CN102153655B - 一种靶向抗肿瘤重组蛋白质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向抗肿瘤重组蛋白质及其制备方法,属于靶向抗肿瘤重组蛋白质药物。包括截短的细胞因子hIL6通过接头连接到绿脓杆菌外毒素A衍生体PE38KDEL上,作为导向载体的hIL6的氨基酸突变衍生体,包括截去hIL6氨基端1-28个氨基酸。本发明进一步涉及该重组靶向蛋白在抗肿瘤中的应用。本发明的优点是:通过基因改造和密码子优化构建了靶向抗肿瘤重组蛋白质hIL6(T23)-PE38KDEL,使得两个配体间空位阻就减小,活性提高;在大肠杆菌实现了高效可溶表达,突破了天然基因低表达量的瓶颈,使得大规模制备该重组毒素成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种靶向抗肿瘤重组蛋白质药物及其基因工程制备方法。
背景技术
对于肿瘤治疗最重要的是首先要能相对准确区分开肿瘤细胞和正常细胞,高效特异性杀死肿瘤细胞,而这种准确区分的能力也是癌症治疗研究的热点之一,也就是所谓的靶向杀伤肿瘤的策略。靶向杀伤肿瘤的策略是基于肿瘤细胞表面的特殊标志物或过表达的特异受体作为靶向,使细胞毒性药物在靶向物质的引导下,相对集中于肿瘤细胞周围并将其杀死,而对于正常细胞却无损害。利用细胞因子与受体的特异性结合的能力,根据某些细胞因子受体在肿瘤细胞表面过量表达,而正常细胞基本没有的这一事实,利用细胞因子携带细胞毒素特异杀伤肿瘤细胞就是其中的一种靶向杀伤策略。利用细胞因子作为导向药物的研究已经有很多,表皮生长因子受体在磷状上皮癌发生时表达异常增多,如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等;转化生长因子受体的导向意义与表皮生长因子受体基本相同;神经分化因子受体为酪氨酸激酶家族,许多癌细胞都有高含量表达;粒细胞集落刺激因子受体在白血病细胞、口腔癌细胞、膀胱癌细胞等都有较高表达;粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体在骨肉瘤细胞、腺癌细胞上有高含量分布;IL-2R在T细胞白血病和淋巴瘤细胞中有较高分布;IL-4R在淋巴瘤细胞中、IL-6R在急性髓样白血病细胞、骨髓瘤细胞、肝癌细胞、前列腺癌细胞等有较高分布;IL-9R在Hodg kin氏瘤细胞、IL-13R在肾细胞瘤和细胞胶质瘤等有较高表达。这些细胞因子已有与绿脓杆菌外毒素(PE,Pseudomonas exotoxin)制备过重组毒素研究报道。利用肿瘤细胞表面标志分子,利用抗体与肿瘤细胞抗原结合特性,利用抗体作为导向部分携带毒素分子,可明显提高靶向选择性有效杀伤靶细胞,如单抗放射性碘治疗原发性肝癌药物-美妥昔单抗注射液导向性能良好。激素分子如LRH、α-促黑素等与PE结合,都能很好地起到导向作用;重组毒素是靶向治疗癌症较好的策略之一。
PE毒素是结构与其分子作用机理已研究的非常清楚,也是目前使用最多的一种细胞毒素,其作用于真核核糖体上的蛋白合成因子EF2,使其糖基化,使蛋白合成终止而死亡;PE毒素分子被修饰和改造出现了几种衍生物,主要是缺失细胞膜亲和区,使其失去细胞结合能力,同时使用KDEL序列替换REDLK,增加其核糖体亲和性,其细胞毒性增加3倍以上,目前最常用结构有PE40KDEL和PE38KDEL,目的在于减少其分子量、增加细胞毒性、增加分子穿透力和降低体内免疫学反应的副作用。
我们利用hIL6作为导向载体,主要根据某些肿瘤细胞过表达IL6R这一事实,而血液细胞和组织细胞表面带有IL6R数量的非常少,即使有表达量也非常低这一事实,利用hIL6携带毒素PE38KDEL与细胞表面的IL6R特异性结合,在受体的介导下使重组毒素相对集中在肿瘤细胞膜上,形成复合物,经重组毒素分子内化段诱导的内化作用,使PE38KDEL分子进入结合的细胞内,在哺乳动物细胞内furin酶的作用下切下一个37kDa的PE分子,这个分子特异地与核糖体上的蛋白合成因子EF2结合,使蛋白合成终止,细胞因缺乏酶的合成而死亡。几个种类的肿瘤细胞表面IL6R呈现过表达现象,在骨髓瘤细胞、肝癌细胞、急性髓样白血病细胞和前列腺癌、结肠癌细胞等均高于正常细胞10倍以上,即肿瘤细胞上相应受体数均在3000~4000个以上,骨髓瘤细胞U266上最多含20000(如U266)个/细胞左右。重组毒素杀死肿瘤细胞需要一定的分子数,主要取决于细胞膜受体数和内化效率,由于IL6R受体在肿瘤细胞上表达与正常细胞上至少相差10倍以上,有的甚至达千倍以上,这使肿瘤细胞上聚集的重组毒素比正常细胞多得多,而对正常细胞的毒副作用减到最低,甚至不呈现毒副作用。据实验分析证明,保证杀死一个瘤细胞其周围需要400~1000个左右的毒素分子。正常细胞上IL6R的受体数都少于200个,同时重组毒素分子内化的效率一般在15%左右,毒素分子对正常细胞发挥不了明显的毒性作用。
虽然美国Ira Pastan领导的课题小组率先构建了IL6PE40,紧接着国内朱平、柳增善小组构建了IL6(23)PE40,溪永志小组构建了IL6(23)PE40KDEL;但Ira Pastan和奚永志小组在大肠杆菌均以包涵体表达,该蛋白复性率低,复性后活性略低于可溶性表达产物;朱平、柳增善小组构虽然实现了可溶性活性表达,但表达量只有5%左右,成为了该毒素大量制备的瓶颈。
国内PE重组毒素对肿瘤治疗研究进行最为深入的为朱平领导的研究小组,其LHRH-PE40已进入II期临床试验。美国是重组毒素原始创新地,其多种PE类重组毒素已进行临床试验;其中IL2-PE40是第一个上市以细胞因子为导向的重组毒素(Ontak)。由于重组毒素研究的发展,国内外已经有十几个相关专利出现,这些上市的、临床研究的和专利也佐证该类重组毒素在肿瘤治疗上具有良好的应用前景。
发明内容
本发明提供一种靶向抗肿瘤重组蛋白质及其制备方法,以解决蛋白复性率低、复性后活性低、表达量低的问题。
本发明采取的技术方案是:包括截短的细胞因子hIL6通过接头连接到绿脓杆菌外毒素A衍生体PE38KDEL上,作为导向载体的hIL6的氨基酸突变衍生体,包括截去hIL6氨基端1-28个氨基酸。
本发明的一种实施方式是:做为导向载体的hIL6是截去氨基端23个氨基酸的衍生体。
本发明的一种实施方式是:做为导向载体的hIL6与PE38KDEL连接的接头氨基酸序列从氨基端到羧基端为AEE。
本发明靶向抗肿瘤重组蛋白质的制备方法是:以该重组蛋白一级氨基酸序列为模板,利用DNA编码技术,重新编码合成该重组蛋白的DNA序列,再通过基因工程表达制备该重组蛋白。
本发明的一种制备方法实施方式是:利用大肠杆菌偏爱密码子,反向编码hIL6(T23)-PE38KDEL蛋白,使用pET28(a)、pET22(b)载体,在宿主菌Rosstabule中表达出高活性重组毒素。
本发明的一种制备方法实施方式是:利用毕赤酵母偏爱密码子,反向编码hIL6(T23)-PE38KDEL蛋白,利用pPICZa、pGAP Za、pPIC9载体,使用宿主菌毕赤酵母中GS115、SMD1168,在BMMY培养基中,甲醇诱导,分泌表达出高活性重组毒素。
本发明靶向抗肿瘤重组蛋白质在制备抗肿瘤蛋白药物中的应用。
本发明利用基因重组技术,将作为导向部分的hIL6的通过连接桥与修饰的PE38KDEL毒性的相偶联,形成一新的非天然功能蛋白质,使导向分子(hIL6)和毒素分子(PE)各自保持原有的功能,且截断的IL6减少了空间位阻,提高了亲和性;再根据表达宿主密码子的偏爱性,优化该蛋白基因所使用的密码子,通过人工合成该基因,在大肠杆菌和酵母中实现其高效、可溶性活性表达,克服了原天然基因在大肠杆菌中低表达或包涵体表达;在酵母中极低量分泌表达的的制备瓶颈,为该重组毒素的制备开辟了一条途径。重组靶向毒素特征是从氨基端最多可截短1-28个氨基端的hIL6,在其羧基端通过AEE三个氨基酸连接到PE38KDEL细胞毒性蛋白质的氨基端。
为了减少重组部分的空间位阻,减小蛋白的分子量,增加其穿透能力,增加其细胞毒性。根据本发明的目的,本发明优选方案是:hIL6的氨基端截断23个氨基酸,其中所说的细胞毒性蛋白质是PE38KDEL,连接部分的氨基酸是AEE,两种连接均有良好的生物活性。
根据本发明的目的,重组靶向蛋白质hIL6(T23)-PE38KDEL的基因除利用原始基因片段的连接;还包括为了高效表达,根据表达宿主优化后合成或突变的基因,及根据表达载体多克隆位点,在5’端和3’而增加酶切位点而形成的基因结构。
本发明的优点是:通过基因改造和密码子优化构建了靶向抗肿瘤重组蛋白质hIL6(T23)-PE38KDEL,使得两个配体间空位阻就减小,活性提高;在大肠杆菌实现了高效可溶表达,使用LB培养基,100uM IPTG、,28℃诱导5小时,表达量达20%左右。在酵母中实现了活性分泌表达,使用pPICZa表达载体的重组酵母,使用BMMY培养基、0.5%甲醇,30℃诱导72小时,表达量达30%左右;使用pGAPZa表达载体的重组酵母,使用YPD培养基30℃诱导72小时,表达量达14%左右。纯化后的hIL6(T23)-PE38KDE具有高效的选择性杀伤活性,对IL6R受体过表达肿瘤细胞具有高效杀伤活性,例如多发性骨髓瘤U266、SP2/0;对IL6R受体阴性细胞无杀伤活性,如HBL-100、293T。hIL6(T23)-PE38KDEL对U266的选择杀伤活性约是hIL6PE40活性的2倍,hIL6(D24)PE40KDEL的1.3倍。通过基因改造和密码子优化,使得该重组毒素对IL6R过表达肿瘤细胞的杀伤活性提高,并且突破了天然基因低表达量的瓶颈,使得大规模制备该重组毒素成为可能。
附图说明
图1是本发明重组靶向蛋白质hIL6(T23)-PE38KDEL一级氨基酸组成结构示意图,接头氨基酸序列从氨基端到羧基端为AEE;
图2是本发明重组靶向蛋白质hIL6(T23)-PE38KDEL体外对肿瘤细胞的杀伤活性图。
图3是三种重组靶向蛋白质体外杀伤U266肿瘤细胞的ID50图,1:hIL6PE40,2:hIL6(D24)-PE40KDEL,3:hIL6(T23)-PE38KDEL;
图4是pET28a-IL6(T23)PE38KDEL重组质粒构建示意图;
图5是pET22b-IL6(T23)PE38KDEL重组质粒构建示意图;
图6是pGAPZa-IL6(T23)PE38KDEL重组质粒构建示意图;
图7是pPICZa-IL6(T23)PE38KDEL重组质粒构建示意图。
具体实施方式
以下是本发明的重组靶向蛋白质hIL6(T23)-PE38KDEL两种主结构的一级氨基酸序列。
1.hIL6(T23)-PE38KDEL的基本氨基酸长度及其分子量:510,MW=56094hIL6(T23)通过AEE三个氨基酸连接PE38KDEL,其氨基酸序列是SEQ No.1。
2.hIL6(T23)-PE38KDEL的基本氨基酸长度及其分子量:511,MW=56239hIL6(T23)通过AEE三个氨基酸连接PE38KDEL,其氨基酸序列是SEQ No.2。
实施例1:
人工合成下列基因,其核苷酸序列是SEQ No.3,利用pET28a上多克隆位点Nco I和Xhol I在大肠杆菌细胞质中表达下列结构的重组靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL,重组表达载体构建见图4。重组质粒转入Rosstabule宿主菌中,使用LB培养基,100uM IPTG,28℃诱导5小时,表达量占上清蛋白的14%-20%左右。经分子量30,000MW超滤截留、10mM PBS(pH7.4)透析,氨基酸序列是SEQ No.1。
使用U266细胞和293T细胞检测细胞杀伤活性,对U266具有明显杀伤活性,293T细胞未见杀伤活性。
实施例2:
人工合成下列基因,其核苷酸序列是SEQ No.3,利用pET22b在大肠杆菌中在周质空间中分泌表达下列结构的重组靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL,重组表达载体构建见图5。重组质粒转入Rosstabule宿主菌中,使用LB培养基,100uM IPTG,28℃诱导5小时,利用渗透休克法提取周质蛋白,表达量占上清蛋白的20%-25%左右。经分子量30,000MW超滤截留、10mM PBS(pH7.4)透析,氨基酸序列是SEQ No.1。
使用U266细胞和293T细胞检测细胞杀伤活性,对U266具有明显杀伤活性,293T细胞未见杀伤活性。
实施例3:人工合成下列基因,将最优化重组毒素基因,其核苷酸序列是SEQ No.4,插入到pGAPZa表达载体EcoRI与Kpn I之间,重组表达载体的构建见图6。在毕赤酵母中SMD1168中分泌表达下列结构的重组靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL,使用YPD培养基30℃诱导72小时,表达量占培养基上清蛋白的16%左右。经分子量30,000MW超滤截留、10mM PBS(pH7.4)透析,氨基酸序列是SEQ No.2。
使用U266细胞和293T细胞检测细胞杀伤活性,对U266具有明显杀伤活性,293T细胞未见杀伤活性。
实施例4:
人工合成下列基因,其核苷酸序列是SEQ No.4,插入到pPICZa表达载体EcoRI与Xho I之间,重组表达载体的构建见图7。在毕赤酵母中GS115中分泌表达下列结构的重组靶向毒素hIL6(T23)-PE38KDEL,使用BMMY培养基,0.5%甲醇30℃诱导72小时,表达量占培养基上清蛋白的26%左右。经分子量30,000MW超滤截留、10mMPBS(pH7.4)透析,氨基酸序列是SEQ No.2。
使用U266细胞和293T细胞检测细胞杀伤活性,对U266具有明显杀伤活性,293T细胞未见杀伤活性。
实验例1:重组靶向蛋白质hIL6(T23)-PE38KDEL体外对肿瘤细胞的杀伤活性研究U266、SP2/0是IL6R过表达肿瘤细胞,HBL-100、293T是IL6R阴性细胞。
利用U266、SP2/0、HBL-100和293T细胞,使用[3H]亮氨酸渗入法测定hIL6(T22)-PE38KDEL蛋白质抑制活性。细胞培养后使用RPMI 1640培养基洗涤3次,铺96孔板,每孔1×106个细胞、200μL 10%血清的1640培养液,加不同浓度的过滤除菌的各种重组毒素溶液。重组毒素溶于含有0.2%人血清的10mM PBS pH 7.4中,按10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL........加入细胞孔中,与细胞一同37℃培养30h后,[3H]亮氨酸渗入法测定蛋白质抑制活性。HBL-100细胞和293T细胞ID50没有变化,U266细胞ID50为30ng/mL,SP2/0细胞的ID50为40ng/mL。
实验例2:三种重组靶向蛋白质体外杀伤U266肿瘤细胞的ID50。
细胞培养后使用RPMI 1640培养基洗涤3次,铺96孔板,每孔1×106个U266细胞、200μL 10%血清的1640培养液,加不同浓度的过滤除菌的各种重组毒素溶液。重组毒素(①hIL6PE40;②hIL6(D24)-PE40KDEL;③hIL6(T23)-PE38KDEL)分别溶于含有0.2%人血清的10mM PBS pH 7.4中,按2ng/mL、4ng/mL、6ng/mL、8ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、30ng/mL........200ng/mL加入细胞孔中,与细胞一同37℃培养30h后,[3H]亮氨酸渗入法测定蛋白质抑制活性。hIL6PE40的ID50为80ng/mL,hIL6(D24)-PE40KDEL的ID50为40ng/mL,hIL6(T23)-PE38KDEL的ID50为30ng/mL。
从图3结果可看到hIL6(T23)-PE38KDEL有效作用浓度(ID50)明显高于hIL6PE40和hIL6(D24)-PE40KDEL两个重组蛋白分子。
Claims (2)
1.一种靶向抗肿瘤重组蛋白质,包括截短的细胞因子hIL6通过接头连接到绿脓杆菌外毒素A衍生体PE38KDEL上,其特征在于:该靶向抗肿瘤重组蛋白质的氨基酸序列为SEQ No.1或SEQ No.2所述。
2.如权利要求1所述的靶向抗肿瘤重组蛋白质在制备抗肿瘤蛋白药物中的应用,所述的肿瘤为多发性骨髓瘤细胞U266或骨髓瘤细胞SP2/0。
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