BG60770B2 - съкратен човешки тъканен плазминогенен активатор - Google Patents

Abstract

Съкратен човешки тъканен плазминогенен активатор (т-па), състоящ се предимно от аминокиселини 69-527, произведен в значими количества по методите на рекомбинантната днк (рднк) технология. Изобретението се отнася до метод за производството на т-па без контаминантите, с които обикновено е свързан в неговата естествена клетъчна среда, за получаване на експресионни вектори и различни клетки гостоприемници.

Description

Представяното изобретение е за човешки плазминогенен активатор, съответстващ на този, който се намира в човешкия серум и/ или тъкани и за съединения и нововъведени форми като заместители, както и за способите и методите за неговото хомогенно произвеждане в терапевтично значими количества.

Изобретението произлиза отчасти от откритието за секвенцията на ДНК и в последствие и тези на аминокиселините на човешки плазминогенен активатор. Това откритие даде възможност за възпроизводството на човешки плазминогенен активатор посредством приложението на рекомбинантната ДНК технология, предлагаща условия за получаването на достатъчни количества материал за започването и провеждането на изпитания върху опитни животни и в клинични условия, като необходимо условие за получаване на разрешение за продажба, безвъзпрепятствано от необходимите ограничения, присъщи на методите за изолиране, използвани досега, включващи добиване и екстрахиране от съществуващи клетъчни култури.

Публикациите и другите материали, използвани за осветяване на произхода на изобретението, както и в отделни случаи за осигуряване на допълнителни детайли за неговото действие са приложени в библиографска справка и за удобство са номерирани и групирани в прибавената библиография.

А. Човешки тъканен плазминогенен активатор

Фибринолиотичната система на организма е в динамично равновесие с коагулационната система и двете поддържат нормалното състояние на кръвното русло. Коагулационната система отлага фибрин, като матрица служеща за възстановяване на хемостазния статус. Фибринолитичната система отстранява фибриновата мрежа, след като хемостатичното състояние е постигнато. Фибринолитичният процес се осъществява посредством протеолитичния ензим плазмин, който се получава от плазмения протеинов прекурсор плазминоген. Плазминогенът се превръща в плазмин посредством активация чрез активатор.

Понастоящем, в аптечната мрежа се предлагат два активатора, стрептокиназа и урокиназа. И двата са показни за лечение на остри съдови заболявания като миокарден инфаркт, белодробна емболия, тромбоза на дълбоките вени, запушване на периферните артерии и други венозни тромбози. Тези бо5 лести представляват голяма опасност за здравето на човека.

Етиологичната основа на тези заболявания показва при някои случаи частично, а най-често и пълно запушване на кръвоносния съд от кръвен съсирек - тромб или тромбоембол. Традиционната антикоагулантна терапия, като тази с хепарин и кумарин, не води до директно повишаване на разтварянето на тромбите или тромбоемболите. Тромболити15 чните агенти, споменати по-горе, стрептокиназа и урокиназа, имат широко и ефективно приложение. Но всеки един от тях има строги противопоказания. Те нямат висок афинитет към фибрина; следователно и двата антико20 агуланта активират циркулиращия и фибриносвързан плазминоген относително индискриминативно. Плазминът (или още фибринолизин), образуван в циркулиращата кръв, се неутрализира твърде бързо и губи тромбо25 литичните си качества. Остатъчният плазмин снижава някои коагулиращи фактори с белтъчен произход, като фибриноген, Фактор V и Фактор VIII, съставящи хеморагичния потенциал. В допълнение, стрептокиназата е силен антиген и пациентите с висок титър на антитела реагират неефективно на третиране и не могат да останат на продължително лечение. Урокиназната терапия е скъпа, дължаща се на нейното изолиране от човешка ури35 на или тъканни култури и това е причина да не е всеобщо възприета в клиничната практика. Урокиназата е била субект на много изследвания - виж справки 1-6.

Така наречените плазминогенни акти40 ватори са били изолирани от различни човешки тъкани, напр. от маточна тъкан, кръв, серум - виж справки 7-11, и от клетъчна култура спр. 94. Получените съединения са описани (справки 12, 13, 14-18). Плазминогенните активатори, произлезли от тези източници са били класифицирани в две големи групи: урокиназен тип плазминогенни активатори (уПА) и тъканен тип плазминогенни активатори (т-ПА), основаващи се на разликите в тех50 ните имунологични качества. (Абревиатурите у-ПА и т-ПА са предложени на XXVIII конгрес на Международния комитет по тромбоза и

I хемостаза, Бергамо, Италия, 27 юли 1982 г.).

Напоследък, беше идентифицирана човешка меланомна клетъчна линия, която секретира т-ПА. Изучаването на този меланомен плазминогенен активатор показва, че той не се различава имунологично и по състава на аминокиселинните съединения от плазминогенния активатор, изолиран от нормални тъканни клетки (справки 19, 88).

Продуктът беше изолиран в относително чиста форма, изучен и бе установено, че притежава качества на високо активен фибринолитичен агент (20).

Някои изследвания (справки 95-98), при които се използва т-ПА, пречистен от меланомна клетъчна линия доказват неговия висок афинитет към фибрина, в сравнение с урокиназния тип плазминогенни активатори. Поинтензивните проучвания на човешкия т-ПА като потенциален тромболитичен агент, обаче са били възпрепятствани от неговата екстремално ниска концентрация в кръвта, тъканните екстракти, съдовите перфузатори и клетъчните култури.

Беше възприето, че приложението на рекомбинантна ДНК и свързаните с нея технологии е най-ефективния способ за осигуряването на необходимите големи количества от високо качествен човешки тъканен плазминогенен активатор, основно пречистен от други човешки протеини. Такива материали ще покажат вероятно биоактивност, даваща достъп до клинично приложение при лечението на различни кардиоваскуларни състояния или болести.

Б. Технология за рекомбиниране на

ДНК

Технологията за рекомбиниране на ДНК е достигнала високи нива. Молекулярните биолози вече са в състояние да рекомбинират различни секвенции на ДНК с лекота, създавайки нови ДНК молекули, способни да продуцират копирани количества от екзогенни белтъчни продукти в трансформирани микроорганизми или клетъчни култури. Общите способи и методи се изразяват в ϊη νίίΓο лигиране на “лепливите” крайни фрагменти на ДНК, произвеждащи ефективни експресионни носители, пригодни за частично трансформиране на микроорганизми, като по този начин се направлява тяхната синтезираща способност до желан екзогенен продукт. Обаче, поради индивидуалните особености на изходните продукти, пътят си остава лъкатушещ и науката все още няма значим напредък. В действителност, този който предзнаменува ус5 пешни резултати без солидна експериментална основа, поема риск за провал.

Рекомбинацията на ДНК от есенциални елементи, т.е. локуса на репликация, на една или повече фенотипни селекционни харак10 теристики, експресионния промотор, хетероложния генен инсертор и остатъчния вектор, обикновено се извършва извън клетката гостоприемник. Полученият рекомбинантен репликантен експресионен носител или плазмид е въведен в клетките посредством трансформация, и големи количества от рекомбинантния носител се добиват от култивирания трансформант. Където генът е правилно инсертиран със спазване на сегментите, които регулират транскрипцията и транслацията на кодираната от ДНК информация, полученият генен експресор е годен действително да произвежда полипептидна секвенция, за която инсертирания ген дава кода, а процесът се опре25 деля като експресия на гена. Полученият продукт може да се добие чрез лизиране, ако е необходимо, на клетката гостоприемник, в микробиалната система и последващо подходящо пречистване от други белтъци.

В практиката, чрез използването на технология за рекомбиниране на ДНК могат да се експресират изцяло хетероложни полипептиди - т.н. директна експресия - или алтернативно може да се експресира хетероложен полипептид, синтезиран като сегмент от аминокиселинна секвенция на хомоложен полипептид. В последните случаи, очакваният биоактивен продукт понякога се оказва биоинактивиран при синтезирането, хомоложния/ хетероложния полипептид се раздробява в извънклетъчното пространство. Виж справки (21) и (22).

По един и същи начин са установени правилата на техниката за изследването на ге45 нетиката и клетъчната физиология както за клетъчни така и за тъканни култури. Известни са способите и методите за поддържането на перманентните клетъчни линии, подготвени от успешни серийни трансфери, от изолирани нормални клетки. За прилагане в изследванията, тези клетъчни линии се запазват върху твърда подложка в течна среда или чрез

I растеж в суспензия, съдържаща хранителни съставки. Увеличаването на добива за голямомащабни производства изглежда поставя за решаване само механични проблеми. Виж справки (23) и (24). 5

По същия начин, биохимичните качества на протеините се използват, като се прилагат в биотехнологиите. Клетките продуциращи желаният протеин произвеждат също стотици други протеини, ендогенни продукти на 10 клетъчния метаболизъм. Тези контаминиращи протеини, а също и други съединения, ако не бъдат отстранени от желания протеин, могат да се проявят като токсини, ако се приложат на животни или хора в хода на терапевтичния 15 курс с желания протеин. Техниката на белтъчната биохимия предлага възможност за сепарационни процедури подходящи за съответните системи за получаването на хомогенни продукти, годни за употреба. Белтъчната би- 20 охимия потвърждава идентичността на желания продукт и обезпечава достоверността на продукцията, без алтерации или мутации. Този клон на науката включва и създаване на лекарствени средства, предварителни изследва- 25 ния и други необходими процедури за изпълнение преди успешните клинични изпитания.

Представяното изобретение се базира на откритието, че технологията за рекомбиниране на ДНК може успешно да се използва за 30 производство на човешки тъканен плазминогенен активатор (т-ПА), за предпочитане по директен способ, и в количества достатъчни за започване и провеждане на изпитания върху опитни животни, както и клинични 35 тествания, като задължителни преди продажба. Полученият човешки т-ПА е годен за приложение, във всички негови форми, за профилактиката или лечението на човешки същества при различните кардиоваскуларни състо- 40 яния или заболявания. Затова, предлаганото изобретение, в един много важен аспект, е предложено като метод за лечение на съдови болести при хората чрез приложението на тПА и за съответните негови фармацевтични 45 форми.

Представяното изобретение обхваща есенциално чист човешки тъканен плазминогенен активатор. Продуктът се произвежда чрез генно инженерство от микроорганизми или сис- 50 теми от клетъчни култури и осигурява възможности за производството на човешки тъканен плазминогенен активатор по един твърде ефикасен способ. В допълнение, в зависимост от клетката гостоприемник, човешкият тъканен плазминогенен активатор, може да съдържа асоциирани гликосилати в по-малка или по-голяма степен в сравнение с естествения продукт. Във всеки случай, Т-ПА не съдържа контаминантите, с които обикновено е свързан в клетъчната среда.

Представяното изобретение се отнася и за репликационни ДНК експресори носители, носещи генни структури за кода на човешки тъканен плазминогенен активатор в експресивна форма, за колонии от микроорганизми или клетъчни култури трансформирани с тях или за микробиални или клетъчни култури от така трансформираните колонии или култури, способни да продуцират човешкия тъканен плазминогенен активатор. В тези аспекти, това изобретение е насочено към различни процеси за получаване на генни секвенции, ДНК експресивни носители, колонии от микроорганизмови щамове и клетъчни култури и специфични формирования. Освен това изобретението включва и получаване на ферментационни култури от споменатите микроорганизми или клетъчни култури.

Фигура 1 показва 10% натриев додецилсулфатен полиакриламиден гел електрофорезиран от ³¹8-метионин маркирани протеини, преципитиран с анти т-ПА имуноглобулин О секретиран от меланомни клетки с или без протеазен инхибитор.

Фигура 2 показва електрофореза на имунопреципитирани транслационни продукти от фракции на матрична рибонуклеинова киселина (мР Η К), получени от меланомни клетки.

Фигура 3 показва хибридизационен модел на 96 бактериални колонии, трансформирани с ДНК, с помощта на депото от ³²Рмаркирана 14-тег като сонда, изготвена основно от 5 аминокиселинна секвенция на човешкия т-ПА.

Фигура 4 е карта на ендонуклеазна рестрикция на пълната дължина на човешки тПА кДНК.

Фигури 5а, 5Ь и 5с показват нуклеотидната секвенция и извлечената аминокиселинна секвенция на пълната дължина на човешки т-ПА кДНК.

I

Фигура 6 е схематична конструкция на експресивния плазмид рбекаК1РА”.

Фигура 7 показва резултатите от анализа на фибринов слой за фибринолитична активност на клетки на Е.соН, трансформирани с рбекаК1РА”.

Фигура 8 е ТХВН (течна хроматография с високо налягане) запис на пептидите на човешкия т-ПА от храносмилателния ензим трипсин.

Фигура 9 показва конструкцията на плазмид, кодиран за директна експресия на зрял човешки т-ПА в (Е.соН).

Фигура 10 показва резултатите от проба фибринов слой, тестувана за фибринолитичната активност на човешкия т-ПА, произведен от Е.соН.

Фигура 11 показва конструкцията на ДХФР (мутант/или неповлиян див тип) /тПА кодиран плазмид, подходящ за трансформиране върху клетъчна култура от тъкан от бозайник.

Фигура 12 е схематична диаграма на човешки тъканен плазминогенен активатор, получен чрез илюстрирания метод в Е. 1.

А. Дефиниции

Както е използван тук, “човешки тъканен плазминогенен активатор” или “човешки т-ПА” или “т-ПА” означава неприсъщ човешки (тъканен тип) плазминогенен активатор, произведен от системи от микробиални или клетъчни култури в биоактивни форми, включващи протеазни части и кореспондиращи с тези тъканни плазминогенни активатори, в други случаи естествени за човешка тъкан. Човешкият тъканен плазминогенен активаторен протеин, получен в това изобретение, е бил определен посредством детерминиран ДНК ген и свързаната с това аминокиселинна секвенция. Разбираемо е, че природни алелни вариации съществуват и попадат от индивид на индивид. Тези вариации могат да бъдат демонстрирани посредством аминокиселинната/ аминокиселинните разлика/и във всеобщата секвенция или чрез делеции, замествания, инсерции, инверсии или прибавяне на аминокиселина/и в гореспоменатата секвенция. В допълнение локацията и степента на гликозилация ще зависят от природата на средата около клетката гостоприемник.

Потенциалът, който се крие в прилагането на технология за рекомбиниране на ДНК, за получаване на производни на различни човешки тъканни плазминогенни активатори, може да се видоизменя различно, в резултат на единично или множествени замествания с аминокиселини, делеции, прибавяния или замествания, например, посредством участък с управлявана мутагенеза на ДНК. Това може да бъде осъществено чрез приготвяне на производни, съхраняващи есенциален “кпп£1е” участък или от участък на серин. Всички такива алелни вариации или промени водещи до деривати на човешкия тъканен плазминогенен активатор са включени в обхвата на това изобретение, както и други подобни човешки несвойствени (тъканен тип) плазминогенни активатори, с подобни физични и биологични качества. Човешкия тъканен плазминогенен активатор е приготвен (1), като се използва за първата му аминокиселина метионинът или (2), където метионинът е интраили екстрацелуларно разграден, за да се използва неговата по правило първа аминокиселина, или (3) заедно с друг негов характерен полипептид или конюгиран протеин, вместо конвенциалния характерен полипептид, като последният и конюгираният специфично се разграждат в интра- или ектрацелуларното пространство (виж справка 21), или (4) посредством директна експресия на зряла форма без необходимостта от разграждане на всеки несвойствен и ненужен полипептид. Последният способ е особен важен, когато клетката гостоприемник не може или не може ефикасно да отстрани характерния пептид, когато експресивния носител е насочен да експресира тьканния плазминогенен активатор заедно с неговия характерен пептид. Във всеки случай така произведения човешки т-ПА, в неговите различни форми, е извлечен и пречистен до ниво, подходящо за приложение за лечение на много съдови състояния и болести.

Освен това, т-ПА притежава форми, които включват протеин с една верига (1-верига) и двуверижен протеин (2-вериги). Последният е протеолитично произлязъл от едноверижно съединение. От теорията се знае, че двуверижния протеин е асоцииран с получен фибрин и тази протеолитична конверсия от едноверижен до двуверижен компонент се извършва в локуса на конверсията на плазминогена до плазмин. Представяното изобретение изхожда от предложението за изпълне5

I ние от 1-верижен протеин, както бе описано, или за изпълнение от 2-верижен протеин, както бе показано, че е възможно. 2-верижният протеин може да бъде получен ин витро от конверсия, след получаването 1 -верижния протеинов продукт. Така наречената “Κιϊηβίε” област е позиционирана срещупосочно на участъка на серина и се предполага, че играе важна роля в свързването на тъканния плазминогенен активатор за фибриновата матрица; следователно наблюдаваната специфична активност на представяният такънен плазминогенен активатор е реално съществуваща по отношение на тромби. Тъканният плазминогенен активатор съдържа ензимно активни участъци, кореспондиращи към природния продукт и терминът човешки тъканен плазминогенен активатор дефинира продукти, включващи такива самостоятелни участъци или заедно с допълнителни аминокиселинни секвенции по цялото протежение на молекулата.

Обобщено казано, представяният с това изобретение човешки т-ПА има функционална дефиниция; това е способност да катализира конверсията от плазминоген до плазмин, да свързва фибрина и е квалифициран като тПА, основаващ се на горепосочените имунологични свойства.

“Есенциална чиста форма” се използва за да се опише това състояние на т-ПА, получен по способи на изобретението и очистен от протеин или вещества, обикновено асоциирани с т-ПА, когато е продуциран от нерекомбинантни клетки, т.е. в неговата “естествена” среда.

“ДХФР-протеин” означава протеин (белтък), притежаващ свойства за активна асоциация с Ди-Хидро-Фолат Редуктаза, и който се продуцира от клетки, способни да живеят в среда, дефицитна на Хипоксантин, Глицин и Тимидин (-ХГТ среда). Най-общо, клетки изпитващи недостиг на ДХФР протеин са неспособни да растат в такава среда, а клетки, съдържащи ДХФР протеини дават растеж.

“Клетки чувствителни на МТХ” се отнася за клетки, които са неспособни да дават растеж в среда, съдържаща ДХФР инхибитора метотрексат (МТХ). И така “клетки чувствителни на МТХ” са клетки, които, освен генетично променените или други добавки, няма да прораснат в среда, подходяща за растеж, когато концентрацията на МТХ е 0,2 μβ/ιηΐ или повече. Някои клетки, като бактерии, не демонстрират МТХ чувствителност поради непропускливостта си за МТХ през клетъчната мембрана, въпреки че те съдържат ДХФР 5 протеин. Най-общо, клетки, съдържащи подобен ДХФР протеин, ще са чувствителни към метотрексат ако са проницаеми за МТХ.

“Див тип” ДХФР” се отнася за дихидрофолат редуктаза, която обикновено се сре10 ща в отделни организми. Дивият тип ДХФР обикновено е чувствителен ΐη νϊίτο на ниски концентрации на метотрексат (МТХ).

“ДХФР протеин” с нисък афинитет на свързване с МТХ” има функционална 15 дефиниция. Това е ДХФР протеин, който когато е генериран в клетки, дава възможност за растеж на клетки, чувствителни на МТХ, в среда, съдържаща поне 0,2 μβ/πιΐ или повече от МТХ. Известно е, че такава дефиниция зависи от способността с която организма продуцира ДХФР протеин” с нисък афинитет на свързване с МТХ”. Но, както е употребено в контекста на това изобретение, като равновесие между тези два механизма, няма да се поражда безпокойство. Изобретението работи, като се съобразява с определените нива на МТХ, и не е резултатно, когато е под влияние увеличената експресия, и в допълнение на вродената природа на продуцирания ДХФР. Конвенциалният ДХФР протеин, който е подходящ за тази дефиниция е описан в и.5.Арр1.5?ег. Νο 459 151, подадена на 19 януари 1983.

“Експресивен вектор” се отнася за векторите които са в състояние да експресират секвенциите на ДНК, където последните са функционално свързани с други секвенции, способни да избират тяхната експресия. Предполага се, въпреки, че не е установено точно, че тези експресионни вектори могат да репликират в организма гостоприемник също като епизомите или като интегрална част от хромозомната ДНК. Ясна неспособност за репликабилност ще ги представя като ефективно бездействащи. Накратко, “експресивен вектор” има функционална дефиниция и всяка ДНК секвенция, която е способна за ефективна експресия на точно определена ДНК кодова конфигурация е включена в този термин, като се прилага за специфична секвенция. Най-общо казано, експресивните вектори при приложението на техниките за

I рекомбиниране на ДНК са често под формата на “плазмиди”, което се отнася за двойно спиралните структури на ДНК, които в техните векторни форми не са свързани с хромозомата. В представяната спецификация, “плазмид” и “вектор” са използвани взаимозаменяемо, като плазмид е по-често прилаганата форма от вектор. Обаче, в изобретението се възнамерява да бъдат включени такива други форми на експресивни вектори, които осигуряват еквивалентни функции и които стават вече достъпни за употреба.

“Рекомбинантни клетки гостоприемници” се отнася за клетки, които са били трансформирани с конструктивни вектори с прилагането на техника за рекомбинация на ДНК. Както бе дефинирано, т-ПА е произведен в количества, постигнати благодарение на тази трансформация, значително по-малки от количествата, които биха били получени от нетрансформирани гостоприемници. т-ПА получен от такива клетки може да бъде определен като “рекомбинантен т-ПА”.

Б. Култури от клетки гостоприемници и вектори

Векторите и откритите от изобретението методи са подходящи за използване в клетки гостоприемници от широк кръг от прокариотни и еукариотни организми.

Най-общо, прокариотите са за предпочитане, поради клониране на ДНК секвенции в конструирането на векторите, прилагани в изобретението. Например, Е.соН К12 щам 294 (АТСС Νο 31446) е специално прилаган. Други микробиални щамове, които могат да бъдат използвани включват Е.соН щамове, като Е.соН В, Е.соН Х1776 (АТСС Νο 31537). Тези примери разбира се, са предназначени по-скоро да илюстрират, отколкото да ограничават.

Прокариотите също могат да бъдат използвани за експресия. Гореупоменатите щамове, а също така и Е.соН \¥3110 (Ρ-, λ прототропен, АТСС Νο 27325) бацили като ВасШих 5иЪН1и$, и други ентеробактерии като 5а1топе11а 1ур1птипит или ЗеггаНа тагсезсепз и различни видове рхеийотапаз също могат да бъдат използвани.

Плазмидите, най-общо, съдържат репликон и контролни структури, са извлечени от видове, съвместими с клетката гостоприемник и се използват заедно с тези гостоприемници. Векторът обикновено носи репликационния участък, също като маркираните структури, които са способни да обезпечат фенотипната селекция в трансформираните клетки. Например, Е.соН е типично трансформирана използвайки рВК322, а плазмида произлиза от разновидност на Е.соН (ВоПуаг, е1 а!., Сепе 2: 95 (1977). рВК322 съдържа гени резистентни на ампицилин и тетрациклин и така обезпечава всички способи за идентифициране на трансформирани клетки. Плазмидът рВК322 или друг микробиален плазмид, трябва също да съдържа или бива видоизменен да съдържа, промотори, които може да бъдат използвани от микробиалния организъм за експресия на неговите собствени протеини. Тези промотори най-често се използват при рекомбинантни ДНК секвенции, включващи/? -лактамаза (пеницилиназа) и лактозна промоторни системи (СЬап£ е1 ак, №1иге, 275: 617 (1978); Вакига е!ак, 5>с1епсе, 198:1056 (1977); (Οοεάάεΐ, е( ак, ИаШге 281:544 (1979)) и триптофананова (трп) промоторна система (ΟοεάάεΙ, е1 ак Νυείεϊε Αεΐάδ Кез., 8:4057 (1980); ЕРО Арр1, РиЬк Νο 0036776). Докато тези са най-често прилаганите, други микробиални промотори са били открити и използвани, и подробностите относно техните нуклеотидни структури са били публикувани, давайки възможност на квалифицираните специалисти да ги свържат функционално с плазмидните вектори (δϊεΠεηΙίδΐ, е1 ак, СеИ 20:269 (1980)).

В допълнение, освен прокариотни и еукариотни микроби също и култури от дрожди могат да се използват. ЗассЬаготусез сегеУ1$1ае или обикновената мая за хляб са най-честите използвани видове сред еукариотните микроорганизми, въпреки, че голям брой други щамове са обикновено на разположение. За експресия в ЗассЬаготусек, плазмидът ΥΕρ7, например, (8ПпсПсотЬ, е( а1, ИаШге, 282:39 (1979); Кшехтап е! а1, Сепе, 7:141 (1979); ТсхсЬетрег е1 а1, Сепе, 10:157 (1980) е използван обикновено. Този плазмид съдържа τρπΐ ген, който осигурява селекционен маркер за мутантен щам от дрожди, не притежаващ способност за растеж в триптофан, например, АТСС Νο 44076 или РЕР4-1 Сопех, СепеПсх, 85:12 (1977)). Наличието на лезия на τρπΐ като характеристика на генома на гостоприемника дрожда осигурява ефективна среда за откриване трансформации при растеж в

I отсъствие на триптофан.

Подходящи структури в дрождени вектори включват промоторите за 3-фосфоглицерат киназа (Нкгетап, е! ак, 1. ВюкСЬет., 255: 12073 (1980) или други гликолитични ензими (Некз. е( ак Ι.Αάν. Епгуте Ке§., 7:148 (1968): Но11апс1, е1 ак, ВюсЬепт1гу, 17: 4900 (1978) такива като енолаза, глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, фосфофруктокиназа, хексокиназа, пируват декорбоксилаза, гликозо-6фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триозафосфат изомераза, фосфоглюкозо изомераза, глюкокиназа. В създадените подходящи експресивни плазмиди, определените структури са асоциирани с тези гени, които са свързани в експресионен вектор 3 от секвенцията за експресиране, за да се постигне полиаденилация на мРНК. Други промотори, които имат допълнителни предимства като транскрипция, контролираща условията на растеж, са промоторните региони за алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, разграждащи ензими имащи отношение към азотния метаболизъм, и гореспоменатите глицералдехид-3-фосфата дехидрогеназа, и ензими, отговорни за усвояването на малтозата и галактозата (НоНапб). Всеки плазмиден вектор съдържащ подходящ за дрожди промотор, локус за репликация и терминационен край на секвенцията е подходящ за използване.

В допълнение на микроорганизмите, клетъчни култури, получени от многоклетъчни организми също могат да бъдат използвани за гостоприемници. По принцип, всяка такава клетъчна култура е подходяща, в зависимост от това дали е вертебрална или инвертебрална култура. Обаче, интересът би бил най-голям за вертебрални клетки и пропагацията на такива клетки в култура (тъканна култура) е станала рутинна процедура в последните години (Τίκδίιε Си1Шге, Асабеппс Ргекх, Кгизе РаИегзоп, ебИогз (1973)). Примери за такива използваеми линии от клетки гостоприемници са УЕКО и НеЬа клетъчни линии, клетъчни линии от овариални клетки на китайски хамстер (СНО) и \У138, ВНК, СО8-7 и ΜϋΟΚ клетъчни линии. Експресионните вектори за такива клетки обикновено включват (ако е необходимо) локус за репликация, промотор локализиран срещу гена за експресиране, места за привързване към съответна рибозома, места за свързване по РНК, полиаденилационен участък и транскрипционални терминаторни секвенции.

За приложение в клетки от бозайници, 5 контролните функции на експресионните вектори често се осигуряват посредством вирусен материал. Например, често прилаганите промотори са извлечени от ро1уоша, Αάεηονϊηιχ 2 и най-често 31ппап Уйиз 40 (8У40). Ранните 10 и късните промотори от вирус 8У40 са специално използвани, понеже се извличат лесно от вируса като фрагмент, който също съдържа 8У40 вирусен локус за репликация (Пегз, е! а1, Ка1иге, 273: 113 (1978). По-мал15 ки или по-големи фрагменти от 8У40 също могат да бъдат използвани, получените така включват приблизително 250 Ьр секвенции, удължени от област Ηΐηά III, срещу В§1 I локализирани във вирусния локус на репликация. Освен това, също е възможно, а често и желателно, да се използва промотор или контролна секвенция, обикновено асоциирана с желаната генна секвенция, като получените така контролни секвенции са съвместими с клетъчните системи на гостоприемника.

Локус за репликация може да бъде обезпечен също чрез конструкция на вектор с включване на екзогенен вектор, такъв може да бъде извлечен от 8У40 или друг вирусен (Ро1уота, Αάεηο УЗУ ВРУ и т.н.) източник, или може да бъде получен от клетка гостоприемник с хромозомен репликационен механизъм. Ако векторът е интегриран в хромозома на клетката гостоприемник, последният е често подходящ.

При избора на предпочитана клетка гостоприемник за трансфекция от векторите от изобретението, които обхващат ДНК секвенция, кодираща двата протеина на т-ПА и ДХФР, подходящо е да се подбере гостоприемника според типа на използвания протеин ДХФР. Ако е използван “див тип” ДХФР протеин, за предпочитане е да се избере клетка гостоприемник, която е инсуфициентна по отношение на ДХФР, което позволява използването на ДХФР кодова секвенция като маркер за успешна трансфекция в селектираната среда, която не притежава хипоксантин, глицин и тимидин. Подходяща клетка гостоприемник в тези случаи е клетъчна линия от яйчник от китайски хамстер (СНО), дефицитна на ДХФР, направена и разпространена като

I описаната от 1)г1аиЬ и СЬа$1п (Ргос.МаН. Аад. Асп, и$А 77:4216 1980), вмъкната в библиографската справка.

От друга страна, ако ДХФР протеин с нисък афинитет на свързване с МТХ, се използва като контролна секвенция, не е необходимо да се прилагат клетки, дефицитни на ДХФР. Поради това, че мутантът ДХФР е резистентен на метотраксат, МТХ съдържаща среда може да бъде използвана като средство за селекция, подбрано така, че клетките гостоприемници са сами по себе си сензитивни на метотраксат. Много еукариотни клетки, които са в състояние да абсорбират МТХ, са сензитивни към метотрексат. Една такава клетъчна линия е тази на СНО, СНО-К1 АТСС Νο ССЬ 61.

Опити, които са посочени по-нататък, описват използването на Е.соН, с лак и трп промоторни системи и използването на СНО клетки като клетки гостоприемници и експресионни вектори, които включват 8У40 локус на репликация като промотор. Обаче, добре би било да се използват аналожни техники за конструиране на експресивни вектори за експресия на желаните протеинови структури в алтернативни прокариотни или еукариотни култури на клетки гостоприемници.

Задоволителни количества от т-ПА са произведени от клетъчни култури, но по-късните подобрения, използващи вторични кодови секвенции, предлагат увеличение на нивата на производство. Вторичната кодова секвенция включва дихидрофолат редуктаза (ДХФР), която е третирана с външен контролен параметър, като метотрексат, и това позволява контрол на експресията посредством контролът на концентрацията на метотрексата (МТХ).

В. Използвани методи

Ако използваните клетки гостоприемници са без труднопропускливи клетъчни бариерни мембрани, трансфекцията се осъществява посредством метода на преципитация на калциев фосфат, както е описан от СгаНат и Уап дег ЕЬ, 52:456 (1973). Но могат да бъдат прилагани и други методи за интродукция на ДНК, като нуклеарно инжектиране или протопластна фузия.

Ако се използват прокариотни клетки или клетки, съдържащи субстанциална клетъчна стена, предпочитаният метод за трансфекция е третиране с калций, посредством калциев хлорид, както е описано от СоЬеп, Е. е! а1. Ργοο.ΝηΙΙ. Асад. 5α. (ΙΙ5Α), 69:2110 (1972).

За конструиране на подходящи вектори, съдържащи желания код и контролни секвенции, се използва стандартна техника за лигиране. Изолирани плазмиди или фрагменти от ДНК се разграждат, прикрепват и повторно лигират в желаните форми към формите, налагани от плазмидите. Разграждането се извършва с рестрикционен ензим (ензими) в подходящ буфер. Изобщо, около 1 μ% плазмид или фрагменти от ДНК се прилагат с 1 единица от ензима в около 20 μ\ от буферния разтвор. (Производителите предлагат подходящи буфери и субстрати за специалните рестрикционни ензими). Прието е времето за инкубация да е 1 час при 37°С. След приключването на инкубацията, протеинът се отстранява чрез екстракция с фенол и хлороформ и нуклеиновата киселина се възстановява от водната фракция посредством преципитация с етанол.

Ако се изискват “Ь1ип1” краища, препаратът се третира за 15 минути при 15°С с 10 единици полимераза I (Κίεηονν), фенол-хлороформ за екстракция и етанол за преципитация.

Размерите на сепарация на разградените фрагменти се осъществяват с 6 процентен полиакриламиден гел, описан от Соедде1, ϋ. е! а1, Νυείείε Астдз Кез, 8:4057 (1980), и отбелязан в библиографската справка.

За лигиране на приблизително еквимоларни количества от желаните компоненти, съвместими за обезпечаването на точно съответствие се третират с около 10 единици Т4 ДНК лигаза на 0,5 μ& ДНК. (Когато разцепените вектори се използват като компоненти, става възможно използването, за възпрепятстване на повторното лигиране, на разцепените вектори посредством предварително третиране с бактериална алкална фосфатаза).

За анализа, за утвърждаване коректността на секвенцията на плазмидите, лигиращите микстури се прилагат за трансформация на Е.соН К12 щам 294 (АТСС 31446) и трансформанти, подбрани за атркНШп или 1е1гасусНпе резистентност, където е подходящо. Получени са плазмиди от трансформанти, анализирани посредством рестрикция и/или съчетаване на метода на Мез51П8, е( а1, ΝικΙείε

I

Ααάχ. Ке$. 9:309 (1981) или чрез метода на Махат, е! ак ΜείΗοόκ ΐη Епгутою^у, 65:499 (1980).

Амплификация на ДХФР протеинови кодови секвенции е осъществена от растящи клетъчни култури-гостоприемници в среда приблизително на 20-500 000 пМ концентрация на метотрексат, подходящ инхибитор на активността на ДХФР. Ефективната област на концентрация е силно зависима, разбира се, от природата на гена на ДХФР, протеина и характеристиките на клетката-гостоприемник. Ясно е, че всеобщо дефинирани горни или долни лимити не могат да бъдат установени. Подходящи концентрации на други аналози на фолиева киселина или други съединения, които инхибират ДХФР, също могат да се прилагат. МТХ обаче е удобна и ефективна за употреба.

Г. Общо описание на предпочитаните изпълнения на изобретението

Човешкият тъканен плазминогенен активатор беше получен съгласно следния протокол:

1. Човешки меланомни клетки, активно продуциращи тъканен плазминогенен активатор бяха култивирани чрез сливане.

2. Клетъчни гранули от такива клетъчни култури бяха екстрахирани в присъствието на рибонуклеазни инхибитори за изолиране на цялата цитоплазмена РНК.

3. Олиго-άΤ колона изолира цялата матрична (информационна) РНК (мРНК) в полиаденилна форма. Тази мРНК беше размерно фракционирана с електрофореза на гел от кисела урейна агораза.

4. Гел-фракцията, съдържаща специфична РНК за тъканния плазминогенен активатор беше идентифицирана по следния способ: РНК от всяка от гел фракциите беше транслирана в заешки ретикулоцитен лизат ϊη νΐίτο с прибавяне на микрозоми от кучешки панкреас. Получените транслационни продукти бяха имунопреципитирани със специфично ΙβΟ антитяло.

5. Подходящата РНК (21 до 248) беше конвертирана с кореспондиращата еднонишкова комплиментарна ДНК (кДНК) от която беше получена двойнонишкова кДНК. След поли -6С прибавяне, последният беше инсертиран във вектор, като плазмид носещ един или повече фенотипни маркери.

6. Така получените вектори са използвани за трансформиране на бактериални клетки, обезпечаващи клонална кДНК библиотека. Фонд от радиобелязани синтети5 чени дезокси олигонуклеотиди комплиментарни за кодони за известни аминокиселинни секвенции в т-ПА, като например фондът от 814-тег5.

А А С

5' -дТС( )СА( )ТА ( )ТСССА-3 “

С С Т (комплиментарна за секвенции, коди15 ращи за известна п-1п1га-аминокиселинна секвенция: триптофан-глутаминова киселина -тирозин-цистеин-аспарагинова киселина (№Ε-Υ-Οϋ) беше получена и използвана да сондира библиотеката от колонии.

7. От позитивни кДНК клонове, беше изолиран и структуриран плазмид ДНК.

8. Структурирана ДНК, кодираща т-ПА след това беше прибавена ϊη νΐίτο за инсерция към подходящ експресионен носител, който беше използван да трансформира подходяща клетка гостоприемник, която да прорасне в клетъчна култура и произведе желания човешки тъканен плазминогенен активатор.

9. Така произведен, човешкия тъканен плазминогенен активатор има 251 аминокиселини в неговия ензимен серии - протеаза участък и “кпп£1е” съдържаща структура, за която се предполага, че има отношение към фибриновото свързване.

Гореописаната процедура е ефективна за получаването на чист т-ПА. Методи от изобретението използващи допълнителна кодова секвенция, чувствителна на метотраксат, позволяват продукцията в култури от клетки гостоприемници на т-ПА с антигенна активност, в количества по-големи от 0,1 р§ от клетка на ден. С подходяща апликация на усилващи условия, може да бъде достигнат добив по-голям от 20 р£ на ден от клетка.

Поставени в алтернативни условия, гениите експресионни нива постигат продукция от повече от 9 х 10‘⁶ РЕ (Рюи^Ь ипйз) от една клетка за ден, а с подходяща амплификация, повече от 18 χ 10’⁴ РЕ от клетка на ден т-ПА може да бъде произведен.

Предимствата, получени в такъв аспект, са в изобретяването на метотрексат, като

I препарат, който нормално е фатален за клетъчното усвояване, и прави възможен клетъчния растеж в среда на контролирани нива на МТХ, посредством ампфликация на генът, кодиран за ДХФР кодова структура (ЗсГптке, КоЪеП Т. е!а!,, δεΐεηεε 202:1051 (1978); ШесИег, Л.Ь. е! а1, Сапсег Кез. 32:153 (1972); СЬап£, δ.Е.е! а1, СеП 7:391 (1976)).

Важността на този аспект на изобретението показва, че амплификацията на гена на ДХФР може да причинява амплификация на асоциирани секвенции, които кодират други протеини. Това се среща в случая, когато асоциирания протеин е хепатит В повърхностен антиген (НВхА®) (СЬпхйпап.Л. е! а1, Ргос.

АсаО. 5съ, 79: 1815 (1982); протеин от Е.соИ ХСРКТ (Кдп£оМ, СогПоп, е! а1, 1.Мо1ес.ап<1 АрркСеп., 1:165 (1981)); и ендогенни секвенции от ДХФР/ЗУ40 плазмидна комбинация (КаиРтап, К.Р. е! а1., ί.ΜοΙεσ. ΒίοΙ. 159:601 (1982)).

Други механизми, отнасящи се за резистентността на метотрексата, включват намаляване на свързващия афинитет на протеина ДХФР, така, че той е по-малко възприемчив към метотрексат (ΡΗηίοίί. \ν.Ρ. е! а!, 8отак СеП СепеС 2:245 (1976).

Беше установено че двата гена на “дивия” тип ДХФР и за протеин ДХФР, който е резистентен към МТХ, благодарение на своя собствен намален капацитет за свързване са амплифицирани от присъствието на МТХ. По принцип, този аспект на изобретението се отнася за използването на амплификационното влияние на структурата на ДХФР върху асоциираните протеинови кодови секвенции за осигуряване на контролен механизъм, който позволява повишение на експресионните нива на т-ПА секвенции, в присъствието на МТХ или благодарение на предшестващо третиране на трансформирани клетки с МТХ.

Е. Примери

Следващите примери са предназначени да илюстрират, но не и да лимитират изобретението. В тези опити култури от Е.соИ и СНО клетъчни линии, подходящи за вида на протеина ДХФР кодова секвенция, бяха използвани като клетъчни култури - гостоприемници. Обаче, също и други еукариотни и прокариотни клетки са подходящи за методите на изобретението.

Е.1 Експресия на гена на човешкия т50

ПА в Е.соИ

Е.1.А Легенда към фигурите

Фиг. 1 е авторадиограма на δϋδ РАОЕ - 10% натриев додецилсулфатен полиакри5 ламиден електрофорезиран гел изразен чрез имунопреципитиран [³⁵δ] - метионин - маркирани (и) протеини(и), секретира(и) от човешки меланомни клетки в продължение на 3 часа ΐη νϊνο, в присъствието (полоса Ь) или при отсъствието (полоса а) на протеазния инхибитор апротинин. След имунопреципитация с тъканен плазминогенен активатор специфичен ΙβΟ, три полоси бяла наблюдавани (полоса а), с молекулни тегла приблизително около

65000, 63000 и 35000. В присъствието на протеазен инхибитор, обаче, видове с 35 000 молекулно тегло не бяха наблюдавани. Когато е използван преимунен серум (полоса с) продукти не бяха имунопреципитирани. В ляво от полоса а са показани преходите и молекулните тегла на протеинови стандарти, маркирани с ^ИС.

Фигура 2 изобразява гел имунофорезата на имунопреципитирани транслационни продукти от РНК фракции, изолирани от гел на кисела урейна агароза. Голяма полоса беше наблюдавана във фракции с номера 7 и 8 след транслация в присъствието на кучешки панкреасни микрозоми, следвана от имуноп30 реципитация с тъканен плазминогенен активатор специфичен ΙβΟ. Тази полоса има молекулярно тегло 63000 далтона. Размерът на мРНК мигрираща във фракции 7 и 8 е приблизително 21 до 248. Позициите на рибозо35 малните РНК маркери които бяха детерминирани след електрофореза на РНК уреа гел и визуализирани посредством етаниден бромид са обозначени над съответната гел полоса.

Фиг. 3 представя хибридизационният модел на 96 бактериални колонии с

А А С

Р-сГГС( )СА( )ТА( )ТСССА(\УЕУ-С-О) сонда ССТ индивидуални трансформанти прораснаха в микротитрова хранителна среда, микроорганизмов препечатък на нитроцелулозна мембрана. Колониите след това бяха лизирани, бактериалната ДНК фиксирана и филтрите бяха хибридизирани със сонди на ³²Р-14-тег (\ν-Ε-Υ-Ό-ϋ). Филтрите бяха про11

I мити за отстраняване на нехибридизираната проба и експозирани върху рентгенов филм. Тази авторадиограма е представителна за конфигурациите, получени с 48 индивидуални филтъра (4600 отделни колонии). Пример за положителен тъканен плазминогенен активаторен кДНК клон върху филтър с номер 25, е обозначен като Е10 (стрелка).

Фигура 4 е карта на ендонуклеазната рестрикция на цяла дължина на т-ПА кДНК. Броят и фрагментите, получени от разцепването от ендонуклеазната рестрикция бяха установени посредством електрофореза през 6 процентов акриламиден гел. Позициите на участъците бяха потвърдени от секвенция на нуклеинова киселина (представена на фиг. 5). Кодиращият регион на най-голямата отворена рамка е секвенцията на предполагаемия сигнален пептид, докато гравираният с пунктир район представя секвенцията на предполагаемия зрял тъканен плазминогенен активатор (527 аминокиселини). 5' - краят на мРНК е в ляво, а 3' - краят е в дясно.

Фигури 5а, 5Ь, 5с илюстрират нуклеотидната секвенция и извлечената аминокиселинна секвенция на пълната дължина на човешки тъканен плазминогенен активатор кДНК. Изобразен е запис като непрекъсната секвенция на 35 аминокиселини (-35 до -1), представящ тяхната зряла конфигурация. Приема се, че тази 35-аминокиселинна секвенция се състои от хидрофилна “рго” секвенция, запис на серии (+1) на зрелия протеин, от около 12 до 15 аминокиселини, по ред предшестван от “конвенционален” хидрофобен сигнал (простиращ се от 5' до -35). Този тип на пред-просеквенция на секретирани протеини е бил описан предварително, например с препроалбумин. Според тази теория, всички секретирани молекули на тъканен плазминогенен активатор ще стартират със серин (+1) като амино-терминал. Друга теория предполага, че хидрофилната секвенция може да бъде включена във функцията на тъканния плазминогенен активатор по аналогичен начин на този, наблюдаван при плазминогена, където пептид от 10000 далтона може да бъде разграден от амино терминална част на природен плазминоген (С1и-плазминоген), получен в помалки молекули, с нов амино терминал, моделиран Ьух-плазминоген. Ьуз-плазминогена е по-лесно активиран до плазмин и също има по-голям афинитет за фибрин, отколкото С1и5 плазминогена. Плазминът бе показан да катализира конверсията на С1и-плазминоген до Ьуз-плазминоген. Този тип контролен механизъм резултира в механизма на “обратната положителна връзка”. Първите количества 10 плазмин формират деградиран фибрин и също резултат в генерирането на плазминоген и молекули, които по-лесно се активират и свързват по-стегнато към тяхната субстанция, отколкото природния плазминоген. Резултатът 15 е по-бърза деградация на фибрин. Хидрофилният пептид от тъканния плазминогенен активатор може да бъде включен в подобен механизъм, неговото разграждане е рузалтат от модифицирано свързване на ензимът с фибрин. Във всеки случай 35 аминокиселинната секвенция се разглежда като пресеквенция на зрелия протеин.

Фигура 6 е схематична конструкция на експресивния плазмид рс1екаК1РА на тъканния плазминогенен активатор. Стартиращият плазмид рбекаРА25Е10 беше първо разцепен с РзН до изолат 376 Ьр фрагмент, който после бе разграден както е показано на фигурата.

Фигура 7 показва резултатите от анализа на фибринов слой за фибринолитична активност на експресивния продукт получен У1а рбекаК1РА в трансформирани клетки.

Фигура 8 е ТХВН запис (течна хроматография с високо налягане) на пептидите на човешкия тъканен плазминогенен активатор от храносмилателния ензим трипсин (Абсорбция при 210 пт). Стрелката идентифицира пикът, кореспондиращ с пептида, използван за изграждане на нуклеотидната проба, приложена от библиотеката от колонии. Пептидът, представян чрез този пик беше разгадан по отношение на цялата му секвенция: Ь-Т-λΥ-Ε Υ-С О-У-Р-5-С-5-Т-С-С-Ь.

Последователностите на другите големи пикове също бяха секвенирани и беше установено, че се потвърждава коректността на аминосеквенцията на човешкия тъканен плазминогенен активатор. Еднобуквеният пептиден код за аминокиселините е следният:

I

Ахр	ϋ	Аспарагинова к-на	Не	I	Изолевцин
ТЬг	Т	Треонин	Ьеи	Ь	Левцин
5ег	5	Серии	Туг	Υ	Тирозин
С1и	Е	Глутаминова к-на	РЬе	Е	Фенилаланин
Рго	Р	Пролин	Ηίχ	Ь	Хистидин
С1у	С	Глицин	Бух	К	Лизин
А1а	А	Аланин	Ατβ	К	Аргинин
Сух	С	Цистеин	Тгр	\ν	Триптофан
ν3ι	V	Валин	С1п	Ω	Глутамин
Ме!	м	Метионин	Ахп	N	Аспарагин

Фигура 9 показва конструкцията на плазмид, кодиран за директна експресия на зрял човешки т-ПА в Е.соН. 50 μ% от плазмид рРА17 бяха разградени с 8аиЗА1, ΗϊικΙΙ и НЬа1 и електрофорезирани върху 6 процентов полиакриламиден гел. Приблизително 0,5 μ& от фрагментът 55 Ьр 8аиЗА1-НЬа1 бяха възпроизведени. Подобно, около 3μβ от 263 Ьр НЬа1-№г1 фрагмент беше пречистен от 80 μ§ от клон рРА25Е10 като първо изолиран 300 Ьр ΡχίΙ - Иаг1 фрагмент. Всички разграждания бяха извършени при температура 37°С в продължение на един час и продуктите от реакцията бяха разтворени и електроелюирани от 6% полиакриламиден гел. Двата индикирани деоксиолигонуклеотиди 5’ ОААТТСАТСТСТТАТСААСТ (I) и 5’ САТСАСТТСАТААСАСАТО (И) бяха синтезирани чрез твърда фаза фосфотриестер (51). 100 ршо1 от олигонуклеотид II бяха фосфорилирани в 30 μ\ реакционна смес, съдържаща 60 тМ Тпх (рН 8), 10 тМ ΜβΟ₂, 15 тМ β -меркаптоетанол и 50 μ Οί [у³²Р]АТФ (АтегхНат 5000 СП ттоР¹), 12 единици οτ Т4 полинуклеотид киназа бяха добавени и реакцията се продължи при 37°С 15 минути, 1 μΐ от 10 мМ АТФ и 12 единици от Т4 киназа бяха прибавени и реакцията продължи допълнително 30 минути. След екстракция с фенол/СНС1₃ фосфорилиращият олигомер II и 5' хидроксил олигомер I бяха комбинирани с 0,5 μβ елюиран 55 Ьр 8аиЗА1-НЬа1 фрагмент и преципитирани с етанол. Тези фрагменти бяха лигирани при стайна температура за 4 часа в 60 μΐ от 20 тМ Тпх-НС1 (рН 7,5), 10 тМ М₈С1₂ 10 тМ дитиотреитол, 0,5 мМ АТФ и 1000 единици от Т4 ДНК лигаза. Микстурата беше разтваряна за 1 час с 48 единици от №г1, 20 единици ЕсоК1 и 40 единици от ΒβΙΙΙ (за да елиминира полимеризацията чрез лигация на сцеплените 8аиЗА1 термина) и електрофорезирана върху 6% гел. 338 Ьр продукт (приблизително 0,1 μβ) беше възстановен чрез електроелюиране. Остатъците от т-ПА кодови структури (аминокиселини 111-528) бяха изолирани на 1645 Ьр фрагмент посредством разграждащ плазмид рРА25Е10 с №г1 и ΒβΙΙΙ. Плазмидът рЬе1РА!гр103 е дериват на плазмида рЬе1РА25 (52) в който участъкът ЕсоК1, дистален по отношение на гена Ье1Р А е бил отстранен (53). Три μβ от рЬе1РА1гр103 бяха разградени с 20 единици от ЕсоК1 и 20 единици от ΒβΙΙΙ за 90 минути при 37°С, електрофорезирани върху 6 процентов полиакриламиден гел и големият ( 4200 Ьр) векторен фрагмент беше възстановен чрез електроелуиране. За окончателната конструкция, 80 ηβ от ΕεοΚΙ-ΒβΙΙΙ рЬе1РА1гр103 беше лигиран със 100 ηβ от 1645 Ьр ΝαΓί-ΒβΙΙΙ фрагмент и 20 ηβ 338 Ьр ЕсоК1-№г1 фрагмент за 10 часа при стайна температура. Плазминът продуцира чиста лизирана зона във фибринов слой и областта на тази зона може да корелира с количеството тъканен плазминогенен активатор в пробата.

Е.1.Б. Източник на мРНК тъканен плазминогенен активатор

Използвани са човешки меланомни клетки (Βοχνεχ Ме1апота) клетъчна линия, АТСС номер СКБ9607). Меланомните клетки бяха култивирани върху конфлуентна монослойна култура в 100 ш1 Еаг1ех М1шта1 ЕххепЬа1 МесИа с прибавен натриев бикарбонат (0,12 процентова финална концентрация), 2 мМ глутамин и 10 процентов топлинно инактивиран фетален телешки серум. За да се потвърди, че меланомните клетки активно продуцират човешки тъканен плазминогенен активатор, човешки меланомни клетки бяха култивирани до сли13 ване в 24 гнездова микротитрова плака. В зависимост от наличието или отсъствието на 0,33 μΜ протеазен инхибитор апротинин, клетките бяха промити веднъж с фосфат буферен физиологичен разтвор и 0,3 т1 от сяропречистен метионин. 75 μ Οί от [³⁵8] метионин бяха прибавени и клетките бяха белязани за 3 часа при 37°С. В края на три часовия период на маркиране, средата беше отстранена от клетките и третирана с или тъканен плазминогенен активаторен специфичен ΙβΟς или пре - имунен серум за имунопреципитация (54). Имунопреципитационните продукти бяха показани посредством електрофореза на 10 процентов 5Ц5-акриламиден гел. Пластът беше фиксиран, изсушен и подложен на флуорография.

Е.1.В Изолиране на информационна РНК и фракциониране по размери.

Цялата РНК от културите от меланомни клетки беше екстрахирана според способа на ν/агд е) ак (55). Клетките бяха утаени посредством центрофугиране след това ресуспендирани в 10 тМ №С1, 10 тМ Тпз-НС1 рН 7,5,

1,5 тМ М£С1₂. Клетките бяха лизирани чрез прибавяне на ΝΡ-40 (1 процентна крайна концентрация) и ядрата бяха утаени чрез центрофугиране. Супернатантът съдържа цялата РНК, която по-нататък беше пречистена чрез многократно екстрахиране с фенол и хлороформ. Водната фаза беше направена 0,2 М в ИаС1 и след това цялата РНК беше преципитирана чрез прибавянето на 2 обема от етанол. Олиго - άΤ целулозна хроматография беше използвана за да пречисти мРНК от цялата получена РНК (54). Типичните добиви от 10 грама от култивираните меланомни клетки бяха от 5 до 10 милиграма от цялата РНК и 50-200 микрограма от Ро1у(А)р1из тРНК.

Фракционирането от Ро1уА⁺мРНК (200 μβ) (56) беше осъществено посредством електрофореза през урея-агарозен гел. Пластът агарозен гел (57, 58) беше съставен от 1,75 процента агароза, 0,025 М натриев цитрат, рН 3,8 и 6 М урея. Електрофорезата беше проведена за 7 часа при 25 милиампера и 4°С. След това гелът беше фракциониран с острие на бръснач. Отделните слоеве бяха стопени при 70° и двукратно екстрахирани чрез фенол и еднократно чрез хлороформ. След това фракциите бяха преципитирани с етанол и в последствие, анализирани чрез ΐη νΐίΐΌ транслация в заешки ретикулоцитни лизатни системи, ВеФехба КезеагсН ЕаЬ. (59, 60), смесени с кучешки панкреасни микрозоми, както следва: Транслациите бяха извършени с помощта на 25 μ <Д от [³⁵5] метионин 500 нанограма от всеки гелов слой РНК в завършващ обем от 30μ1, съдържащ 25 тМ НЕРЕ5, 43,8 тМ калиев хлорид, 10 шМ креатинин фосфат. 19 аминокиселини 50 тМ всяка, 1,1 шМ магнезиев хлорид, 16,6 тМ етилендиаминтетраоцетна киселина (ЕДТА), 0,16 тМ дитиотреитол, 8,3 шМ хемин, 16,6 μβ/ηιΐ креатинин киназа, 0,33 шМ калциев хлорид, 0,66 тМ ЕСТА, 23,3 тМ натриев хлорид.

Инкубирането беше проведено при 30°С за 90 минути. Кучешки панкреасни микрозомални мембрани, получени от сурови микрозоми с помощта ΕϋΤΑ за отстраняването на рибозомите (61) и третирани с нуклеаза, както вече е описано (62) и поставени в транслационна микстура при крайна концентрация от 7 А₂₆₀ единици/т1. Транслационните продукти от имунопреципитираните транслационни продукти бяха анализирани чрез електрофореза върху 10 процентов полиакриламиден гел с натриев додецил сулфат както е вече описано (63). Обезцветените гелови пластове бяха фиксирани, изсушени и подложени на флуорография (64).

Получените транслационни продукти от всяка фракция на гела бяха имунопреципитирани със заешки анти-човешки тъканен плазминогенен активатор специфичен ΙβΟ. Една главна имунопреципитирана полипептидна връзка беше наблюдава в транслацията на РНК фракционни номера 7 и 8 (миграти от 21 до 245), имаща молекулно тегло от приблизително 63 000 далтона. Тази връзка не беше наблюдавана, когато преимунен ΙβΟ беше използван за имунопреципитиране, което подсказва че тези полипептиди бяха специфичен тъканен плазминогенен активатор.

Е.1.Г. Получаване на библиотека от колонии, съдържащи тъканни плазминогенни активаторни секвенции.

Пет μβ от гел фракциониране мРНК (гелов слой 7 мРНК) беше използван за получаването на двойнонишкова кДНК чрез стандартни процедури (52, 65, 66). кДНК беше фракционирана върху 6 процентов полиакрил амиден гел. кДНК с по-голям размер от 350 базови двойки в дължина (125 ηβ) бе14 ше електроелюирана. 30 п§ от кДНК беше разширена с деокси (С) остатъци с използването на терминал деоксинуклеотидил трансфераза (67) и ренатурирана с 300 п£ от плазмида рВК322 (68), който по подобен начин е свързан с деокси (С) остатъци на участъка ΡχΙ I (67). Ренатурираната смес след това беше трансформирана в Е.соН К12 щам 294 (АТСС Νο 31446). Приблизително 4600 трансформанти бяха добити.

Е.1.Д. Получаване на сонда от ДНК

Пречистен човешки тъканен плазминогенен активатор беше добит с помощта на процедурите, които са описани в приложената литературна справка (19, 20).

Молекулата беше сканирана за да се локализират регионите, най-подходящи за направата на синтетични проби, както следва:

За да стане протеинът подходящ за разграждане от трипсин, той е бил редуциран и карбоксиметилиран. 2 ш£ от тъканен плазминогенен активатор бяха първо диализирани през 0,01 процентов Тчюеп 80, през цялата нощ при стайна температура. Лиофилизираният протеин беше след това разтворен в 12 ш1 от 0,56 М ТП8-НС1 буфер (рН 8,6), 8 моларен в уреа и 5 тМ ΕϋΤΑ. Дисулфидните връзка бяха редуцирани чрез прибавянето на 0,1 ш1 от Д-меркаптоетанол. Тази реакция беше осъществена под азот за 2 часа при 45°С. Редуцираните дисулфиди бяха алкилирани до карбоксиметил дериват с добавянето на 1,0 ш1 от 1,4М йодооцетна киселина в 1Ν КаОН. След 20 минути при стайна температура реакцията беше преустановено чрез диализа през 0,01 процентов Тдаееп 80, за 18 часа при стайна температура и лиофилизиране.

Полученият лиофилизиран карбоксиметилиран протеин беше повторно разтворен в 3 т! 0,1М буфер от натриев фосфат (рН 7,5). Беше прибавен трипсин (ТРСК) (съотношение 1 към 50) и разтворен при 37°С. Кратни количества (0,1 т1) бяха взети на 3 часа, на 6 часа и на 12 часа. Второ прибавяне на трипсин беше осъществено на 12 час. След 24 часа реакцията беше спряна чрез замразяване на пробата, докато можеше да бъде инжектирана на НРЬС. Напредването на разграждането беше детерминирано посредством 808 гел на кратните количества. Всички гелове бяха празни, с изключение на слабо изразената лента на 3 часовата пропорция. Това индикира, че 24 часовото разграждане е завършило напълно и не са останали големи пептиди.

Проба (0,5 т1) беше инжектирана в притежаващата висока разделителна способност АЬТЕХ С-8 ултрасфера 5 μ , с два пробега. Градиент от ацетонитрил беше приготвен в постепенен порядък (от 1 до 5 процента за 5 минути, 5 до 35 процента за 100 минути, 3550 процента за 30 минути). В единия от двата препаратни пробега, елюантът беше монитиран при две дължини на вълната (210 пш и 280 пш). Степента на абсорбция при двете дължини на вълната беше използвана за да се индикират съдържащите триптофан, пептиди.

Пептидните пикове, най-вероятно заради съдържанието им на триптофан, или поради използването им заради други причини, са били секвенирани първи. Това позволи детерминирането на секвенцията на повечето от триптофанни пептиди. След секвенирането на около 25 от най-вероятните пептидни пикове, всички данни за секвенции, които подлежат на регулиране, бяха събрани в общ фонд за да се придобие предварителен модел на първичната структура тъканен плазминогенен активатор. От тези данни и този модел, множество възможни сонди бяха локализирани.

Е.1.Е. Идентификация на бактериални клонове, съдържащи кДНК секвенции на тьканен плазминогенен активатор.

Колониите бяха индивидуално инокулирани в гнездата на микротитърните плаки, съдържащи ЬВ (93) + 5 μ£/πι1 тетрациклин и съхранявани при -20°С, след прибавянето на ϋΜ8Ο до 7 процента. Две копия от библиотеката за колонии бяха дали растеж върху нитроцелулозни филтри и ДНК от всяка колония, фиксирани на филтъра, според способа на ОгшШеш Но£пе85 (69).

Сондата

А А С

Р-обозначена-ТС( ) СА( )ТА( )ТСССА е с т беше получена (от синтетичен олигомер) ОУ-Е-У-С-Р) 14-тег фонд, както е описано по-горе. Филтрите, съдържащи 4600 трансформанти бяха прехибридизирани за 2 часа при стайна температура в 50 тт натриев фосфат рН 6,8, 5 х 88С (80), 150 £ разрушена ДНК от сперма от сьомга, 5 х разтвора

I на ОепЬагск (85) 10 процентов формамид и след това хибридизиран с 50 χ 10⁶ за минута от обозначената проба в същия разтвор. След инкубация от една нощ при стайна температура в 6 х 88С, 0,1 процентен 8ϋδ за 30 минути, 5 веднъж в 2 х 88С и след това експозирана на ΚΟϋΑΚ ХК-5 рентгенов филм с ϋιιροηΐ ίίβΗΐηίηβ Ρΐιιχ усилващи екрани за 16 часа.

ДНК плазмид беше изолиран посредством бърз метод (71) от всички колонии, пока- 10 зали положителна хибридизационна реакция. кДНК инсерти от тези клони бяха след това секвенирани след субклонираните фрагменти в М13 вектор тр 7 (73) и според химическата процедура на Махат ОПЬегГ (74). Фиг.З изла- 15 га филтър номер 25, показващ хибридизационната конфигурация на положителен тъканен плазминогенен активаторен клон. кДНК инсертът в клон 25Е10 беше демонстриран като кодиран от ДНК за тъканен плазминогенен ак- 20 тиватор чрез сравняването на неговата аминокиселинна секвенция с пептидна секвенция (виж по-горе) получена от пречистен тъканен плазминоген активатор и чрез експресивен продукт, продуциран от Е.соИ, както по-долу 25 е описано по-подробно. кДНК инсертът от клон 25Е10 (плазмид рРА25Е10) имаше 2304 базови чифта в дължина с най-дългата отворена четяща рамка кодираща протеин от 508 аминокиселини (М>¥ 56 756) и съдържаща 772 Ьр 30 3' нетранслирани региона. Този кДНК клон не притежава Ν-терминална кодова секвенция.

Бактериален клон Е.соИ (рРА25А10), а също така и като проба от плазмид рРА25Е10, бяха депозирани в Атепсап Туре СиИиге 35 Со1есИоп и получиха номера 67587 и 40401 респ.

Е.1.Ж. Директна експресия на човешки тъканен плазминогенен активаторен клон в Е.соИ.

Както при фиг. 6,50μ& от рРА25Е10 бяха разградени с Р$1 I и 376 Ьр фрагмент изолиран посредством електрофореза върху 6 процентов разтвор на полиакриламиден гел. Приблизително 3 μ& от този фрагмент бяха 45 изолирани от гела с помощта на електроелюиране, разградени с 30 единици от ϋάε I за 1 час при 37°С, екстрахирани с фенол и хлороформ и преципитирани с етанол. Получените ϋάε I лепливи краища бяха раз- 50 ширени до “Ь1ип(” краища с прибавянето на 5 единици ДНК полимераза I (фрагмент на

Κίεηοχν) и 0,1 тМ за всяка от άΑΤΡ, дСТР, άΟΤΡ, άΤΤΡ до получаване на реакционна микстура и последващо инкубиране при 4°С за 8 часа. След екстрахиране с фенол и хлороформ, ДНК беше разградена с 15 единици Иаг 1 за 2 часа и реакционната микстура беше електрофорезирана върху 6 процентов полиакриламиден гел. Приблизително 0,5 μ& от желания 125 Ьр “Ь1ипГ” край Иаг I фрагмент беше отделен. Този фрагмент кодира амино киселини с номера от 69 до 110 в зрялата пълна дължина на тъканния плазминогенен активаторен протеин.

За изолирането на 1645 Ьр №г I - В§1 II фрагмент, 30 μ& от рРА25Е10 бяха разградени с 30 единици от №г I и 35 единици от Ββΐ II за 2 часа при 37°С и реакционната смес електрофорезирана върху 6 процентов полиакриламиден гел. Приблизително 6 μ& от желания 1645 Ьр Иаг - ΒβΙ II фрагмент бяха възстановени.

Плазмидът рдекаК18КС, който е дериватен на плазмида р8КСех16 (79), в който Есо Κ 1 участък е проксимален по отношение на 1гр промотор и е дистален по отношение на 8КС ген, е бил отстранен чрез репарация с ДНК полимераза I (28), и комплиментарния на себе си олигодеоксинуклеотид ААТТАТСААТТСАТ (синтезиран чрез фосфотриестерния метод) беше инсертиран в остатъчния Есо ΚΙ участък, непосредствено стоящ до ХЬа I участък, 20 μ% от р0екаК18КС бяха разградени до край с Есо К1, екстрахирани с фенол и хлороформ и преципитирани с етанол. След това плазмидът беше разграден със 100 единици от нуклеазата 81 при 16°С, за 30 минути в 25 шМ натриев ацетат (рН 4,6) 1 шМ Ζηα₂ и 0,3 М ИаС1, за да се създаде “Ь1ип1” край със секвенция АТС. 40 Следа екстрахиране с фенол и хлороформ и преципитиране с етанол, ДНК беше разградена с Ват ΗΙ, електрофорезирана върху 6 процентов полиакриламиден гел, и големия (4300 Ьр) векторен фрагмент беше извлечен посредством електроелюиране.

Експресивният плазмид беше сглобен чрез лигиране заедно с 0,2 от μ& вектор, 0,06 μ& от 125 Ьр “Ь1ипГ” край - №г I фрагмент и 0,6 μ% от 1645 Ьр №г 1 - Ββΐ II фрагмент с 10 единици от Т4 ДНК лигаза за 7 часа при стайна температура и при използването за трансформиране на Е.соИ щам 294

I (АТСС Νο 31446) за ампицилинова резистентност. ДНК плазмид беше получен от 26 от колониите и разграден с ХЬа I и Есо ΚΙ. 12 от тези плазмиди съдържат желаният 415 Ьр ХЬа Ι-Есо ΚΙ и 472 Ьр Есо ΚΙ - фрагменти. Анализ на ДНК секвенция верифицира това, че няколко от тези плазмиди имаха АТС (АнтиТимоцитен Глобулин) стимулационен код коректно поставен на старта на аминокиселинния номер 69 (серин). Един от тези плазмиди, р(1екаК1РА° беше тестуван и произведе желаният тъканен плазминогенен активатор (фигура 7). Бактериалният клон Е.соП (Ье11аК1РА), а също така проба от плазмида рЬе11аК1РА са били депозирани в Атепсап Туре СиПиге СоИесНоп и придобиват номера 67585 и 40400, респективно.

Е. 1.3. Пълна дължина на тъканна плазминогенна активаторна кДНК

а) Получаване на библиотека от колонии, съдържащи N-терминални тъканни плазминогенни активаторни секвенции: 0,4μς от синтетичният олигонуклеотид

5' ТТСТСАССАСАССССС 3' беше използван за прайминг 7,5μς гел фракция Νο 8 мРНК (горе) за получаване на двойноверижна кДНК с помощта на стандартни процедури (65, 66). кДНК беше размерно фракционирана върху 6 процентов полиакриламидов гел. Фракция с размер, по-голям от 300 базови чифта (36 п&) беше електроелюирана. 5 п£ кДНК беше елонгирана с деокси (С) радикали при употребата на терминална деоксицитидил трансфераза (67) и ренатурация с 50 п£ от плазмид рВК322 (68) , който е бил по подобен начин свързан с деокси (О) радикали на участък ΡχΙ I (67). Ренатурираната микстура след това беше трансформирана в Е.соП К12 щам 294. Приблизително 1500 трансформанта бяха добити.

б) ЗоШЬегп хибридизация на човешка геномна ДНК: Откакто кДНК прайминг реакция беше осъществена, с използването на синтетичен фрагмент, който хибридизира 13 базови чифта от N-терминалът на клон рРА25Е10, неподходящ рестрикционен фрагмент стана достъпен в този район с 29 базови чифта (който включва 16-тег секвенция) за скрийнинг на кДНК клонове. Следователно, беше необходимо да се изолира човешки тъканен плазминогенен активаторен геномен клон за да се идентифицират всички първично разширени кДНК клонове, съдържащи кодови секвенции на тъканен плазминогенен активатор с Ν-терминал.

Първата стъпка в този процес включва установяването на факта, че единствен хомо5 ложен тъканен плазминогенен активаторен ген е налице в човешката геномна ДНК. За да се детерминира това беше извършена 8ои1Негп хибридизация. В тази процедура (77), 5 μς от човешка лимфоцитарна ДНК с високо мо10 лекулно тегло (получена както в 80), беше разградена напълно с различни рестрикционни ендонуклеази, електрофорезирана на 1,0 процентов агарозен гел (81) и изсушен на нитроцелулозен филтър (77). Сонда от ³²Р-маркирана ДНК беше приготвена (76) от 5' край на кДНК инсерт от рРА25Е10 (230 Ьр Нра II - Кза 1 фрагмент) и хибридизиран (82) с нитроцелулозен филтър. 35 χ 10⁶ за минута от пробата бяха хибридизирани за 40 часа и след това промити както описва (82). Две ендонуклеазни разградни структури осигурява само един хибридизиращ ДНК фрагмент: В₈1 Н (5,7 КЬр) и Ρνυ II (4,2 КЬр). Два хибридизиращи ДНК фрагмента бяха наблюдавани с Нтс II (5,1 КЬр и 4,3 КЬр). Взети заедно тези данни подсказват за наличието на един единствен тъканен плазминогенен активаторен ген в човешкия геном, и че този ген съдържа поне една интервенираща секвенция.

в) Скрийнинг на библиотека от човешки ламбда фаг за тъканни плазминогенни активаторни гени.

Стратегията, използвана за идентифицирането на ламбда фаг рекомбинанти, носещи тъканни плазминогенни активаторни гени се състои в откриване на хомоложен нуклеотид с радиактивна сонда, приготвена от тъканния плазминогенен активатор на кДНК от рРА25Е10. Един милион рекомбинантни ламбда фага бяха посяти на Петри с ϋΡ 50 8ир Р с плътност от 10000 рГи/15 ст, и нитроцелулозен филтър беше приготвен за всяка плака по метода на ВепЮп апд ОаУ15(78). По стандартна процедура (83). ³²Р маркирана ДНК сонда беше получена от 230 базови чифта Нра II - Кза I фрагмент локализира 34 базови чифта от 5' край на плазмид рРА25Е10. Всеки нитроцелулозен филтър беше прехибридизиран при 42°С за 2 часа в 50 тМ натриев фосфат (рН 6,5), 5 х 85С (77), 0,05 ητβ/πιΐ подложена на ултразвуково въздействие ДНК от сперма от сьомга, 5 х разтвор на ПепЬагсИ (84),

I процентов формамид и след това хибридизиран с 50 χ 10⁶ за минута от маркираната сонда в същият разтвор, съдържащ 10 процентов натриев декстранов сулфат (85). След инкубация от една нощ при 42°С, филтрите бяха 5 промити 4 пъти при 50° С в 0,2 х 88С, 0,1 процентов 5ϋδ за 30 минути, еднократно в 2 х 58С при стайна температура и след това експозирани с КоОак ХК.-5, рентгенов филм с Цироп! Сгопех усилващ екран за една нощ. 10 Всичко 19 клона бяха добити, които бяха хидризирани със сондата. Фага ДНК беше получен, както вече беше описано (86) от 6 рекомбинанта. Ламбда клон С беше селектиран за получаването на фрагмент Ρνυ 11 за 15 скрийнинг на колония. 30//£ от ДНК бяха разградени с Ρνιι II за 1 час при 37°С, електрофорезирани на 1,0 процентов агарозен гел. 4,2 килоЬр фрагмент с вече доказано съдържание на секвенции на тъканен плазминогенен акти- 20 ватор беше електроелюиран и пречистен. Сондата с ³²Р маркер беше получена чрез стандартни процедури (83) за хибридизация на колонии, както е описано по-долу.

в) Скрийнинг на библиотека от колонии 25 за 5' тъканни плазминогенни активаторни секвенции.

Колониите бяха трансферирани от петрите и посяти на нитроцелулозни филтри, и ДНК от всяка колония фиксирана на филтър, 30 според процедурата на Οηιηδίείη - Но^пезз (69). ³²Р-маркирана проба беше подготвена от телешки тимусен прайминг (83) 4,2 кЬр Ρνιι II фрагмент от изолиран тъканен плазминогенен активаторен ламбда геномен клон. Филтри, съ- 35 държащи 1500 трансформанта бяха хибридизирани с 112 х 10* срт от ³²Р - геномен Рчи II фрагмент. Хибридизацията беше за 16 часа, ползвайки условията, описани от РгкзсЬ е! а1. (82). Филтрите бяха екстензивно промити и 40 след това експозирани на Ко<1ак ХК - 5 рентгенов филм с ϋιιροηΐ ΕίβΗίηϊηβ - Р1их усилващи екрани за 16-48 часа. 18 колонии отчетливо хибридизираха геномната сонда. ДНК плазмид беше изолиран от всяка от тези колонии и 45 беше свързан на нитроцелулозни филтри и хибридизиран с ³²Р - маркиран синтетичен олигонуклеотид (16-шег), използван за оригинална прайминг реакция. От осемнадесетте клона, седем хибридизираха с киназен 16-шег. От сек- 50 венционния анализ след субклонираните фрагменти в ш13 вектор тр⁷ (73), един клон (рРА17) беше показано съдържа коректния 5' N терминален регион от тъканен плазминогенен активатор, сигнална водеща секвенция и 84 Ьр 5' нетранслиран регион. От двата клона рРА25Е10 и рРА17 пълната нуклеотидна секвенция (фиг. 5) и рестрикционната конфигурация (фиг. 4) на пълна дължина на клон на тъкания плазминогенен активатор бяха детерминирани.

Бактериалният клон Е.соН (рРА17), а също и сонда от плазмид рРА17, са били депозирани в Ашепсап Туре СиЬиге СоПесбоп и получиха вх. Νο 67586 и 40402 респ.

Молекулата на природния тъканен плазминогенен активатор има потенциала да стабилизира чрез 17 дисулфидни моста, базирани по хомология с други серии протеази. Съществуват четири потенциални N - гликосилационни участъка, три локализирани “кпп£1е” , регионите на азп₁₁₇, а8п₎₈₄, а8п₂₁₈ и един потенциален участък региона на леката верига, на а5П₄₄₈. Вариациите в структурата на олигозахаридните лиганди може би са отговорни за различните молекулярни форми (65000 и 63000 мол.т.).

Е.1.И. Директна експресия в Е.соН на тъканен плазминогенен активаторен кДНК клон в цяла дължина.

Реконструкцията на пълната кодиращата секвенция беше възможна благодарение на използването на обикновен НЬа1 рестрикционен ендонуклеазен участък, разделен от двата частични клона рРА17 и рРА25Е10. Рестрикционен фрагмент 55 Ьр 8аиЗА1-НЬа1, кореспондиращ с аминокиселини 5-23, беше изолиран от плазмида рРА17. 8аиЗА1 рестрикционен участък беше локализиран на кодон, четири от предполагаемата зряла кодова секвенция и беше приложена за да отстрани сигналният пептиден кодов регион. 263 Ьр НЬа1ΝηγΙ фрагмент (кодиращ за аминокиселини 24-110) беше също изолиран от плазмид рР25Е10. Два синтетични деоксиолигонуклеотиди бяха определени с възстановените кодове за аминокиселини 1-4, инкорпорирани на АТС (антитимоцитарен глоб.) транслационен стимулиращ кодон и създаден на ЕсоК1 свързващ термин. Тези три фрагмента бяха след това лигирани заедно с форма на 338 Ьр фрагмент кодиращ за аминокиселини 1-110. Този фрагмент и 1645 Ьр ΝβγΙ-Β^ΙΙΙ фрагмент от рРА25Е10 бяха след това лигирани

I между ЕсоК1 и ΒβΙΙΙ участъци от плазмида рЬе1РА1гр103 (53) за да даде експресионният плазмид р(-РА1гр12. Клонираният т-ПА ген е транскрибиран под контрола на 300 Ьр фрагмент от Е.соИ 1гр оперон, който съдържа ίτρ промотор, оператори 8Ηΐηε - Оа1£агпо секвенция от 1гр лидерен пептид, но липсва лидерния пептиден АТС стимулиращ кодон (52).

Проба от плазмида р1-РА1гр12 е била депозирана в Атепсап Туре СиИиге СоИесИоп и придоби номер 40404.

Е.1.Й. Секвенционен анализ

Секвенционният анализ беше базиран на деградацията на Ебтап (83Ь). Пробата беше поставена в чаша от Весктап 890В или 890С секвенсер. Ро1уЬгепе ТМ (поли Ν,Ν,Ν',Ν¹ -тетраметил-1Ч-триметиленхексаметиленов диамониев диацетат) беше използван като носител в чашата (63С). Секвенсерът беше модифициран със студен уловител и няколко програмни промени за да редуцира фоновите пикове. Реагентите бяха Весктап секвенция 0,1 М 9иабго1 буфер, фенилизотиоцианат и хептафлуоробутанова киселина.

Селектираните Едманови цикли бяха ръчно конвертирани до 2-анилино-5-тиазолинонови деривати. 1-хлорбутанът беше изсушен под азот. След това 1,0 N солна киселина във вода беше прибавена към 2-анилино-5тиазолинон и загрети до 70°С за 10 минути за да конвертират в З-фенил-2-тиохидантион (ФТХ дериват). ФТХ - аминокиселинният остатък след това беше разтворен в 50-процентов ацетонов нитрил и вода и инжектиран в течен хроматограф с високо налягане, реверсивна фаза. Всяка ФТХ - аминокиселина беше след това идентифицирана посредством сравнение с ретенационните времена на стандартната микстура от ФТХ - аминокиселини, които бяха въведени в конверсионния флакон и третирани по същият начин както цикъла от секвенсера.

Е.1.К. Анализи за откриване на експресия на тъканен плазминогенен активатор

1. директен анализ на плазминова формация

а) Теория

Чувствителен анализ за тъканен плазминогенен активатор може да бъде получен посредством мониторинг на тъканният плазминогенен активатор катализиращ конверсията на плазминоген до плазмин. Плазминът е ензим за който съществуват хроматографски анализи. Тези анализи се основават на протеолитичното разграждане на трипептид от хромофорна група. Степента на разграждане ди5 ректно зависи както от спецификата, така и от концентрацията на протеазата която е била тествана. Основата на анилиза е детерминацията на количеството плазмин, формиран от инкубацията на тъканния плазминогенен 10 активатор, съдържащ разтвор с разтвор от плазминоген. Най-голямо количество от активатор, формира най-голямо количество от плазмин. Плазминът се измерва посредством мониторинг на неговото разграждане от хроматогенният субстрат 82251 (набавен от КаШ Огоир, Ιηί. СгеешуюЬ, СТ.).

б) Процедура

Кратно на пробата количество е смесено с 0,10 т1 от 0,7 ηΐβϊ/πιΐ плазминоген (в 0,05 М Тпз НС1, рН 7,4, съдържащ 0,012 М МаС1) и допълнен обем до 0,15 т1. Сместа се инкубира при 37°С за 10 минути, 0,35 т1 от 82251 (1,0 шМ разтвор в горния буфер) е добавен, и реакцията продължава в продължение на 30 минути при 37°С. Ледено оцетна киселина (25 μΙ) е прибавена за да терминира реакцията. Пробите се центрофугират и се измерва абсорбцията на дължина на вълната 405 пт. Количественото определяне на активността се постига посредством сравняването със стандартен урокиназен разтвор. Активността беше записана в Р1ои£Ь единици, като 90000 Р1ои§Ь единици са еквивалентни на активността показана от 1 т£ от пречистен тъканен плазминогенен активатор.

2. Индиректен анализ на плазминова формация

а) Теория

Беше предложен чувствителен анализ на активността на тъканния плазминогенен активатор (87). Анализът се базира на детерминацията на плазминова формация, посредством измерването на размера на плазминовото разграждане от фибрин в ага рова среда, съдържаща фибрин и плазминоген. Плазминът продуцира открояваща се зона на лизис във фибриновата плака. Областта на тази зона на лизис може да корелира с количеството на тъканен плазминогенен активатор в пробата.

б) Процедура

Следвайки процедурата на СгапеШ Ирегпо и КешЬ (87), петритата бяха инкуби19

I рани 3,5 часа при 37°С и зоната на лизис беше измерена. Количественото определяне беше постигнато посредством сравняването със стандартен урокиназен разтвор.

Е.1.Л. Установяване на активността на тъканният плазминогенен активатор

1. Бактериално развитие и подготовка на проба.

Колония от Е.соН, съдържаща плазмидът (р<1е11аК1РА”) беше инокулирана в епруветка, съдържаща 5 т1 от ЕВ хранителна среда с 20 χζβ/ιηΐ ампицилин. Клетките бяха оставени за една нощ при 37°С. Кратна част от тази култура беше разредена в съотношение 1:100 в 300 ш1 от М9 среда, съдържаща 20 μβ/πιΐ ампицилин. Клетките бяха оставени в колба при 37°С за 4 часа, и се получи абсорбция на 550 пт от 0,419. Триптофановият аналог индолакрилова киселина беше добавена до концентрация 30 μ^/ιηΐ. Клетките бяха инкубирани 90 минути с протичаща абсорбция на 550 пш от 0,628. Клетките бяха отделени посредством центрофугиране и ресуспендирани в 0,8 ш1 от 0,01М Тпх, рН 8,0, съдържаща 0,01 Μ ΕϋΤΑ. Получената суспензия беше разбъркана при стайна температура за 18 часа. Пробата беше центрофугирана и супернатантът беше анализиран по отношение на активността на тъканния плазминогенен активатор.

2. Установяване на активността

Таблица 1 показва резултата от активацията на плазминоген чрез екстракт от Е.соН. Генерираната активност зависи от присъствието на плазминоген. Тази активност не е повлияна от преимунен серум от заек, но е инхибирана от антисерум, който е създаден срещу деривати на тъканния плазминогенен активатор от меланомни клетки. Това демонстрира че екстрактите от Е.соН продуцират плазминоген, повлияващ активността, която е инхибирана от антитела срещу тъканния плазми5 ногенен активатор.

Фиг. 7 показва резултата от анализа на фибриново Петри за фибринолитична активност. Стандартно количество от урокиназа бе прибавено в централната редица в кон10 центрации от ляво на дясно, от 0,24, 0,14, 0,10, 0,05, 0,02 ΡΙουβΗ единици. Долната редица е от проби от натурален тъканен плазминогенен активатор, със същото количество от ензима във всяко гнездо. Гнездата 15 съдържат, от ляво на дясно, тъканен плазминогенен активатор, антиплазминогенен активатор плюс тъканни плазминогенни активаторни антитела. Гнездата на горната редица съдържат 8 μ\ от рекомбинантни тъканни 20 плазминогенни активаторни екстракти от Е.соН. В първото гнездо е само екстракт, във второто има прибавен преимунен серум, и в третото има прибавени тъканни плазминогенни аткиваторни антитела. Очевидно е, че пре25 имунният серум не въздейства на натуралния или на рекомбинантния тъканен плазминогенен активатор, и че тъканните плазминогенни активаторни антитела инхибират активността на натурални, като екстракти от Е.соН. Основавайки се на урокиназни стандарти, екстрактите съдържат незначително по-малко от 2,5 ΡΙοιίβΗ единици за милилитър. Това е благоприятно в сравнение със стойността, получена в таблица 1 от 1,3 Рюи^Ь единици за ш1.

Таблица 1 излага резултатите от анализите, извършени по начина, описан по-горе в Е.1.К.1.6.:

Таблица 1

Е.соН от култури, съдържащи рбеКаШРА

Плазминогенна активация чрез екстракти от

Проба	А405	Активност	Изчислени	ΡΙοιίβΗ
		<%>	единици	в т!
Екстракт
(без плазминоген)	0,043	(0)
Екстракт	0,451	(100)	1,3
Екстракт плюс
преимунен серум	0,477	106	-
Екстракт плюс
анти т-ПА антитела	0,079	9

I

Фигура 10 представя резултатите от анализа на проба фибринов слой, извършен с екстракти от 10 Ь ферментационни култури от Е.соН, съдържащи тъканен плазминогенен активаторен експресивен плазмид. Фибринолитичната активност на тъканния плазминогенен активатор, съдържащ екстракт е представена на фиг. 10 (гнездо А). Тази фибринолитична активност е инхибирана от анти тПА ΙβΟ (гнездо С), но не и от преимунен ΙβΟ (гнездо В) или анти урокиназен 1§С (гнездо ϋ) и не се виждат доказателства за активност от екстракта, получен от клетки, съдържащи като контрола левкоцитен интерферонов плазмид рЬе1РА»гр103 (гнездо Н).

Е.2 Получаване на т-ПА с помощта на ДХФР протеин с ниска активност на свързване на МТХ.

Е.2.А Векторна конструкция

Секвенцията, кодираща човешки тъканен плазминогенен активатор (т-ПА) е инсертирана в експресивен плазмид, съдържащ мутантна ДХФР с ниска активност на свързване на МТХ, описана в заявка, υ.δ. 55ег. Νο. 459151 подадена на 19 януари 1983, кореспондираща с Еигореап Ра1еп1 АррПсаЬоп РиЬ1.

Νο 117060 (отбелязана в библ. справка), осъществена със следната процедура (виж фиг. 11):

Три фрагмента от отчасти съвпадащите плазмиди, рРА25Е10, и рРА17, и Р»РА1гР12 (горе) бяха приготвени както следва: Плазмид рРА17 беше разграден с ϋάε I, с използването Κίεηοχν ДНК полимераза 1, и срязана е Ρ$ί I; Беше изолиран, приблизително 200 Ьр фрагмент, съдържащ 5'-терминал т-ПА секвенция. Вторият т-ПА фрагмент беше получен чрез разграждането на рбе11аК1РА” с Рз1 1 и №г I и изолирайки приблизително 310 Ьр фрагмент. Третият т-ПА фрагмент беше добит чрез разграждането на рРА25Е10 е 40 Наг I иг В&1 II и изолирайки приблизително 1645 Ьр фрагмент, който съдържа допълнително повече от т-ПА кодовият регион, няколко 3' нетранслирани секвенции.

Плазмид рЕ342, който експресира НВУ повърхностен антиген (също упоменат като рНВз348-Е) е бил описан от Ьеущзоп е» а!., заявка за патент 8ег. Νο. 326980, подадена на 3 декември 1981 г., сега изоставена, заради продължението на заявка 5ег. Νο. 603539, по- 50 дадена на 24 април 1988 г. кореспондираща с Еигореап Ра1еп1 АррНсабоп РиЬ1. Νο. 73656, която е упомената в библиографската справка. (Накратко, локусът на вируса 5У40 на 5»1ггиап, беше изолиран чрез разцепване на 5>У4О ДНК с ΗΐηΟΙΙΙ, и конвертирайки краищата на ΗίηόΙΙΙ 5 до ЕсоК1 краища чрез прибавяне на конвертор (АССТСААТТС). Тази ДНК беше срязана с ΡνυΙΙ и ΚΙ линкерите бяха прибавени. Следвайки разцепване с ЕсоК1, фрагментът 348 Ьр обхващащ локуса, беше изолиран пос10 редством електрофореза и електроелюиране е полиакриламиден гел, и клониран в рВК322. Експресивният плазмид рНВз348-Е беше конструиран чрез клониране на фрагментът 1986 Ьр, получен от ЕсоК1 и ΒβΙΙΙ разцепване от 15 НВУ (хепатит Б вирус) (Ашта1 νίηικ Сепебсх. (СЬ 5) Асад. Ргезз, Ν.Υ. 1980), (който обхваща генът, кодиращ ΗΒ$Αβ) в плазмидът рМЬ (Ьизку е» ак, ИаТиге. 293: 79 (1981) на участъците ЕсоКЛ и ВатНк (рМЬ е дериват на 20 рВК322, който има делеция, елиминираща секвенции, които са инхибитори за плазмидна репликация в маймунски клетки). Полученият плазмид (ρΚΙ-ΒβΙ) след това беше линеаризиран с ЕсоК1, и фрагментът 348 Ьр, 25 представяйки локусния регион на 8У40, беше въведен в ЕсоК.1 участък от ρΚΙ-ΒβΙ. Локусният фрагмент може да инсертира в друга ориентация. Този фрагмент кодира и двата 8У40 промотора - ранният и късният с добавяне към 30 локуса на репликация. НВУ гени могат да бъдат експресирани под контрол на единия от промоторите, зависещ от тази ориентация (рНВ5348-Е представящ НВз експресиран под контрол на ранния промотор). рЕ342 е моди35 фициран чрез частично разцепване с ЕсоК1, запълвайки в разцепвания участък с използването на ΚΙεποχν ДНК полимераза I, и лигирайки плазмидния гръб заедно с това, като така отстранява Есо КЛ участъка, записващ 8У40 локуса в рЕ42. Полученият плазмид, проектиращ рЕ3420еИаК1, е разцепен с Есо ΚΙ, запълнен с ползването на Κίεηοχν ДНК полимераза I и срязан с Ваш ΗΙ. След електрофореза на акриламиден гел, приблизително 3500 45 Ьр фрагментът е подложен на електроелюиране, екстрахиран с фенол-хлороформ и преципитиран с етанол както по-горе.

Така получения р342Е 3500 Ьр вектор, както и по-горе описаните т-ПА фрагменти, включващи приблизително 2160 Ьр бяха лигирани заедно с използването на стандартни техники. Плазмид, съдържащ трите т-ПА ко21 диращи фрагмента в собствената ориентация беше изолиран, охарактеризиран и моделиран - рЕ342-т-ПА. Този плазмид беше разцепен със 8ас II и третиран с алкална фосфатаза (ВКЬ). За да се постигне секвенция на ДХФР, приблизително 1700 Ьр фрагмент беше генериран чрез 8ас11 разцепване от рЕНЕК. (рЕНЕК е плазмид експресиращ мутант ДХФР, описан в и.8.8ег. Νο. 459151 (горе). Този фрагмент беше лигиран в рЕ342-т-ПА плазмид за да създаде рЕТРАЕК400, а плазмид, който е аналогичен на рЕНЕК с изключение на ΗΒχΑβ кодов регион е бил преместен чрез кДНК секвенции от т-ПА.

Е.2.Б Експресия и амплификация на тПА секвенция рЕТРАЕК400 (рЕТРЕК) беше трансфектиран в две (Шг-СНО-ОиХ В11 клетки и ОНЕК+СНО-К1 (АТСС ССБ61) клетки посредством методът на СгаЬат и Уап <1ег ЕЬ. Трансформираните άΗίτ-клетки бяха селектирани чрез прорастване в среда, дефицитна на глицин, хипоксантин и тимидин. Трансформираните ϋΗΡΚ+ клетки бяха селектирани чрез растеж в 100 ηΜ МТН. Колониите, които израснаха в подходящо подбраната среда бяха изолирани с използването на клониращи пръстени и пропагирани в същата среда за няколко поколения.

За амплификация, клетки от колониите са разцепени в среда, съдържаща 5 х ΙΟ⁴, 10⁵,

2,5 х 10⁵, 5 х 10⁵ и ΙΟ⁶ ηΜ МТХ и пасажирани няколко пъти. Клетките бяха посети при много ниска (10² - 10³ клетка/среда) плътност в 10 ст панички и получените колонии бяха изолирани.

Е.2.В Аналитични методи

Експресията на т-ПА в трансфектираните амплификирани колонии може конвенционално да бъде анализирана посредством методите, подобни на тези, изложени в Е.1.К.1.6.

Коамплификацията на ДХФР и т-ПА секвенции е анализирана посредством изолиране на ДНК от съединени монослойни колонии, както следва: съединени монослойно колонии в 150 тт петрити са промити с 50 т1 стерилен РВ8 (фосфатно-солеви буферен разтвор) и лизирани чрез прибавянето на 5 т1 от 0,1 процентов δϋδ (сяро-солеви буферен разтвор), 0,4 М СаС1₂, 0,1 Μ ΕϋΤΑ, рН 8. След

5-10 минути, микстурата се отделя, екстрахира се във фенол и хлороформ, и се преципитира в етанол. ДНК е ресуспендирана в 1 т! (за 150 тт петри) 10 тМ Тп$-НС1 рН 8, 1 тМ ΕϋΤΑ (ТЕ), КИахе добавени до 0,1 ιηβ/τηΐ, и разтворът се инкубира 30 минути при 37°С. δϋδ след това се добавя до 0,1 процент и проназа (на 8|§та) също се прибавя до 0,5 πΐβ/ιηΐ. След 3-16 часа инкубиране при 37°С, разтворът отново се екстрахира с фенол и хлороформ, последователно и се преципитира с етанол. Пелетът на ДНК е ресуспендиран в 0,5 т1 вода и разцепен с рестрикционни ензими. Приблизително 5-10 μ% от разцепената ДНК е електрофорезирана в агарозен гел [1 процентна агароза в Тпх-ацетатен буфер (40 шМ Τγϊ5, 1 тМ ΕϋΤΑ, доведена до рН 8,2 с оцетна киселина)]; Сгоихе, е! а1, I.ΒίοΙ.СЬет. 257: 7887 (1982)). След като бромфенолната синя боя мигрира от пътя надолу по гела, гелът беше отстранен и оцветен с етаниден бромид. След визуализирането на ДНК с ултравиолетова светлина, ДНК се трансферира от гелът към нитроцелулозните филтри, както е в процедурата на 8ои1Ьегп (ΤΜοΙ.ΒϊοΙ. 98:503. (1975)). Филтрите след това бяха хибридизирани с белязана транслационна сонда, направена от 1700 Ьр 5ас11 фрагмент от рЕНЕК (получен и хибридизиран като гореописаната), или от приблизително 1970 Вр В§1 II фрагмент от рЕТРЕК.

Е.З Произвеждане на т-ПА в съединение с див тип ДХФР белтък

Е.З.А. Векторна конструкция По начин, аналогичен на способа, използван при конструирането на рЕТРЕК, беше конструиран плазмида рЕТРЕК съдържащ ДНК секвенция, кодираща див тип ДХФР. Конструкцията е подобна на тази, описана в пример Е.2.А., с изключение на това, че плазмида рЕНЕК като източник на генна секвенция за ДХФЗ протеин, беше заместен с плазмида ρΕ342.ΗΒν.Ε400.ϋ22, описан в и.8.8ег. Νο. 459152, подаден на 19 януари 1983 г., сега РакИо 4713339, издаден на 15 декември 1987 г. кореспондиращ с Еигореап Ра1еШ АррНсаНоп РцЪкИо. 117058, упоменат в библиографската справка. Плазмидът ρΕ342.ΗΒν.Ε400.ϋ22 е същият като рЕНЕК, с изключение на един единствено различен базов чифт, като несъвпадение между дивия тип и мутанта ДХФР. Така полученият плазмид рЕТРЕК е аналогичен на рЕТРЕК, с из22

I ключение на това, че ДНК секвенцията, кодирана на дивия тип ДХФР е заместена за тази на мутанта. Проба за плазмида рЕТРРК е била депозирана в Атепсап Туре СиНиге СоНесОоп и получи входящ Νο 40403.

Е.З.Б Експресия на т-ПА секвенция рЕТРРК беше използван за да трансфектира ДХФР дефицитните СНО клетки (иг1аиЬ и СЬахш), с използването на преципитацията с калциев фосфат по метода на СгаЬаш и Уап дег ЕЬ. Двадесет и една колонии, които прораснаха върху селективна среда (НСТ), бяха подложени на анализ посредством детектиране на плазминови формации, получаващи се при разграждането на фибрин в петри с агар, съдържащ фибрин и плазминоген, както е описано от Сгапе1П-Р1регпо, е1 а1. ТЕхр.Мед., 148: 223 (1978).

Четири от най-силно позитивните клонове бяха след това анализирани количествено за плазминова формация, според метода изложен в Е.1.К.1.6.

От такова количествено детерминиране е установено, че четирите тествани клона показаха същата или сравнима секреционна способност на т-ПА в средата, изразена чрез единици/клетка/ден. Субклонове бяха получени посредством трансфериран инокулат от два от клоновете в отделни петрита съдържащи -НСТ среда. Два от получените субклона, 18В и 1 бяха използвани за по-нататъшния анализ.

Е.З.В. Амплификация и нива на секреция на т-ПА.

Гореспоменатите клонове бяха посяти при 2 x1ο⁵ клетки в петрита от 100 тт, в 50 пМ МТХ за да подпомогне амплификацията. Преживелите клетки, когато бяха анализирани по споменатия по-горе способ, дадоха във всички случаи, около 10 пъти неамплифицирани количества, изразяващи активността на тъканния плазминогенен активатор. Два от тези клона, бяха подбрани за по-нататъшно изследване и бяха наименувани 1-15 и 18В-9.

По-нататък, субклона 1-15 беше амплифициран чрез посетите 2 χ 10⁵ клетки в петрита от 100 тт, съдържащи 500 пМ МТХ. Анализът на така амплифицираните клетки показа по-нататъшно увеличаване на добива (от около 3 обхвата) на т-ПА когато беше извършено количествено определяне, според метода в С.1.С, нивата бяха в обхвата на 7 х 10“* единици/клетка/ден. Една част от тези амплифицирани клетки след това беше трансфериране и поддържаше присъствие от 10000 пМ МТХ. Субклоновете 1-15 и 18В-9 бяха след това тествани, след като бяха поддържани за приблизително 1-2 месеца при условията показани в Таблица 3.

Таблица 3

Клетъчна линия	Условия на растеж	ηβ т-ПА/клетка/ ден*
1-155(М	500 пМ МТХ	28,5 х 103
1-15500	500 пМ МТХ	26,0 х 103
Ь155й0	(-НСТ среда, без МТХ)	8,3 х 103
1-15500	(-НСТ среда, без МТХ)	18,0 χ 10 3
1 ”1^10000	ЮулМ МТХ	29,3 х 103
1 -15! оооо	Ю^М МТХ	49,0 х 103
18В-9	50 пМ МТХ	14,3 χ 10 3
18В-9	50 пМ МТХ	14,4 х 10 3
18В-9	(-НСТ среда, без МТХ)	14,3 χ 10 3
18В-9	(-НОТ среда, без МТХ)	14,4 х 10 3
1	(-НСТ среда, без МТХ)	1,0 х 10 3
1	(-НСТ среда, без МТХ)	0,7 х 103

I * т-ПА в клетъчната среда беше анализиран количествено чрез радиоимунологичен метод, както следва: Пречистен т-ПА, и пречистен йодов т-ПА маркер получени от меланомни клетки бяха разредени на серии за да включват концентрации от 12,5 до 400 п§/ш1 в буферен разтвор, съдържащ солен буферен фосфат, рН 7,3, 0,5 волски серумен албумин, 0,01 процентов Тч/ееп 80 и 0,02 процентов ΝηΝ₃. Към радиоактивните маркиращи протеини, за да бъдат анализирани, бяха прибавени подходящи разреждания на пробите. Антигените бяха оставени за инкубация за една нощ при стайна температура в присъствието на 1:10000 разреждане на 1&С фракция от заешки анти т-ПА антисерум. Комплексът антиген/антитяло беше преципитиран чрез абсорбция с анти-заешки ΙβΟ имуногранули (ВюКаб) от козел за два часа при стайна температура. Гранулите бяха пречистени с прибавянето на солен разредител, центрофугирани за 10 минути при 2000 χ β при 4°С. Супернатантите бяха изхвърлени и радиоактивността на преципитатите беше измерена. Концентрациите бяха установени чрез сравняване със стандарт.

Клетъчните линии са както следва: клетъчна линия “1” е неамплифициран клон от оригиналната група на четирите клона. “115_50θ” е амплифициран субклон от клетъчна линия “1”, която беше амплифицирана инициал но в 50 пМ МТХ за да даде 1-15 и след това трансферирана за по-нататъшно амплифициране в 500 пМ МТХ. 1-15_1θθθθ е субклон на 1 - 15_50θ който е бил впоследствие амплифициран в присъствието на 10000 пМ МТХ. Клетъчна линия 18В-9 е субклон на оригиналната група на четирите клона, която е била амплифицирана с 50 пМ МТХ.

Пробата с СНО клетъчна линия 1-15_50θ е била депозирана в Атепсап Туге Сикиге СоИескоп и получи входящ Νο СКЬ 9606.

Всички от амплифицираните клетки показаха увеличени нива на секреция на т-ПА, много над тези показали неамплифицираните клетки. Ако една неамплифицирана култура секретира т-ПА повече от 0,5 ρβ/клетка/ден, амплификацията дава 50 р&/клетка/ден.

Ж. Фармакологични структури

Съединенията от представяното изобретение могат да бъдат формулирани според известните методи за получаване на фармацевтично използваеми структури, където продуктът на човешкия тъканен плазминогенен активатор е комбиниран в микстура с фармацевтично приемливо средство - носител.

Подходящи носители и технологията за тяхното получаване, включване на други човешки протеини, включително и човешки серумен албумин, са описани например в Кеппп£1оп’5 РНАКМАСЕиТ1САЬ δΟΙΕΝΟΕδ от Е.У/.МаШп, упоменат в инкорпорираната библиографска справка. Такива структури ще съдържат ефективно количество от протеин, заедно с подходящо количество от носителя, за да бъдат произведени фармацевтично при15 емливи композиции, подходящи за ефективно приложение.

Например, човешкият тъканен плазминогенен активатор, може да бъде прилаган парентерално на лица, страдащи от кардиовас20 куларни заболявания. Определянето на дозата и дозирането може да станат паралелно с тези в текуща употреба в клиничните изследвания на други кардиоваскуларни препарати тромболитични средства, т.е. около 440

Ш/к® телесно тегло, като интравенозната начална доза е последвана от продължителна интравенозна инфузия от около 440 Ш/к#/ час за 12 часа, при пациенти, страдащи от пулмонарна емболия.

Като пример за подходящо определяне на дозата на есенциалния хомогенен човешки тъканен плазминогенен активатор при параентерална апликация, флакон, съдържащ 25000 Ш активност тъканен плазминогенен активатор, 25 ш£ таппко1 и 45 т£ №С1 могат да бъдат реконститюирани с 5 т1 стерилна ациа ОехШ1а1а за инжектиране и смесени с подходящ обем от 0,9 процентов натриев хлорид или 5 процентова бех1гозе ΙηΐεεΙϊοη за ин40 травенозно приложение.

3. Подробно описание на рекомбинантна човешка т-ПА

Структурата на частичния ембодимент на човешкия т-ПА, получена в опитите, опи45 сани дотук, е била подложена на изследване по отношение на някои детайли, както чрез осветяване на генната кодова секвенция, така и чрез известните биохимични техники за анализ на белтъци. Съвременното разбиране за структурата на белтъците е илюстрирано на фиг. 12.

Още СоПеп и сътр. (88) демонстрираха, че двойно верижният човешки т-ПА е формиран от протеолитичното разграждане на едноверижна молекула в два полипептида, свързани с дисулфидна връзка. Съвременното ниво на познания ни позволява да заключим, че тежката верига (30882 мол. тегло) е получена от ΝΗ₂ терминална част и че леката верига (28126 мол.тегло) включва СООН-терминална област. N-терминал, структуриран от двуверижна молекула, подсказва, че двуверижната форма е генерирана чрез разцепването на единична аргинил-изолевцинова връзка (фиг. 12; нарисуваната стрелка).

Първичната структура на частта на тежкия верижен участък от човешкия т-ПА (фиг. 12) разкрива, висока степен на секвенционна хомология с т.н. “кппк1е” региони на плазминоген (89) и протромбин (40 и 41). “Кппк1е” регион се отнася за характеристична триадна дисулфидна структура, оригинално открита в “προ’’-фрагмент на протромбин, най-първо описана в детайли от Ма£пи$$оп е! а1. (91, 92). От първичната секвенция на т-ПА, два т.н. “кппк1е” региони, от 82 аминокиселини, всеки, е очевидна високата степен на хомология с 5 “кппк1е” региони на плазминоген. Оставащите Ν-терминални 91 аминокиселини, разделят ниска степен на хомология с “конвенционалния” “кппк1е” регион. Обаче някой може да спекулира, че тези област може също да приема структура, съдържаща мултипленни дисулфидни връзки, като 11 допълнителни цистеинови остатъци, намерени тук.

Каталитичният участък на леката верига на човешкия т-ПА, така нареченият серин протеазен участък, както в други серинови ензими, е най-вероятно формиран чрез хистадин₃₂₂, аспарагин_37], и серин₄₇₈ остатъци. Нещо повече, амино киселинните секвенции, заобикалящи тези остатъци са много хомоложни към кореспондиращите части на други серинови белтъци, като трипсин, протромбин и плазминоген.

Въпреки това, че е направена справка с избрани реализации, следва да се разбира, че настоящото изобретение не се ограничава до тях, а по-скоро представлява обоснован списък от приложените претенции.

Claims (1)

1. Патентни претенции

   1. Рекомбинантен човешки тъканен плазминогенен активатор, състоящ се предимно от аминокиселинната секвенция 69-527, изобразена на фигури 5а, 5Ь и 5с.