CN101343328B - 靶特异性双突变体融合蛋白质 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了靶特异性双突变体融合蛋白质,是由人促性腺激素释放激素突变体(mGnRH)与重组绿脓杆菌外毒素A突变体(PE38m4a)融合蛋白质构建的,本发明的mGnRH-PE38m4a蛋白质对包括结肠癌HT-29细胞、卵巢癌OVCAR3细胞、子宫颈腺癌HeLa细胞及肝癌HepG-2细胞等肿瘤细胞系均有明显的特异结合活性和细胞毒性;正常细胞基本没有致死作用;融合蛋白比天然PEA活性提高了9-10倍左右;而且成本低,方法简单,更适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域,涉及具有靶细胞特异性细胞毒性的融合蛋白质,具体地说,本发明涉及人促性腺激素释放激素突变体(mGnRH)与重组绿脓杆菌外毒素A突变体(PE38m4a)融合蛋白质的构建,以及所说的双突变体融合蛋白质作为抗肿瘤药物,在抑制类固醇激素刺激的肿瘤发生和发育中的应用。
背景技术
传统的肿瘤治疗方法是使用化学药物直接杀伤体内的肿瘤细胞。然而,大多数抗肿瘤药物在杀伤肿瘤的同时还杀伤正常细胞,即不可避免地造成严重的毒副作用。为了提高抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性,自20世纪70年代后期以来,人们就试图将某些抗肿瘤药物或本来缺乏靶向选择性的毒素(包括细菌或动植物来源的毒素)化学偶联到适当的导向分子或称识别分子上,以制备杂交的具有靶特异性的抗肿瘤剂。随着分子生物学技术的发展,进而建立了以DNA重组技术制备这样的融合蛋白质的方法。
在肿瘤的发生和发育过程中,许多肿瘤细胞都在其表面过量表达某些细胞因子或受体蛋白质,例如表皮生长因子受体(EGF-R)和转化生长因子α受体(TGFα-R)。因此,可将某些细胞毒性剂(如绿脓杆菌外毒素(PE)、白喉毒素、霍乱毒素、葡萄球菌内毒素及蓖麻毒素等)连接到作为导向剂的EGF、TGF-α或bFGF分子上,以产生兼有肿瘤细胞导向功能和细胞毒活性的杂交分子。这些杂交分子借助其对靶肿瘤细胞导向能力将整个分子引向靶细胞并通过其毒素部分杀伤靶细胞。
目前研究较多且较深入的细胞毒性剂是绿脓杆菌外毒素A(PEA)(参见美国专利4,545,985)。PEA是由613个氨基酸组成的单链多肽。对PE分子的X射线晶体学研究和突变分析显示,PE分子包括三个与产生细胞毒性相关的结构区域:负责与敏感细胞结合的氨基末端细胞受体结合区(I区);负责毒素分子向细胞内转位的中间转位区(II区);以及负责失活细胞延伸因子-2并最终导致细胞死亡的羧基末端酶促活性区(III区)。其中I区包括介导细胞结合的Ia区(氨基酸1-252)和目前尚未明确其功能的Ib区(氨基酸365-399)。可以使用生物化学或重组DNA技术修饰PE分子,以制备PE分子中有一个或多个氨基酸缺失或取代的各种修饰的PE片段,例如,一般将删去了PE分子中Ia区,只含有酶促和转位区,分子量约为40KDa的PE-A蛋白质称为PE40。现已发现删除PE的Ia和大部分Ib区(氨基酸365-380)后,即PE38毒素分子,该分子仍保留其特异性细胞毒性,但降低了非特异性毒性和抗原性(例如参见Hwang et al.,Cell48:129-136,1987;美国专利4,892,827和欧洲专利0261671)。
许多现有技术文献已描述了PE与各种生长因子、抗体、激素或CD4融合,以产生可选择性地导向并杀伤具有不同细胞膜蛋白(受体或抗原)之靶细胞的杂交蛋白质的方法(参见Pastan and Fitz.G.,Science254:1173-1177,1991)。例如,Chaudhary等人(PNAS84:4538-4542,1987)描述了PE40与TGFα间形成的杂交体融合蛋白质(TGFα-PE40)。TGF
α-PE40的临床实用性依赖于其结合并杀伤具有表皮生长因子受体之细胞的能力。美国专利5,428,143公开了用于选择性杀伤HIV感染之细胞的杂交蛋白质及编码该杂交蛋白质的嵌合基因的构建。其中所说的杂交蛋白质由含有HIV结合位点的人CD4和可杀死HIV感染之细胞毒性蛋白质(PE40)组成。
作为与本发明更为相关的现有技术,国际专利WO93/15751公开了将促性腺激素释放激素(GnRH)肽直接偶联到绿脓杆菌外毒素分子上制成的嵌合蛋白质分子。据称,投用这样的嵌合分子可导致脑垂体中携带GnRH受体的细胞被破坏,并伴有性激素分泌的降低,因而可望将其用于动物不育化及抑制类固醇激素相关肿瘤的增殖。另外,国际专利申请WO97/15325描述了一种含有与绿脓杆菌外毒素化学结合的GnRH的免疫原性载体系统,以其作为疫苗可在动物体内诱发产生高浓度抗GnRH抗体,因而可用于控制受孕、减少生殖激素驱动的行为及治疗类固醇激素反应性肿瘤。
发明内容
本发明的目的是提供靶特异性双突变体融合蛋白质,它是由突变的促性腺激素释放激素mGnRH与重组绿脓杆菌外毒素A突变体融合而成的融合毒素,特征在于所述的重组绿脓杆菌外毒素是去除Ia区及Ib区的氨基酸365-380,且C末端氨基酸Glu610、Leu612、Lys613分别人工突变为Lys610、Glu612和Leu613的PEA分子,即PE38m4a。
所述的突变的促性腺激素释放激素mGnRH,它的基因是以大肠杆菌偏性密码子为主体的基因形式合成的,氨基酸序列为:Met-Gly-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-His。
靶特异性双突变体融合蛋白质它的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
一种表达载体,pET27-mGnRH-PE38m4a,其基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明靶特异性双突变体融合蛋白质是由下述方法制备的;
(1)人工合成适合基因表达的mGnRH基因序列,和PE38m4a基因序列;
(2)将人工合成的融合基因序列通过基因操作克隆到表达载体中;
(3)用步骤(2)的表达载体转化大肠杆菌中;
(4)在适当条件下表达所说的融合蛋白质;
(5)从细胞培养物中回收并纯化融合蛋白质。
步骤(1)mGnRH基因序列,采用人工设计合成了NcoI内切酶识别序列--大肠杆菌偏性密码子组成的mGnRH核苷酸序列,其中第6位Gly突变为Trp--NdeI内切酶识别序列--PE38m4a核苷酸序列--EcoRI内切酶识别序列;合成的基因序列的5’和3’端分别引入了NcoI和EcoRI核酸内切酶酶切位点,并造成适于连接的粘性末端。
步骤(2)所述的基因如序列表SEQ ID NO.1所示。
所述的载体是pET27。
步骤(3)所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(λDE3)。
本发明的再一个目的是靶特异性双突变体融合蛋白质在治疗与促性腺激素释放激素受体有关的肿瘤药物的应用
GnRH是由Schally等于1971年从动物体内分离纯化,阐明其结构后又人工合成的,并以此获得了1976年的Nobel奖。GnRH为一个不含游离氨基酸与羧基的十肽,其分子结构为:P-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2,其中第4-6位氨基酸形成β转折,呈发夹形,适合与受体结合,第2和3位对生物活性很重要,第6位对维持发夹构象起重要作用,第1位与第4-10位氨基酸均参与受体结合,若置换以上氨基酸残基可导致活力丧失或呈几何级增强。
在体内很容易被蛋白水解酶降解,故其半衰期仅4-8min。其水解酶肽酶的主要作用部位是Gly6-Leu7和Pro9-Gly10-NH2。为寻求高效且持久的GnRH类似物,通过对其肽链结构中氨基酸的拾取或替换,已合成3000多种GnRH类似物。由于合成的GnRH半衰期长,作用更强,所以比天然的GnRH更适于病人的治疗。合成长效的GnRH激动剂的要求是稳定分子结构,使之不易被酶水解,增加与循环中的蛋白和胞膜的结合及提高对GnRH受体的亲和力。如6位为D-氨基酸的类似物和取代Gly10酰胺基。这种GnRH激动剂不仅耐蛋白酶水解作用较大,而且对受体有较高的亲和力。若在第6位引入庞大的疏水基团可进一步增加与受体的亲和力。这样的置换稳定了释放激素类似物的“活性”构型,提高了与循环中蛋白的结合,从而延长半衰期。早期开发的GnRH拮抗剂的理论基础与GnRH激动剂相似,可改善与受体结合,却产生不易接受的组胺释放副作用。因此,开发下一代的GnRH拮抗剂的焦点集中到既提高效能又减少组胺释放这一方面。
越来越多的研究发现,某些激素和细胞因子的受体在肿瘤细胞上有异常高的表达,如EGFR、GnRHR等。而且,激素和细胞因子的分子相对较小,结构简单,基因操作方便,因此,作为免疫毒素的载体有很大的可行性。目前有很多的细胞因子和激素被利用来做免疫毒素的载体,如IL-2、IL-4、EGF、GnRH等,并且表达的重组免疫毒素蛋白均具有特异性细胞毒效应。GnRH受体最早发现于垂体,随着近年来对GnRH及其受体研究的进一步深入,越来越多的临床和实验表明,垂体外组织也有GnRH及其受体的分布,并且垂体外正常组织及其相应部位癌组织GnRH受体性质有许多不同。有文献报道,它们所介导的信号传导通路不同,也有报道,癌细胞表面的GnRH受体可能介导细胞调亡。另外,癌细胞膜表面受体的亲和力通常大于相应正常组织细胞膜表面受体亲和力。据报导,在脊椎动物牛蛙脑垂体和后脑的细胞上已经发现了3种GnRH受体的亚型,人体中目前发现两种亚型,但其分布和功能各不相同,I型受体与I型GnRH结合,II型受体与II型GnRH结合,二者之间交叉反应极低。已经有大量的实验证明:(1)人类正常组织的性腺(包括子宫内膜、子宫肌层、卵巢和睾丸),胎盘和大脑组织的细胞膜上有GnRH受体的分布。(2)不排除其他正常组织细胞膜上有亲和力及低的GnRH受体存在的可能,如肝脏。(3)GnRH受体主要分布在肝癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫肌瘤、乳腺癌和前列腺癌细胞膜上。
本文所使用的术语“mGnRH”是指能够与其表面上具有类固醇激素受体的细胞结合,并且当以高剂量投用于哺乳动物宿主时能引发抗GnRH抗体产生的天然GnRH的类似物或衍生物。
天然GnRH也称为促黄体激素释放激素(LHRH或LRH),其为具有下示氨基酸序列的十肽分子:
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
式中所用的氨基酸符号为本领域通用的三字母缩写符号,并且其中的pGlu代表焦谷氨酸。由于基因工程表达中无法合成焦谷氨酸,所以一般都将之突变为谷氨酰氨。可适用于本发明的mGnRH类似物或衍生物是Trp6-mGnRH。研究结果显示,分子中的第3~6位氨基酸是维持GnRH活性所必需的,而Ser4和Tyr5则在受体结合中起到关键性作用。已有证据表明,卵巢细胞特别是粒层细胞表面具有GnRH受体。已证明小鼠睾丸细胞(Legdig细胞)表面的受体表达与体内激素水平有关(Harwood,J.P.et al.,Endocrinology107:407-413,1980)。另外,还有人发现大鼠子宫内膜上具有亲合力很高的GnRH受体(曹咏清等,中国科学B辑1:32-37,1984)。虽然目前对GnRH的垂体外作用机理尚不完全清楚,但可以肯定的是,GnRH与性腺或子宫内膜等类固醇激素相关组织或细胞上特异性受体的结合是GnRH发挥垂体外作用的一个重要环节。而且也已显示,与靶细胞膜和细胞内分泌颗粒上存在的GnRH受体结合基本上是没有种属特异性的(张崇理等,中国应用生理学杂志5(1):87-93,1988)。
本发明所涉及的融合毒素中设计的导向部分为突变的mGnRH氨基酸序列为:Met-Gly-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-His
式中所用的氨基酸符号为本领域通用的三字母缩写符号,其中为了基因连接方便在基因合成时于N末端加入了Met-Gly的密码子,并且将新序列中第八位氨基酸于基因水平上突变为Trp,以使表达产物与相应受体结合能力的增强;同时将大肠杆菌偏性密码子引入到其中,以使表达产物适合在大肠杆菌中表达。我们对按本发明方法制备的mGnRH-PE38m4a融合蛋白质的生物学活性分析已清楚地证明,mGnRH-PE38m4a具有与包括A549细胞在内多种性器官来源的肿瘤细胞具有杀伤活性,而对多种组织来源的正常细胞则没有这种特异杀伤活性(参见实施例2)。
本文中所使用术语“IC50”是指杀死靶细胞达到对照组的50%所需的嵌合毒素的浓度。本发明中使用标准的MTT法检测“IC50”值。
Allured等人对PE晶体的X线衍射分析表明PE是613个氨基酸组成的单链毒素蛋白,分子量66kDa,其前体为638个氨基酸,在分泌过程中切去了由25个氨基酸组成的高度疏水的引导肽。从PE的晶体结构中得知,它在空间上分为三个结构域(Domain,D)区,即I区、П区和Ш区(见图1)。I区在PE的氨基端(N端),占分子的1/3强,呈反向平行的β结构,它由Ia区和Ib区组成,这两部分在DNA序列上是分离的,但在三维结构中紧靠在一起。Ia区由第1~252个氨基酸组成,Ib区由第365~399个氨基酸组成。П区由第253~364个氨基酸组成,为中央区,由6-7个a-螺旋组成。Ш区由第400~613个氨基酸组成,为羧基端区,占分子的1/3。此毒素的分子结构中有8个半胱氨酸,形成4个二硫键,它们是三级结构形成折叠的决定因素。PEA结构功能的特点在于它的三个结构功能区在单一肽链上行使其细胞毒性所必需的细胞结合、转位和ADP-核糖基化这三种功能,探知各区的功能及分析各区结构与功能的关系主要根据PEA基因突变的研究。
Ia区行使识别和结合靶细胞表面受体的功能,Ia区的缺失产生了分子量40000的PE40,它保留了完整的ADP-核糖基化功能,但细胞毒性减低到1%,这是由于PE40丧失细胞结合能力的结果。对Ia区的定点诱变研究发现,当将第57位赖氨酸(Lys57)诱变为谷氨酸(Glu)时突变的PE细胞毒性减低到1%,这是由于突变毒素同靶细胞表面结合能力丧失的缘故。同时已观察到Lys57位于PE分子表面,这与其有受体结合能力是相符合的。I区上其它Lys位点的突变对PE细胞毒素作用无任何影响。可见,Lys57是Ia区的关键的氨基酸位点。除Lys57外,位于Ia区的His246,Arg247和His249三个碱性氨基酸也是维持PE生物学活性的重要位点。在突变型PE的Glu246,247,249和PE Glu57,246,247,249,上述碱性氨基酸已由Glu替换,使Ia区与II区间连接的氢键受阻断,突变型分子比天然PE较为伸展,增加了对蛋白酶的敏感性,缩短了在小鼠体内循环的半衰期,因此,它们对动物显示低的细胞毒性。
Ib区在三维结构上位于Ia区和III区之间,此区的大部缺失并不影响PE的生物学活性。在PE40的基础上缺失了Ib区的第365~381位氨基酸,形成了PE38分子。PE38分子比PE40分子量小2000Da,缺失了3-4个关键的抗原决定簇,因此抗原性明显降低。
П区在毒素跨膜转位过程中起主导作用。当П区缺失时,尽管其细胞结合能力和ADP-核糖基化活性尚存,但细胞毒性丧失,说明П区为毒素转位功能所必需的。П区的强疏水区插入膜或横跨膜是转位过程的重要环节。A与B螺旋之间有一个环位于分子表面,Arg276和Arg279在此环上,细胞蛋白酶裂解作用发生在第279和第280位氨基酸之间。实验表明,将Arg276、Arg279点突变成Gly后,其细胞毒性作用减低到1/400。因为突变分子对细胞蛋白酶有抗力,因而不能裂解产生37000片段,毒素不能转位入胞浆而不产生细胞毒作用。研究发现Arg276不可用大小相近和电荷相同的氨基酸替换,说明此位点与细胞有关成分的相互作用是专一的。可见,Arg276和Arg279是维持П区转位功能的关键性位点。其他重要的氨基酸位点有Cys265,Cys287等,它们点突变成Ser或Ala后,造成细胞毒作用减低到1/10。此外,П区E螺旋的部分(第346~364位氨基酸)缺失不引起PE活性的丧失。
Ш区有三个功能,其一是催化EF-2受ADP-核糖基化作用,其二引导毒素的酶活性片段进入内质网。其三激活与细胞凋亡有关的Caspases-3酶,启动细胞的凋亡机制而引起细胞凋亡。Allured提出Ш区的一个裂缝区是酶活性中心。现已证实,定位在裂缝区的Glu553是关键的活性位点,Glu553参与结合NAD的过程,Glu553向Asp的点突变导致其ADP-核糖基化活性至少减低到1%,缺失它则完全丧失活性。其他几个裂缝区的残基Arg458,Arg467及Trp466也参与Ш区同NAD相互作用的过程。Tyr481以Phe替代时引起ADP-核糖基转移酶活性减低却不减低NAD糖苷水解酶活性而被推测参与同EF-2相互作用;Trp558也不直接参与结合NAD的过程却为ADP-核糖基化作用所必需。Ш区的另一个关键残基His426位于由第421~432位氨基酸残基构成的a螺旋内,此螺旋位于酶催化作用中心的远端,在Ш区酶催化位点的分子构筑上起关键作用。此外,Ш区表面Arg490附近是另一处蛋白酶靶区。Arg490的缺失或突变可导致产生耐蛋白酶的分子,Arg492的缺失或突变引起ADP-核糖基化活性减低。Ш区C末端特异的氨基酸序列的功能是介导PE由胞吞泡向内质网的转位。此特异序列是Arg609-Glu610-Asp611-Leu612-Lys613(即REDLK)五个氨基酸残基片段。它的缺失使PE的细胞毒性丧失,但对其ADP-核糖基化活性并无任何影响。在活性PE分子的C末端特异序列REDLK和使蛋白质在内质网滞留序列KDEL之间有功能相似性。当编码PE的C末端REDLK序列以KDEL片段取代时可导致其细胞毒性提高2-8倍,证明KDEL序列使PE在内质网滞留作用更为有效。
用于构建本发明的融合蛋白质的PE分子是在缺失了Ia区和大部分Ib区的PE分子基础上,保留609位Arg和611位Asp,将Glu610、Leu612、Lys613分别突变为Lys610、Glu612和Leu613,而形成一种新的氨基酸组合RKDEL,即PE38m4a。
鉴于本发明抗肿瘤嵌合毒素中导向剂或称识别分子的促性腺激素释放激素的原序列基因不适合于基因工程表达,另外作为细胞毒性成分的PE38m4a多位点突变,为了便于基因操作,人工设计合成了如下组分的基因序列:NcoI内切酶识别序列-大肠杆菌偏性密码子组成的mGnRH核苷酸序列,其中第6位Gly突变为Trp-NdeI内切酶识别序列-PE38m4a核苷酸序列-EcoRI内切酶识别序列。合成的基因序列的5’和3’端分别引入了NcoI和EcoRI核酸内切酶酶切位点,并造成适于连接的粘性末端。可按照本领域技术人员已知的重组技术(例如参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,1989),克隆合成的基因入表达载体pET27(Merck Co.)系列中构建pET27-mGnRH-PE38m4a。然后将重组载体系统转化到原核细胞如大肠杆菌细胞中以生产mGnRH-PE38m4a融合蛋白质。DNA重组操作中,使用限制性酶切法鉴定序列连接方向的正确性和可能的突变,最后以Sanger双脱氧链终止法进行序列测定以进一步证实之。
这里应特别指出的是,由于相对于细胞毒性部分PE38m4a来说,导向部分mGnRH的分子量小得多,所以由两者产生的融合蛋白质很可能形成新的二级空间构象,导致PE38m4a部分对mGnRH的卷曲,影响融合蛋白质的受体结合的程度。然而通过技术人员计算机分析PE38m4a部分的卷曲并不能影响mGnRH的分子暴露和与受体结合。
重组蛋白质基因将被可操纵地连接到适当的表达控制序列上,如连接到适于在大肠杆菌中使用的T7、trp或λ启动子、核糖体结合位点及转录终止信号上。可使用已知的转化方法,如适于原核细胞的氯化钙处理法将本发明的重组质粒转化到选择的宿主细胞中。可基于质粒上所含抗生素抗性基因所赋予的抗生素抗性来选择被转化的阳性细胞。一旦表达了所需的融合蛋白质,即可按照本领域已知的方法分离并纯化该融合蛋白质。例如,可从发酵培养物中离心收集菌体细胞并用溶菌酶和超声波裂解之,然后超速离心并在低浓度磷酸盐(约20mM)溶液中加入饱和硫酸铵进行分步沉淀。依次经离子交换层析(IEC)和体积排阻层析(SEC)纯化所需的mGnRH-PE38m4a重组蛋白质。另外,亦可使用盐析、亲合层析及制备性凝胶电泳等方法进行纯化(参见R.Scopes,Protein Purificafion,Springer-Verlag,N,Y.,1982)。
一般说来,使用聚丙烯酰胺凝胶以SDS-PAGE电泳法(Laemmli,Nature227:680-689,1970)分析各柱层析洗脱部分,并使用多克隆抗PE抗血清和以免疫印迹法检测之。对重组融合蛋白质纯化产物进行肿瘤细胞抑制试验以检测融合蛋白质的细胞毒性(IC50)。以及用125I标记的天然GnRH与融合蛋白在A549细胞表面进行竞争取代,以确定融合蛋白中的mGnRH与天然GnRH对细胞表面受体的亲合能力。
可将本发明的mGnRH-PE38m4a融合蛋白质作为基本活性成分,并加入一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂,制成适于临床应用的药物组合物。所说的载体或赋形剂包括但不只限于磷酸盐缓冲盐水、生理盐水、等渗葡萄糖溶液、葡聚糖、右旋糖苷等。根据所治疗的疾病的不同,可在本发明的药物组合物中加入一种或多种与本发明的融合蛋白质有辅助或协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物。另外,可在本发明的药物组合物中加入选自人血清白蛋白、低分子量肽、甘氨酸或赖氨酸及金属阳离子(如Zn2+、Mn2+、Mg2+和Ca2+)的蛋白质保护剂,以及选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂。
可以通过常规给药途径,特别是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物,例如通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几毫微克至几十毫克/公斤体重/天,但针对每个特定病人的具体用药剂量将根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、对药物的反应能力及给药方式等因素而定。
应特别指出的是,尽管更深入的作用机理尚不明确,但我们的实验室已证明本发明的mGnRH-PE38m4a蛋白质对包括结肠癌HT-29细胞、卵巢癌OVCAR3细胞、子宫颈腺癌HeLa细胞及肝癌HepG-2细胞等肿瘤细胞系均有明显的特异结合活性和细胞毒性;正常细胞基本没有致死作用;融合蛋白比天然PEA活性提高了9-10倍左右;而且成本低,方法简单,更适合工业化生产。
附图说明
图1显示用于表达mGnRH-PE38m4a的重组质粒的构建图。
图2显示的125I-mGnRH-PE38m4a(▲)和125I-GnRH(■)与A549细胞膜表面受体结合的饱和曲线。
图3显示的125I标记的mGnRH-PE38m4a和GnRH与A549细胞膜表面受体结合后分别用未标记的不同浓度的GnRH或mGnRH-PE38m4a竞争替代的曲线。◆代表不同浓度的GnRH竞争替代125I-mGnRH-PE38m4a的曲线,■代表不同浓度的mGnRH-PE38m4a竞争替代125I-GnRH的曲线。
具体实施方式
实施例1:mGnRH-PE38m4a融合蛋白质的制备
A.重组表达质粒的构建与鉴定
a.mGnRH-PE38m4a双链基因的制备:参考现有文献资料设计并人工体外合成如SEQ IDNO.1所示mGnRH-PE38m4a的双链核苷酸序列(含酶切识别位点及目的基因共1089bp)。在T4连接酶(Promega)存在下直接克隆于PGEM-T载体中,并转化大肠杆菌JM105,获得含PGEM-T/mGnRH-PE38m4a质粒的工程菌株。
b.mGnRH-PE38m4a表达质粒的制备:提取PGEM-T/mGnRH-PE38m4a质粒,并利用NcoI和EcoRI核酸内切酶双酶切,收集mGnRH-PE38m4a基因片段,在T4连接酶(Promega)存在下直接克隆入相同酶切的pET27载体中,转化大肠杆菌JM105,获得含pET27-mGnRH-PE38m4a质粒的工程菌株。
c.mGnRH-PE38m4a表达菌株的筛选:提取pET27-mGnRH-PE38m4a质粒进行酶切鉴定后,将正确克隆的质粒转化感受态大肠杆菌BL21(λDE3)细胞,并将被转化的细胞培养于含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中,以扩增质粒DNA。培养完成后,以常规方法提取质粒DNA。用NcoI和EcoRI酶切鉴定,然后阳性重组质粒进行DNA序列分析。SEQ ID NO:1显示了所测得的mGnRH-PE38m4a重组基因的核苷酸序列。SEQ ID NO:2显示了所测得的mGnRH-PE38m4a重组基因的核苷酸序列所推导出的氨基酸序列。图I显示了重组质粒pET27-mGnRH-PE38m4a的构建。
B.mGnRH-PE38m4a融合蛋白质的表达及产物的纯化:
将携带pET27-mGnRH-PE38m4a重组基因质粒的大肠杆菌BL21(λDE3)(含有T7RNA聚合酶启动子基因)(Studier,F.W.and Moffatt,B.A.,J.Mol,Biol,189:113-130,1986)培养在含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养基中37℃培养,当OD600达到约0.4~0.6时加入1mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度1mM),37℃继续培养3-4小时,以诱导目的产物的表达。然后离心收集细菌,细菌经过适当方法破碎后再离心收集沉淀和上清,进行SDS-PAGE电泳确定目的蛋白的表达形式和表达量。经SDS-PAGE电泳表明目的蛋白以可溶性分泌形式表达,表达量占菌体总蛋白的20%左右。并将含有目的蛋白质上清中加入缓冲液成分,终浓度达50mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA,4℃中空纤维超滤器(Milipore)作用30分钟,4℃离心(20,000g,30分钟),取上清(可溶性部分)即为mGnRH-PE38m4a粗提物。
mGnRH-PE38m4a粗提物经过缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia),用含有0~0.5M NaCl的TE缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA)连续梯度洗脱,并收集蛋白质各组分峰部分。目的组分峰部分经小型中空纤维超滤器(Milipore)作用30分钟超滤浓缩换液后,使浓缩物通过用20mM Tris-HCl,pH8.0,1mM EDTA,0.15M NaCl缓冲液平衡过的1.6×100cm Sephacryl-100柱(Pharmacia),并用含有0.15M NaCl的TE缓冲液(20mMTris·HCl,pH8.0,1mM EDTA)洗脱。收集活性峰部分并再次过高压液相色谱柱(日本岛津),收集蛋白质峰值(A280)部分并在30mM PBS中彻底透析,透析后于-20℃下储存备用。如此纯化的蛋白质纯度>95%。
利用125I标记的天然GnRH和mGnRH-PE38m4a进行肿瘤细胞A549的结合试验及多克隆抗PE抗血清对纯化的mGnRH-PE38m4a蛋白质进行鉴定。
实施例2:125I标记的天然GnRH和mGnRH-PE38m4a融合蛋白质的靶特异性和生物学活性分析
A.结合能力试验:
a.GnRH和mGnRH-PE38m4a的125I标记:称取1mg Lodogen溶于0.5ml氯仿中,取50μl(100μg)加至试管底部,用氮气吹干,加不含保护剂的多肽或蛋白质半成品0.4ml,加入Na125I5mCi室温反应12min,反应过程不断摇动,使之反应充分。
125I标记的混合物利用Sepharyl S-200HR凝胶柱(1×50cm)分离纯化,收集各管,取放射性强度最高的管进行试验。
b.癌细胞及正常细胞培养:用RPMI-1640完全培养基在5%CO2,37℃条件下单层贴壁培养并计数。每细胞孔中加入相同CPM的125I标记GnRH、mGnRH-PE38m4a(5μCi/孔,稀释在BSA-PBS中),并进行系列等倍稀释度,1小时后RPMI-1640完全培养基洗涤5次,经胰蛋白酶消化,吹打收集细胞悬液,进行γ计数(结果见图2)。
从图2所示的结果可以看出,125I标记GnRH和mGnRH-PE38m4a均以剂量依赖方式结合到肿瘤细胞A549表面直到达到饱和程度,并且显示125I-mGnRH-PE38m4a的结合能力>125I-GnRH,而对正常细胞结合能力均极低,从而证实本发明部分中纯化的mGnRH-PE38m4a融合蛋白能够以剂量依赖方式与受体阳性细胞结合。
B.GnRH、mGnRH-PE38m4a与125I标记GnRH、mGnRH-PE38m4a竞争结合试验
基本上按照Qayum,A.等人(Br.J.Cancer62:96-99,1990)所述的方法进行多肽或蛋白质对A549细胞结合的特异性竞争和取代研究。
将培养的A549单层细胞记数后加入结合试验饱和曲线拐点处放射性标记物γ计数单位的125I-mGnRH并37℃温浴1小时。RPMI-1640完全培养基洗涤5次,1小时后再分别加入未标记的mGnRH-PE38m4a(0.01-1000μM),37℃温浴1小时,RPMI-1640完全培养基洗涤5次,经胰蛋白酶消化,吹打收集细胞悬液,进行γ计数;另外进行反证试验:将培养的A549单层细胞计数后加入饱和曲线拐点处放射性标记物γ计数单位的125I-mGnRH-PE38m4a,用未标记的GnRH(0.01-1000μM)进行竞争和取代研究,结果见图3。
图3中■代表不同浓度的mGnRH-PE38m4a竞争替代125I-GnRH的曲线。◆代表不同浓度的GnRH竞争替代125I-mGnRH-PE38m4a的曲线。
从图3所示的数据可以看出,以渐增的浓度加入未标记的mGnRH-PE38m4a或GnRH均可以将标记物进行取代,另外可以看出GnRH取代125I-mGnRH-PE38m4a的浓度是mGnRH-PE38m4a取代125I-GnRH的浓度的7-8倍左右,说明mGnRH-PE38m4a融合蛋白中经过突变处理,其中的mGnRH组分较未突变的GnRH对靶细胞的结合能力提高7倍以上。
实施例3:细胞毒性试验:
定量的样品经过滤除菌,按等倍稀释法将不同量的样品加入各细胞孔中,使之总体积为100μl,5%CO2,37℃条件下培养12h,培养板各孔中分别加入100μl MTT染色试剂,5%CO2,37℃条件下继续培养4h,于490nm波长下测定吸光值,计算重组毒素对各种肿瘤和正常细胞的50%细胞死亡的浓度(IC50),同时利用天然绿脓杆菌外毒素A(PEA,Sigma公司)作为对照,比较融合毒素和天然PEA的活性变化。结果见表1。
表1:纯化的mGnRH-PE38m4a和天然PEA对肿瘤和正常细胞的IC50
表1显示纯化的mGnRH-PE38m4a和天然PEA对某些肿瘤细胞及某些正常细胞培养物的细胞毒性。IC50数值是指杀死靶细胞达到对照组的50%所需的融合蛋白的浓度。A549为人肺腺癌细胞株、LOVO为人肠癌细胞株、MKN45为人胃腺癌细胞株、Bcap37为人乳腺癌细胞株、QGY为人肝癌细胞株、PC-3M为人前列腺癌细胞株、A375为人黑色素瘤细胞株、KB为人口腔癌细胞株,正常细胞有人胚肾、人胚肝培养株。
从表1所示的结果可以看出,本发明所纯化的mGnRH-PE38m4a可以杀死人肺腺癌、人肠癌、人胃腺癌、人乳腺癌、人肝癌、人前列腺癌、人黑色素瘤、人口腔癌细胞株,并且IC50值较低,而对正常细胞人胚肾、人胚肝培养株无杀伤作用;天然PEA对相同种类肿瘤细胞的IC50均高于融合蛋白IC50值,二者相差10倍左右,由此可见,融合蛋白比天然PEA活性提高了9-10倍左右。试验还表明PEA几乎对所有细胞都有致死作用,而mGnRH-PE38m4a则对正常细胞基本没有致死作用。
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<110>北京博翱泰生物技术有限公司
<120>靶特异性双突变体融合蛋白质
<160>2
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<212>DNA
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Claims (6)
1.靶特异性双突变体融合蛋白质,它的基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
2.靶特异性双突变体融合蛋白质,它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。
3.一种表达载体,pET27-mGnRH-PE38m4a,其特征在于:表达载体pET27中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示的基因序列。
4.靶特异性双突变体融合蛋白质,是由下述方法制备的:
(1)人工体外合成如序列表SEQ ID NO.1所示的融合基因序列;
(2)将人工合成的融合基因序列通过基因操作克隆到表达载体中;
(3)用步骤(2)的表达载体转化大肠杆菌中;
(4)在适当条件下表达所说的融合蛋白质;
(5)从细胞培养物中回收并纯化融合蛋白质。
5.根据权利要求4所述的靶特异性双突变体融合蛋白质,其特征在于:所述的载体是pET27,步骤(3)所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(λDE3)。
6.根据权利要求2所述的靶特异性双突变体融合蛋白质,在制备多种与促性腺激素释放激素受体有关的肿瘤药物的应用。
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