CN108047335A - 一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途，属于基因工程领域。一种靶向结肠癌的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，纯化方法包含了硫酸铵沉淀法、疏水层析、离子交换层析和分子排阻层析，均是以蛋白质的理化性质分离蛋白的温和方法，避免了使用亲和层析类等较为剧烈的纯化方式，在满足纯度的同时，减少了蛋白活性的损失。纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白经细胞水平和动物实体瘤水平试验证实，其具有显著的抗肿瘤活性，为结肠癌的个体化治疗提供了新的方向。

Description

一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于基因工程领域，尤其是指靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途。
背景技术
结肠癌(Colorectal cancer,CRC)是人类高发恶性肿瘤之一，其发病率一直呈上升趋势，全球每年患结肠癌的病例超过1亿人，在全球恶性肿瘤发病率中已上升至第三位，其死亡率居恶性肿瘤死因的第二位。在我国，结肠癌的发病率和死亡率均保持上升趋势，其发病递增速度为世界平均数的两倍，已位于我国恶性肿瘤发病率的第四位，严重危害人类健康。目前，结肠癌的治疗手段以手术治疗为主，辅以全身或局部化疗、放疗等治疗手段，但术后肿瘤易复发，且化疗、放疗毒副作用大，易引起肿瘤细胞耐药。40年前，Moolten FL等提出的重组毒素概念为癌症的诊疗带来一片光明。重组毒素的策略是基于抗原-抗体、激素-受体特异性结合的特性，以肿瘤细胞表面特有的标志物、特异受体或高表达的受体为靶标，使毒素集中于肿瘤细胞周围，最终将肿瘤细胞杀死而对正常细胞无损害。近年来，随着基因工程技术的发展，利用基因重组技术将负责细胞识别的抗体片段或激素基因与毒素活性片段的基因进行融合，经表达及纯化制备得到新型重组毒素。新型重组毒素具有靶向性好、杀伤能力强、毒性低、分子量小、免疫原性低、产生的分子均一、成本低易于改造、能够大量生产等优点，具有良好的开发应用前景。
近年来，诸多国内外学者开展大量涉及胃肠道肿瘤生长、侵袭、转移等发病机制或信号传导通路的研究。随着研究的深入，人们发现胃肠道肿瘤细胞表达的胆囊收缩素受体(Cholecystokinin receptor,CCKR)可通过自分泌或旁分泌途径促进肿瘤细胞的增生和转移，即肿瘤细胞既合成分泌胆囊收缩素(Cho1ecystokinin,CCK)和胃泌素(Gastrin,GS)，又表达CCKR，前者作为生长因子与分泌CCK和GS的细胞或周围细胞表面的CCKR结合，产生增殖信号传入核内，引起肿瘤细胞生长，尤其是2型胆囊收缩素受体(CCK2R)在大多胃癌、结直肠癌细胞及癌旁组织细胞膜上高表达，而正常组织表达量极低，与结肠癌的发生发展过程有密切关系，是结直肠癌诊断和治疗的理想靶点。
胆囊收缩素(Cholecystokinin，CCK)是十二指肠及近端空肠离散的肠内分泌细胞(I型)和大脑神经元合成分泌的，其主要的生理学作用是刺激胰腺分泌、胆囊收缩、产能、抑制胃酸分泌、肠能动性、促进细胞生长、基因表达、蛋白合成和饱腹感等。另外，CCK也能够促进外分泌性胰腺的生长，大量实验证实，CCK与动物的进食、记忆、疼痛、焦虑等精神状态有关。CCK在人体内以多种长短不同的分子形式存在，均由含115个氨基酸残基的CCK原加工剪切形成的多肽，包括CCK-83、CCK-58、CCK-39、CCK-33、CCK-25、CCK-22、CCK-18、CCK-12、CCK-8、CCK-7、CCK-6、CCK-5以及CCK-4。
绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin,PE)是制备重组毒素的理想毒素分子，其高效杀伤活性及细胞杀伤机制已得到详细阐明。对PE分子进行加工修饰，并与人工靶向元件(如受体配基和抗体片段)结合，使其发挥细胞毒性潜能，可选择性消除某些特异性肿瘤细胞。Ira Pastan等证明一个毒素分子在35min内可成功的失活300个核糖体，理论上一个重组毒素分子与肿瘤细胞结合后即可将该细胞杀死，但由于毒素内化效率、细胞内Furin酶切割效率的影响(Furin酶对PE的切割效率为5％-15％)，杀死一个肿瘤细胞需要400-1000个毒素分子。这要求在杀死靶细胞时需要一定量的毒素分子，确保了少量非特异性结合至正常细胞表面的毒素不能发挥细胞毒作用，从而保证了对正常细胞的安全性，因此在抗癌药物的应用中具有很高的价值。
对于药物类重组蛋白不能有功能外的冗余序列，因此在设计时就不带有亲和标签，或者在有亲和标签的情况下纯化后再将亲和标签切除，无论哪一种方法都增加了重组蛋白纯化的难度。尽管根据蛋白质的等电点、分子量、可溶性等差异，发明了多种色谱纯化技术，但对药物类重组蛋白的纯化仍是一个挑战，因为重组蛋白的纯化通常需要多个色谱纯化技术来实现，而且即使只有一个氨基酸的差异，同一纯化方案也不能应用在另一重组蛋白，而需要对每个步骤重新优化。因此，一种新的高效的纯化方法的建立对重组蛋白的制备和应用是至关重要的。
发明内容
本发明提供一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途。
本发明采取的技术方案是：一种靶向结肠癌的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所述。
编码如权利要求1所述的靶向结肠癌的重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。
一种靶向结肠癌的重组蛋白的制备方法，包括下列步骤：
(一)通过基因扩增获得靶向结肠癌的重组蛋白的重组DNA，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所述，通过Nco I和BamH I酶切位点，将该重组DNA克隆入pET28a载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆细胞培养保存；
(二)将重组大肠杆菌BL21(pET28a-rCCK8PE38)接种于2xYT培养基中，37℃持续摇培至OD600达到0.5，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.6mM，27℃摇培5小时后，离心收集菌体，12000g，15min，4℃；
(三)按照1g：20ml的比例用磷酸盐缓冲液PBS重悬菌体，使用超声破碎仪破碎菌体，离心收集上清中的可溶性蛋白，12000g，120min，4℃；
(四)将步骤(三)收集的蛋白溶液进行纯化，步骤如下：
a)在步骤(三)获得的蛋白溶液中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度10％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集上清液；在上清液中继续滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度30％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集沉淀；
b)使用上样缓冲液，20mmol/L Tris-HCl,3mol/L NaCl,1mmol/L EDTA,pH 7.4，重悬步骤a)沉淀物，经蛋白纯化系统，上样到疏水层析介质Phenyl HP，再以3-0mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.9-0mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；
c)将步骤b)收集的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为：20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 6.0；
d)将步骤c)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到离子交换层析介质DEAE FF，再以0-1mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.5-0.7mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；
e)将步骤d)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为保存液，50mmol/L Na3PO4，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH7.4，经上述纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白的纯度可达95％以上。
一种靶向结肠癌的重组蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。
所述靶向结肠癌的重蛋白作用于HCT116人结肠癌裸鼠模型，能够显著抑制肿瘤的生长和扩散。
本发明通过基因工程技术，将胆囊收缩素CCK8与绿脓杆菌外毒素PE38融合表达，获得的靶向结肠癌的重组蛋白同时具有了胆囊收缩素特异性亲和高表达CCK2R细胞的能力，和PE毒素高效的细胞毒作用，使其能够特异性靶向杀伤结肠癌细胞(高表达CCK2R)，最终实现对结肠癌的治疗。通过构建pET重组质粒，以BL21大肠杆菌为宿主，能够大量合成并分泌高活性的靶向结肠癌的重组蛋白，其优点在于合成分泌周期短，培养基及培养条件简单、廉价易获取。在蛋白纯化方面，通过大量试验和条件优化，最终建立了一套组合纯化方法来纯化靶向结肠癌的重组蛋白，包含了硫酸铵沉淀法、疏水层析、离子交换层析和分子排阻层析，均是以蛋白质的理化性质分离蛋白的温和方法，避免了使用亲和层析类等较为剧烈的纯化方式，在满足纯度的同时，减少了蛋白活性的损失。纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白经细胞水平和动物实体瘤水平试验证实，其具有显著的抗肿瘤活性，为结肠癌的个体化治疗提供了新的方向。
将纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白用无菌水溶解稀释至2000ng/mL，体外作用于结肠癌细胞，显著的抑制了结肠癌细胞的增殖。
将培养的人结肠癌细胞系HCT-116注射到裸鼠皮下，构建HCT-116裸鼠肿瘤模型，使用纯化后靶向结肠癌的的重组蛋白治疗该肿瘤模型，结果是能够显著抑制肿瘤在裸鼠体内生长和扩散，同时，对裸鼠的短期或长期毒副作用均不显著。
附图说明
图1是pET28a-rCCK8PE38质粒结构示意图；
图2是靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38在E.coil中的表达分析图，图中：
M：即用型蛋白分子量标准(宽)；1：BL21(pET28a-rCCK8PE38)诱导后全菌蛋白；2：BL21(pET28a-rCCK8PE38)诱导后包涵体蛋白；3：BL21(pET28a-rCCK8PE38)诱导后可溶性蛋白；
图3是硫酸铵沉淀参数优化图，图中：
M:即用型蛋白分子量标准(宽)；1-7:10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％硫酸铵饱和度下沉淀蛋白；黑色箭头指向的蛋白条带即为靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38，当硫酸铵饱和度在饱和度10％时，重组蛋白rCCK8PE38的沉淀量较少，而核酸、脂类等杂质被优先沉淀；当硫酸铵饱和度30％时，靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38即能够完全沉淀，因此选择收集10％-30％硫酸铵饱和度下沉淀的蛋白；
图4是疏水层析介质筛选图，其中：
(A):1-13：Butyl FF疏水柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(B):1-12：Butyl HP疏水柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(C):1-10：Butyl-s FF疏水柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(D):1-10：Otcyl FF疏水柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(E):1-11：Phenyl FF(HS)疏水柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(F):1-9：Phenyl FF(LS)疏水柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(G):1-7：Phenyl HP疏水柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；
黑色箭头所指蛋白条带为靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38，图中可以看出，疏水层析介质Phenyl HP洗脱下的蛋白里，目的蛋白的纯度最高，因此选择了Phenyl HP介质作为最合适的疏水层析介质；
图5是离子交换层析介质筛选图，其中：
(A):1-7：Q XL离子交换柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(B):1-13：Q FF离子交换柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(C):1-10：DEAE FF离子交换柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；(D):1-13：ANX FF离子交换柱洗脱下的蛋白；M:即用型蛋白分子量标准(宽)；
黑色箭头所指蛋白条带为靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38，图中可以看出，离子交换层析介质DEAE FF洗脱下的蛋白里，目的蛋白的纯度最高，因此选择DEAE FF介质作为最合适的离子交换层析介质；
图6是纯化各阶段纯化效果图，图中：
M:即用型蛋白分子量标准(宽)；1:超声后可溶性蛋白；2:硫酸铵沉淀蛋白；3:疏水层析纯化后蛋白；4:离子交换层析纯化后蛋白；5:分子排阻层析纯化后蛋白；
图7是靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38细胞毒性试验结果图；
图8是靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38对实体瘤治疗效果图；
图9是靶向结肠癌的重组蛋白rrCCK8PE38治疗实体瘤的肿瘤抑制率图，图中：
G1：低剂量组(5mg/kg)；G2：中剂量组(15mg/kg)；G3：高剂量组(45mg/kg)。
具体实施方式
一种靶向结肠癌的重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。
编码如权利要求1所述的靶向结肠癌的重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。
一种靶向结肠癌的重组蛋白的制备方法，包括下列步骤：
(一)通过基因扩增获得靶向结肠癌的重组蛋白的重组DNA，核苷酸序列如SEQ IDNo.1所述，通过Nco I和BamH I酶切位点，将该重组DNA克隆入pET28a载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆细胞培养保存；
(二)将重组大肠杆菌BL21(pET28a-rCCK8PE38)接种于2xYT培养基中，37℃持续摇培至OD600达到0.5，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.6mM，27℃摇培5小时后，离心收集菌体，12000g，15min，4℃；
(三)按照1g：20ml的比例用磷酸盐缓冲液PBS重悬菌体，使用超声破碎仪破碎菌体，离心收集上清中的可溶性蛋白，12000g，120min，4℃；
(四)将步骤(三)收集的蛋白溶液进行纯化，步骤如下：
a)在步骤(三)获得的蛋白溶液中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度10％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集上清液；在上清液中继续滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度30％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集沉淀；
b)使用上样缓冲液，20mmol/L Tris-HCl,3mol/L NaCl,1mmol/L EDTA,pH 7.4，重悬步骤a)沉淀物，经蛋白纯化系统，上样到疏水层析介质Phenyl HP，再以3-0mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.9-0mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；
c)将步骤b)收集的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为：20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 6.0；
d)将步骤c)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到离子交换层析介质DEAE FF，再以0-1mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.5-0.7mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；
e)将步骤d)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为保存液，50mmol/L Na3PO4，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH7.4，经上述纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白的纯度可达95％以上。
一种靶向结肠癌的重组蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。
所述靶向结肠癌的重蛋白作用于HCT116人结肠癌裸鼠模型，能够显著抑制肿瘤的生长和扩散。
本发明利用基因重组技术，将CCK(115个氨基酸)的第97至104位置的8个氨基酸序列Phe-Asp-Met-Trp-Gly-Met-Tyr-Asp反向编译为Asp-Tyr-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe的重组型rCCK8，并利用柔性linker HMAEE连接在PE38毒素蛋白的氨基端，组合成为具有高效靶向细胞毒性作用的重组蛋白。
下边通过实验例来进一步说明本发明。
实验例1靶向结肠癌的重组蛋白(以下简称rCCK8PE38)重组基因表达载体的构建与表达
(1)以pET-MSHPE38为模板，利用PCR方法将反向的CCK8通过柔性linker(序列HMAEE)连接到PE38的氨基端，引物序列如下：
CCATGGGCTTCGACATGTGGGGCATGTATGACCATATGGCCGAA
F：
GAGGGCGGCAGCCTGGCC
R：GGATCCTTACAGCTCGTCCTTCGGCG
PCR条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，72℃延伸10min，32个循环；
(2)扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将目标DNA使用胶回收试剂盒回收后，使用Nco I和BamH I酶切。将酶切下的目的基因片段与pET28a质粒片段通过T4连接酶连接，转化入BL21感受态，涂布在预加卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养过夜后，挑取单克隆菌株，摇培增菌后送至测序公司鉴定，鉴定结果与设计一致，见图1；
(3)诱导表达rCCK8PE38，将表达的全菌蛋白、上清液可溶性蛋白、包涵体蛋白分别制样，通过10％SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定，见图2。具体步骤如下：将BL21(pET28a-rCCK8PE38)重组菌株接种于2xYT培养基(1.6％胰蛋白胨，1％酵母粉，0.5％NaCl，pH7.0)，37℃下持续摇培至菌液OD600(600nm吸光度)达到0.5左右，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.6mM，将温度降至27℃持续摇培5h。使用低温高速离心机收集菌体(12000g，15min，4℃)，菌块经PBS缓冲液清洗3遍后，以1g菌：20ml PBS的比例重悬，使用细胞超声破碎仪破碎菌体，再次离心(12000g，120min，4℃)，回收上清液。
实验例2靶向结肠癌的重组蛋白rCCK8PE38的纯化
(1)硫酸铵沉淀
将上清液蛋白等分成7份，分别缓慢滴加饱和硫酸铵溶液(pH7.0)至硫酸铵饱和度10％、20％、30％、40％、50％、60％和70％，再持续搅拌30min后，12000g离心10min，将沉淀重悬制样，经SDS-PAGE鉴定，确定最佳硫酸铵饱和度为10％-30％，见图3；
(2)疏水层析
疏水层析和实验中用到的其他层析操作均在 purifier 100TM系统(GE生命，美国)上完成；为了使疏水层析达到对rCCK8PE38最好的纯化效果，优化了包括疏水层析介质，盐离子类型和盐离子浓度。首先，使用HiTrapTM HIC试剂盒筛选了7种疏水层析介质(Phenyl HP、Phenyl FF(HS)、Phenyl FF(LS)、Butyl HP、Butyl FF、Butyl-s FF、OctylFF)，其中Phenyl HP纯化效果最好，见图4；然后，比较了NaCl和硫酸铵两种盐离子，发现高浓度NaCl的疏水作用较弱，洗脱也更加容易，对蛋白活性影响小，因此选择NaCl作为疏水层析中使用的盐离子；最优盐离子浓度的优化则比较了当平衡缓冲液的NaCl浓度分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3、3.5、4mol/L时，同一种疏水介质对蛋白的吸附效果，结果显示，当平衡缓冲液的NaCl浓度为3mol/L时，目的蛋白相较于杂蛋白，更多的吸附在疏水介质上，因此3mol/L为最优盐离子浓度；
优化后的疏水层析纯化具体操作参数如下：首先，纯化柱中填装适量Phenyl HP介质，使用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 7.4)充分滤过层析柱以清除潜在的残留蛋白，然后以去离子水滤过层析柱使介质复性；疏水层析柱准备就绪后，10-20个柱体积(层析柱中填装的介质所占体积)的平衡缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，3mol/LNaCl，1mmol/L EDTA，pH 7.4)缓慢滤过层析柱直到滤过液的紫外吸收值(280nm)及电导率的指示线趋于稳定，设定此时的紫外值及电导率为基准值(线)；将蛋白溶液缓慢注入层析柱中，此时紫外吸收值会逐渐升高到一个峰值后，随着未结合蛋白的滤出，紫外吸收值会逐渐降低，直到再次趋近基准值，此时继续使用平衡缓冲液滤过层析柱，直到紫外值和电导率完全达到基准值。通过另一个进液泵逐渐增加洗脱缓冲液的比例，使进入层析柱的混合液NaCl浓度从3mol/L缓慢降低到0mol/L，收集0.9mol/L-0mol/L时的洗脱液；
(3)离子交换层析
为了使离子交换层析达到对rCCK8PE38最好的纯化效果，优化了包括离子交换层析介质，缓冲液pH值。首先，由于rCCK8PE38的预测PI值为4.61，更适于使用阴离子交换层析纯化，因此我们通过HiTrapTM IEX试剂盒筛选了4种阴离子层析介质(Q FF、DEAE FF、ANXFF、Q XL)，其中DEAE FF纯化效果最好，附图5；在阴离子交换层析中，当蛋白的PI<缓冲液pH值时，更容易吸附在层析介质上，因此我们比较了缓冲液4.0-8.5时，离子交换层析的纯化效果，结果显示，当平衡及洗脱缓冲液的pH值为6.0时，可以获得最好的纯化效果；
优化后的离子交换层析纯化具体操作参数如下：首先，纯化柱中填装适量DEAE FF介质，使用洗脱缓冲液(20mmol/L Tris-HCl，1mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH 6.0)充分滤过层析柱以清除潜在的残留蛋白，然后以去离子水滤过层析柱使介质复性；离子交换层析柱准备就绪后，10-20个柱体积(层析柱中填装的介质所占体积)的平衡缓冲液(20mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 6.0)缓慢滤过层析柱直到滤过液的紫外吸收值(280nm)及电导率的指示线趋于稳定，设定此时的紫外值及电导率为基准值(线)；将蛋白溶液缓慢注入层析柱中，此时紫外吸收值会逐渐升高到一个峰值后，随着未结合蛋白的滤出，紫外吸收值会逐渐降低，直到再次趋近基准值，此时继续使用平衡缓冲液滤过层析柱，直到紫外值和电导率完全达到基准值。通过另一个进液泵逐渐增加洗脱缓冲液的比例，使进入层析柱的混合液NaCl浓度从0mol/L缓慢增加到1mol/L，收集0.5mol/L-0.7mol/L时的洗脱液；
(4)分子排阻层析
分子排阻层析主要被用来分离分子量差距较大的蛋白分子，以及除盐。我们使用G-25分子排阻层析介质灌装在层析柱中，将10-20个柱体积的稳定缓冲液(50mmol/LNa3PO4，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH 7.4)缓慢滤过层析柱，直到滤过液的紫外吸收值(280nm)及电导率的指示线趋于稳定，设定此时的紫外值及电导率为基准值(线)。将小于0.3个柱体积的蛋白溶液缓慢注入层析柱，紫外吸收值会随着不同分子量大小的蛋白先后滤出而呈现数个紫外峰，收集最高紫外峰时的滤出液。附图6，纯化各阶段纯化效果。
实验例3rCCK8PE38抗肿瘤活性分析
(1)细胞毒性分析
为了验证重组蛋白rCCK8PE38的生物活性，即对肿瘤细胞是否有细胞毒性作用，通过CCK-8毒性检测试剂盒检测rCCK8PE38对多种细胞的杀伤效果；
实验材料和仪器
1)人结直肠癌细胞系HCT116、SW62、HCT8、人胃癌细胞细胞系BGC823、鼠黑色素瘤细胞系B16、人宫颈癌细胞系HeLa(购自中国医学科学院癌细胞库)，CCK-8毒性检测试剂盒(购自北京全式金)，96孔细胞培养板(购自美国康宁公司)。多功能酶标仪(购自美国Biotek公司)
2)实验方法和结果
首先，取对数期的细胞接种在96孔板中，每孔约5000个细胞，每种细胞分为10个对照组，分别加入2、4、8、15、30、60、120、250、500、1000ng/mL纯化后的rCCK8PE38，放置在CO2培养箱中37℃孵育72h后，加入终浓度10％的CCK-8显色液，再孵育4h后，检测450nm紫外吸收值。
结果显示，rCCK8PE38能够显著抑制人结肠癌细胞系HCT116、HCT8、SW620，而对其它细胞系没有显著影响，图7，通过上述实验数据可以计算得到重组蛋白对各细胞的半数抑制率，即IC50值(50％细胞抑制率时蛋白的浓度)，见表1；
表1重组蛋白rCCK8PE38对各种细胞的杀伤活性(IC50)
(2)实体瘤抑瘤试验
1)实验动物、细胞及耗材
BALB/c品系裸鼠100只，6-8周齢，雌性，体重在16-18g之间，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；HCT116细胞系购自中国医学科学院癌细胞库；生理盐水购自山东辰欧，0.4mm无菌注射针购自江西恒达；
2)实验器械
超净工作台、解剖台、电子天平、手术剪、止血钳、游标卡尺等；
3)实验方法和结果
3.1HCT-116结肠癌裸鼠模型的构建
将健康的裸鼠于SPF级条件下的层流架中正常饲喂3～5天后，用酒精棉对裸鼠皮肤反复擦拭数次消毒，用1mL注射器将富集的HCT116细胞注入裸鼠右前肢腋下(偏背部)，每只注射1×107个细胞，每日观察小鼠饮食、活动，及成瘤情况，当注射部位肿胀消退后再次出现隆起肿块，则使用游标卡尺测量直径，选择肿瘤直径大小在3～6mm的裸鼠参与实验。
3.2重组蛋白rCCK8PE38治疗结肠癌裸鼠模型
通过尾静脉注射的方式给予rCCK8PE38治疗，按注射剂量分为三组(5mg/kg、15mg/kg、45mg.kg)，对照组注射等量生理盐水，各组均未出现显著的不良反应。连续治疗14天，治疗组的肿瘤体积显著低于非治疗组，说明rCCK8PE38能够有效抑制结肠癌的生长，图8；将小鼠处死后解剖，治疗结束后，将小鼠处死后解剖，分离肿瘤组织并称重，通过与空白对照组对比后计算出肿瘤抑制率，见图9；取其心、肝、脾、肺、肾切片染色，在治疗组中未见转移灶，而非治疗组的肝脏中发现肿瘤转移灶，说明rCCK8PE38能够有效抑制结肠癌肿瘤细胞扩散。
序列表
<110> 上海杵焱健康科技有限公司
<120> 一种靶向结肠癌的重组蛋白及其制备方法和用途
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1077
<212> DNA
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 1
atgttcgaca tgtggggcat gtatgaccat atggccgaag agggcggcag cctggccgcg 60
ctgaccgcgc accaggcttg ccacctgccg ctggagactt tcacccgtca tcgccagccg 120
cgcggctggg aacaactgga gcagtgcggc tatccggtgc agcggctggt cgccctctac 180
ctggcggcgc ggctgtcgtg caaccaggtc gaccaggtga tccgcaacgc cctggccagc 240
cctggcagcg gcggcgacct gggcgaagcg atccgcgagc agccggagca ggcccgtctg 300
gccctgaccc tggccgccgc cgagagcgag cgcttcgtcc ggcagggcac cggcaacgac 360
gaggccggcg cggccaacgg cccggcggac agcggcgacg ccctgctgga gcgcaactat 420
cccactggcg cggagttcct cggcgacggc ggcgacgtca gcttcagcac ccgcggcacg 480
cagaactgga cggtggagcg gctgctccag gcgcaccgcc aactggagga gcgcggctat 540
gtgttcgtcg gctaccacag caccttcctc gaagcggcgc aaagcatcgt cttcggcggg 600
gtgcgcgcgc gcagccagga cctcgacgcg atctggcgcg gtttctatat cgccggcgat 660
ccggcgctgg cctacggcta cgcccaggac caggaacccg acgcacgcgg ccggatccgc 720
aacggtgccc tgctgcgggt ctatgtgccg cgctcgagcc tgccgggctt ctaccgcacc 780
agcctgaccc tggccgcgcc ggaggcggcg ggcgaggtcg aacggctgat cggccatccg 840
ctgccgctgc gcctggacgc catcaccggc cccgaggagg aaggcgggcg cctggagacc 900
attctcggct ggccgctggc cgagcgcacc gtggtggttc cctcggcgat ccccaccgac 960
ccgcgcaacg tcggcggcga cctcgacccg tccagcatcc ccgacaagga acaggcgatc 1020
agcgccctgc cggactacgc cagccagccc ggcaaaccgc cgaaggacga gctgtaa 1077
<210> 2
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工合成(人工序列)
<400> 2
Phe Asp Met Trp Gly Met Tyr Asp His Met Ala Glu Glu Gly Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys His Leu Pro Leu Glu Thr
20 25 30
Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp Glu Gln Leu Glu Gln Cys
35 40 45
Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu Tyr Leu Ala Ala Arg Leu
50 55 60
Ser Cys Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg Asn Ala Leu Ala Ser Pro
65 70 75 80
Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile Arg Glu Gln Pro Glu Gln
85 90 95
Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala Glu Ser Glu Arg Phe Val
100 105 110
Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly Ala Ala Asn Gly Pro Ala
115 120 125
Asp Ser Gly Asp Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu
130 135 140
Phe Leu Gly Asp Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln
145 150 155 160
Asn Trp Thr Val Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu
165 170 175
Arg Gly Tyr Val Phe Val Gly Tyr His Ser Thr Phe Leu Glu Ala Ala
180 185 190
Gln Ser Ile Val Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp
195 200 205
Ala Ile Trp Arg Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr
210 215 220
Gly Tyr Ala Gln Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn
225 230 235 240
Gly Ala Leu Leu Arg Val Tyr Val Pro Arg Ser Ser Leu Pro Gly Phe
245 250 255
Tyr Arg Thr Ser Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val
260 265 270
Glu Arg Leu Ile Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr
275 280 285
Gly Pro Glu Glu Glu Gly Gly Arg Leu Glu Thr Ile Leu Gly Trp Pro
290 295 300
Leu Ala Glu Arg Thr Val Val Val Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro
305 310 315 320
Arg Asn Val Gly Gly Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu
325 330 335
Gln Ala Ile Ser Ala Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro
340 345 350
Pro Lys Asp Glu Leu
355

Claims (5)

1.一种靶向结肠癌的重组蛋白，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述。
2.编码如权利要求1所述的靶向结肠癌的重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于：该核苷酸序列如SEQ ID No.1所述。
3.如权利要求1所述的靶向结肠癌的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(一)通过基因扩增获得靶向结肠癌的重组蛋白的重组DNA，核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，通过NcoI和BamHI酶切位点，将该重组DNA克隆入pET28a载体，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取单克隆细胞培养保存；
(二)将重组大肠杆菌BL21(pET28a-rCCK8PE38)接种于2xYT培养基中，37℃持续摇培至OD600达到0.5，加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷IPTG至终浓度0.6mM，27℃摇培5小时后，离心收集菌体，12000g，15min，4℃；
(三)按照1g：20ml的比例用磷酸盐缓冲液PBS重悬菌体，使用超声破碎仪破碎菌体，离心收集上清中的可溶性蛋白，12000g，120min，4℃；
(四)将步骤(三)收集的蛋白溶液进行纯化，步骤如下：
a)在步骤(三)获得的蛋白溶液中缓慢滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度10％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集上清液；在上清液中继续滴加饱和硫酸铵溶液，至终饱和度30％，低温离心，12000g，5min，4℃，收集沉淀；
b)使用上样缓冲液，20mmol/L Tris-HCl,3mol/L NaCl,1mmol/L EDTA,pH 7.4，重悬步骤a)沉淀物，经蛋白纯化系统，上样到疏水层析介质Phenyl HP，再以3-0mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.9-0mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；
c)将步骤b)收集的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为：20mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH 6.0；
d)将步骤c)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到离子交换层析介质DEAEFF，再以0-1mol/L氯化钠浓度梯度洗脱，收集0.5-0.7mol/L氯化钠浓度洗脱下的蛋白溶液；
e)将步骤d)获得的蛋白溶液经蛋白纯化系统，上样到分子排阻层析介质G-25除盐，其缓冲体系被置换为保存液，50mmol/L Na3PO4，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，pH7.4，经上述纯化后的靶向结肠癌的重组蛋白的纯度可达95％以上。
4.如权利要求1所述的一种靶向结肠癌的重组蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用。
5.如权利要求4的所述的一种靶向结肠癌的重组蛋白在制备治疗结肠癌药物中的应用，其特征在于：靶向结肠癌的重蛋白作用于HCT116人结肠癌裸鼠模型，能够显著抑制肿瘤的生长和扩散。
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