ES2240167T3 - Polipeptido con actividad fibrinolitica. - Google Patents
Polipeptido con actividad fibrinolitica.Info
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Abstract
Esta invención proporciona una metaloproteinasa fibrinolítica que tiene la disposición ordenada lineal de aminoácidos que no se produce de manera natural reflejada en la SEQ ID NO: 1, a la que también se hace referencia en la presente memoria como ¿nueva con actividad trombolítica¿ (o ¿NAT¿). También se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos, tales como la de la SEQ ID NO: 2 y variantes suyas que codifican una NAT. El término ¿maduro¿ se usa en su sentido convencional para hacer referencia al polipéptido biológicamente activo que ha sido procesado enzimáticamente in situ en la célula hospedadora para escindirlo de la región prepro. A causa de su actividad fibrinolítica, la NAT es útil in vivo como agente que lisa coágulos sanguíneos para tratar la trombosis en un mamífero (incluidos ratas, cerdos y seres humanos).
Description
Polipéptido con actividad fibrinolítica.
Esta invención se refiere a una metaloproteinasa
con actividad fibrinolítica con una secuencia que no se produce de
manera natural, a métodos combinantes para su fabricación y a su uso
para tratar la trombosis in vivo.
La fibrolasa es un polipéptido enzimáticamente
activo (específicamente, una metaloproteinasa) compuesta de 203
residuos de aminoácidos que se aisló originalmente por purificación
a partir del veneno de la serpiente cabeza de cobre sureña; patente
de los Estados Unidos No. 4.610.879, concedida el 9 de septiembre de
1986 (Markland et al.); y Guan et al., Archives of
Biochemistry and Biophysics, Volumen 289, número 2, páginas
197-207 (1991). La enzima exhibe actividad
fibrinolítica directa con poca o ninguna actividad hemorrágica, y
disuelve coágulos sanguíneos formados o a partir de fibrinógeno o a
partir de sangre completa.
Se ha determinado también la secuencia de
aminoácidos de la fibrolasa, habiendo métodos descritos para la
producción recombinante en levaduras y el uso para el tratamiento de
estados tromboembólicos in vivo; Randolph et al.,
Protein Science, Cambridge University Press (1992), páginas
590-600, y la solicitud de patente europea No.
0323722 (Valenzuela et al.), publicada el 12 de julio de
1989.
Esta invención proporciona una metaloproteinasa
fibrinolítica que tiene la disposición ordenada lineal de
aminoácidos que no se produce de manera natural reflejada en la SEQ
ID NO: 1, a la que también se hace referencia en la presente memoria
como "nueva con actividad trombolítica" (o "NAT"). También
se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos, tales como la de la
SEQ ID NO: 2 y variantes suyas que codifican una NAT.
El término "maduro" se usa en su sentido
convencional para hacer referencia al polipéptido biológicamente
activo que ha sido procesado enzimáticamente in situ en la
célula hospedadora para escindirlo de la región prepro.
A causa de su actividad fibrinolítica, la NAT es
útil in vivo como agente que lisa coágulos sanguíneos para
tratar la trombosis en un mamífero (incluidos ratas, cerdos y seres
humanos).
El polipéptido NAT de esta invención proporciona
ventajas como agente terapéutico respecto a la fibrolasa que se
produce de forma natural (es decir, el polipéptido fibrinolítico que
se encuentra en el veneno de serpiente). De la fibrolasa nativa se
sabe que contiene varios extremos N alternativos: QQRFP, EQRFP y
ERFP (en los que "E" designa una glutamina ciclada, o ácido
piroglutámico). Más específicamente, partiendo de un extremo N
compuesto de QQRFP, la molécula de fibrolasa experimenta degradación
para dar como resultado dos isoformas, que tienen en el extremo N
las secuencias de EQRFP y ERFP, respectivamente. La fibrolasa
recombinante tal como se produce en levaduras típicamente da lugar a
una mezcla de estas tres formas y, así, no es homogénea. Véase
Loayza et al., Journal of Chromatography, B 662, páginas
227-243 (1994). Es más, el residuo de glutamina
ciclada da como resultado un extremo N "bloqueado" que hace
imposible la secuenciación.
En contraste, la NAT recombinante de esta
invención proporciona una única especie: sólo se produce típicamente
un extremo N. El resultado es mayor homogeneidad del producto final
comparado con la fibrolasa recombinante, lo que es beneficioso
cuando el uso final previsto son aplicaciones médicas.
La Figura 1 representa de manera lineal la
secuencia completa de aminoácidos de la NAT (SEQ ID NO: 3), que
consiste en la región "prepro" (subrayada), que incluye el
péptido "señal" y el polipéptido maduro (no subrayado).
La NAT se puede producir mediante la expresión
recombinante de la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 4,
que codifica la secuencia completa de aminoácidos de la NAT (SEQ ID
NO: 3), incluyendo la región prepro de los nucléotidos
1-783 y el polipéptido maduro de los nucleótidos
784-1386, en un hospedador adecuado. Después de la
expresión, la región prepro se elimina mediante procesamiento
enzimático en la célula hospedadora para dar lugar al polipéptido
maduro activo (SEQ ID NO: 1).
Preferiblemente, la NAT se produce de forma
recombinante en levaduras, como se explicará con mayor detalle más
adelante.
El polipéptido maduro (SEQ ID NO: 1) que se
produce así puede o no tener una metionina en el extremo amino,
dependiendo de la manera en la que se prepare. Típicamente, un
residuo de metionina estará presente el extremo amino cuando el
polipéptido se produzca de forma recombinante en una cepa bacteriana
no secretora (por ejemplo, E. coli) como hospedador.
Además de la molécula de ácido nucleico de la SEQ
ID NO: 2, también son utilizables secuencias degeneradas de la misma
que codifiquen el mismo polipéptido. La presente invención también
abarca moléculas de ácidos nucleicos que pueden codificar residuos
adicionales de aminoácidos flanqueando las porciones en 5' o 3' de
la región que codifica el polipéptido maduro, tales como secuencias
que codifican regiones pre/pro alternativas (es decir, secuencias
responsables de la secreción del polipéptido a través de las
membranas celulares) en lugar de la región pre/pro "nativa" (es
decir, la que se encuentra en la fibrolasa que se produce de manera
natural). Las secuencias adicionales también pueden ser secuencias
no codificantes, incluyendo secuencias reguladoras tales como
promotores de transcripción o traducción, dependiendo de la célula
hospedadora.
La NAT se puede preparar utilizando métodos bien
conocidos de la tecnología del DNA recombinante, tales como los
expuestos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY
(1989) y/o Ausubel et al., editores, Current Protocols in
Molecular Biology, Green Publishers Inc. y Wiley and Sons, Nueva
York (1994). Una molécula de DNA que codifica el polipéptido o una
versión truncada del mismo se puede obtener, por ejemplo, mediante
el rastreo de una genoteca de DNA genómico o cDNA, o mediante
amplificación por PCR, para obtener una molécula de ácido nucleico
que codifique la fibrolasa, seguida por el reemplazamiento de los
codones que codifican los residuos de aminoácidos del extremo N QQR
con un codón para serina (S). Alternativamente, puede prepararse una
molécula de DNA que codifica la NAT mediante síntesis química
utilizando métodos bien conocidos para el experto en la técnica,
tales como los descritos por Engels et al., en Angew. Chem.
Intl. Ed., Volumen 28, páginas 716-734 (1989).
Típicamente, el DNA será de una longitud de varios cientos de
nucleótidos. Los ácidos nucleicos de más de aproximadamente cien
nucleótidos se pueden sintetizar en forma de varios fragmentos
utilizando estos mismos métodos y los fragmentos pueden luego
ligarse entre ellos para forma una secuencia de nucleótidos de la
longitud deseada.
La molécula de DNA se inserta en un vector de
expresión apropiado para la expresión en una célula hospedadora
adecuada. El vector se selecciona para que sea funcional en la
célula hospedadora concreta empleada (es decir, el vector es
compatible con la maquinaria de la célula hospedadora, de tal forma
que pueda producirse la expresión del DNA). El polipéptido se puede
expresar en células hospedadoras procarióticas, de levaduras, de
insectos (sistemas con baculovirus) o eucarióticas, aunque se
prefieren las levaduras como se explicará con mayor detalle más
adelante.
Los vectores utilizados en cualquiera de las
células hospedadoras para expresar la NAT pueden contener también
una secuencia flanqueante en 5' (a la que también se hace referencia
como "promotor") y otros elementos reguladores de la expresión
unidos de forma operativa al DNA a expresar, así como (una)
secuencia potenciadora(s), un elemento de terminación de la
transcripción, un origen de elemento de replicación, una secuencia
intrónica completa que contenga un sitio de corte y empalme dador y
aceptor, una secuencia de péptido señal, un elemento de sitio de
unión a ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región
polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifica la NAT,
y un elemento marcador que permite la selección. Cada uno de estos
elementos se discute más adelante.
De forma opcional, el vector puede contener
también una secuencia "etiqueta", es decir, una secuencia
oligonucleotídica localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia
que codifica el polipéptido que codifica una secuencia poliHis (tal
como hexaHis) u otra secuencia inmunogénica pequeña (tal como el
epítopo de c-myc o de la hemaglutinina, para los
cuales hay anticuerpos comercialmente disponibles, incluidos
anticuerpos monoclonales). Esta etiqueta se expresará junto con la
NAT, y puede servir como una etiqueta de afinidad para la
purificación de este polipéptido a partir de la célula hospedadora.
De forma opcional, la etiqueta se puede retirar posteriormente del
polipéptido purificado por diversos métodos, por ejemplo, con el uso
de una peptidasa selectiva.
La secuencia flanqueante de 5' puede ser la
secuencia flanqueante de 5' nativa, o puede ser homóloga (es decir,
de la misma especie y/o cepa que la célula hospedadora), heteróloga
(es decir, de una especie diferente de la especie o cepa de la
célula hospedadora), híbrida (es decir, una combinación de
secuencias flanqueantes en 5' de más de un origen) o sintética. El
origen de la secuencia flanqueante de 5' puede ser cualquier
organismo unicelular procariótico o eucariótico, cualquier organismo
vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre y cuando la
secuencia flanqueante de 5' sea funcional en, y pueda ser activada
por la maquinaría de la célula hospedadora.
El origen de elemento de replicación es
típicamente una parte de vectores de expresión procarióticos
adquiridos comercialmente y ayuda a la amplificación del vector en
una célula hospedadora. La amplificación del vector hasta un cierto
número de copias puede, en algunos casos, ser importante para la
expresión óptima de la NAT. Si el vector de elección no contiene un
origen de sitio de replicación, se puede sintetizar uno químicamente
basándose en una secuencia conocida, y luego ligarlo al vector.
El elemento de terminación de la transcripción
está localizado típicamente en 3' con respecto al extremo de la
secuencia que codifica el polipéptido y sirve para terminar la
transcripción del mRNA. Habitualmente, el elemento de terminación de
la transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en
G-C seguido de una secuencia de poliT. Aunque el
elemento se clona fácilmente a partir de una genoteca o incluso se
adquiere comercialmente como parte de un vector, también puede
sintetizarse fácilmente utilizando métodos conocidos para la
síntesis de ácidos nucleicos.
Un elemento génico marcador que permite la
selección codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el
crecimiento de una célula hospedadora crecida en un medio de cultivo
selectivo. Los genes típicos marcadores de selección codifican
proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras
toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kamamicina en el
caso de células hospedadores procarióticas, zeocina en el caso de
células hospedadoras de levadura, y neomicina en el caso de células
hospedadoras de mamífero; (b) complementan deficiencias auxotróficas
de la célula; o (c) aportan nutrientes críticos no disponibles en el
medio complejo. Los marcadores que permiten la selección preferidos
para uso en expresión procariótica son el gen de resistencia a la
kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de
resistencia a la tetraciclina.
El elemento de unión a ribosomas, denominado
corrientemente secuencia Shine-Dalgarno (en el caso
de procariotas) o secuencia Kozak (en el caso de eucariotas), es
necesario para la iniciación de la traducción del mRNA. El elemento
está localizado típicamente en 3' con respecto al promotor y en 5'
con respecto a la secuencia codificante del polipéptido a
sintetizar. La secuencia Shine-Dalgarno varía pero
típicamente es una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido
en A-G). Se han identificado muchas secuencias
Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede
sintetizarse fácilmente utilizando métodos expuestos anteriormente y
utilizarse en un vector procariótico. La secuencia Kozak típicamente
incluye secuencias inmediatamente antes y después del codón de
iniciación. Una secuencia Kozak preferida es una que esté asociada
con una alta eficiencia de la iniciación de la traducción en el
codón de inicio
AUG.
AUG.
En aquellos casos en los que sea deseable que el
polipéptido NAT se secrete de la célula hospedadora, se puede usar
una secuencia señalizadora para dirigir el polipéptido fuera de la
célula hospedadora donde se sintetiza. Típicamente, la secuencia
señalizadora está situada en la región codificante de la secuencia
del ácido nucleico, o directamente en el extremo 5' de la región
codificante. Se han identificado muchas secuencias señalizadoras, y
aquí se puede utilizar cualquiera de ellas que sea funcional en la
célula hospedadora seleccionada. Consecuentemente, la secuencia
señalizadora puede ser homóloga o heteróloga respecto al
polipéptido. Adicionalmente, la secuencia señalizadora se puede
sintetizar químicamente utilizando métodos a los que se ha hecho
referencia anteriormente.
Después de que se ha construido el vector y se ha
insertado un ácido nucleico en el sitio apropiado del vector, puede
insertarse el vector completo en una célula hospedadora adecuada
para su amplificación y/o la expresión del polipéptido.
Como se ha mencionado, las células hospedadoras
pueden ser procarióticas (tales como E. coli ) o eucarióticas
(tales como una célula de levadura, una célula de insecto, o una
célula de vertebrado). La célula hospedadora, sea de levadura o de
algún otro hospedador, cuando se cultiva en condiciones apropiadas,
puede sintetizar una NAT, que posteriormente se puede recoger del
medio de cultivo (si la célula hospedadora la secreta al medio) o
directamente de la célula hospedadora que la produce (si no se
secreta). Después de recogerlo, el polipéptido NAT se puede
purificar utilizando métodos tales como cromatografía de tamizado
molecular, cromatografía de afinidad, y similares.
La selección de la célula hospedadora dependerá
en gran medida de la manera en la que la célula hospedadora sea
capaz de "plegar" la NAT en su estructura nativa secundaria y
terciaria (por ejemplo, la orientación apropiada de los puentes
disulfuro, etc.) de tal forma que sea preparado por la célula un
material biológicamente activo. Sin embargo, incluso en los casos en
que la célula hospedadora no sintetice un material biológicamente
activo, se puede "plegar" tras la síntesis utilizando
condiciones químicas apropiadas, tales como las conocidas por los
expertos en la técnica. En cualquier caso, se puede inferir un
plegamiento adecuado a partir del hecho de que se haya obtenido un
material biológicamente activo.
Las células o líneas celulares hospedadoras
adecuadas pueden ser células de mamífero, tales como células de
ovario de hámster chino (CHO) o células 3T3. La selección de células
hospedadoras de mamífero adecuadas y métodos para la transformación,
cultivo, amplificación, cribado y producción y purificación del
producto son conocidos en la técnica. Otras líneas celulares de
mamífero adecuadas son las líneas celulares de mono
COS-1 y COS-7, y la línea celular
CV-1. Las células hospedadoras de mamífero
adicionales que pueden servir de ejemplo incluyen líneas celulares
de primate y líneas celulares de roedor, incluidas líneas celulares
transformadas. También son adecuadas células diploides normales,
estirpes celulares derivadas del cultivo in vitro de un
tejido primario, así como explantes primarios. Las células
candidatas pueden ser deficientes genotípicamente en el gen de
selección, o pueden contener un gen de selección que actúe de forma
dominante. Otras líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen,
pero no se limitan a, HeLa, células de ratón L-929,
las líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o
NIH, líneas de células de hámster BHK o HaK.
También son útiles como células hospedadoras
células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E.
coli (por ejemplo, HB101, DH5a, DH10, y MC1061) son bien
conocidas como células hospedadoras en el campo de la biotecnología.
También se pueden emplear diversas cepas de B. subtilis,
Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces
spp., y similares. Adicionalmente, también están disponibles
como células hospedadoras para la expresión del polipéptido de la
presente invención muchas cepas de células de levadura conocidas por
los expertos en la técnica. También, cuando se desee, pueden
utilizarse como células hospedadoras células de insecto. Véase, por
ejemplo, Miller et al., Genetic Engineering, volumen 8,
páginas 277-298 (1986).
La inserción (a la que se hace referencia también
como "transformación" o "transfección") del vector en la
célula hospedadora seleccionada puede lograrse utilizando métodos
tales como fosfato cálcico, electroporación, microinyección,
lipofección o el método de DEAE-dextrano. El método
seleccionado será en parte función del tipo de célula hospedadora a
utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos
por el experto en la técnica, y se exponen, por ejemplo, en Sambrook
et al., citado anteriormente.
Las células hospedadoras que contienen el vector
se pueden cultivar utilizando medios estándar bien conocidos por el
experto en la técnica. Los medios contendrán habitualmente todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las
células. Medios adecuados para cultivar células de E. coli
son, por ejemplo, el caldo de Luria (LB) y/o el caldo de cultivo
estupendo (TB, del inglés Terrific Broth). Medios adecuados
para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos
los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de
crecimiento según requiera la línea celular en particular que se
cultive. Un medio adecuado para cultivos de insectos es el medio de
Grace complementado con yeastolate, hidrolizado de lactoalbúmina y/o
suero fetal de ternera, según sea necesario.
Típicamente, un antibiótico u otro compuesto útil
para el crecimiento selectivo de las células transformadas sólo se
añade a los medios como complemento. El compuesto a utilizar vendrá
dictado por el elemento marcador que permite la selección presente
en el plásmido con el cual se transforma la célula hospedadora. Por
ejemplo, cuando el elemento marcador que permite la selección es la
resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de
cultivo será kanamicina.
La cantidad de NAT producida en la célula
hospedadora se puede evaluar utilizando métodos estándar conocidos
en la técnica. Tales métodos incluyen, sin limitación, análisis con
transferencias tipo Western, electroforesis en geles de
SDS-poliacrilamida, electroforesis en geles no
desnaturalizantes, separación por HPLC, inmunoprecipitación, y/o
ensayos de actividad tales como los ensayos de desplazamiento en gel
de la unión a DNA.
Si la NAT es secretada de las células
hospedadoras que no sean bacterias Gram-negativas,
la mayor parte se encontrará probablemente en el medio de cultivo
celular. Si la NAT es secretada de bacterias
Gram-negativas, se encontrará en alguna medida en el
periplasma. Si la NAT no es secretada, estará presente en el
citoplasma.
En el caso de una NAT intracelular, las células
hospedadoras se rompen primero típicamente por medios mecánicos. En
el caso de una NAT que tenga una localización periplásmica, se puede
utilizar cualquier ruptura mecánica o tratamiento osmótico para
liberar los contenidos periplásmicos a una solución tamponada. El
polipéptido NAT se aísla entonces de esta solución. La purificación
a partir de la solución se puede lograr después de esto utilizando
diversas técnicas. Si la NAT se ha sintetizado de tal forma que
contenga una etiqueta tal como hexahistidina u otro péptido pequeño
en su extremo carboxilo o amino, se puede purificar esencialmente en
un proceso de una etapa haciendo pasar la solución a través de una
columna de afinidad donde la matriz de la columna tiene una alta
afinidad por la etiqueta o por el polipéptido directamente (es
decir, un anticuerpo monoclonal). Por ejemplo, la polihistidina se
une con gran afinidad y especificidad al níquel, por lo que se puede
utilizar para la purificación una columna de afinidad de níquel (tal
como las columnas de níquel de Qiagen). (Véase, por ejemplo, Ausubel
et al., editores, Current Protocols in Molecular Biology,
citado anteriormente).
Cuando, por otra parte, el polipéptido no tenga
ninguna etiqueta y no estén disponibles anticuerpos, pueden
utilizarse otros procedimientos bien conocidos para la purificación.
Tales procedimientos incluyen, sin limitación, cromatografía de
intercambio iónico, cromatografía de tamizado molecular,
cromatografía en fase inversa, HPLC, electroforesis nativa en gel en
combinación con elución del gel, y enfoque isoeléctrico preparativo
(aparato/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific). En algunos
casos, pueden combinarse dos o más de estas técnicas para lograr una
pureza incrementada.
Son especialmente preferidas para uso en la
producción de una NAT las células de levadura, y de la forma más
ventajosa las del género de levaduras conocido como Pichia
(por ejemplo, Pichia pastoris), a causa de la mayor
eficiencia de replegamiento comparadas con, por ejemplo, células
bacterianas tales como E. coli. Métodos de expresión
recombinantes adecuados para el caso de esta cepa de levadura están
descritos en las patentes de Estados Unidos Nos. 4.855.231 (Stroman
et al.), 4.812.405 (Lair et al.), 4.818.700 (Cregg
et al.), 4.885.242 (Cregg) y 4.837.148 (Cregg).
De forma notable, las células de Pichia se
pueden utilizar también para expresar fibrolasa con una eficiencia
similar a partir de moléculas de DNA que codifican esta
metaloproteinasa, y tal método constituye un aspecto adicional de la
presente invención. La fibrolasa es una metaloproteinasa conocida
que ha sido descrita en la literatura científica y de patentes;
véase Randolph et al., y la solicitud de patente europea No.
0323722, citadas anteriormente. Típicamente, la fibrolasa a expresar
tendrá la SEQ ID NO: 5, que está codificada por la molécula de cDNA
de la SEQ ID NO: 6 (o variante suyas que codifiquen la misma
secuencia de aminoácidos). La expresión de fibrolasa en tal sistema
implicará típicamente una molécula de DNA de la SEQ ID NO: 7, que
codifique la secuencia "prepro" (nucleótidos
1-783) además del polipéptido "maduro"
(nucleótidos 784-1392).
También están incluidas dentro del alcance de la
presente invención versiones de la NAT modificadas químicamente en
las que el polipéptido está unido a un polímero u otra molécula para
formar un derivado con el fin de modificar propiedades. Para
propósitos terapéuticos en seres humanos especialmente, puede ser
ventajoso obtener derivados de la NAT de tal manera mediante la
unión de uno o más restos químicos diferentes al resto de
polipéptido. Tales restos químicos pueden seleccionarse entre
diversos polímeros solubles en agua. El polímero debería ser soluble
en agua de tal forma que el polipéptido NAT al que está unido sea
miscible en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiológico. El
polímero soluble en agua se puede seleccionar del grupo que consiste
en, por ejemplo, polietilenglicol, copolímeros de
etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol
polivinílico, polivinilpirrolidona,
poli-1,3-dioxolano,
poli-1,3,6-trioxano, copolímero de
etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros o
copolímeros al azar o no al azar) (véase más adelante con respecto a
las moléculas de fusión) y dextrano o
poli(n-vinilpirrolidona)polietilenglicol,
homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de
propileno/óxido de etileno), polioles polioxietilados,
poliestirenomaleato y alcohol polivinílico. El
poli(polietilenglicol-propionaldehído) puede
tener ventajas en la fabricación debido a su estabilidad en
agua.
El polímero puede ser de cualquier peso
molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. En el caso del
polietilenglicol, el peso molecular preferido está entre
aproximadamente 2 kilodalton (kDa) y aproximadamente 100 kDa
(indicando el término "aproximadamente" que en las
preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más,
algunas menos, del peso molecular mencionado) para facilidad en el
manejo y la fabricación. Pueden utilizarse otros tamaños,
dependiendo del perfil terapéutico deseado (por ejemplo, la duración
de la liberación mantenida deseada, los efectos, de haber alguno
sobre la actividad biológica, la facilidad en el manejo, el grado o
la ausencia de antigenicidad y otros efectos conocidos del
polietilenglicol sobre una proteína terapéutica).
El número de moléculas poliméricas unidas así
puede variar, y un experto en la técnica será capaz de establecer el
efecto sobre la función. Se pueden obtener monoderivados, o se
pueden proporcionar di, tri, tetra o algunas combinaciones de
derivados, con el mismo o con restos químicos diferentes (por
ejemplo, polímeros, tales como pesos diferentes de
polietilenglicoles). La proporción de moléculas de polímero con
respecto a las moléculas de polipéptido NAT variará, según lo hagan
sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, la
relación óptima (en términos de eficiencia de una reacción en la que
no haya exceso de polipéptido o polímero sin reaccionar) estará
determinada por factores tales como el grado deseado de derivación
(por ejemplo, mono, di, tri, etc.), el peso molecular del polímero
seleccionado, si el polímero es ramificado o no ramificado, y las
condiciones de reacción.
Los restos químicos deberían unirse a una NAT
considerando los efectos sobre los dominios funcionales o
antigénicos del polipéptido. Hay numerosos métodos de unión
disponibles para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, el
documento EP-0401384 (acoplamiento de PEG a
G-CSF), y Malik et al., Experimental
Hematology, volumen 20, páginas 1028-1035 (1992)
(que informa sobre la adición de polietilenglicol a
GM-CSF utilizando cloruro de tresilo). A modo de
ilustración, el polietilenglicol se puede unir covalentemente a
través de residuos de aminoácidos por medio de un grupo reactivo,
tal como un grupo amino o carboxilo libre. Los grupos reactivos son
aquellos a los que se puede unir una molécula de polietilenglicol
activado (u otro resto químico). Los residuos de aminoácidos que
tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y el
residuo del aminoácido del extremo N. Aquellos que tienen un grupo
carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspártico, residuos
de ácido glutámico, y el residuo del aminoácido del extremo C.
También se pueden utilizar grupos sulfhidrilo como grupo reactivo
para unir la(s) molécula(s) de polietilenglicol (u
otro resto químico). Lo preferido para los propósitos de fabricación
es la unión a un grupo amino, tal como el del extremo N, o a un
grupo lisina. La unión a residuos importantes para la unión al
receptor debería evitarse si se desea una unión al receptor.
Se pueden desear específicamente derivados
modificados en el extremo N. Utilizando polietilenglicol como
ilustración, uno puede seleccionar de entre diversas moléculas de
polietilenglicol (por peso molecular, ramificación, etc.), la
proporción de moléculas de polietilenglicol con respecto a las
moléculas de polipéptido en la mezcla de reacción, el tipo de
reacción de adición de polietilenglicol a desarrollar, y el método
para obtener la NAT con polietilenglicol en el extremo N
seleccionada. El método para obtener la preparación con
polietilenglicol el extremo N (es decir, separar este resto de otros
restos con un solo resto de polietilenglicol si fuera necesario)
puede ser por purificación del material con polietilenglicol en el
extremo N a partir de una población de moléculas NAT con
polietilenglicol. La modificación química selectiva en el extremo N
se puede lograr mediante alquilación reductora que explota la
reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino
primarios (lisina frente al del extremo N) disponibles para obtener
derivados. Véase la solicitud PCT WO 96/11953, publicada el 25 de
abril de 1996. En las condiciones apropiadas de reacción, se logra
una formación de derivados de la NAT sustancialmente selectiva en el
extremo N con un grupo carbonilo que contiene el polímero. Por
ejemplo, se puede añadir polietilenglicol a una NAT selectivamente
en el extremo N llevando a cabo la reacción a un pH que permita
sacar ventaja de las diferencias de pK_{a} entre el grupo
\epsilon-amino de los residuos de lisina y el
grupo \alpha-amino del residuo de extremo N del
polipéptido. Mediante tal formación selectiva de derivados, se
controla la unión de un polímero a un polipéptido: la conjugación
con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N del
polipéptido y no ocurre ninguna modificación significativa de otros
grupos reactivos, tales como los grupos amino de las cadenas
laterales de las lisinas. Utilizando alquilación reductora, el
polímero puede ser del tipo descrito anteriormente, y debería tener
un único aldehído reactivo para el acoplamiento al polipéptido.
Puede utilizarse el poli(etilenglicol propionaldehído), que
contiene un único aldehído
reactivo.
reactivo.
La NAT o derivados químicamente modificados de
acuerdo con la invención pueden formularse para la administración
in vivo, y con la mayor preferencia por vía intratrombótica
(es decir, por medio de la administración localizada directamente al
sitio del coágulo en el vaso sanguíneo, por ejemplo, mediante
catéter). La administración sistémica normalmente no se prefiere
debido a la probabilidad de que la
\alpha2-macroglobulina innata de la circulación
general pueda formar complejos con la NAT para impedir la
interacción con la fibrina o el fibrinógeno, dificultando así la
lisis del coágulo. Sin embargo, puede haber casos en los que se
pueden utilizar cantidades mayores de NAT que excedan de los niveles
circulantes de \alpha2-macroglobulina,
posibilitando así la administración y el suministro por vía
sistémica. En general, están incluidas dentro de la invención
composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de
NAT junto con diluyentes farmacéuticamente aceptables, conservantes,
solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos. Con
"cantidad efectiva" se quiere indicar cantidad suficiente para
producir un efecto biológico medible (es decir, una cantidad
efectiva desde el punto de vista trombolítico que efectúe la lisis
del coágulo o coágulos sanguíneos que estén siendo tratados).
Típicamente, la NAT estará en forma altamente
purificada, y cualquier composición farmacéutica que se utilice como
vehículo de administración estará normalmente preesterilizada para
su uso, tal como mediante filtración a través de membranas estériles
de filtración.
Un experto en la técnica será capaz de determinar
dosis efectivas para la administración y observar el efecto
terapéutico deseado. Las dosis efectivas concretas dentro de este
intervalo dependerán del trastorno o estado clínico concreto que se
esté tratando, así como de la edad y estado de salud general del
receptor, y se pueden determinar mediante procedimientos clínicos
estándar. Cuando sea posible, será deseable determinar la curva de
dosis-respuesta de la composición farmacéutica
primero in vitro, como en los sistemas de bioensayo, y luego
in vivo en sistemas útiles de modelos animales antes de
realizar ensayos en seres humanos. El experto que lleve a la
práctica la invención, considerando el contexto terapéutico, el tipo
de trastorno en tratamiento, y otros factores aplicables, será capaz
de determinar la dosificación apropiada sin un esfuerzo indebido.
Típicamente, una persona que lleve a la práctica la invención
administrará la composición con NAT hasta que se alcance una dosis
que logre el efecto deseado (es decir, lisis del coágulo sanguíneo).
La composición se puede administrar como una dosis única, o como dos
o más dosis (que pueden o no contener la misma cantidad de
polipéptido) a lo largo del tiempo, o de una forma continua.
La NAT también se puede utilizar para generar
anticuerpos de acuerdo con métodos estándar. Los anticuerpos pueden
ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena
única y/o biespecíficos, etc. Para mejorar la probabilidad de
producir una respuesta inmune, la secuencia de aminoácidos de la NAT
se puede analizar para identificar porciones de la molécula que
pueden estar asociadas con una inmunogenicidad incrementada. Por
ejemplo, la secuencia de aminoácidos se puede someter a análisis
computerizado para identificar epítopos de superficie, tal como de
acuerdo con el método de Hope y Woods, Proceedings of the National
Academy of Science USA, volumen 78, páginas
3824-3828 (1981).
Pueden utilizarse diversos procedimientos
conocidos en la técnica para la producción de anticuerpos
policlonales que reconozcan epítopos de la NAT. Para la producción
del anticuerpo, pueden inmunizarse diversos animales hospedadores
mediante inyección con el polipéptido, incluyendo pero sin limitarse
a conejos, ratones, ratas, etc. Pueden utilizarse diversos
adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo
de la especie hospedadora, incluyendo pero sin limitarse a, el
adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de
aluminio (alum), sustancias tensioactivas tales como lisolecitina,
polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas,
hemocianinas de lapa, dinitrofenol, y adyuvantes potencialmente
útiles para seres humanos tales como el bacilo de
Calmette-Guerin y Corynebacterium parvum.
Para la preparación de anticuerpos monoclonales
dirigidos contra la NAT, puede utilizarse cualquier técnica que
proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas
celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica de los
hibridomas desarrollada originalmente por Kohler y Milstein que se
describe en Nature, volumen 256, páginas 495-497
(1975), así como la técnica de los triomas, la técnica de los
hibridomas de células B humanas descrita por Kozbor et al. en
Immunology Today, volumen 4, página 72 (1983), y la técnica de los
hibridomas y el EBV para producir anticuerpos monoclonales descrita
por Cole et al. en "Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy", Alan R. Liss, Inc., páginas 77-96
(1985), son todas ellas útiles para la preparación de anticuerpos
monoclonales de acuerdo con esta invención.
Los anticuerpos de esta invención se pueden
utilizar terapéuticamente, tal como unirse a y con ello neutralizar
o inhibir cantidades en exceso de la NAT in vivo después de
la administración. Los anticuerpos pueden además utilizarse con
propósitos diagnósticos, tal como en forma marcada para detectar la
presencia de la NAT en un fluido corporal, muestra de tejido u otro
extracto, de acuerdo con métodos diagnósticos conocidos.
La invención se ilustra adicionalmente en los
siguientes ejemplos.
Una manera eficaz de producir fibrolasa es
expresarla inicialmente como preprofibrolasa en la que ocurre una
escisión mediante la proteasa kex-2 en la unión
entre las regiones "prepro" y "madura" para dar lugar a un
material biológicamente activo (fibrolasa "madura"). A partir
de este diseño, la síntesis y procesamiento de la preprofibrolasa
conduce a la secreción de fibrolasa madura al medio de cultivo. La
secuencia real en la unión rota es (...TKR\downarrowQQRF...).
Kex-2 es una endoproteasa que
produce una escisión tras dos aminoácidos básicos adyacentes, en
este caso lisina(K)-arginina(R). La
fibrolasa madura expresada a partir de un DNA que tiene la secuencia
anteriormente mencionada reveló que el residuo de glutamina (Q)
esperado en el extremo N había sufrido de hecho desaminación y
ciclación para generar ácido piroglutámico (E). Esta modificación
química se consideró indeseable, puesto que los péptidos con un
residuo de glutamina ciclada (ácido piroglutámico) en el extremo N
no logran reaccionar en el procedimiento de la degradación de Edman
para la secuenciación de aminoácidos. De acuerdo con ello, se
eliminaron los dos residuos de glutamina (Q) del extremo N de la
secuencia de la fibrolasa madura, dando como resultado un residuo de
arginina (R) en el extremo N. Puesto que kex-2
produce una escisión después de dos aminoácidos básicos adyacentes
como se ha mencionado, se anticipó que la secuencia (...KRRF...)
presentaría un sitio ambiguo para la escisión mediante
kex-2. De acuerdo con esto, el residuo de arginina
(R) del extremo N (que se ha mostrado subrayado anteriormente) se
reemplazó por un residuo de serina (S) dando como resultado la
secuencia (...KRSF...). La elección de la serina se basó en la
necesidad de introducir un aminoácido que facilite la escisión
mediante kex-2 cuando sucede en el lado del extremo
C del sitio de hidrólisis. Rholam et al., European Journal of
Biochemistry, volumen 227, páginas 707-714
(1995).
Como resultado, la secuencia de DNA de la
preprofibrolasa se modificó mediante mutagénesis dirigida en la
región codificante del extremo N de la fibrolasa madura para
sustituir los codones "QQR" por un codón de "S",
utilizando un protocolo estándar de PCR, dando así como resultado
una preproNAT que tenía la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:
3. Los oligonucleótidos utilizados para cebar las reacciones de PCR
se muestran más adelante, y también se muestra su homología con la
secuencia diana. Inicialmente, se llevaron a cabo dos reacciones de
PCR utilizando los oligos 1 y 4 como una pareja de cebadores y los
oligos 2 y 3 como otra pareja de cebadores, ambos con DNA del gen
precursor como molde. Los productos de DNA de estas dos reacciones
(de 601 y 815 nucleótidos de longitud) se purificaron mediante
electroforesis en gel de agarosa y se combinaron para servir como
molde en una segunda ronda de PCR utilizando los oligos 1 y 2 como
pareja de cebadores. Este producto final de PCR (de 1372 nucleótidos
de longitud) se escindió con las endonucleasas de restricción
XhoI y NotI. El producto de la digestión se
desproteinizó con fenol/cloroformo y se precipitó el DNA. Una
porción del DNA recuperado se ligó al plásmido pPICZ\alpha
(Invitrogen, Carlsbad, CA, Catálogo No. VI95-20),
que había sido escindido de forma similar con las nucleasas de
restricción XhoI y NotI, desfosforilado
enzimáticamente, y desproteinizado con fenol/cloroformo. Todas las
etapas subsiguientes se llevaron a cabo de acuerdo con el manual del
kit para la expresión en Pichia de Invitrogen (Invitrogen
Corp., catálogo No. K1710-01). Los productos de la
reacción de ligación se transformaron en E. coli mediante
electroporación y se seleccionaron por su supervivencia en medios
sólidos que contenían zeocina. Se aisló el plásmido y se confirmó la
región de profibrolasa mediante secuenciación de DNA. El plásmido se
linearizó mediante escisión con la endonucleasa de restricción
PmeI y luego se transformó en Pichia pastoris
GS115his^{+}. La cepa GS115 es normalmente
his^{-}, así que el genotipo his^{+} se restauró
mediante transformación con una fuente de DNA que portaba la versión
de tipo silvestre del gen his4. Alternativamente, se puede
obtener comercialmente una cepa his^{+} de Invitrogen Corp.
(línea celular X-33, catálogo No.
C180-00). Las bacterias en las que se había
integrado el DNA se seleccionaron como colonias resistentes a
zeocina. Los clones candidatos se indujeron en medios que contenían
metanol, y se ensayó en el caldo la producción de la NAT mediante
PAGE al 4-20%, utilizando tinción con Coomasie.
Los oligonucleótidos utilizados para la
mutagénesis dirigida mediante PCR fueron como sigue:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La localización de estos oligonucleótidos se
muestra más adelante en relación con la secuencia del DNA de doble
cadena (SEQ ID NO: 12 cadena codificante o sentido, SEQ ID NO: 13
cadena complementaria o antisentido) y la secuencia correspondiente
de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de la fibrolasa (incluida la región
prepro) que se modifican para crear la NAT. Las regiones de los
extremos N y C de la fibrolasa madura se indican mediante el
subrayado de las secuencias de los aminoácidos terminales (QQRF y
LNKP). La región del extremo N (QQRF) es la que se modifica (para
sustituir QQR por S). En el caso de los oligos 3 y 4, más adelante,
se insertan líneas discontinuas para denotar la localización de los
codones omitidos que codifican residuos QQ en la región del extremo
N de la fibrolasa.
Cuando se hicieron intentos de expresar el DNA de
la NAT en E. coli, un replegamiento muy pobre y un
requirimiento de condiciones diluidas redujo la eficiencia de
purificación. Estas y otras consideraciones condujeron al uso de
Pichia pastoris, una especie de levadura, como célula
hospedadora. Se inoculó un cultivo de clones seleccionados de
Pichia pastoris que habían sido transfectados con cDNA de la
NAT prepro (SEQ ID NO: 4) en 500 ml del siguiente medio de
inoculación para el crecimiento:
| Extracto de levadura | 30,0 g |
| Fosfato potásico dibásico | 17,2 g |
| Glucosa | 20,0 g |
| Biotina | 0,004 g |
| Agua | hasta completar 1 litro |
| Ácido fosfórico, 85% | hasta ajustar el pH a 6,00 |
Las células transfectadas de P. pastoris
se incubaron a 30ºC en un agitador durante aproximadamente 30 a 32
horas. Se utilizó aproximadamente 1% (p/v) del cultivo resultante
para inocularlo en un fermentador de 10 litros. El fermentador
contenía sales basales esterilizadas y glucosa (más adelante).
Después de la esterilización del fermentador se añadieron doce
mililitros por litro de sales PTM4 (PTM4 es una solución de metales
traza que contiene sulfato cúprico pentahidrato, yoduro sódico,
sulfato de manganeso monohidrato, molibdato sódico dihidrato, ácido
bórico, cloruro cobaltoso hexahidrato, cloruro de zinc, sulfato
ferroso heptahidrato, d-biotina, ácido sulfúrico y
agua purificada) por litro de lote de medio. La temperatura de
crecimiento con fermentación fue 30ºC. El pH en el fermentador se
controló con hidróxido amónico y ácido fosfórico a pH 6,00. El zinc
de las sales de zinc añadidas al medio queda incorporado a la NAT
como parte de la estructura de metaloproteinasa.
| Ácido fosfórico, 85% | 26,7 ml |
| Sulfato cálcico | 0,93 g |
| Sulfato potásico | 18,2 g |
| Sulfato magnésico-7H_{2}O | 14,9 g |
| Hidróxido potásico | 4,13 g |
| Glucosa | 30,0 g |
| Agua | hasta completar 1 litro |
El cultivo del lote se hizo crecer hasta que se
consumió completamente la glucosa (17 a 20 horas). Entonces se
inició una fase de alimentación del lote. El medio de la fase de
alimentación del lote consistió en glucosa y 12 ml de sales PTM4 por
litro. La alimentación de inducción consistió en glucosa, metanol al
25%, y 12 ml de sales PTM4 por litro. En el momento de la inducción,
la temperatura del reactor se modificó hasta 20ºC. La fase de
inducción duró de 60 a 75 horas. Se recolectaron los medios
acondicionados y se descartaron los restos celulares.
Se clarificó el caldo de levaduras (medio
acondicionado menos restos celulares) del Ejemplo 2 y se ajustaron
el pH y la conductividad a 6,5 y 10-20 mS/cm,
respectivamente. El caldo se cargó sobre una resina de afinidad con
metal inmovilizado que había sido cargada con cobre (Cu) y
equilibrada con solución salina tamponada de fosfato (PBS). La
resina se lavó con PBS y se eluyó con un gradiente de imidazol
(0-100 mM) en PBS. Las fracciones que contenían NAT
"madura" (SEQ ID NO: 1) se reunieron y se diluyeron hasta que
la conductividad fue menor que 1,5 mS/cm, pH 6,4. La mezcla diluida
de fracciones se cargó sobre una resina de Sefarosa SP (Amersham
Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) que había sido equilibrada
con ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES)
10 mM. La columna se lavó con MES y se eluyó con un gradiente de
NaCl (0-500 mM) en MES. Las fracciones que contenían
NAT se reunieron y almacenaron.
Para demostrar que la NAT "madura" (SEQ ID
NO: 1) es biológicamente activa y funcionalmente única, se llevaron
a cabo estudios farmacológicos agudos en ratas en las que se creó
una lesión focal en una de las arterias carótidas aplicando una
corriente anódica. Esta lesión produce un trombo oclusivo que se
forma generalmente en quince minutos. Una vez que se formó el
trombo, se observó la arteria durante un período de treinta minutos
para asegurarse de que la oclusión carótida era estable. Luego se
administraron intravenosamente heparina y aspirina para impedir la
propagación adicional del trombo. Los animales se trataron luego con
una infusión intraarterial del material de ensayo. El flujo
sanguíneo a través de la arteria carótida se siguió durante la
administración del material de ensayo de forma que la lisis exitosa
del coágulo pudiera detectarse y se pudiera tomar nota del tiempo en
el cual ocurría la lisis del coágulo. Se anotó el porcentaje de
experimentos en los que ocurría la lisis del coágulo y se calcularon
medias de grupo sólo para aquellos experimentos en los que la lisis
del coágulo fue exitosa. Como medida del potencial hemorrágico del
material de ensayo, toda la sangre que brotó del sitio quirúrgico se
recogió con trozos de gasa. Las gasas se colocaron en una solución
detergente para solubilizar los glóbulos rojos y liberar la
hemoglobina, que se cuantificó luego espectrofotométricamente. La
hemoglobina derramada se utilizó para calcular un volumen de pérdida
de sangre. Los datos del ensayo se muestran en la Tabla que aparece
a continuación.
Estos estudios establecen que la NAT es
biológicamente activa en un modelo animal de lisis de coágulos in
vivo. Además, la lisis de coágulos se logró en una cantidad
marcadamente reducida de tiempo y con menos pérdida de sangre desde
el sitio quirúrgico, en comparación con la uroquinasa. Así, el
perfil de actividad de la NAT se puede distinguir de la clase de
agentes trombolíticos de los activadores del plasminógeno
(representados por la uroquinasa) en que la lisis de coágulos con la
NAT ocurre más rápidamente y con complicaciones hemorrágicas
reducidas.
La actividad fibrinolítica de la NAT es
comparable a la de la fibrolasa. Además, como se mencionó
anteriormente, la estabilidad del extremo N de la NAT da como
resultado un producto final más homogéneo tras la expresión
recombinante, que es una ventaja distinta (es decir, el extremo N no
cambiará a lo largo del tiempo dando como resultado una mezcla de
diferentes formas, haciendo así más estable el polipéptido).
<110> Boone, Thomas C.
\hskip1cmLi, Huimin
\hskip1cmMann, Michael B.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> POLIPÉPTIDO CON ACTIVIDAD
FIBRINOLÍTICA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> A-596
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 09/411,329
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-10-01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 201
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
NAT (análogo de fibrolasa de Agkistrodon Contourtrix)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 603
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
codifica NAT (análogo de fibrolasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 462
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
Pro-NAT nativa (análogo de fibrolasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia artificial:
codifica pro-NAT (análogo de fibrolasa)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fibrolasa nativa de Agkistrodon
contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 609
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Codifica la fibrolasa nativa de
Agkistrodon cortortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1392
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de
pro-fibrolasa nativa de Agkistrodon
cortortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial:
\hskip1cmOligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptactattgcc agcattgctg c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial:
\hskip1cmOligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcctacagtct tacggtaaac g
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial:
\hskip1cmOligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtac
\hfill45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de secuencia
artificial:
\hskip1cmOligonucleótido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggttaatttg aactgattct ctagaaaggg tgtttctatg catg
\hfill44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> Complemento( (1) )..(1620))
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena complementaria (sentido) de la
cadena antisentido (Véase SEQ ID NO:13)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia codificante de la
pro-fibrolasa nativa de Agkistrodon
contortrix
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1620
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_misc
\vskip0.400000\baselineskip
<222> Complemento ((1)..(1620))
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cadena complementaria (antisentido)
de la cadena sentido (Véase SEQ ID NO:12)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia anticodificante de la
pro-fibrolasa nativa de Agkistrodon
contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 540
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Los Xaa en las posiciones 465, 493,
516 y 536 corresponden a codones de parada.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Pro-fibrolasa nativa
de Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 203
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Fibrolasa nativa de Agkistrodon
contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 1 representa el
compuesto químico, ácido piroglutámico. A este compuesto químico
se hace referencia en la memoria con la letra "E"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 202
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fibrolasa nativa de Agkistrodon
contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa en la posición 1 representa el
compuesto químico, ácido piruglutámico. A este compuesto químico
se hace referencia en la memoria con la letra "E".
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 538
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: forma análoga de pro-fibrolasa nativa
de Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 602
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibrolasa de
Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 816
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibrolasa de
Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1373
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Fragmento de fibrolasa de
Agkistrodon contortrix
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
Claims (25)
1. Un polipéptido con actividad fibrinolítica que
tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.
2. El polipéptido de la reivindicación 1, que se
ha preparado mediante expresión recombinante en una levadura.
3. Una molécula de ácido nucleico que codifica el
polipéptido de la SEQ ID NO: 1.
4. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 3, que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4.
5. Un vector de expresión que comprende elementos
reguladores de la expresión unidos de forma operativa a una molécula
de ácido nucleico según la reivindicación 3.
6. Un vector de expresión según la reivindicación
5, en el que la molécula de ácido nucleico tiene la secuencia de
nucleótidos de la SEQ ID NO: 4.
7. Una célula hospedadora transformada o
transfectada con la molécula de ácido nucleico de la reivindicación
3 ó 4.
8. Una célula hospedadora transformada o
transfectada según la reivindicación 7, que es una célula
procariótica o eucariótica.
9. Una célula eucariótica transformada o
transfectada según la reivindicación 8, que es una célula de
levadura.
10. Una célula de levadura transformada o
transfectada según la reivindicación 9, que es de Pichia
pastoris.
11. Un método para la producción de una nueva
metaloproteinasa con actividad trombolítica codificada por el ácido
nucleico de la reivindicación 3, comprendiendo el método cultivar
células hospedadoras que contienen una molécula de DNA que codifica
dicha metaloproteinasa unida de forma operativa a elementos
reguladores para estimular su expresión en condiciones tales que la
molécula de DNA se exprese, y aislar la metaloproteinasa expresa del
cultivo de células hospedadoras.
12. El método de la reivindicación 11, en el que
la molécula de DNA es de la SEQ ID NO: 4.
13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en el
que las células hospedadoras son células de levadura.
14. El método de la reivindicación 13, en el que
las células de levadura son de Pichia pastoris.
15. Un método para la producción de un agente
fibrinolítico metaloproteinasa que comprende cultivar células
hospedadoras de Pichia que contienen una molécula del ácido
nucleico de la reivindicación 3 ó 4 unida de forma operativa a
elementos reguladores para estimular su expresión en condiciones
tales que la molécula de ácido nucleico se exprese, y aislar la
metaloproteinasa expresada del cultivo de células hospedadoras.
16. El método de la reivindicación 15, en el que
la célula hospedadora de Pichia es de Pichia
pastoris.
17. Un anticuerpo contra el polipéptido de la
reivindicación 1 ó 2.
18. El anticuerpo de la reivindicación 17, que es
un anticuerpo monoclonal.
19. Un anticuerpo según la reivindicación 17 ó
18, para su uso en terapia o diagnóstico.
20. Una composición farmacéutica que comprende un
polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, junto con un diluyente,
conservante, solubilizante, emulsionante, adyuvante y/o vehículo
farmacéuticamente aceptable.
21. Un polipéptido según la reivindicación 1 ó 2,
para uso en aplicaciones médicas.
22. Uso de un polipéptido según la reivindicación
1 ó 2, para la fabricación de un medicamento para uso en el
tratamiento de la trombosis.
23. Uso según la reivindicación 22, en el que el
polipéptido es para su suministro vía administración
intratrombótica.
24. Uso según la reivindicación 22, en el que el
polipéptido es para el suministro en una arteria.
25. Uso según la reivindicación 23 ó 24, en el
que el polipéptido es para el suministro vía catéter.
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