定量的目的。評分0表示未觀察到染色或在小於10%的腫瘤細胞中觀察到膜染色；評分+1表示在大於10%的腫瘤細胞中檢測到微弱/勉強可覺察的膜染色；對於評分+2，在大於10%的腫瘤細胞中觀察到中等完全膜染色；評分+3表示在大於10%的腫瘤細胞中觀察到強的完全膜染色。在本揭露中，IL-4R表達為0或+1評分的那些樣品可以視為不過表達IL-4R，而+2或+3評分的那些樣品可以視為過表達IL-4R。
以下結合實施例用於進一步描述本申請，但這些實施例並非限制保護範圍。
實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. 示例性免疫毒素的製備
將人源化IL-4R單株抗體hu25G7(重鏈可變區序列如SEQ ID NO：43所示，hu25G7-VH；輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：37所示，hu25G7-A LCVR)的單鏈可變區段(scFv)藉由接頭ASGGPE(SEQ ID NO：50)與突變且截短的假單胞菌外毒素(PE38KDEL)(SEQ ID NO：
49)融合表達；其中將hu25G7抗體VH-44和VL-100位置的胺基酸突變成半胱胺酸(如SEQ ID NO：47-48)，VH與VL由連接肽(GGGGS)3(SEQ ID NO：51)連接；據此獲得靶向IL-4R的免疫毒素25G7-(scdsFv)-PE38KDEL(以下稱25G7-IT)，完整序列如SEQ ID NO：52所示。
圖1A和圖1B是兩種免疫毒素的結構示意圖。在大腸桿菌BL21中表達25G7-IT，從包涵體中進行蛋白純化和複性；然後去除內毒素，獲得純化的25G7-IT蛋白，分子量約為63KDa(SDS-PAGE結果如圖2A和圖2B所示)。
人源化抗人IL-4R的抗體25G7的重鏈序列如SEQ ID NO：17所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示。可以根據本領域常規的抗體表達和純化方法，例如根據專利申請WO2020038454A1中描述的方法表達和純化抗體。前述專利申請藉由引用將其全文併入本文中。
hu25G7-VH-44序列
hu25G7-VL-100序列
PE38KDEL序列：
接頭L1序列：
ASGGPE SEQ ID NO：50；
連接肽L2序列：
GGGGSGGGGSGGGGS SEQ ID NO：51；
25G7-(scdsFv)-PE38KDEL(25G7-IT)序列：
此外，我們還開發了沒有額外引入鏈間二硫鍵形式的免疫毒素融合蛋白25G7-(scFv)-PE38KDEL，其胺基酸序列如SEQ ID NO：53所示。
25G7-(scFv)-PE38KDEL序列：
實施例2. 相互作用的親和動力學測定
使用Biacore生物大分子相互作用儀(biacore 8K,GE)，藉由表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)技術，測定25G7-IT和參照樣品MDNA55(在大腸桿菌系統中進行表達純化)分別與hrIL-4R-Fc(ILR-H5253，Acro)相互作用的親和動力學。
本實驗採用捕獲法，將抗人IgG抗體(29234600，GE)共價偶聯到CM5晶片(29149603，GE)上，然後將rhIL-4R-Fc作為配體捕獲於晶片上，隨後將25G7-IT和參照樣品MDNA55作為分析物分別進樣，進行親和力分析和計算。
實驗結果顯示，25G7-IT和參照樣品MDNA55與rhIL-4R-Fc具有強親和力，KD分別為1.01E-10和4.39E-10M(表2)。25G7-IT與rhIL-4R-Fc親和力顯著強於參照樣品MDNA55與rhIL-4R-Fc親和力。
實施例3. 與GBM靶細胞的結合能力測定
GBM細胞系U87、U251、LN229中內源性IL-4R表達比較低，因此利用慢病毒系統在這三株GBM細胞系中過表達人源IL-4R。經過
G418篩選後，利用流式細胞技術鑑定IL-4R過表達的效果(圖3)，結果顯示IL-4R在這三株細胞系中穩定過表達。
在DMEM培養基中加入10% FBS和1%青黴素/鏈黴素製備成完全培養基，在37℃含5% CO2培養箱中培養U87-、U251-、LN229-IL4R穩轉細胞株。T75培養瓶裡的細胞用1.5ml TrpLE(Gibco，#12605-010)在37℃消化3-5分鐘，然後用含有FBS的DMEM培養基中和，離心後製備成濃度為2×106個/ml的細胞懸液，以每孔50μl的體積加入96孔圓底板。將25G7-IT、MDNA55以及hIgG1同種型對照分別用DMEM培養基稀釋成8個濃度點(三倍梯度：20；6.67；2.22；0.74；0.25；0.08；0.03；0μg/ml)，分別以每孔50μl的體積加入96孔板與細胞混合均勻，並在冰上共孵育40分鐘。孵育結束後，用200μl的流式檢測緩衝液洗滌三次，用流式檢測緩衝液1：300稀釋抗PE38抗體(Sigma-aldrich，Cat：P2318-1ML)，並以每孔50μl的體積加入96孔板重新懸浮細胞，讓抗體和細胞在冰上共孵育40分鐘。接下來用200μl的流式檢測緩衝液洗滌三次，用流式檢測緩衝液1：500稀釋抗兔IgG Fab2 Alexa Fluor 647(Cell Signaling Technology，#02/2020)，並以每孔50μl的體積加入96孔板重新懸浮細胞，讓抗體和細胞在冰上共孵育30分鐘。離心並用200μl的流式檢測緩衝洗滌三次後重新懸浮細胞，用BD FACSCelestaTM流式細胞儀檢測每孔單細胞Alexa Fluor647的信號。
分析平均螢光強度(MFI)，實驗結果如表3和圖4A至圖4C顯示，25G7-IT與參照樣品MDNA55均能與IL-4R陽性GBM細胞系結
合，而且25G7-IT與U87-、U251-、LN229-IL4R穩轉細胞株的結合能力強於MDNA55。
實施例4. GBM靶細胞中的內吞效率測定
為測定25G7-IT與參照樣品MDNA55在GBM靶細胞中的內吞效率，比較了25G7-IT與MDNA55分別在上述三株IL-4R穩轉腦膠質瘤細胞中的內吞效率。
根據實施例3中的實驗結果，選擇終濃度2μg/ml作為檢測內吞效率的濃度，因為在該濃度時三種細胞樣品中的內吞效率基本到達飽和狀態。將25G7-IT、MDNA55以及hIgG1同種型對照用DMEM培養基稀釋成2μg/ml。以每孔50μl的體積加入96孔板與細胞混合均勻，並在冰上共孵育40分鐘。利用DMEM完全培養基洗滌三次後，用100μlDMEM完全培養基重新懸浮細胞，將96孔板中標註為0h的100μl細胞轉移到另一塊96孔圓底板，並加入100μl的4%多聚甲醛固定液，4℃固定。將剩下的細胞放入37℃培養箱中分別培養1小時、2小時、4小時和24小時後，取出相應的細胞轉移到另一塊96孔板中以同樣的方法4℃固定。
0小時至4小時內吞的細胞在當天進行流式抗體染色；24小時內吞後的細胞在孵育至實驗結束時，即進行流式抗體染色和流式分析。當4小時內吞的細胞被固定達半小時以後，將所有固定的細胞離心並用流式檢測緩衝洗滌兩次。用流式檢測緩衝液1：300稀釋抗PE38抗體(Sigma-aldrich，Cat：P2318-1ML)，並以每孔50μl的體積加入96孔板重新懸浮細胞，接下來將抗體和細胞在冰上共孵育40分鐘。後續實驗步驟同實施例3，分析結果如表4和圖5A至圖5C所示。
實驗結果顯示，25G7-IT與參照樣品MDNA55均能在IL-4R過表達GBM細胞中有效內吞，在4小時時間點於三種細胞中內吞效率達
60%至80%，而且25G7-IT在LN229-、U251-IL4R穩轉細胞株中的內吞效率高於MDNA55。
實施例5. GBM靶細胞中的體外殺傷效率測定
為測定25G7-IT與參照樣品MDNA55在GBM靶細胞中的體外殺傷效率，藉由CTG(CELL TITER-GLO)法比較了兩者在上述三株穩轉人IL-4R腦瘤細胞中的體外藥效。
DMEM培養基中加入10% FBS和1%青黴素/鏈黴素製備成完全培養基。在37℃含5% CO2的培養箱中，培養U87-IL4R、U251-IL4R、LN229-IL4R穩轉細胞株和U87、U251、LN229對照細胞。
在96孔板中按照每孔4000個細胞以及130μl培養基的密度進行鋪板。過夜後，待細胞完全貼壁，加入20μl分別含25G7-IT或MDNA55的梯度濃度藥物(終濃度：100nM、20nM、4nM、0.8nM、0.16nM、0.032nM、0.0064nM、0.00128nM、0.000256nM、0nM)，在培養箱中培養3天。三天後，將96孔板拿出培養箱並平衡到室溫，在細胞懸液中加入50μl的CTG試劑(CellTiter-Glo Luminescent，Promega，#G7573)，用搖床混勻2分鐘後，室溫靜置10分鐘。用EnVision2105 Multimode Plate Reader(PerkinElmer)中內置的Luminescence模式檢測細胞活率。將吸光度結果換算成百分比後用Prism 8分析結果。
實驗結果(圖6A至圖6F)顯示，25G7-IT與參照樣品MDNA55均能在IL-4R過表達GBM細胞中高效殺傷靶細胞，特別是對LN229-IL4R有較高的藥效，於0.1nM濃度達到80%的體外殺傷效果。總體來看，25G7-IT在LN229、U251、U87三株IL-4R穩轉腦膠質瘤細胞株中的體外殺傷效率高於MDNA55。
此外，還比較了沒有鏈間二硫鍵形式的藥物25G7-scFv-PE38KDEL與25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)、MDNA55在LN229
和U251 IL-4R穩轉腦膠質瘤細胞株中的體外殺傷效率。圖7A至圖7D顯示25G7-scFv-PE38KDEL與25G7-IT、MDNA55在腦膠質瘤細胞中的體外殺傷效率相當。
實施例6. 靶向IL-4R的藥物在GBM腫瘤模型中的體內藥效
為測定25G7-IT與參照樣品MDNA55在GBM腫瘤模型中的體內藥效，首先構建了IL-4R表達為1+(免疫組織化學評分)的U87-MG皮下接種的模型。
在實驗小鼠於右側背部皮下接種2×106 U87-MG細胞，細胞重新懸浮在1：1的PBS與基質膠中(0.1ml/隻)，定期觀察腫瘤生長情況。當皮下接種腫瘤的平均大小達到約100-150mm3時，進行分組，每組8隻小鼠。多位點瘤內給藥，藥物25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)和MDNA55的給藥劑量均為0.5mg/kg(mpk)，每週給藥一次，總共給藥四次。開始給藥後，每週測量兩次小鼠的體重和腫瘤的大小，腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(mm3)=1/2×(a×b2)(其中a表示長徑，b表示短徑)。
實驗結果如圖8A至圖8C和表5顯示，在IL-4R低表達的U87-MG腫瘤模型中(免疫組織化學評分為1+)，0.5mpk每週給藥一次，給藥4次後，25G7-IT的TGI(腫瘤生長抑制率)為80%，而參照樣品MDNA55的TGI為51%。該結果說明在IL-4R低表達的神經膠質瘤模型中，25G7-IT的腫瘤生長抑制效果顯著優於MDNA55。
實施例7. 靶向IL-4R的藥物在GBM腫瘤模型(IL-4R 3+)的體內藥效
為進一步測定25G7-IT與參照樣品MDNA55在GBM腫瘤模型中的體內藥效，利用IL-4R過表達的LN229細胞系(標註為LN229-IL4R，免疫組織化學評分為3+)建立了皮下接種的模型。
在實驗小鼠於右側背部皮下接種1×107 LN229-IL4R細胞，細胞重新懸浮在1：1的PBS(0.1ml/隻)，定期觀察腫瘤生長情況。當皮下接種腫瘤的平均大小達到約100-150mm3時，進行分組，每組6-7隻小鼠。MDNA55給藥劑量為0.25mpk(i.t.)，25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)劑量為0.25mpk(i.t.或i.v.)，每週給藥一次，總共給藥四次，腫瘤生長監測和計算同實施例6。
實驗結果如圖9A至圖9C和表6顯示，在IL-4R高表達的LN229-IL4R腫瘤模型中(免疫組織化學評分為3+)，0.25mpk(i.t.)的25G7-IT、MDNA55的TGI(腫瘤生長抑制率)均達到99%(完全緩解)，而同劑量0.25mpk的25G7-IT(i.v.)的TGI為68%，瘤內給藥效果優於靜脈給藥。
此外，在IL-4R高表達的LN229-IL4R腫瘤模型中(免疫組織化學評分為3+)，進一步降低了免疫毒素的劑量，25G7-scdsFv-PE38KDEL(25G7-IT)給藥劑量為0.1(第二次及以後降為0.05)、0.3(第二次及以後降為0.15)mpk，MDNA55給藥劑量為0.1(第二次及以後降為0.05)mpk，瘤內給藥。
實驗結果如圖10A至圖10C和表6顯示，在LN229-IL4R腫瘤模型中(免疫組織化學評分為3+)，0.1(第一次給藥)或0.05(第二至第四次給藥)mpk每週給藥一次，給藥4次後，25G7-IT的TGI(腫瘤生長抑制率)為77%，而參照樣品MDNA55的TGI為59%；而且25G7-IT藥物在0.3(第一次給藥)或0.15(第二至第四次給藥)mpk的劑量下，荷瘤小鼠的腫瘤完全緩解(TGI=99%)。該結果說明在IL-4R高表達的神經膠質瘤模型中，低濃度的25G7-IT的腫瘤生長抑制效果優於等劑量的MDNA55，而高劑量的25G7-IT藥物可以讓荷瘤小鼠完全緩解，呈現明顯的劑量效應。
本揭露中實驗動物的使用及福利遵照國際實驗動物評估和認可委員會(AAALAC)的規定。每天監測動物的健康狀況及死亡情況，
例行檢查包括觀察受試物和藥物對動物日常行為表現的影響如行為活動，體重變化，外觀體徵等。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.)
上海盛迪醫藥有限公司(SHANGHAI SHENGDI PHARMACEUTICAL CO.,LTD)
<120> 抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物及醫藥用途
<130> 721150CPCT
<150> CN202011529235.1
<151> 2020-12-22
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<213> 小鼠(Mus musculus)
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<211> 9
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<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
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<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
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<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 8
<210> 9
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 9
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<210> 11
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 14
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 15
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<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
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<212> PRT
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<211> 98
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> PRT
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<213> 人工序列
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成序列(LCDR3)
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<213> 人工序列
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(LCDR1)
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(hu25G7 HC)
<400> 44
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<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(hu25G7-A LC)
<400> 45
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成序列(hu25G7-B LC)
<400> 46
<210> 47
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(hu25G7-VH-44)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(hu25G7-VL-100)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(PE38KDEL)
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<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker1)
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<210> 51
<211> 15
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<220>
<223> 合成序列(Linker 2)
<400> 51
<210> 52
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(25G7-(scdsFv)-PE38KDEL)
<400> 52
<210> 53
<211> 592
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(25G7-(scFv)-PE38KDEL)
<400> 53
<210> 54
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 54
<210> 55
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 55
<210> 56
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 56
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 57
<210> 58
<211> 18
<212> PRT
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<220>
<223> 合成序列(linker)
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 59
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
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<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 61
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 62
<210> 63
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 63
<210> 64
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 64
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 65
<210> 66
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 66
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<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列(linker)
<400> 67
Claims (22)
- 一種抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其包含：- 抗IL-4R抗體或其抗原結合片段、以及- 一個或多個毒素分子；該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段與該毒素分子共價或非共價連接；該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自以下(I)至(IV)中的任一項：(I)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；(II)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；(III)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；(IV)重鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和輕鏈可變區，其包含胺基酸序列分别如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項1所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中該抗IL-4R抗體選自以下的任一項：鼠源抗體、嵌合抗體、全人抗體、人源化抗體。
- 如請求項1或2所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含來源於人種系輕鏈IGKV3-11*01的FR或與其有至少95%序列同一性FR；較佳地，該FR包含回復突變，該回復突變選自46P、47W、71Y中的一個或多個；和/或該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含來源於人種系重鏈IGHV3-48*01的FR或與其有至少95%序列同一性的FR；較佳地，該FR包含回復突變，該回復突變選自49A、67S、93T中的一個或多個。
- 如請求項1或2所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含來源於人種系輕鏈IGKV2D-29*01的FR或與其有至少95%序列同一性的FR，較佳地，該FR包含回復突變，該回復突變選自4L和/或58I；和/或該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含來源於人種系重鏈IGHV1-2*02的FR或與其有至少95%序列同一性的FR，較佳地，該FR包含回復突變，該回復突變選自69L、71I、73K、94K中的一個或多個。
- 如請求項1或2所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區為人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區、或其變體；和/或該抗原結合片段為Fab、Fv、scFv、F(ab’)2、dsfv或ScdsFv，較佳為scFv。
- 如請求項5所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中，該scFv自N端至C端依次包含重鏈可變區、連接肽和輕鏈可變區，或者該scFv自N端至C端依次包含輕鏈可變區、連接肽和重鏈可變區；該連接肽選自以下任一項或其組合：(GxS)n、(SxG)n、(GGGGS)n、(G)n，其中x是1-6的任一整數，且n是1-30的任一整數；或該連接肽選自以下任一項或其組合：GKSSGSGSESKS、EGKSSGSGSESKEF、GSTSGSGKSSEGKG、GSTSGSGKSSEGSGSTKG、GSTSGSGKPGSGEGSTKG、SRSSG和SGSSC，較佳(GGGGS)3。
- 如請求項1至6中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其包含選自以下(I)至(IV)中的任一項：(I)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：43具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：37具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；(II)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：9具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；(III)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：1具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；(IV)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：43具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：41具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；(V)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：47所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：47具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：48具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；較佳地，重鏈可變區序列如SEQ ID NO：43所示，且輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：37所示；或重鏈可變區序列如SEQ ID NO：9所示，且輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：10所示；或重鏈可變區序列如SEQ ID NO：1所示，且輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：2所示；或重鏈可變區序列如SEQ ID NO：43所示，且輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：41所示；或重鏈可變區序列如SEQ ID NO：47所示，且輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：48所示。
- 如請求項1至6中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中，重鏈可變區包含如SEQ ID NO：25-27之一所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：25-27之一具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：28-30之一所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：28-30之一具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；或者重鏈可變區包含如SEQ ID NO：31-33之一所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：31-33之一具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：34-36之一所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：34-36之一具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；較佳地，重鏈可變區序列如SEQ ID NO：25-27之一所示，且輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：28-30之一所示；或重鏈可變區序列如SEQ ID NO：31-33之一所示，且輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：34-36之一所示；更佳地，重鏈可變區和/或輕鏈可變區包含用於稳定結构的突變；進一步佳地，重鏈可變區第44位的胺基酸殘基突變成半胱胺酸殘基，進一步佳地，輕鏈可變區第100位的胺基酸殘基突變成半胱胺酸殘基。
- 如請求項1至6中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自(I)至(IV)中的任一項：(I)重鏈，其包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈，其包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；(II)重鏈，其包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：19具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈，其包含如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：20具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；(III)重鏈，其包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：17具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈，其包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：18具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；(IV)重鏈，其包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和輕鏈，其包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；較佳地，重鏈序列如SEQ ID NO：44所示，且輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示；或重鏈序列如SEQ ID NO：19所示，且輕鏈序列如SEQ ID NO：20所示；或重鏈序列如SEQ ID NO：17所示，且輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示；或重鏈序列如SEQ ID NO：44所示，且輕鏈序列如SEQ ID NO：46所示。
- 如請求項1至9中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段藉由接頭連接至該毒素分子；該接頭為蛋白性或非蛋白性的接頭；較佳地，該複合物為融合蛋白。
- 如請求項10所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，該接頭選自以下任一項或其組合：ASGGPE、VM、AM、AM(G2-4S)pAM、ASGCGPE、ASGCCGPE、ASGCGSCPE、ASCGTTGCPE、KASGKKYGCKKGPE、KGGGCAGGPE；較佳ASGCGPE；其中p是1-10的任一整數。
- 如請求項1至11中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中該毒素分子選自以下任一項或其組合：成孔毒素、嗜水氣單胞菌氣溶素、氣單胞菌溶素原、布加寧、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素。
- 如請求項12所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其中該毒素選自以下任一項或其組合：PE-LR、PE-LO10R456A、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE24、PE25、PE38QQR、PE35、PE38KDEL、PE38DKEL、PE38RDEL、PE38KNEL，較佳如SEQ ID NO：49所示的PE38KDEL。
- 如請求項1至13中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其包含如SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：53所示的序列。
- 一種抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，其包含：- 抗IL-4R抗體或其抗原結合片段、以及- 一個或多個毒素分子；該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段與該毒素分子共價或非共價連接；其中，該毒素分子選自以下任一項或其組合：成孔毒素、嗜水氣單胞菌氣溶素、氣單胞菌溶素原、布加寧、蓖麻毒素、假單胞菌外毒素、霍亂毒素或白喉毒素；較佳地，該毒素分子選自以下任一項或其組合：PE-LR、PE-LO10R456A、PE-T20、PE-T20-KDEL、PE4E、PE40、PE38、PE24、PE25、PE38QQR、PE35、PE38KDEL、PE38DKEL、PE38RDEL、PE38KNEL；更佳地，該毒素分子是如SEQ ID NO：49所示的PE38KDEL。
- 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至15中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物。
- 一種載體，其含有如請求項16所述的多核苷酸，其為真核表達載體、原核表達載體或病毒載體。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項17所述的載體，較佳地，該宿主細胞為細菌、酵母或哺乳動物細胞，更佳地，該宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢細胞或人胚腎293細胞。
- 一種醫藥組成物，其含有：如請求項1至15中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，以及視需要地，可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種治療和/或預防癌症或腫瘤的方法，包括：向受試者施用治療有效量或預防有效量的如請求項1至15中任一項所述的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物、如請求項16所述的多核苷酸、或如請求項19所述的醫藥組成物，較佳地，該癌症或腫瘤選自以下任一項或其組合：前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、多發性骨髓瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、肺癌、腎癌、肝癌、大腸癌(例如結腸癌)、胰腺癌、胃癌、白血病和中樞神經系統腫瘤；更佳地，中樞神經系統腫瘤選自以下任一項或其組合：神經膠質瘤、神經膠質母細胞瘤、神經母細胞瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突膠質瘤、血管瘤、腦膜瘤、視網膜母細胞瘤。
- 如請求項20所述的方法，該中樞神經系統腫瘤為神經膠質母細胞瘤；較佳地，該中樞神經系統腫瘤為復發性或難治性膠質母細胞瘤、或O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶表達陽性或陰性的神經膠質母細胞瘤。
- 一種用於製備抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物的方法，包括如下步驟：在如請求項18所述的宿主細胞中表達抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物，以及從該宿主細胞中分離該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段的複合物。
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