JPH0372877A - 活性化ヒトプロテインｃ誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ 産業上の利用分野 本発明によるヒトプロティンＣ誘導体または活性化ヒト
プロティンＣ誘導体は、抗凝固剤として、例えば静脈血
栓症、汎発性血管向凝固（ＤＩＣ）など血栓形成に起因
する疾患の治療への適用を目的としている。また、線溶
促進剤として、線溶療法の補助剤としての使用も目的と
している。本発明の活性化ヒトプロティンＣ誘導体もし
くは体内で活性化されたヒトプロティンＣ誘導体は、天
然型の活性化ヒトプロティンＣより血中半減期が長いた
め、より効果が持続する特徴がある。

従来の技術 生体には自己にとって好ましくない出血が起きた場合、
それを阻止しようとするメカニズムすなわち血液凝固系
が備わっている。この系は主として、−群の血漿性タン
パク質、血小板などの血球そして血管内皮細胞により構
成されるもので、血球成分などを含むフィブリンの網状
構造物を形成することによって止血するものである。し
かしながら、この系がそれを必要としない時に、あるい
は必要としない部位で作動した場合、自己にとって不都
合な血栓を生じることがあり、ときには致死的となる。

一方、血漿中にはこの血液凝固系を制御する系もまた備
わっている。その主要なもののひとつは血液凝固因子ト
ロンビンに対する阻害剤アンチトロンビン■である。別
のひとつはプロティンＣを介した系であり、これは血液
凝固系のより前の段階に作用するものである。プロティ
ンＣは血漿セリンプロテアーゼ前駆体の一種であって、
血小板や血管内皮細胞の表面で、トロンビンとそのレセ
プターであるトロンボモジュリンとの複合体による限定
分解によって活性化され、セリンプロテアーゼである活
性化プロティンＣ（ＡＰＣ）に変換される。１）ＡＰＣ
は血液凝固系の活性化第５因子および活性化第８因子を
選択的に分解することによって抗凝固活性を発揮する。

２）・３）この活性はプロティンＳによって増強される
ことが知られている。”　Ａ　Ｐ　Ｃはまた、組織プラ
スミノーゲンアクチベータの阻害剤であるＰＡＩ−１を
切断することにより、線溶促進効果をもつと考えろれて
いる。′〉 ヒトプロティンＣは肝で生合成され、血漿中に約４μｇ
／ｍｌ存在している。ヒトプロティンＣはその生合成の
過程で種々のポスト　トランスレーショナル　モデイフ
ィケーション（Ｐｏｇｔ　ｔｒａｎｓ−ａｔｉｏｎａｌ
　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｌをその分泌細胞内で受け
ることが知られている。シグナルペプチドたるプレ領域
（−４２位〜−２５位〉およびプロ領域（−２５位〜−
１位〉の除去、９ケ所のγ−カルボキシル化、７１位の
β−ヒドロキシル化がこれに含まれる。

さらには４ケ所と思われるＮ−グリコジル化、１５６位
のＬｙｓおよび１５７位のＡｒｇの除去による２本鎖化
といった修飾を受けて細胞外へ分泌される。

γ−カルボキシル化はビタミンに要求性の過程で、プロ
領域の配列がこれに関係しており、特に−１２位から一
１７位の部分が重要であることが明らかにされた。６）
このγ−カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）はカルシウ
ムイオンとの結合性をもち、ＡＰＣの活性発現に必要な
ものである。

ヒトプロティンＣはＧｌａｌミドメインビダーマルグロ
ースファクター（ＥＧＦ）ａｔドメインからなる軽鎖（
分子量約２万１千）と、活性化ペプチド、触媒ドメイン
からなる重鎮〈分子量約４万１千〉とがジスルフィド結
合したちのく２本鎖型）であるが、血漿中には少量なが
ら１本鎖プロティンＣも存在する。ＡＰＣに変換される
際には、１２残基の活性化ペプチドが除去され、それに
伴ってコンホメーションが変化する。ＡＰＣが抗凝固活
性を発揮する際には、触媒ドメインだけでなく、軽鎖も
これに関わっている。軽鎖は、カルシウムイオンを介し
たリン脂質膜への結合や、プロティンＳとの協同作用に
必要な領域である。

一方ＡＰＣは血漿性インヒビターによって阻害を受ける
ことが知られており、これがＡＰＣ活性の血中半減期に
関係していると考えられている。

その主要なものはプロティンＣインヒビター（ＰＣＩ＞
７）とアルファ１アンチトリプシン８〉である。

ヒトプロティンＣまたはヒトＡＰＣはその欠損者の治療
に有効と思われるほか、血栓形成に起因する種々の疾患
の治療に使われるであろう。これには例えば静脈血栓症
、汎発性血管向凝固＜ＤＩＣ〉が含まれる。また線溶療
法の補助剤として使うことも考えられる。

ヒトプロティンＣの製造方法としては、ヒト結晶から精
製する方法があり、それを活性化剤で活性化することに
よりヒトＡＰＣを製造することができる。しかし、原料
となるヒト血漿の供給の問題、エイズウィルス、肝炎ウ
ィルス等の混入の可能性への懸念から組み換えＤＮＡ技
術による製造が検討されている。ヒトプロティンＣをコ
ードするｃＤＮＡは既に明らかにされている。″・１０
ゝこれを用い動物細胞宿主中でプロティンＣを発現させ
ることはすでに行われている。１１〉また２本鎖化への
切断部位近傍を改変することにより、２本鎖化の割合を
増大させた動物細胞での発言方法も開発された。１２〉
　またＡＰＣの直接発現法も開示されている。１３〉 発明が解決しようとする問題点 活性化ヒトプロティンＣを治療薬として用いる場合に問
題となる点はその血中半減期が約２０分と短いことであ
る。従ってこれを有効に投与するには点滴によらざるを
得ない困難がある。

前述のように活性化ヒトプロティンＣの血中半減期を決
定する主要な因子は、プロティンＣインヒビター（ＰＣ
Ｉ　）　、α１−アンチトリプシンといった血漿中の阻
害剤との相互作用にあると考えられている。そこで半減
期の長い活性化ヒトプロティンＣを得るには、こうした
阻害剤との反応性の低下した誘導体をつくればよいと考
えた。これらの阻害剤は、最終的には活性中心のセリン
残基と共有結合をするものであるが、その前段階として
活性中心に接近する必要があろう。活性化ヒトプロティ
ンＣを含むセリンプロテアーゼ類の活性中心部分は、タ
ンパクの立体構造においてその″＜ぼみ”の奥にあると
考えられている。従ってこうした阻害剤は、この“くぼ
み°゛のパふち″に相当する部分とまず相互作用するも
のと思われる。

１０またこの相互作用は主として静脈的相互作用による
ものとして検討を進めた。

一方、この相互作用をプロテアーゼである活性化ヒトプ
ロティンＣ側から眺めてみる。活性化ヒトプロティンＣ
には、セリンプロテアーゼとしての活性発現に必要な領
域（活性中心のＡｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｅｒ残基や、それら
を空間的に適当な位置に固定するアミノ酸残基など）と
、それに特異的な基質の認識に関わる領域とがあろう。

さらにはそれに特異的な阻害剤との相互作用に関係する
領域が在るものと思われる。ただしこの領域は、基質の
認識に関わる領域と異なるかどうかは不明であるが、わ
れわれは、この領域が前述の“′くぼみ”の“ふち”に
相当する部分であると考えた。以上の観点から、第１図
に示すようなヒトプロティンＣ誘導体を蛋白質工学的手
法で作製した。なお、Ｎｏ、　４゜５．６の改変部位は
、他のセリンプロテアーゼ類の対応する部分に共通して
みられる゛コンセンサス”なアミノ酸酸基であり、従っ
て前述のセリンプロテアーゼとしての活性発現に必要な
領域に相当すると考えた。それに対し、他の３つの改変
部位は、活性化ヒトプロティンＣに特有のアミノ酸残基
であり、従って阻害剤との相互作用に関係している可能
性のある部分と考え種々の改変を行なった。

問題を解決するための手段 本発明は、活性化ヒトプロティンＣのアミノ酸配列にお
ける次の３つの条件、すなわち（ｉ）　　活性化ヒトプ
ロティンＣタンパクの立体構造において、その活性中心
Ｈｉｓ（４２）、　Ａｓｐ（８８）、及び５ｅｒ（１９
１）が位置しているくぼみの「ふち」に相当するアミノ
酸残基（但し、番号は重鎮のＮ末を１とする。）； （ｉｉ）　　セリンプロテアーゼ類の「コンセンサス」
なアミノ酸残基でないアミノ酸残基；及び（ｎｉｌ　　
荷電したアミノ酸残基 を満足するアミノ酸残基の１或いは複数個を、逆電荷を
もつ必須アミノ酸残基で置換した配列を有する、活性化
ヒトプロティンＣ誘導体；及び上記活性化ヒトプロティ
ンＣ誘導体の重鎮Ｎ末にアクティベイジョンペプチドが
結合しているヒトプロティンＣ誘導体を提供する。

本発明はまた、上記ヒトプロティンＣ誘導体を、酵素、
例えばトロンビン、トロンビンートロンボモジュリン複
合体或いは蛇毒などによって処理することによりアクテ
ィベイジョンペプチドを切除し、上記活性化ヒトプロテ
ィンＣ誘導体を得る方法を提供する。

上記ヒトプロティンＣ誘導体におけるアクティベイジョ
ンペプチドとしては、下記アミノ酸配列；ＤＴＥＤＱＥ
ＤＱＶＤＰＲ ＥＤＱＥＤＱＶＤＰＲ ＤＱＥＤＱＶＤＰＲ ＱＶＤＰＲ （但し、アミノ酸の一文字表示法による）が挙げられる
。

本発明において示される活性化ヒトプロティンＣ誘導体
の作製はタンパク質工学として知られる組み換えＤＮＡ
技術によって達成される。ヒトプロティンＣのｃＤＮＡ
を改変する方法のひとつはサイト・ダイレフテッド・ミ
ュータジエネシス（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いるもので、実施例の中で具
体的に述べられる。ほかに「カセット変異法」として知
られる方法を用いてもｃＤＮＡの改変は可能である。こ
れは改変したい部分を含むｃＤＮＡＵＴ片を適当な制限
酵素を用いて除去し、代わりに化学合成法で作製した改
変したい形の配列を含むＤＮＡ断片を挿入する方法であ
る。

宿主細胞中で目的のｃＤＮＡを発現される方法は種々知
られている。基本的にはプロモーターと呼ばれる転写に
関わるＤＮＡ配列で、その宿主細胞中で作用を持つもの
を、目的のｃＤＮＡと連結し、それを何らかの方法で宿
主細胞内に導入することで達成される。本発明を実施す
るための宿主細胞は、プロペプチドの除去、糖鎖の付加
、α−カルボキシル化といった修飾が正しくなされるこ
とを期待する意味で、少なくとも真核細胞の中から選ぶ
必要がある。

実施例においては、ヒトプロティンＣ誘導体を発現させ
た後、それを蛇毒由来のプロティンＣ活性化剤で活性化
することにより、活性化ヒトプロティンＣ誘導体を得る
方法が示される。活性化剤としてはほかに、トロンビン
やトロンビン−トロンボモジニリン複合体を用いること
もできる。あるいはまた、活性化ペプチド領域の改変も
同時に行なうことで、はじめから活性化ヒトプロティン
Ｃ誘導体の形で発現させることも可能である。

ヒトプロティンＣまたは活性化ヒトプロティンＣのＥＬ
ＩＳＡによる定量法は既に開発されている。１００本発
明のヒトプロティンＣ誘導体、または活性化ヒトプロテ
ィンＣ誘導体の定量にもこれを応用することができる。

この方法ではＧｌａをもつヒトプロティンＣ誘導体また
は活性化ヒトプロティンＣ誘導体のみを測定することも
できる。

本発明のヒトプロティンＣ誘導体または活性化ヒトプロ
ティンＣの精製には、バリウム吸着法、イオン交換クロ
マトグラフィー法を含む天然型ヒトプロティンＣの精製
法を応用することができるが、カルシウムイオンの有無
によるＧｌａｌミドメインンホメーション変化を認識す
る抗ヒトプロティンＣモノクローナル抗体を使用したア
フイニテイ力ラムクロマトグラフイーを用いるのが特に
好ましい。１６）これは、Ｇｌａを有する、従って抗凝
固活性をもつもののみを精製することができる点と、Ｅ
ＤＴＡという温和な溶離剤が使える点で優れた方法であ
る。

実施例 本発明の実施例では、次の方法を用いた。

ＤＮＡの切断 １μｇのプラスミドＤＮＡまたはＭ１３ファージのレプ
リカティブ・フオーム（ＲＦ）ＤＮＡまたはＤＮＡ断片
の切断は、１０μｍの緩衝液中、４〜１０単位の制限酵
素を用い、メーカーにより指定された温度で２時間保つ
ことにより行なった。緩衝液は、制限酵素に付属のもの
を用いた。

ＤＮＡ断片のアガロースゲルからの回収制限酵素で切断
したＤＮＡ断片は、サブマリン型電気泳動槽を用いた０
、８％アガロースゲル電気泳動で分離した。目的のＤＮ
Ａ断片を含むアガロースゲルを切り出し、ＧＥＮＥＣＬ
ＥＡＮ　（Ｂｉｏ　１０１社）を用いて回収した。方法
は添付の説明書に従った。

ＤＮＡ断片の結合 ＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いて行なっ
た。方法は、添付の説明書に従った。

大腸菌の形質転換 大腸菌８８１０１株のコンピテントセル（宝酒造〉に、
２０μＤ以下のＤＮＡ溶液を加え、１時間氷上に置いた
。次に４２℃の水浴に１分間つけたあと、再び氷上に５
分間置いた。これを１ｍｌのＬ−ブロスに加え、１時間
振盪培養した後、その一部（５０μｍ〜３００μｍ〉を
、゛アンピシリンプレート（Ｌ−ブロス、寒天１５　ｇ
／ｆＪ　、アンピシリン５０μｇ／ｍｌ）にまいて−晩
３７°Ｃで培養し、コロニーを作らせた。

プラスミドＤＮＡの小スケール調製 アルカリ溶菌法による調製を行なった。具体的には”Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”　　（Ｔ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ、　１９８２）の３６８ページに記載の手順に
従った。必要に応じて前述の”　ＧＥＮＥＯＬＥＡＮ”
による精製を行なった。

プラスミドＤＮＡの大スケール調製 基本的には“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔ
ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ、Ｄ、　Ｈａｍｅｇ、　ＩＲ
Ｌ　ｐｒｅｓＳ、　１９８４）の８ページに記載の手順
に従ったアルカリ溶菌法及びＣｓＣｌ平衡密度勾配遠心
法で行なった。ただし、超遠心に用いたローターは日立
製ＲＰ−６７ＶＦバーチカルローターである。またＣｇ
ＣＩの除去は透析によらず、ＴＥ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
　−ＨＣＩ　ｐｉ（８，０，１ｍＭＥＤＴＡ、）で４倍
に希釈後、エタノール沈澱をすることで代えた。

ＤＮＡの塩基配列の決定 ダイデオキシ・チェーン・ターミネーション（ｄｉｄｅ
ｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）法を用
いた。反応に用いた試薬は宝酒造の“’　７−ｄｅａｚ
ａシークエンスキット”のものを使用し、操作手順はそ
れに添付された説明書に従った。ラベルには、”５−Ｃ
ＴＰ　ａ　Ｓ　（４００Ｃｉ　／ｍｍｏｌ、アマジャム
社）を用いた。

電気泳動は６％アクリルアミドの０．３ｍｍ厚のゲルを
使用し、泳動後乾燥してからオートラジオグラフィーに
かけた。用いたテンペレートＤＮＡは、ヒトプロティン
ＣｃＤＮＡの改変操作後は１本鎖ＤＮＡが容易に得られ
るためこれを用いたが、それ以外では２本鎖のプラスミ
ドをアルカリ変性後、中和したものを用いた。その際の
手順は″ベクターＤＮＡ″　（榊佳之、講談社、１９８
６）の６７ページに記載の方法によった。またプライマ
ーは、調べたい部分の近傍の配列１８塩基分を化学合成
し、それを精製して用いた。

ＤＮＡ断片の化学合成およびその精製 ｃＤＮＡの改変のためのプライマー（第４図）および延
期配列決定のためのプライマーはアプライド・バイオシ
ステムズ社３８０Ａ型ＤＮＡ合戒装置で”Ｔｒ　ＯＮ、
　ＡＩＪＴＯ’“の条件で合成した。その精製には同社
製“オリゴヌクレオチド精製カートリッジ”を添付の説
明書に従って用いた。

実施例１ ヒトプロティンＣをコードするｃＤＮＡの取得ヒト肝細
胞より、グアニジンチオシアネート法１７）に従ってｍ
ＲＮＡを抽出した。ヒト肝細胞２×１０８個に５ｍｌの
ＧＴＣ溶液（６Ｍグアニジニウムインチオシアネート、
５＋ｎＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプト
エタノール、０゜５％Ｎ−ラウロイルザルコシン酸ナト
リウム〉を加え、ホモゲナイズした。３．８ｍｌの５．
７Ｍ　Ｃ３ＣＩ　、０．１ＭＥＤＴＡ水溶液の上に重層
し、これをＲＰＳ−４０Ｔローター（日立製）を用いて
、３５．０００ｒｐｍで１５時間、２５°Ｃで超遠心し
た。超遠心後注意深く溶液を取り除いた後、エタノール
約１ｍｌで３回リンスし、１．４ｍｌの水に溶解後エタ
ノール沈澱させた。この沈澱を０．５Ｍ　Ｎａｉ！　、
　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）、
１ｍＭＥＤＴＡ、　０．０５％ＳＤＳの組成の洗浄後０
．５ｍｌに溶解し、０．５ｍｌのＯｌｉｇｏ　　（ｄＴ
）セルロースカラムを通した。

このカラムを上記洗浄液で洗った後、１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、１ｍＭＥＤＴＡ、　０．
０５％ＳＤＳの組成の溶出液で溶出し、約３１μｇのｐ
ｏｌｙＡ＋ＲＮＡを得た。これをもとに、Ｇｕｂｌｅｒ
と）！ｏｆｆｍａｎの方法１６）に従い、アマジャム社
製ｃＤＮＡ合成キットを用いてＣＤＮＡを合成した。

５μｇのｐｏｌｙＡ”　ＲＮＡに５０ユニツトのヒト胎
盤由来ＲＮａｓｅ阻害剤（ＨＰＲＩ）の存在下５．ｔｚ
ｇのＱｌｉｇｏ　（ｄＴ）１２〜１８を加え１００ユニ
ツトの逆転写酵素を４２℃で１，５時間働がせて約３０
％の収率で１本ｇｃＤＮＡを合成した。この反応液に４
ユニットの大騙菌すボヌクレアーゼＨと１１５ユニツト
の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ■を加え１２℃で１時間、
２２℃で１時間反応させた後７０℃で１０分間放置して
酵素を失活させた。その後１０ユニツトのＴ４ＤＮＡポ
リメラーゼを加え３７℃で１０分間反応させて、約９５
％の収率で２重鎖ｃＤＮＡを得た。この２重鎖ｃＤＮＡ
に２０ユニツトのＥｃｏＲＩメチラーゼを３７℃で１時
間作用させた後、ＩＩ！ｃｏＲＩ　リンカ−〈宝酒造製
〉を結合させた。これに１６ユニツトのＥｃｏＲＩ（宝
酒造製〉を加え３７℃で２時間反応させた後、セファロ
ースＣＬ−４Ｂカラムを通し、純化した約０．８μｇの
ｃＤＮＡを得た。次にこのｃＤＮＡＯ，４μｇとλｇｔ
　１０アーム１．０μｇ　（ベクタークローニングシス
テムズ社製〉とを連結したものを用いてｉｎ　ｖｉｔｒ
ｏパッケージングを行ない、ヒト肝細胞由来ｃＤＮＡラ
イブラリーを得た。このライブラリーを大腸菌Ｃ６００
ｈｆｌ−株に感染させ、プラークを形成させた。ヒトプ
ロティンＣ遺伝子を含むクローンは次に示す３２ｐで標
識した合成ＤＮＡＰＣ−Ｉ　　ＰＣ−２をプローブとし
たプラークハイブリダイゼーション法により選別した。

ＰＣ−１（５’）　ＡＴＣＧＡＣＧＧＣＡＴＣＧＧＣＡ
ＧＣＴＴＣＡＧＣＴＧＣ：ＧＡＣＴＧＣＣＧＣＡＧＣＧ
　（３’）ＰＣ−２（５’）　ＣＧＣＴＧＣＧＧＣＡＧ
ＴＣＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＴ
ＣＧＡＴ　（３’）ヒトプロティンＣのｃＤＮＡを含む
λｇｔ　１０フアージからのＤＮＡの調製は、Ｔｈｏｍ
ａｓとＤａｖｔｓの方法により行なった。このＤＮＡを
ＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、
ヒトプロティンＣのｃＤＮＡ断片を回収した。このＤＮ
Ａ断片を、あらかじめＥｃｏＲＩ処理、およびバクテリ
アのアルカリ性ホスファターゼで処理したＰｔ１Ｃ８と
ライゲーションすることによりＰＯＣ３−ＰＣＩを造成
した。

このヒトプロティンＣＣＤＮＡの塩基配列を調べたとこ
ろ、完全長ヒトプロティンＣｃＤＮＡと比較してその５
′側部分が約５０塩基対欠けていることがわかったため
、実施例２で述べる方法でその部分を補った。

実施例２ 天然型ヒトプロティンＣ発現ベクターの造成第２図に示
されるように、実施例１で得られたＰＯＣ８−ＰＣＩを
それぞれ１ケ所づつ切断部位をもつＨｉｎｄＩＩＩとＳ
ａｃ　■で切断してアガロースゲル電気泳動にかけ、Ｓ
ａｃ　■−Ｈ１ｎｄＩＩ［の小断片を回収した。

（これをＡ断片とする。）またＰＯＣ３−ＰＣＩをＳａ
ｃ　ＩＩとＥｃｏＲＩで切断してアガロースゲル電気泳
動にかけ、Ｓａｃ　Ｉ［より５′側のＥｃｏＲＩ　−５
ａｃ　ＩＩ断片を回収した。このＤＮＡ断片をさらに、
この断片中１ケ所の切断部位をもつＤｄｅ　Ｉで切断し
た後アガロースゲル電気泳動にかけ、Ｄｄｅ　Ｉ　−３
ａｃ　ＩＩ断片を回収した。〈これをＢ断片とする。〉 一方、翻訳開始点の上流から、上記Ｄｄｅ　工までのＤ
ＮＡ断片を５′側は旧ｎｄＩＩ［で切断された形で、３
′側はＤｃ［ｅ　工で切断された形で化学合成法により
合成した。（これをＣ断片とする。）次にそれぞれ１ケ
所の旧ｎｄ［、Ｓａｃ　ＩＩ切断部位をもつｐＮＡＫを
ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃ　ＩＩとで切断し、アガロース
ゲル電気泳動にかけることにより旧ｎｄ■−３ａｃ　■
断片（アンピシリン耐性遺伝子および大腸菌中での複製
開始点を含む）を回収した。このＤＮＡ断片と上記Ｂ断
片、Ｃ断片との３分子ライゲーションを行ない、ｐＮＡ
Ｋ−ＰＣＵを造成した。次にこのｐＮＡＫ−ＰＣＵを旧
ｎｄＩＩＩとＳａｃ　■で切断し、アガロースゲル電気
泳動にかけることにより、旧ｎｄＩ［ｌ−５ａｃ　■小
断片を回収した。（これをＤ断片とする〉 一方、ｐｓＶ２−ｇｐｔ　１９）をＡｐａ　Ｉで部分消
化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、２ケ所のＡｐａ
　エサイトのうち１ケ所だけが切断されたもの（ｌｉｎ
ｅａｒ型）を回収し、さらにＨｉｎｄＩＩ［で完全消化
後再びアガロースゲル電気泳動にかけ、第２図に示した
旧ｎｄｌ［−（Ａｐａ　Ｉ）　−Ａｐａ　工断片を回収
した。この断片にＤＮＡポリメラーゼエクレノウ断片と
デオキシリボヌクレオチド三りん酸を作用させて、旧ｎ
ｄＩＩＩサイトおよびＡｐａ　エサイトを平滑末端化し
た。このＤＮＡ断片にりん酸化された旧ｎｄ■リンカー
（宝酒造〉をライゲーションした後、ＨｉｎｃｌＩＩ［
処理を行ない、アガロースゲル電気泳動にかけ再び回収
した。このＤＮＡ断片を分子内でうイゲーションしたも
のを大腸菌ＨＢＩＯＩに導入することにより、これを増
やした。この大腸菌より抽出したプラスミドＤＮＡを再
び旧ｎｄｉ［で切断し、バクテリアのアルカリ性ホスフ
ァターゼで処理したものと、上記Ａ断片およびＤ断片と
３分子ライゲーションし、天然型ヒトプロティンＣ発現
ベクターｐＳＶ２−ＰＣＩを得た。

実施例３ ヒトプロティンＣ誘導体発現ベクターの造成第３図に示
すように実施例２で造成したｐｓＶ２−ＰＣＩを旧ｎｄ
ｎＩで切断し、アガロースゲル電気泳動にかけ、ヒトプ
ロティンＣｃＤＮＡ部分を回収した。このＤＮＡ断片を
、あらかじめ旧ｎｄＩＩ［およびバクテリアのアルカリ
性ホスファターゼで処理したＭ１３　ｍｐｌ、１のレプ
リカテイブ・フオーム（ＲＦ）ＤＮＡとライゲーション
し、これを大腸菌ＴＧ−１株に導入し、プラークを生じ
させた。このプラークから組み換えＭ１３ファージをよ
うじでとり、２０μｍの大腸菌ＴＧ−１株の一晩培養液
とともに２ｍｌの２ＸＴＹ培地に加え、５時間３７℃で
振盪培養を行なった。この培養液中の大腸菌を集め、ア
ルカリ溶菌法でレプリカティブ・フオーム（ＲＦ）ＤＮ
Ａを調製し、制限酵素切断による解析で、ヒトプロティ
ンＣｃＤＮＡがＭ１３の遺伝子とは逆方向に挿入された
クローンを同定した。このクローンを培養した時の培養
上清中の組み換えＭ１３ファージから、アマジャム社“
Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｔｄｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｔｓ　ｓｙｓｔｅ
ｍ”に添付の手順書に従ってテンペレートＤＮＡを調製
した。

このテンペレートＤＮＡと、第４図に示したプライマー
を用い、アマジャム社”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ
ｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ”を、それに添付の説明書に
従って使用することによりヒトプロティンＣ誘導体ｃＤ
ＮＡを作製した。これは基本的にはＦ、　Ｅｃｋｓｔｅ
ｉｎらの方法によるものである。′。）得られたヒトプ
ロティンＣ誘導体ｃＤＮＡを含むＭ１３ファージレプリ
カティブ・フオームＤＮＡを大腸菌ＴＧ−１株に導入し
、プラークを生じさせた。このプラーク中の組み換えＭ
１３ファージを前述の方法で２ｍｌのスケールで培養し
、その培養上清から組み換えＭ１３ファージをポリエチ
レングリコール沈殿により調製し、それをフェノール処
理することにより、１本鎖ＤＮＡを得た。具体的にはア
マジャム社”Ｍ１３　ａｔｏｎｉｎｇ　ａｎｄｓｅｑｕ
ｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ”に添付のハンドブックに従った
。

この１本鎖ＤＮＡをテンペレートとし、化学合成した改
変部近傍の１８塩基（十鎖）をブライマーとして塩基配
列決定の操作を行ない、目的の改変がなされたクローン
を選別した。保存しておいたそのクローンに対応する菌
体から、アルカリ溶菌法により組み換えＭ１３ファージ
のレプリカテイブ・フオーム（ＲＦ）ＤＮＡを調製した
。これをＢｔ。

１０１社“ＧＥＮＥＣＬＥＡＮ”で精製し、Ｓａｃ　Ｉ
［とＮａｅ　工＜Ｎｏ、１）　、またはＡｖａ　Ｉ　（
Ｎｏ、２〜７）で消化したものをアガロースゲル電気泳
動にかけ、改変部分を含むＤＮＡ断片を回収した。また
ｐＳＶ２−ＰＣｌもＳａｃ　ＩＩとＮａｅ　工（Ｎｏ、
ｌ）　、またはＡｖａ　■（Ｎｏ。

２〜７）で消化し、バクテリアのアルカリ性ホスファタ
ーゼで処理したものをアガロースゲル電気泳動にかけ、
大きい方の断片を回収した。これらの改変部分を含むＤ
ＮＡ断片と、同じ制限酵素で切断したｐＳＶ２−ＰＣＩ
のＤＮＡ断片とをライゲーションし、大腸菌ＨＢＩＯＩ
株に導入した。得られた形質転換体からプラスミドをア
ルカリ溶菌法で調製し、旧ｎｄＩ［Ｉおよび組み換えに
用いた制限酵素で切断後、アガロースゲル電気泳動で解
析し、目的の組み換えがなされたものを選別した。さら
に、これらのｐｌａｓｍｉｃ［について改変部分近傍の
塩基配列を調べ、正しい組み換えがなされていることを
確認した。また、この組み換えに用いた改変部分を含む
ＤＮＡ断片全領域についてＭ１３　　ＤＮＡに組込まれ
た状態または発現ベクターの形のプラスミドの状態で塩
基配列を調べ、意図しない改変が起きていないことを確
認した。こうして得られた発現ベクターを含む大腸菌を
４００　ｍｌのＬ−ブロス中で培養したものからプラス
ミドを抽出し、ヒトプロティンＣ誘導体発現ベクターと
して実施例４の発現に用いた。

実施例４ ヒトプロティンＣ誘導体の発現 Ｃｏ５−７細胞＜ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５１）をファル
コン３ｏ２５シャーレを用い、シャーレ当り３０ｍ１の
１０％ＦＣ３−ｅＲＤＦ中で培養した。はぼコンフルエ
ントになったシャーレに１２枚分の細胞をトリプシン処
理ではがし、Ｐ　Ｂ　Ｓ　Ｈ６０ｍ１の中に懸濁したも
のを１１０００ｒｐ室温で５分間遠心し、上滑を除いた
。再度６０ｍ１のＰ　Ｂ　Ｓ　（−）に懸濁し、１１０
００ｒｐ室温で５分間遠心し、上清を除いたものを０．
９ｍｌのＰＢＳ（−）に懸濁した。一方ヒドブロチイン
Ｃ誘導体発現ベクター９６μｇはあらかじめ１゜５　ｍ
ｌエッペンドルフチューブの中でエタノール沈澱するこ
とにより滅菌しておき、１５０００ｒｐｍ　１０分間遠
心後、無菌的に上清を除き、ＰＢＳ（−）０．６　ｍｌ
に溶解した。

これを上記のＣｏ５−７細胞の懸濁液と混合しくほぼ２
．４ｍｌとなる）、バイオラット社“ＧＥＮＥ　ＩＩＩ
ＬＳＥＲ”用キスベット（０，８ｍ１）３個に分注した
。バイオラット社”ＧＥＮＥ　ＰＵＬＳＥＲ”を用い、
１００ＯＶ　、２５μＦ１回の条件でエレクトロポレー
ションを行なった。すみやかに細胞懸濁液をファルコン
２０５９チェーブに移し、１０ｍ１のｌＯ％ＦＣ３−ｅ
ＲＤＦ−２ｐ。

ｇ／ｍｌビタミンに１を滴下しながらゆるやかに振盪し
、希釈した。これを３０ｍ１のｌＯ％ＦＣ８−ｅＲＤＦ
−２μｇ／ｍｌビタミンに１を入れたファルコン３０２
５シャーレ１２枚に１ｍｌづつ加え、希釈した。

これをＣＯ２インキスベーターで２４時間培養後、シャ
ーレ当り５ｍｌのＰ　Ｂ　Ｓ　（−）で２回よく洗い、
工ＴＥＳ−ｅＲＤＦ−２μｇ　／ｍｌビタミンＫｌの無
血清培地をシャーレ当り３０ｍ１加え、さらに４８時間
培養し、その培養上清を回収した。（ＩＴＥＳ：９μｇ
／ｍ！インスリン、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、
１０μＭエタノールアミン２　Ｘ　１０−８Ｍセレナイ
ト、ｅＲＤＦ：極東製薬製） 同量のＩ　ＴＥ　Ｓ　−ｅＲＤ　Ｆ　−２μｇ　／ｍｌ
ビタミンに１を加え、再び４８時間培養し、その培養上
清を回収する操作をあと２回行なった。こうして改変ヒ
トプロティンＣを含む培養上清を得た。

これらの培養上清中のヒトプロティンＣ誘導体の濃度、
またはＧｌａをもつヒトプロティンＣ誘導体の濃度の測
定はサイドイッチＥＬＩＳＡ法で行なった。プレート側
のモノクローナル抗体はＪＴＣ−４（Ｈ鎖認識〉を用い
、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　Ｏ’　）標識
抗体としてＪＴＣ−１（Ｃａ２＋に依存してＧｌａ　ド
メインを認識、ＧｌａをもつヒトプロティンＣ誘導体の
測定用〉またはＪＴＣ−５（活性化ペプチド認識、ヒト
プロティンＣ誘導体全体の測定用）を用いた。２１′測
定に際しては、アメリカン　ダイアグノスチ力社の血漿
由来のヒトプロティンＣを用いて検量線を描いた。第１
表に培養上清中のヒトプロティンＣ誘導体の濃度を示す
。

第１表 ヒトプロティンＣ誘導体の発現量 （培養上清中〉 実施例５ ヒトプロティンＣ誘導体の精製 実施例４で得られた培養上清をメンブレンフィルター（
ミリポア）に通し、ｃｅｌｌ　ｄｅｂｒｉｓを除いたの
ち、５ｍＭ　　ＣａＣＩｚ　、　０．０２％ＮａＮ３２
５単位／　ｍｌアプロチニン、１ｍＭベンザミジンを加
えた〈濃度はいずれも最終濃度〉。あらかじめセルロフ
ァインにＪＴＣ−３”）をカップリングさせたもので、
〜１　ｍｌのｂｅｄ　ｖｏｌｕｍｅのカラムを作り、５
ｍＭＣａＣｌ２−ＴＢＳ　（ｐＨ７，４）−０，０２％
ＮａＮ３で平衡化しておいた。これに２０ｍ１／ｈ　、
　４°Ｃの条件で培養上清を加え、さらに同条件で５ｍ
ＭＣａＣｌ２−Ｉ　Ｍ　ＮａＣｌ　−５０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ　−ＨＣＩ　＜ｐｔｌ　７゜４）で４時間洗った。溶
出は８ｍｌの１０ｍＭＥＤＴＡ−ＴＢＳ　（ｐＨ７，４
１０，０２％ＮａＮ３で２０ｍ１／ｈで行なった。次に
ＣａＣｌ２をＥＤＴＡに対応する量よりｌｏｍＭ　（ｆ
ｉｎａｌ１分だけ多く加え、さらにセントリコン１０（
アミコン）で３００μｍ程度に濃縮した。一部分を希釈
しＥＬＩＳＡでその濃度を測定した。

実施例６ 活性化ヒトプロティンＣ誘導体の合成基質切断活性 実施例５で得られた精製ヒトプロティンＣ誘導体０．５
μｇに、１００　ｔｔｆＪの３　ｍＭ　　ＣａＣＬ　　
Ｔ　Ｂ　５（ｐＨ７，４）　、１０ｎｇのトロンビンお
よび２４ｎｇのトロンボモジュリンを加え、３７℃で１
時間保つことにより活性化ヒトプロティンＣ誘導体とし
た。これを３ｍＭ　　ＣａＣｌ２−ＴＢＳ　（ｐＨ７，
４）で段階的に希釈し、２ｍｌの０．１Ｍ　　Ｃ５Ｃｌ
−５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ　＜ｐ）Ｉ８、Ｏ）お
よび２０μｍのｌｏｍＭ　Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−９ｅｒ−Ｔ
ｈｒ−Ａｒｇ−ＭＣＡ　（活性化プロティンＣ活性測定
用合成基質）を加え、３８０μｍの光で励起し、４４０
μｍの蛍光を測定することにより、これらの活性化ヒト
プロティンＣ誘導体の合成基質切断活性を調べた。結果
を第５図に示す。Ｎｏ、４．５．６の誘導体は比活性が
大きく低下しているのに対し、Ｎｏ、１．２．３の誘導
体は天然型とさほど変らない比活性を有していた。

実施例７ 活性化ヒトプロティンＣ誘導体（Ａｒｇ（１８３）→Ａ
ｓｐ）の抗凝固活性 実施例５で精製したヒトプロティンＣ誘導体（Ａｒｇ（
１８３）→Ａｓｐ）　２　ｕ　ｇを０，１％ＢＳＡ−Ｔ
ＢＳ（ｐｉｆ　７．４＞で１６０μＤに希釈し、４０μ
ｍのＩＵ／ｍ１のプロタック（アメリカンダイアグノス
チ力社〉を加え、３７℃で１．５時間保ち、活性化ヒト
プロティンＣ誘導体とした。これを希釈して、１２．５
．２５゜５０　１００、２００μｇ１５０μｆＪＯ，１
％ＢＳＡ−ＴＢＳ（ｐＨ７，４）とした。３７℃に２分
間保った１００μｍのシスメックス、コントロール血漿
■に、このサンプルと、５０μｍのシスメックスＡＰＴ
Ｔ試薬を加えて攪拌し、３７℃に２分間保ったのち、１
００μｇの２５ｍＭ　　ＣａＣｌ２を加えて攪拌し、シ
スメックスＣＡ−１００型血液凝固分析器でＡＰＴＴを
測定した。天然型の活性化ヒトプロティンＣと比較した
結果を第６図に示す。Ａｒｇ（１８３）→Ａｓｐの誘導
体は天然型の約６割の比活性を示した。

実施例８ 活性化ヒトプロティンＣ誘導体の血漿中での失活化速度 実施例６で合成基質切断活性が天然型とあまり変らなか
ったＮｏ、１．２．３の３種の誘導体について、その血
漿中での失活化速度を調べた。実施例６と同様に活性化
したプロティンＣ誘導体１μｇを、５５０μｍのヒト血
漿に加え、２５０７ｍ１のアプロチニン、１００　μＨ
のＭＤ８０５　　（いずれもｆｉｎａｌ）存在下３７℃
で０．５．１０．２０．６０分保ち、各時間ごとに１０
０μＤサンプリングし、その合成基質切断活性を実施例
６と同様に調べた。時間が０のときを１００としたとき
のデータを第７図に示す。Ｎ０１１２．３のいずれの誘
導体もその失活化速度が低下していることがわかる。

実施例９ 活性化ヒトプロティンＣ誘導体のＰＣＩによる阻害速度 Ｎｏ、　３の誘導体の、精製プロティンＣインヒビター
　（ＰＣＩ　）によって阻害される速度を天然型ＡＰＣ
と比較した。実施例６と同様にヒトプロティンＣまたは
その誘導体を活性化し、１００　ＪｉＭ　　（最終濃度
〉のＭＤ−８０５を加えてその反応を止めた。１μｇの
精製したＰＣＩに各濃度のＡＰＣ１１００μｇの０．１
％ＢＳＡ−３ｍＭ　　ＣａＣｌ２−ＴＢＳ　＜ｐＨ７゜
５）、１０μｍの６５μｇ／ｍｌデキストラン硫酸を加
え室温で３０分間反応させた。残存するＡＰＣ活性を実
施例６と同様に、合成基質切断活性を指標として調べた
。その結果を第８図に示す。横軸はＰＣＩ／ＡＰＣの比
、縦軸は残存ＡＰＣ活性を示す。

Ｎｏ、　３の誘導体は天然型ＡＰＣよりＰＣＩによって
阻害されにくくなっていることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は天然型ヒトプロティンＣのアミノ酸配列と、本
発明において検討した改変部位を示す。 第２図は天然型ヒトプロティンＣ発現ベクターの造成プ
ロセスを示す。 第３図はヒトプロティンＣ誘導体発現ベクターの造成プ
ロセスを示す。 第４図はヒトプロティンＣｃＤＮＡの改変に用いた合成
プライマーの塩基配列を示す。 第５図は活性化ヒトプロティンＣ誘導体の合成基質切断
活性を示す。 第６図は活性化ヒトプロティンＣ誘導体（Ａｒｇ（１８
３）→Ａｓｐ）の抗凝固活性を示す。 第７図は活性化ヒトプロティンＣ誘導体の血漿中での失
活化速度を示す。 第８図は活性化ヒトプロティンＣ誘導体（Ａｒｇ＜１８
３）→Ａｓｐ）の精製プロティンＣインヒビターによる
阻害速度を示す。 参考文献 １）　　Ｅｓｍｏｎ　ＣＴ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａ
ｃａｄ　Ｓｃｉ　ｔｌｓＡ、　７８゜２２４９、　　（
１９８１＞ ２）　　Ｖｅｈａｒ　ＧＡ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　１９．４０１．　　（１９８０）３）　　Ｗａｌｋ
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ｔａ、　５７１゜３３３、　　（１９７９１ ４）　　Ｗａｌｋｅｒ　ＦＪ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ
ｍ、　２５６．１１１２８＋１９８１） Ｃａｍｐ　ＰＣ，Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、　６８
．１２２１．　　（１９８１）Ｆｏｓｔｅｒ　ＤＣ，Ｂ
ｔｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ、　２６．７００３．　　（
１９８７＞５ｕｚｕｋｉ　Ｋ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ
ｍ、　２５８．１６３．　　（１９８３）Ｈｅｅｂ　Ｍ
Ｊ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２６３．１１６１３
．　　（１９８８）Ｆｏｓｔｅｒ　ＤＣＰｒｏｃ　Ｎａ
ｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　８１゜４７６６、
　　＜１９８４１ １０）　　Ｂｅｃｋｍａｎｎ　ＲＪ、　　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　　１３．　５２３３゜（１
９８５） １１）イーライ・リリー社　特開昭６ｌ−２０５４８７
１２）ザイモジェネティクス社　特開昭６２−１１１６
９０１３）ザイモジェネティクス社　ＥＰ　２６６１９
０１４）鈴木宏治、蛋・核・酵、３４．　　（８）、　
９４９゜＜１９８９１ １５）蛮人　特開昭６ｌ−２８３８６８１６）蛮人　特
開昭６ｌ−１３４９９ １７）　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ＪＭ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　１８．５２９４゜（１９７９＋ １８）　Ｇｕｂｌｅｒ　Ｕ、　Ｇｅｎｅ、　２５．２６
３．　　（１９８３）１９）　Ｂｅｒｇ　Ｐ、　Ｐｒｏ
ｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　７８．２
０７２゜＋１９８１＋ ２０）　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　Ｆ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ
ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８７４９゜（１９８５＋ ２１）　Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉ　Ｋ、　Ｊ　Ｂｉｏｌ
　Ｃｈｅｍ、　２６１．１１０９７゜（１９８６＋ ｒｇ Ａｓｐ 第４図 Ｄ（４５）４口の改変用 アミノ酸Ｎｏは日録 Ｎ末を１（以下同） Ｄ（１８２）→Ｒ Ｒ（＋８３）→Ｄ Ｄ（１８５）→Ｒ Ｗ（２１１）→Ｄ Ｅ（２１３）→Ｒ ４９２−

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）活性化ヒトプロテインＣのアミノ酸配列において
   次の３つの条件を満たすアミノ酸残基のうちひとつある
   いは複数個を逆電荷をもつ必須アミノ酸残基で置換した
   配列を有することにより、天然の活性化ヒトプロテイン
   Ｃに比較して延長された血中半減期を有することを特徴
   とする活性化ヒトプロテインＣ誘導体。 （条件） ［１］活性化ヒトプロテインＣタンパクの立体構造にお
   いて、その活性中心Ｈｉｓ（４２）、Ａｓｐ（８８）、
   Ｓｅｒ（１９１）が位置しているくぼみの「ふち」に相
   当する部分にあるアミノ酸残基であること。 （ここで番号は重鎖Ｎ末端を１とした。以下同） ［２］他のセリンプロテアーゼ類における対応部分と共
   通性のないアミノ酸残基であること。 すなわち、セリンプロテアーゼ類における 「コンセンサス」なアミノ酸残基でないこと。 ［３］荷電したアミノ酸残基であること。
2. （２）置換されるアミノ酸残基がＡｓｐ（２０）、Ｌｙ
   ｓ（２２）、Ｌｙｓ（２３）、Ｌｙｓ（２４）、Ａｓｐ
   （４５）、Ｌｙｓ（４８）、Ｌｙｓ（４９）、Ａｓｐ（
   １８２）、Ａｒｇ（１８３）の中から選ばれたひとつま
   たは複数個である前項記載の活性化ヒトプロテインＣ誘
   導体。
3. （３）酵素的に活性化することにより請求項１または２
   に記載の活性化ヒトプロテインＣ誘導体となるヒトプロ
   テインＣ誘導体。
4. （４）前項記載のヒトプロテインＣ誘導体を酵素的に活
   性化することにより、活性化ヒトプロテインＣ誘導体を
   得る方法。
5. （５）請求項１から３に記載の活性化ヒトプロテインＣ
   誘導体またはヒトプロテインＣ誘導体をコードするＤＮ
   Ａ配列。