EA005944B1

EA005944B1 - Фибринолитически активный полипептид

Info

Publication number: EA005944B1
Application number: EA200200410A
Authority: EA
Inventors: Томас Чарльз Бун; Хуимин Ли; Майкл Бенджамин Манн
Original assignee: Амген Инк.
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 2000-09-29
Publication date: 2005-08-25
Also published as: DE60019147D1; HK1049351A1; CZ298502B6; RS20060033A; EP1224298B1; AU767827B2; CN101230340A; MXPA02003126A; KR20060114034A; NO20021501D0; KR100700753B1; DE60019147T2; CN1402788A; HK1049351B; PT1224298E; EA200200410A1; AU7625400A; DK1224298T3; US6261820B1; BR0014414A

Abstract

Описаны фибринолитически активный полипептид металлопротеиназы (называемый «тромболитик нового действия»), который применим для фибринолиза in vivo, и способы и материалы для его получения с помощью рекомбинантной экспрессии.

Description

Данное изобретение относится к фибринолитически активной металлопротеиназе с последовательностью неприродного происхождения, к рекомбинантным способам её получения и к её применению при лечении тромбоза ίη νίνο.

Предпосылки создания изобретения

Фибролаза представляет собой ферментативно активный полипептид, конкретно, металлопротеиназу, состоящую из 203 аминокислотных остатков, которую первоначально выделили из яда мокасиновой змеи: патент США 4 610 879, выдан 9 сентября 1986 г (Магк1апй е! а1.); и Сиап е! а1., Лге1итс5 οί ΒίοсНетМгу апй Вюрйуыск, том 289, номер 2, стр.197-207 (1991). Фермент проявляет прямую фибринолитическую активность с небольшой геморрагической активностью или без геморрагической активности, и он растворяет сгустки крови (тромбы), либо образованные фибриногеном, либо сгустки цельной крови.

Аминокислотная последовательность фибролазы также была определена методами, описанными для рекомбинантного продуцирования в дрожжах, и применяется для лечения тромбоэмболических состояний ίη νίνο; ΡηηΛΙρΙι е! а1., Рго1еш §с1епсе, СашЬпйде ишуегЩу Ргс55 (1992), стр. 590-600 и Европейская патентная заявка 0 323 722 (Уа1епхие1а е! а1.), опубликованная 12 июля 1989 г.

Сущность изобретения

Данное изобретение охватывает фибринолитическую металлопротеиназу, имеющую неприродную линейную аминокислотную последовательность, изображённую как 8ЕО ΙΌ N0:1, также называемую в данном описании «тромболитик нового действия» (или «ΝΑΤ»). Также охватываются нуклеотидные молекулы, такие как молекула 8ЕС ΙΌ N0:2 и её варианты, кодирующие ΝΑΤ.

Термин «зрелый» употребляется в общепринятом смысле и относится к биологически активному полипептиду, который ферментативно процессирован ίη кйи в клетке-хозяине, с отщеплением его от препро-участка.

Благодаря своей фибринолитической активности ΝΑΤ применим ίη νίνο в качестве агента, растворяющего тромбы (сгустки крови), для лечения тромбоза у млекопитающего (включая крыс, свиней и человека).

Полипептид ΝΑΤ по данному изобретению имеет преимущества перед природной фибролазой в качестве терапевтического агента (то есть фибринолитического полипептида, обнаруженного в змеином яде). Известно, что природная фибролаза содержит несколько различных Ν-концов: ООЙЕР, ЕОИЕР и ЕКЕР (где «Е» обозначает циклизованный глутамин или пироглутаминовую кислоту). Более конкретно, начиная с Ν-конца, состоящего из СОЙЕР, молекула фибролазы претерпевает расщепление, давая в результате две изоформы, имеющие Ν-концевые последовательности ЕОИЕР и ЕЙЕР, соответственно. Рекомбинантная фибролаза, будучи продуцирована в дрожжах, обычно дает смесь всех трёх из этих форм и, следовательно, не является однородной. См. Εοηλ'ζη е! а1., ΙοιίΓηηΙ οί Сй^οтаΐοд^аρйу, Β662, стр. 227243 (1994). Кроме того, циклизованный глутаминовый остаток даёт в результате «блокированный» Νконец, который делает секвенирование невозможным.

Напротив, рекомбинантный ΝΑΤ по данному изобретению даёт одну форму: обычно получают только один Ν-конец. Результатом является большая гомогенность конечного продукта по сравнению с рекомбинантной фибролазой, что является преимуществом, когда предполагаемой конечной целью является применение в медицине.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 дано линейное изображение полной аминокислотной последовательности ΝΑΤ (8ЕС ΙΌ Ν0:3), состоящей из «препро»-участка (подчёркнут), включающего «сигнальный» пептид, и зрелого полипептида (не подчёркнут).

ΝΑΤ можно продуцировать рекомбинантной экспрессией нуклеотидной молекулы 8ЕС ΙΌ Ν0:4, которая кодирует аминокислотную последовательность ΝΑΤ (8ЕС ΙΌ Ν0:3), включая препро-участок от нуклеотида 1 до 783 и зрелый полипептид, нуклеотиды 784-1386, в подходящем хозяине. После экспрессии препро-участок ферментативно отщепляется, в результате получается зрелый активный полипептид (8ЕС ΙΌ Ν0:1). Предпочтительно, ΝΑΤ продуцируют рекомбинантно в дрожжах, что подробнее описано ниже.

Получаемый таким образом зрелый полипептид (8ЕС ΙΌ Ν0:1) может иметь или не иметь аминоконцевой метионин, в зависимости от способа получения. Обычно аминоконцевой метиониновый остаток будет присутствовать, когда полипептид продуцируют рекомбинантно в несекретирующем бактериальном (например, Е. отН) штамме в качестве хозяина.

Помимо нуклеотида с 8ЕС ΙΌ Ν0:2 также применимы его вырожденные последовательности, которые кодируют тот же самый полипептид. Данное изобретение также охватывает нуклеотиды, которые могут кодировать дополнительные аминокислотные остатки, фланкирующие 5' или 3' участки области, кодирующей зрелый полипептид, такие как последовательности, кодирующие альтернативные пре/проучастки (то есть последовательности, ответственные за секрецию полипептида через клеточные мембраны) вместо «нативного» пре/проучастка (то есть обнаруженного в природной фибролазе). Дополнительные последовательности могут также являться не кодирующими последовательностями, включая регулярные последовательности, такие как промоторы транскрипции или трансляции, зависящие от клеткихозяина.

- 1 005944

ΝΑΤ можно получать, используя хорошо известные методы рекомбинантной ДНК, такие как представленные в 8атЬгоок с! а1., Мо1еси1аг С1ошид: Α ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу Ргс55. Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ (1989) и/или Аи8иЬе1 е! а1., еФ1ог5. Сштеп! Рго!осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1оду. Сгееп РиЬШйега 1пс. апб Айеу апб 8оп5. №\ν Υо^к (1994). ДНК, кодирующая полипептид или его процессированную версию, может быть получена, например, скринингом библиотеки на основе геномной или кДНК или РСВ-амплификацией с целью получения нуклеотида, кодирующего фибролазу, с последующим замещением кодонов, кодирующих Ν-концевые аминокислотные остатки ООВ, кодоном для серина (8). Или же ДНК, кодирующую ΝΑΤ, можно получать химическим синтезом с применением методов, хорошо известных специалистам, таких как методы, описанные ЕпдеК е! а1. в Апде\\\ Скет. 1п!1. Еб., том 28, стр.716-734 (1989). Обычно ДНК имеет протяжённость в несколько сот нуклеотидов. Нуклеиновые кислоты протяжённостью более, примерно, ста нуклеотидов можно синтезировать в виде нескольких фрагментов, используя те же методы, и фрагменты можно лигировать вместе, получая нуклеотидную последовательность заданной длины.

Молекулу ДНК встраивают в соответствующий вектор экспрессии с целью экспрессии в подходящей клетке-хозяине. Вектор выбирают так, чтобы он был функциональным в конкретной применяемой клетке-хозяине (то есть вектор совместим с механизмами клетки-хозяина, так чтобы могла осуществляться экспрессия ДНК). Полипептид можно экспрессировать в прокариотных, дрожжевых клеткаххозяевах, клетках-хозяевах насекомых (бакуловирусные системы) или в эукариотных клетках-хозяевах, хотя дрожжевые являются предпочтительными, как более подробно объясняется ниже.

Векторы, используемые в любой клетке-хозяине для экспрессии ΝΑΤ, могут также содержать 5' фланкирующую последовательность (также называемую «промотор») и другие регуляторные элементы экспрессии, функционально связанные с ДНК, которая должна экспрессировать, а также энхансер(ы), ориджин репликации, элемент терминации транскрипции, полную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный сайт сплайсинга, последовательность сигнального пептида, сайт связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерный участок для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей ΝΑΤ, и селективный маркёр. Каждый из этих элементов обсуждается ниже.

При необходимости, вектор может также содержать последовательность- «метку», то есть олигонуклеотидную последовательность, расположенную на 5' или 3' конце кодирующей полипептид последовательности, которая кодирует полиНЕ (такой как гексаНщ), или другой малой иммуногенной последовательности (такой как эпитоп с-тус или гемагглютинина, антитела для которых, включая моноклональные антитела, промышленно доступны). Эта метка может экспрессировать наряду с ΝΑΤ и может служить как метка афинности для очистки этого полипептида от клетки-хозяина. При необходимости метку затем можно удалять из очищенного полипептида различными методами, например, с применением селективной пептидазы.

5' фланкирующая последовательность может быть нативной 5' фланкирующей последовательностью, или она может быть гомологичной (то есть из того же вида и/или штамма, что и клетка-хозяин), гетерологичной (то есть из иного вида или штамма нежели клетка-хозяин), гибридной (то есть комбинацией 5' фланкирующих последовательностей более, чем из одного источника), или синтетической. Источником 5' фланкирующей последовательности может быть любой одноклеточный прокариотный или эукариотный организм, любое позвоночное или беспозвоночное, или любое растение при условии, что 5' фланкирующая последовательность функциональна в механизмах клетки-хозяина и может быть активирована с их помощью.

Ориджин репликация обычно представляет собой участок векторов экспрессии прокариот, выпускаемых промышленностью, и способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Амплификация вектора до определённого числа реплик может, в некоторых случаях, являться важной для оптимальной экспрессии ΝΑΤ. Если выбранный вектор не содержит ориджина репликации, его можно синтезировать химически на основе известной последовательности, а затем лигировать в вектор.

Элемент терминации транскрипции обычно расположен 3' относительно конца кодирующей полипептид последовательности и служит для терминации транскрипции мРНК. Обычно элемент терминации транскрипции прокариотных клеток представляет собой С-С-обогащённый фрагмент, за которым следует полиТ-последовательность. Хотя элемент легко клонируется на основе библиотеки или даже выпускается промышленностью как часть вектора, его также можно легко синтезировать с помощью известных способов синтеза нуклеиновых кислот.

Селективный маркёр кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, выращенной в избирательной культуральной среде. Типичный селективный маркёр (ген) кодирует белки, которые: (а) сообщают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, к ампициллину, тетрациклину или канамицину - в случае прокариотных клеток-хозяев, зеоцину - в случае дрожжевых клеток-хозяев, и неомицину - в случае клеток-хозяев млекопитающих; (Ь) дополняют ауксотрофный дефицит клетки; или (с) снабжают важными питательными веществами, недоступными из комплексных сред. Предпочтительные селективные маркёры для экспрессии в прокариотах представляют собой ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к ампициллину и ген устойчивости к тетрациклину.

- 2 005944

Элемент связывания рибосомы, обычно называемый последовательностью Шайна-Дальгарно (Ыипс-ЭаЦагпо) (для прокариот) или последовательностью Козака (Кохак) (для эукариот), необходим для инициации трансляции мРНК. Элемент обычно расположен 3' относительно промотора и 5' относительно кодирующей последовательности синтезируемого полипептида. Последовательность ШайнаДальгарно меняется, но обычно представляет собой полипурин (то есть с высоким содержанием А-С). Идентифицированы многие последовательности Шайна-Дальгарно, каждую из которых можно легко синтезировать с помощью вышеописанных методов и использовать в прокариотном векторе. Последовательность Козака обычно включает последовательности непосредственно перед и после инициирующего кодона. Предпочтительная последовательность Козака является последовательностью, которая ассоциирована с высокой эффективностью инициации трансляции при АИС стартовом кодоне.

В тех случаях, когда желательно, чтобы ΝΑΤ-полипептид секретировал из клетки-хозяина, можно использовать сигнальную последовательность для того, чтобы направить полипептид из клетки-хозяина, где он синтезирован. Обычно сигнальная последовательность позиционирована в кодирующей области нуклеотидной последовательности или непосредственно на 5'-конце кодирующей области. Были определены многие сигнальные последовательности, и некоторые из них, которые являются функциональными в выбранной клетке-хозяине, могут использоваться по данному изобретению. Соответственно, сигнальная последовательность может быть гомологичной или гетерологичной последовательностью полипептида. Кроме того, сигнальную последовательность можно химически синтезировать, ссылки на которую даны выше.

После того, как вектор сконструирован и нуклеиновая кислота встроена в нужный сайт вектора, полный вектор можно ввести в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида.

Как уже упоминалось, клетки-хозяева могут быть прокариотные (такие как Е.со11) или эукариотные (такие как дрожжевая клетка, клетка насекомых или клетка позвоночных). Клетка-хозяин, будь это дрожжи или любой другой хозяин, при культивировании в подходящих условиях, может синтезировать ΝΑΤ, который затем можно собирать с культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или непосредственно из клетки-хозяина, продуцирующей его (если он не секретирует). После сбора полипептид ΝΑΤ можно очистить такими методами, как хроматография на молекулярных ситах, афинная хроматография и т.п.

Выбор клетки-хозяина в большой степени зависит от того, является ли способ, каким клетка-хозяин способна «скручивать» ΝΑΤ в его нативную вторичную или третичную структуру (например, подходящая ориентация дисульфидных мостиков и т.п.), таким, что клетка образует биологически активный материал. Однако, даже если клетка-хозяин не синтезирует биологически активный материал, он может «скручиваться» после синтеза при использовании соответствующих химических условий, таких которые известны специалистам в данной области техники. В любом случае тот факт, что получен биологически активный материал, подразумевает соответствующее скручивание.

Подходящими клетками-хозяевами или клеточными линиями могут быть клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки 3Т3. Выбор подходящих клеток-хозяев млекопитающих или способов трансформации, культивирования, амплификации, скрининга и получения и очистки продукта известны в технике. Другими подходящими клеточными линиями млекопитающих являются клеточные линии СО8-1 и СО8-7 и СУ-1 обезьян. Другие примеры клеток-хозяев млекопитающих включают клеточные линии приматов и грызунов, включая трансформированные клеточные линии. Также применимы нормальные диплоидные клетки, клеточные штаммы ίη νίΐτο культур первичной ткани, а также первичных эксплантатов. Предполагаемые клетки (кандидаты) могут генотипически отличаться по гену селекции или могут содержать доминантно действующий ген селекции. Другие подходящие клеточные линии млекопитающих включают, без ограничения, НеЬа, мышиные Ь-929 клетки, 3Т3 линии мышей 8\νί55, Ва1Ь-с или ΝΙΗ, клеточные линии хомячков ВНК или НаК.

Также пригодны в качестве клеток-хозяев бактериальные клетки. Например, различные штаммы Е.со11 (например, НВ101, ДН5а, ДНЮ и МС1061) хорошо известны как клетки-хозяева в биотехнологии. Различные штаммы В.биЫШб, РБеиботопаБ Брр, других ВасШиБ Брр, 81тер1отусеБ Брр и т.п.также могут применяться. Кроме того, многие штаммы дрожжевых клеток, известные специалистам в данной области техники, также применимы в качестве клеток-хозяев для экспрессии полипептида по данному изобретению. Также, если требуется, можно в качестве клеток-хозяев использовать клетки насекомых. См., например, М111ег е1 а1., Сепейс Епдшеетшд, том 8, стр. 277-298 (1986).

Включение (также называемое «трансформация» или «трансфекция») вектора в выбранную клеткухозяина можно осуществлять такими методами, как кальций-фосфатный, электропорация, микроинъекция, липофекция или метод ΌΕΑΕ-декстраном. Выбор метода частично зависит от вида используемой клетки-хозяина. Эти методы и другие пригодные методы хорошо известны специалистам в данной области техники и представлены, например, в 8атЬгоок е1 а1., см. выше.

Клетки-хозяева, содержащие вектор, можно культивировать, применяя стандартные среды, хорошо известные специалистам в данной области техники. Среды обычно содержат все питательные вещества, необходимые для роста и выживания клеток. Подходящими средами для выращивания клеток Е.со11 яв

- 3 005944 ляются, например ,бульон Лурия (ЬВ) и/или бульон Террифика (ТВ). Подходящими средами для культивирования эукариотных клеток являются ΚΡΜΙ 1640, МЕМ, ΌΜΕΜ, каждая из которых может быть дополнена сывороткой и/или факторами роста, как требуется конкретной культивируемой клеточной линией. Подходящей средой для культур насекомых является среда Грейса (Стасе), дополненная, при необходимости, дрожжевым экстрактом, гидролизатом лактальбумина и/или фетальной телячьей сывороткой.

Как правило, антибиотик или другое соединение, пригодное для избирательного роста только трансформированных клеток, добавляют как дополнение к средам. Использование конкретного соединения диктуется селективным маркёром, присутствующим на плазмиде, при участии которой трансформирована клетка-хозяин. Например, если селективный маркёр представляет собой ген устойчивости к канамицину, соединение, добавляемое в культуральную среду, является канамицином.

Количество ΝΑΤ, продуцированного в клетке-хозяине, можно оценивать стандартными методами, известными в технике. Такие методы включают, без ограничения, вестерн-блоттинг, электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата, ВЭЖХ-разделение, иммунопреципитацию и/или анализы активности, такие как анализы сдвига в геле при ДНК-связывании.

Если ΝΑΤ секретирует из клеток-хозяев, иных, нежели грам-отрицательные бактерии, основную часть, по-видимому, можно обнаружить в клеточной культуральной среде. Если ΝΑΤ секретирует из грамотрицательных бактерий, какую-то часть его обнаруживают в периплазме. Если ΝΑΤ не секретирует, он находится в цитоплазме.

В случае внутриклеточного ΝΑΤ клетки-хозяева обычно сначала разрушают механически. В случае ΝΑΤ, расположенного в периплазме, для выделения периплазматического содержимого в буферный раствор можно применять либо механический лизис, либо осмотическую обработку. Затем полипептид ΝΑΤ выделяют из этого раствора. Далее можно различными методами проводить очистку от раствора. Если ΝΑΤ синтезирован так, что он содержит метку, такую как гексагистидин или другой малый пептид либо на карбоксильном, либо на аминоконце, он практически может быть очищен с помощью одностадийного процесса пропусканием раствора через афинную колонку, если матрица колонки имеет высокое сродство к метке или к полипептиду непосредственно (то есть моноклональное тело). Например, полигистидин связывается с высоким сродством и специфичностью с никелем, следовательно, для очистки можно использовать афинную колонку из никеля (такую как никелевые колонки О1адеп) (см., например, Ли5иЬе1 е! а1., еййога, СиггеШ Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, см. выше).

Если, с другой стороны, полипептид не содержит сетки и не доступны никакие антитела, можно использовать для очистки другие хорошо известные методы. Такие методы включают, без ограничения, ионообменную хроматографию, хроматографию на молекулярных ситах, обращённо-фазовую хроматографию, ВЭЖХ, электрофорез в естественном геле в сочетании с гель-элюцией и препаративное изоэлектрофокусирование («Порите» прибор/метод, НоеГег 8с1еп!1йс). В некоторых случаях для достижения повышенной степени чистоты можно комбинировать два или более этих метода.

Особенно предпочтительными для получения ΝΑΤ являются дрожжевые клетки и наиболее желательны клетки рода дрожжей, известные как РюЫа (например, РюЫа райопк), вследствие большей эффективности повторного скручивания по сравнению, например, с бактериальными клетками, такими как Е.сой. Соответствующие рекомбинантные методы экспрессии для этих дрожжевых штаммов описаны в патентах США 4 855 231 (8!гошап е! а1.), 4 812 405 (Ьа1г е! а1.), 4 818 700 (Сгедд е! а1.), 4 885 242 (Сгедд) и 4 837 148(Сгедд).

Замечательно, что клетки РюЫа можно также применять для экспрессии фибролазы с аналогичной эффективностью при участии ДНК, кодирующей эту металлопротеиназу, и такой метод составляет ещё один аспект данного изобретения. Фибролаза представляет собой известную металлопротеиназу, которая описана в научной и патентной литературе, см. Рапйо1р11 е! а1., и Европейскую патентную заявку 0 323 722, приведённые выше. Как правило, экспрессируемая фибролаза имеет последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ:5, которая кодируется кДНК с последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:6 (или её вариантами, кодирующими ту же самую аминокислотную последовательность). Экспрессия фибролазы в такой системе обычно включает ДНК с последовательностью 8ЕО ΙΌ ΝΟ:7, которая кодирует «препро» последовательность (нуклеотиды 1-783) в дополнение к «зрелому» полипептиду (нуклеотиды 784-1392).

Химически модифицированные версии ΝΑΤ, в которых полипептид связан с полимером или другим веществом, образуя производное, с целью модификации свойств, также входят в объём данного изобретения. Для целей терапии человека в особенности может быть предпочтительной дериватизация ΝΑΤ присоединением одного или более других химических фрагментов к полипептидному фрагменту. Такие химические фрагменты можно выбирать из различных водорастворимых полимеров. Полимер должен быть водорастворимым, так что полипептид ΝΑΤ, к которому он присоединяется, смешивается с водной средой, такой как физиологическая среда. Водорастворимый полимер можно выбирать из группы, состоящей, например, из полиэтиленгликоля, сополимеров этиленгликоля и пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозы, декстрана, поливинилового спирта, поливинилпирролидона, поли-1,3-диоксолана, поли-1,3,6-триоксана, сополимера этилена с малеиновым ангидридом, полиаминокислот (либо гомополимеров, либо статистических, либо нестатистических сополимеров (см. подробнее ниже, при рассмотрении слитых молекул) и декстрана или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоля, гомополимеров

- 4 005944 пропиленгликоля, сополимеров полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированных полиолов, полистиролмалеата и поливинилового спирта. Полиэтиленгликольпропиоальдегид может быть предпочтительным в процессе производства благодаря своей стабильности в воде.

Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвлённым или неразветвлённым. В случае полиэтиленгликоля для простоты обращения и производства предпочтительна молекулярная масса около 2-100 килодальтон (кДа) (термин «около, приблизительно» указывает, что при получении полиэтиленгликоля некоторые молекулы могут иметь большую или меньшую молекулярную массу, чем указано). Можно использовать полимер другого размера в зависимости от терапевтического профиля (например, желательная пролонгированность действия; влияние, если таковое есть, на биологическую активность; лёгкость обработки (обращения); степень или отсутствие антигенности и другое известное действие полиэтиленгликоля на терапевтический белок).

Число полимерных молекул, присоединённых таким образом, может меняться, и специалист в данной области техники может выяснить влияние на функцию. Можно монодериватизировать или получить ди-, три-, тетра- или какую-либо комбинацию дериватизации с тем же самым или другими химическими фрагментами (например, с полимерами, такими как полиэтиленгликоль различной молекулярной массы). Соотношение молекул полимера и молекул полипептида ΝΑΤ изменяется с изменением их концентраций в реакционной смеси. В большинстве случаев оптимальное соотношение (или, если говорить об эффективности реакции, когда нет избытка не прореагировавшего полипептида или полимера) определяется такими факторами, как заданная степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярная масса выбранного полимера, является ли полимер разветвлённым или неразветвлённым и условия реакции. Химические фрагменты присоединяются к ΝΑΤ с учётом влияния функциональных или антигенных доменов полипептида. Существует ряд способов присоединения, известных (доступных) специалистам в данной области техники. См., например, ЕР 0 401 384 (присоединение РЕС (ПЭГ) к С-С8Е) и Майк с1 а1., ЕхрептепЫ Нста1о1оду. том 20, стр. 1028-1035 (1992) (сообщает о пэгировании СМ-С8Е при участии трезилхлорида). В качестве примера (иллюстрации) полиэтиленгликоль может ковалентно связываться с аминокислотными остатками с помощью реакционноспособной группы, такой как свободная амино- или карбоксильная группа. Реакционноспособными группами являются такие, с которыми может связываться активированная молекула полиэтиленгликоля (или другой химический фрагмент). Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу, могут включать остатки лизина и Ν-концевой аминокислотный остаток. Аминокислотные остатки, содержащие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспаргиновой кислоты, глутаминовой кислоты и С-концевой аминокислотный остаток. Сульфгидрильные группы также можно использовать в качестве реакционноспособной группы для присоединения молекул(ы) полиэтиленгликоля (или другого химического фрагмента). Для целей производства предпочтительно присоединять по аминогруппе, такой как аминогруппа при Ν-конце или в лизиновом остатке.

Присоединения к остаткам, важным для рецепторного связывания, следует избегать, если желательно рецепторное связывание.

Могут требоваться конкретно производные, химически модифицированные по Ν-концу. Если брать в качестве примера полиэтиленгликоль, можно выбрать из ряда полиэтиленгликоля молекулы (по молекулярной массе, разветвлению и т.п.), молекулярное соотношение в реакционной смеси полиэтиленгликоля к полипептиду, тип осуществляемой реакции пэгирования и способ получения выбранного пэгированного по Ν-концу ΝΑΤ. Способом получения пэгированного по Ν-концу препарата (то есть по возможности отделения этого фрагмента от других монопэгированных частиц) может быть очистка пэгированного по Ν-концу материала от совокупности пэгированных молекул ΝΑΤ. Селективную Ν-концевую химическую модификацию можно провести с помощью восстановительного алкилирования, которое использует различную реакционную способность различных первичных аминогрупп (лизина и Νконцевой), пригодных для дериватизации. См. международную заявку АО 96/11953, опубликованную 25 апреля 1996 г. При соответствующих условиях реакции достигается практически селективная дериватизация ΝΑΤ по Ν-концу в присутствии карбонилсодержащего полимера. Например, можно селективно пэгировать ΝΑΤ по Ν-концу, проводя реакцию при рН, позволяющем воспользоваться разницей рК_а εаминогруппы лизиновых остатков и рК_а α-аминогруппы Ν-концевого остатка полипептида. С помощью такой селективной дериватизации контролируется присоединение полимера к полипептиду: конъюгация с полимером происходит преимущественно по Ν-концу полипептида и не наблюдается заметной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи лизина. Для использования в восстановительном алкилировании полимер может быть описанного типа и должен иметь одну альдегидную группу для присоединения к полипептиду. Может использоваться полиэтиленгликольпропиоальдегид, имеющий одну реакционноспособную альдегидную группу.

ΝΑΤ или химически модифицированные производные по данному изобретению можно приготовить в виде препаратов для применения ίη νίνο и, наиболее предпочтительно, внутрь тромба («внутритромбозно», то есть путём местной доставки непосредственно к сгустку в кровеносном сосуде, например, с помощью катетера). Обычно системная доставка не является предпочтительной, ввиду вероятности того,

- 5 005944 что природный Ь2 макроглобулин в общем кровотоке может давать комплекс с ΝΑΤ, предупреждая взаимодействие между фибрином или фибриногеном, таким образом препятствуя лизису (разрушению) сгустка. Однако могут существовать примеры, когда можно использовать большие количества ΝΑΤ, которые превышают уровни Ь2 макроглобулина в кровотоке, что делает возможным системное введение и доставку. В целом данное изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие эффективные количества ΝΑΤ вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Под «эффективным количеством» понимается количество, достаточное для достижения измеряемого (определяемого) биологического эффекта (то есть тромболитически эффективное количество, которое вызывает растворение тромба или тромбов, подвергаемого(-ых) лечению).

Обычно ΝΑΤ имеет высокую степень чистоты, и любая применяемая в качестве средства доставки фармацевтическая композиция обычно предварительно стерилизуется перед применением, например, фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны.

Специалист в данной области техники способен определить эффективные дозы путём введения и наблюдения за требуемым терапевтическим эффектом. Конкретные эффективные дозы в этом интервале зависят от конкретного подвергаемого лечению нарушения или состояния, а также от возраста и общего состояния здоровья реципиента и может определяться стандартными клиническими методами. Если возможно, желательно построить кривую эффекта дозы фармацевтической композиции сначала ίη νίίτο, в виде биоаналитических систем, а затем на подходящих животных модельных системах, прежде, чем испытывать на людях. Опытные практики, принимая во внимание терапевтическую сторону, вид нарушения, подлежащего лечению, и другие соответствующие факторы, смогут определить нужную дозу без больших усилий. Обычно практикующий специалист вводит композицию ΝΑΤ до достижения дозы, вызывающей нужное действие (то есть фибринолиз). Композицию можно вводить в виде однократной дозы или в виде двух или более доз (которые могут содержать или не содержать такое же количество полипептида), разделённых во времени или постоянно.

ΝΑΤ можно также использовать для получения антител обычными методами. Антитела могут быть поликлональными, моноклональными, рекомбинантными, химерными одноцепочечными и/или биспецифическими и т.д. С целью повышения вероятности получения иммунного ответа аминокислотную последовательность ΝΑΤ можно анализировать и определить участки молекулы, которые могут ассоциироваться с иммуногенностью. Так, аминокислотную последовательность можно подвергнуть компьютерному анализу для определения поверхностных эпитопов, например, по методу Хоупа и Вудса: Норе апб Аообз, Ртосеебшдз о£ 111е Ναΐίοηαΐ Αсабету о£ 8е1епее υδΑ, том 78, стр. 3824-3828 (1981).

Различные методы, известные из уровня техники, можно использовать для получения поликлональных антител, которые распознают эпитопы ΝΑΤ. Для получения антитела различные животные-хозяева можно иммунизировать, делая инъекции полипептида, включая, без ограничения, кроликов, мышей, крыс и т.п. Различные адъюванты можно использовать для усиления иммунологического ответа, в зависимости от вида хозяина, включая, без ограничения, адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидроксид алюминия (а1ит), поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плурониевые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и потенциально применимые адъюванты человека, такие как ВасШе Са1тейе-Сиет1п и СотупеЬас1етшт раппт.

Для получения моноклональных антител, специфичных к ΝΑΤ, можно использовать любые методы, которые позволяют получать антитела при участии клеточных штаммов в культуре. Например, метод гибридом, первоначально предложенный Колером и Мильштейном (КоЫет апб МИйеш), описанный в №11иге. т. 256, стр. 495-497 (1975), а также метод триом, метод человеческих В-клеточных гибридом, описанный КохЬог е1 а1. в 1ттипо1оду ^бау, т. 4, стр.72 (1983) и метод ЕВУ-гибридом для получения моноклональных антител, описан Со1е е1 а1. в «Мопос1опа1 ЛпиЬоб1е5 апб Сапсег Люгеру, Л1ап В. Ькз, 1пс., стр. 77-96 (1985), все применимы для получения моноклональных антител по данному изобретению.

Антитела по данному изобретению могут применяться терапевтически, так чтобы связаться с избыточным количеством ΝΑΤ ш νί\Ό после введения и тем самым нейтрализовать или ингибировать после введения.

Антитела могут дополнительно использоваться для целей диагностики, например, в меченой форме для обнаружения присутствия ΝΑΤ в общей воде организма, образце ткани или другом экстракте в соответствии с известными диагностическими методами.

Описание конкретных вариантов изобретения

Изобретение далее иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Происхождение (деривация) последовательности ΝΑΤ.

Эффективным способом получения фибролазы является первоначальная экспрессия в виде препрофибролазы, при расщеплении которой протеазой кех-2 в месте соединения «препро» и «зрелой» областей получается биологически активный материал («зрелая» фибролаза). По такому дизайну синтез и процессинг препрофибролазы ведёт к секреции фибролазы в культуральную среду. Действительная последовательность в расщепляемом месте соединения (...ΤΚΒ ООРЕ..).

Кех-2 является эндопротеазой, которая расщепляет в месте после двух прилегающих основных

- 6 005944 аминокислот, в данном случае лизин (К) - аргинин (В). Зрелая фибролаза, экспрессируемая при участии ДНК, имеющей вышеприведённую последовательность, показывает, что ожидаемый Ν-концевой глутаминовый (ζ)) остаток в действительности претерпевает деамидирование и циклизацию, образуя пироглутаминовую кислоту (Е). Эта химическая модификация считается нежелательной, так как пептиды с Νконцевым циклическим глутаминовым (пироглутаминовая кислота) остатком не реагирует по методу расщепления по Эдману для секвенирования аминокислот. Соответственно, оба глутаминовых остатка (ζ)) на Ν-конце последовательности зрелой фибролазы делегируют, что приводит к Ν-концевому остатку (В)-аргинина. Так как кех-2, как уже упоминалось, расщепляется после двух соседних основных аминокислот, ожидали, что последовательность (...КВВР...) представляет собой двусмысленный сайт расщепления под действием кех-2. Соответственно, Ν-концевой остаток аргинина (Я) (подчёркнут, см. выше) заменяется на остаток серина (8), давая последовательность (...КК8Е...). Выбор серина обоснован необходимостью ввести аминокислоту, которая облегчает кех-2-расщепление, когда оно происходит на Суконцевой стороне сайта гидролиза. Юю1ат с1 а1., Еигореаи 1оитпа1 о£ ΕίίοοΙιοιηίκΙΓν. τ.227, стр. 707-714 (1995).

В результате последовательность ДНК, кодирующей препрофибролазу, модифицируют с помощью сайт-направленного мутагенеза на Ν-концевом кодирующем участке для зрелой фибролазы с заменой кодонов для «ССВ» на кодон для «8», используя стандартную методику РСК, таким образом получают πρεπροΝΑΤ, отвечающий за аминокислотную последовательность 8ЕС Ю N0:3. Олигонуклеотиды, применяемые для праймирования РСЯ-реакций, перечислены ниже и также показана их гомология с целевой последовательностью. Сначала проводят две РСЯ-реакции с применением олигонуклеотидов 1 и 4 в качестве одной пары праймеров и олигонуклеотидов 2 и 3 в качестве другой пары праймеров, обе с ДНК родительского гена в качестве матрицы. ДНК-продукты этих двух реакций протяжённостью 601 и 815 нуклеотидов очищают электрофорезом в агарозном геле и объединяют, чтобы они служили в качестве матрицы во втором цикле РЯС с олигонуклеотидами 1 и 2 в качестве пары праймеров. Этот конечный продукт (протяжённостью 1372 нуклеотида) расщепляют с помощью рестиктаз Х1ю1 и ΝοΐΙ. Гидролизат депротеинизируют с помощью фенола/хлороформа и ДНК осаждают. Часть регенерированной ДНК лигируют в плазмиду ρΡΙΟΖα (Ιηνίίτο^εη, СагКЬаб. СА, Са1а1од Νο У195-20), которую аналогично расщепляют рестриктазами Х1ю1 и ΝοΐΙ, ферментативно дефосфорилируют и депротеинизируют с помощью фенола/хлороформа. Все последующие стадии проводят в соответствии с руководством к набору Ιηνίίτο^εη Р1сЫа Ехргеккюп Кй (Ιηνίίτο^εη Согр., Са1а1од Νο К1710-01). Продукты реакции лигирования трансформируют в Е.соН электропорацией и отбирают по выживанию на зеоцин-содержащих твёрдых средах. Плазмиду выделяют и область фибролазы подтверждают секвенированием ДНК. Плазмиду подвергают линеаризации, расщепляя рестиктазой Рше1, а затем трансформируют в Р1сЫа ракЮпк С8115Ык⁺. Штамм С8115 обычно Ык', поэтому Ы8⁺ генотип восстанавливают трансформацией при участии источника ДНК, несущего дикий вариант гена 1Й84. Или же штамм Ык можно получить от Ιηνίίτο^εη Согр. (Х-33 клеточная линия, Са1а1од Νο С180-00). Компоненты отбирают в виде устойчивых к зеоцину колоний. Возможные клоны индуцируют в метанол-содержащих средах и бульон анализируют на ΝΑΤ-продукцию на 420% РАСЕ с помощью окрашивания Кумасси голубым.

Следующие лигонуклеотиды применяются для сайт-направленного РСЯ-мутагенеза:

О11до 1 5'-ТАСТАТТОССАбСАТТОСТСС-3' (ЗЕр Ю КО: 8)

ОИдо 2 5 - -ОСАААТСССАТГСТОАСАТСС-З ' (ЗЕО Ю КО: 9)

ОИдо 3 (ЗЕО Ю N0: 10) 5' -ТССААТТАААСТТОАСТААСАеАТСТТТСССАСАААОАТАС13ТАС-3'

ОНдо 4 (ЗЕО ИЗ N0: 11)

5' -СТАССТАТСТТТСТООСАААОАТСТСТТАСТСААОТТТААТТСО-3 '

Локализация этих нуклеотидов показана ниже в связи с двухнитевой последовательностью ДНК (8ЕС Ю N0:12 - кодирующая или смысловая нить 8ЕС Ш N0:13 - комплиментарная или антисмысловая нить) и соответствующей аминокислотной последовательностью фибролазы (включая препро-участок), модифицированных с целью создания ΝΑΤ. Ν-концевая и С-концевая области зрелой фибролазы указаны подчёркиванием концевых аминокислотных последовательностей (СОВЕ и ΕΝΚΡ). Ν-концевая область (ССВЕ) представляет собой область, которая модифицирована (с замещённой 8 вместо СРЮ· В олигонуклеотидах 3 и 4, см. ниже, пунктирными линиями показана локализация не включённых (пропущенных) кодонов, кодирующих остатки СС в Ν-концевой области фибролазы.

-7005944

АТетОАТТТССТТСААТТТТТАСГОСТОТТПАТГСаАЖЛТССТССССАТТАССТССТ ---------+------------+-------+---------+—--------+

ТАСТСТАААЖаиаТТАААААТСАСОАСААААТААССЕТСОТАССААзСОТААТСаАССА

МНР РЗХРТАУЬРААЗЗАЬАА

ССАСТСААСАСТАСААСАСААИТаМАССССАСАААТТССМСТаААССГСГСАТСССТ

---------+---------+---------+---------+---------+---------+ бСТСАОТтаТЙАГаТТСТСТТСТАСТТТаСССТаТТТААвХСаАСТТССАСЛСТАСССА

ΡνΝΤΤΤΕΕΞΤΑΟΙΡΑΒΑνίΟ

ТАСТСАЙАТТТАОААС«ЮАТТТССАТСТТССТСТГГтеССАТТТТССААСАССАСАЛАТ

АТСАОТСТААЛТСТТССССТААА<КТАСААСОАСАААЛСССТААААОСТТСТССТЗТТТА

ОИдо 1 5'-ТАСТАГТСССАССАттеСТ(ЗС-3'

ААССЮСТТАТГетТТАТАААТАСТАСТАТТОССАСЗСАТТССТССТАААаААОААСаОСТА в<гьь₽гктт1Л81*АкяЕ<гу

ХЬоХ

I

ТСТСТСШ^ОААААаАОАСОСТСААССТТСТТСТАТТАТСТТСЯААТСТаЗТААССТТААС

АОАаАССТСТТТТСТСТССаАСТТСОААОААОАТААТАаААССТТАСАССАТТОСААТТС аАТТАССААОТТСТТТАТССААаАААСетСАСТССАСТТССТАССССТССТаТТСААССА +

СТААТССТТСААСАААТАССТТСТТТССАСТаАССТСААССАТССССАССАСААСТТОСТ

ΒϊΕννΥΡΒΚνΤΡνΡΗδΑνβΡ

ААОТАСОААСАТ<ХСАТССААТАС5ААТТСААОСТТААСЛгГаААССАСТТСТСТТССАС

ТГСАТССТ1^АС(етАС!т'А1ВСТГЛАаТТССААТТаТСАСТТ{аЗТСААСАаААССТ<3

ΚΥΕϋΑΗΟΥΕΡΚνΝΕ Е.Р V V Ь Н

ТтаЗАААААААСАААССТТТСТТСТСТСААеАТТАСТСТСАААСТСАТТАСТССССАОАТ +

ААСС1ТТПТГТСТТТССАААСААйА(^?ТСТААТСА^ТГТСА<ЗТААТЙАЙСССТСТА

ЬЕКМКСЬГЗЕОУЗЕТНУЗРС ОСТАеАСАААТТАСТАСТТАСССАТТевСТаААСАТСАСТСТТАСТАССАТССТАОААТС

-----.----+------—+-—-----+---------ч----------+

ССАТСТСТТГААТОАТОААТСССТААСССАСТТСТАСТСАСААТОАТССТАССАТСТТАС

ΟΚΕΙΤΤΥΡΙ.<3ΕΒΗ€ΥΥΗ<1ΛΙ

СААААСаАГХКТПАСТССАСТОСТТСТЛТСТСТ^ТТОТААСЗСТГТСАА&ХТГСАТТТС ------—+- — --—--+-- ---_+—_------+---— +-—------+

СТТГГССтаСЗАСТОАОСТОЛСОААСАТАСАаАСеААСАТТЕССАААСТТСССадТАААе ЕНЕАОЗТАЗХЗАСИОЪКСНР ААОТ«ЮииМТ(ЗАААТОТАСГгаАТ?ТСААССАТТ©ЗААТТСТССаАСТСТСААССССАТ

---------₊-----------+---------+--------*+

ТТСААССТТССАСТТТАСАТОАЛСТААСТТ6СТААССТТААСА66СТОЛОАСТТСОООТА

КЬЦ<ЗЕМ¥Ь1ЕРЪЕЬЗВЗЕАН

-8005944

ССТСТСТАСААСТАСОААААСОТСОААДАССААОАТСААСССССАААСАТСТСТОСТОТТ

---------+---------+---------+---------—------ ----------СОАСАДА'ГОТТСАТССТТТТССАОСТТТТССТТСТАСТТССООСТТТСТАСАСАССАСАА ΑνΥΚϊΕΝνεΚΕΟΕΑΡΚΜσον οΐίςο 3 5 *· -ТССААТТААЛСТТОАСТААС

АСССААААСТОООААТСАТАТОААССААТСААОААОЭС СТТСС ААТТАААСГГОАСГААС

ТСОСТТТТСАСССТТАСТАТАС'ГТССТТАСТТСТТССССААССТТАА'т'СААСТОАГТС

011 до 4 3'-ОСТТААТТТОААСТСАТТС

ТОКИЕЗУЕРХККАРОЬИЬТК

А<^------ТСТТТСССАСАААСЛ7АСОТАС-3 ' АбАСААСАААСАТТСССАСААА&АТАССТАСАОСТОСТТАТССТТОСТОАССАССЭТАТО ----..---->---·---------+---------+------------+

ТСТСТТСТТТСТААССОТСТТТСТАТОСАТСТСОАССААТАССААСОАСТСОТСССАТАС

ТСТ------АСААДССОТСТТГСТАТССАТО- 5 '

Н О О К Г ΡΟΗΥνςΕνίνΑΟΗΗΜ

ААСАСТАААТАСААССОТСАСТСТСАСААААТСССТСААТСЗСТОСАССАААТССТСААС

ТТОТ^ТТТАТСОТЗССАСТалеАСТСЗГГГГАеОС^ОТАСССАССЛ^Э^тТАСХадТТСЭ

ΝΤΚΥΝσοδοκίΗΰΜνΗςινΝ

АССА1ТААС5АААТСТАС»<5АССАСТ6ААСАТССААТГСАСТП13етТОСТТТ®ЗАААТС

ТООТААТТОСТТТЛЙАТ^ГСТСбТОАСТТСТАеетААСТСаикАССААСа^А^СТТТАС

Т1НВ1ГК₽1.»10РТЬ УСЬЕ1

ТООТССДЦ^ССАА{1АТТ1ХЗАТСАССаТТАСГТС1^ТАТСССАССАС^СТС113ССАТССТТС

--- ----+- —+--.— ----+---------* лсслсстгасттстАллстАСгетслм<алслслтл5ЭЗтситотс«ЗАСсатлс<з*лс

НЗЫООЬХТУТЗУЗНПТЬАЕГ бСТААСТССССТОАЛЛССбАССПКТвСЗТСЗССААСЗТСАТаЛТААСССТСАЛСтаСТС

---------+-----------___ +

ССАТТ«2АСССЗСАСТТТ(ХЮаХЗ(^<ЗАСОСА<Р:<ЗСТТССАаТАСТАТТСССАСГТОАССАС СММаЕТОЬЬККОЯНПИАаьь АссастАтсзАсттс(ис(зотаАТАСт<этаатстсссттАССУггазт<5ССАтстатсАА

---------+---------♦---------+—-----—+---------+---------+

ТЗОСОАТАеСТОААОСТбССАСТАТСАСААССАСАССОААТССААССАСсаТАСАСАаТТ

Т А I ОГО<ЗОТУСЬАУУ<ЗСМС(2

СТСАААСАТТСТАСТССТСТТАТССАО^ССАС^ТССССТАТТААССТОСТООТТОСТСТд

-------—₊---------+---------+--САСТТТСТААСАТСАССАСААТАОСТССТССГСАСССОАТААТТСОАСОАССААСОАСАС

Ь КНЗТСУХООНЗАТИЬЬУАЬ

АССАгаХАСАСОААСТаОТГСАТААССТа^А1Х^ССАСаАТ«Х^ССА(7ТСТСАС

ТС^АССОТ<ГКХ:ТТОАСССА(7ГА:Л^(^СССАТАСТТО?ТССТАССеГТССТСАСАСТС

ТМАНЁЬЙНЫЬСМЫНПСЫОСН ТССбСТССАААСТЧЗСТСТСТТАТОССТСОТАТССТСТССОАТСААСС^ТССАААСТСТТС

---------+— -----+---------+-----——>—-—-+---------+

АССЮСАССТТТОАССАСАСААТАСССАСЗАТАССАСАСОСТАСТТОСТАССТТ’ГСАСААС ССАЫЗСУМААМЬЗО ОРЗКЬР

ТСС^ТССТСТААОМЛСЗАСТАССЛеАССТТССТа^ССТТААСЛАСССОСАбТетАТС

---------------+- ——- +———---+——— —+-+

АссстсАселеАТГСтттсгатсетстасАлссАСТСОСААттс^ δϋΟδΚΚΟΥΟΤΡΕΤνΝΝΡΟΟί

ЫОС.1

I

СТОААСАААССбТААССЭЭССЕССАОСТТТСТАЕААСАААААСТСАТСГСАОААЗАббАТ

--- —---+ —---—---------+—-—-—-+------—-+

ОАСТТОТТТООСАТТССКСС^ОСТСОАААСАТСТТ^ХТГТГОАеТАеАвТСТГСТССТА

Ь М К Р - ААА5РЬЕ0КЬ13ЕЕ0

-9005944

СТОААТАОСССССТСОАССАТСА'ГСАТСАТСАТСАТТаАОТТГЗТАСССТТАСАСАТСАС --------- *-------------------*-------—+---------₊-------.,+ оасттатсосозсасстсстастастаотастастаастсааасатсссадтстотасто

Ьет5АУ0НННННМ*7С5ЬЯНС

ТСТТССТСАЕТТСААСОТ^САСТОАС^^САССССТСТТОСТАЗАТТСТААТСААЙ

---------4-----------+ --------+__________----------АСААЕ^ЗТСААСаГТСААСССЗ^ЗААТЗСТСТТСТСОССАСААССАТСТААСАТТАСТТС СЗЗУОУОНЬЙЕОЙЗС * I I/ I К

АСС»ТСТ^<^Т(КС^ТТТСССТОАС^(ЗАТ<ХЛС^ТГСАТ^^

ТССТАСАСТСТТАСЗСТАААССЮАСТСТСТАССГССОААОТАААААСТАТОААААААТАА

ССТАСА<ЗТСТТАСООТАААСб-5' ОНдо 2

КНЗЕСНЬ₽Е КСКЬНГ*УУГ1

Пример 2. Экспрессия ΝΑΤ в Р1сЫа раЧогк.

При попытках экспрессировать ДНК, кодирующую ΝΑΤ, предпринятых в Ε.εοίί, очень слабое раскручивание и требование разбавленных условий понижают эффективность очистки. Эти и другие соображения привели к использованию в качестве клеток-хозяев Р1сЫа раЧогк. вида дрожжей. Культуру выбранных клонов Р1сЫа раЧогк. которые были трансформированы при участии кДНК πρεπροΝΑΤ (3Εζ) Ю N0:4), инокулируют в 500 мл следующей культуральной среды для инокуляции:

На литр среды для одноразовой загрузки:

Дрожжевой экстракт	30,0 г
Двухосновный фосфат калия	17,2 г
Глюкоза	20,0 г
Биотин	0,004 г
Вода	До 1 л
Фосфорная кислота 85%	Для доведения рН до 6,00

Трансфицированные клетки Р. раЧогк инкубируют при 30°С в шюттель-аппарате в течение 30-32 часов. Около 1% (в/о) полученной культуры используют для того, чтобы инокулировать в 10-литровый ферментёр. Ферментёр содержит стерилизованные основные соли и глюкозу (см. ниже). После стерилизации ферментёра на литр загружаемой среды добавляют 12 мл на литр РТМ4 солей (РТМ4 представляет собой раствор со следами металлов, содержащий пентагидрат сульфата меди, иодид натрия, моногидрат сульфата марганца, дигидрат молибдата натрия, борную кислоту, гексагидрат хлорида кобальта, хлорид цинка, гептагидрат сульфата двухвалентного железа, й-биотин, серную кислоту и очищенную воду). Температура ферментационного роста составляет 30°С. Значение рН в ферментере - 600, регулируют с помощью гидроксида аммония и фосфорной кислоты. Цинк из добавляемых в среду цинковых солей, встраивается в ΝΑΤ как часть металлопротеиназной структуры.

Основные соли на литр загружаемой среды:

Фосфорная кислота, 85% 26,7 мл

Сульфат кальция 0,93г

Сульфат калия 18,2г

Сульфат магния - 7Н₂О 14,9г

Гидроксид калия 4,13г

Глюкоза 30,0г

Вода До 1 л

Партия культур выращивается до тех пор, пока глюкоза не израсходуется полностью (17-20 ч). Затем начинается стадия периодической подпитки. Среды стадии периодической подпитки состоят из глюкозы и 12 мл солей РТМ4 на литр. Индукционная подпитка состоит из глюкозы, 25% метанола и 12 мл РТМ4 солей на литр. При индукции температуру реактора изменяют до 20°С. Фаза индукции длится 6075 ч. Кондиционированные среды собирают и клеточный дебрис отбрасывают.

Пример 3. Очистка ΝΑΤ от Р1сЫа раЧогк.

Дрожжевой бульон (кондиционированные среды минус клеточный дебрис) из примера 2 осветляют и рН и проводимость доводят, соответственно, до 6,5 и 10-20 шЗ/см. Бульон наносят на иммобилизованную смолу со сродством к металлу, которая нагружена медью (Си) и уравновешена физиологическим раствором с фосфатным буфером (РВ8). Смолу промывают РВ8 и элюируют в градиенте имидазола (ΟΙ 00 мМ) в РВ8. Фракции, содержащие «зрелый» ΝΑΤ (8Εζ) Ю N0:1), собирают и разводят до тех пор, пока проводимость станет менее 1,5 ш8/сш, рН 6,4. Разбавленный пул наносят на смолу 8Р Зерйагоке (Ашегейаш Р11аппас1а Βίοΐεοίι, 1пс., РЕса1а\\ау. ΝΥ), которая уравновешена 10 мМ 2-(1\[-морфолино)этансульфоновой кислотой (МЕЗ). Колонку промывают МЕЗ и элюируют в градиенте №1С1 (0-500 мМ) в МЕЗ. Фракции, содержащие ΝΑΤ, собирают и хранят.

Пример 4. Тромболиз при остром тромбозе сонной артерии у крыс. Сравнение ΝΑΤ с урокиназой.

-10005944

Для того чтобы продемонстрировать, что «зрелый» ΝΑΤ (8Εζ) ГО N0:1) является биологически активным и функционально уникальным, проведены фармакологические исследования на крысах, у которых очаговое поражение одной из сонных артерий вызывают, подводя анодный ток. Это поражение вызывает окклюзивный тромбоз, образующийся обычно в течение пятнадцати минут. Когда тромб образовался, артерию наблюдают в течение тридцати минут, чтобы убедиться, что окклюзия сонной артерии устойчива. Затем внутривенно вводят гепарин и аспирин для предупреждения дальнейшего развития тромбоза. Затем проводят лечение животных с помощью внутриартериального вливания испытуемого вещества. Ток крови через сонную артерию контролируют в ходе доставки испытуемого материала так, чтобы успешный фибринолиз можно было обнаружить в момент, когда его можно заметить. Отмечают процент экспериментов, в которых происходит разрушение сгустка и групповые значения рассчитывают только для тех экспериментов, где лизис сгустка успешен. Для измерения геморрагического потенциала испытуемого вещества всю кровь, выделившуюся в месте хирургического вмешательства, собирают марлевыми тампонами. Тампоны помещают в раствор детергента для солюбилизации эритроцитов и выделения гемоглобина, который затем определяют количественно спектрофотометрически. Полученный гемоглобин используют для подсчёта объёма потерянной крови. Опытные данные приведены ниже в таблице.

Таблица 1. Частота фибринолиза, время до фибринолиза и хирургическая потеря крови (среднее ± станд.

отклонение)

	Частота лизиса (%)	Время до лизиса (мин.)	Потеря крови (мл)
Физиологический раствор (п=6)	0% (0 из 6)	Ν/Α	0,10 ±0,23
Урокиназа	33%	55,3	1,06
25 ед/мин (п=15)	(5 из 15)	± 15,9	±1,59
Урокиназа	86%	33,5	1,43
250 ед/мин (п-15)	(13 из 15)	± 15,3	± 1,45
ΝΑΤ 2 мг	78%	6,3	0,96
(п-14)	(11 из 14)	±5,8	±0,77

Эти исследования показывают, что ΝΑΤ биологически активен в отношении животных при фибринолизе. Кроме того, растворение тромба достигается в течение значительно более короткого времени и с меньшей потерей крови из «хирургического» участка по сравнению с урокиназой. Следовательно, профиль активности ΝΑΤ может отличаться от профиля активности тромболитических агентов класса активаторов плазминогена (представленных урокиназой) тем, что фибринолиз под действием ΝΑΤ происходит более быстро и с меньшими геморрагическими осложнениями.

Фибринолитическая активность ΝΑΤ сравнима с фибринолитической активностью фибролазы. Кроме того, как упоминалось выше, устойчивость Ν-конца ΝΑΤ даёт более гомогенный конечный продукт при рекомбинантной экспрессии, что имеет явное преимущество (то есть Ν-конец не изменяется во времени, приводя к смеси различных форм, и это делает полипептид более стабильным).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фибринолитически активный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность 8Εζ) ГО N0:1.
2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он получен рекомбинантной экспрессией в дрожжах.
3. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид 8Εζ) ГО N0:1.
4. Нуклеиновая кислота по п.З, отличающаяся тем, что она имеет последовательность 8Е0 ГО N0:4.
5. Вектор экспрессии, содержащий регуляторные элементы экспрессии, функционально связанные с нуклеиновой кислотой по п.З.
6. Вектор экспрессии по и.5, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0:4.
7. Линия прокариотических клеток-хозяев, трансформированная или трансфицированная вектором по п.5 или 6.
8. Линия эукариотических клеток-хозяев, трансформированная или трансфицированная вектором

-11 005944 по п.5 или 6.
9. Клетка-хозяин по п.8, отличающаяся тем, что она является дрожжевой клеткой.
10. Клетка-хозяин по п.9, отличающаяся тем, что она является клеткой Р1сЫа райогк.
11. Способ получения фибринолитически активной металлопротеиназы, заключающийся в культивировании клетки-хозяина, содержащей ДНК по п.3, функционально связанную с регуляторными элементами, стимулирующими её экспрессию в условиях экспрессии ДНК, и в выделении экспрессируемой металлопротеиназы из культуры клетки-хозяина.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что ДНК имеет последовательность 8ЕО ΙΌ N0:4.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что клетка-хозяин представляет собой дрожжевую клетку.
14. Способ по п.13, отличающийся тем, что дрожжевые клетки представляют собой клетки Р1сЫа района
15. Способ получения металлопротеиназного фибринолитического агента, заключающийся в культивировании клеток-хозяев Р1сЫа, содержащих ДНК по п.3, функционально связанную с регуляторными элементами, стимулирующими её экспрессию в условиях экспрессии ДНК, и выделение экспрессируемой металлопротеиназы из культуры клетки-хозяина.
16. Способ по п.15, отличающийся тем, что клетка-хозяин Р1сЫа представляет собой клетку РюЫа раЧогй.
17. Способ лечения тромбоза у млекопитающего, заключающийся во введении млекопитающему тромболитически эффективного количества полипептида по п.1.
18. Антитело против полипептида по п.1.
19. Антитело по п.18, отличающееся тем, что оно является моноклональным антителом.