JP2005278550A - ２本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造法 - Google Patents

Abstract

【課題】より高活性をしめす２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造方法を提供する。
【解決手段】１本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質とヒトカリクレイン８とを接触させることを特徴とする、２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造法。
【選択図】なし

Description

本発明は、２本鎖組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の製造方法、並びに該方法により製造される高活性型２本鎖ｔ−ＰＡからなる医薬に関する。

血液凝固反応は、フィブリンの凝塊を生ずるプロセスとして、種々の血液因子が複雑に絡んだ相互作用によって行われる一連の反応である。この血液凝固反応と対応するように、フィブリンの凝固塊（フィブリン血栓）の分解、すなわち線溶反応は、種々の酵素並びに蛋白質によって高度に制御されている。その中心的な役割を担うのが、酵素前駆体プラスミノーゲンから変換されるプラスミンである。

酵素前駆体プラスミノーゲンは、１本鎖糖タンパク質で、主に肝臓で合成後に血中に分泌されて１０−２０ｍｇ／ｄｌの血中濃度で存在している。酵素前駆体プラスミノーゲンは、必要な場所で限定分解作用を受けて、プラスミンへと変換される。

この酵素前駆体プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を司る蛋白質が、プラスミノーゲンアクチベーターと呼ばれる蛋白質群であり、そのひとつに組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）がある。

ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ｔ−ＰＡなどのプラスミノーゲンアクチベーターは、血栓溶解剤として用いられているが、中でもｔ−ＰＡは、その高いフィブリン特異性と強力な血栓溶解能によって、心筋梗塞や脳梗塞などの血栓疾患に対する、血管を閉塞したフィブリン塊を溶かす治療（線溶療法）に多く利用されている。

ｔ−ＰＡは、複数の生理活性部分の明確な領域（ドメイン）を有するという分子構造を採っている。すなわち、Ｎ端末の最初の領域はフィブロネクチンと相同性のある領域、成長因子と相同性のある領域、つづいて２つのクリングル領域があり、最後に、他のセリンプロテアーゼと類似性の見られる活性部位をもつ。

かかる構造的特長を有するｔ−ＰＡは、通常、１本鎖の糖タンパク質（分子量６５，０００〜７２，０００）として血管内皮細胞で主に合成されて血中に分泌され、プラスミノーゲンとともにフィブリン血栓に付着して、効率良くプラスミンを生成させる。そして、フィブリンの存在下に、ｔ−ＰＡは分子の中央領域内の一ヵ所の部位（Ａｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６の部位）で開裂され、ジスルフィド結合で連結された２本鎖となって活性化される。２本鎖構造のうち、重鎖（分子量４０，０００および３７，０００の２つの型）はｔ−ＰＡ分子のＮ端末側に由来し、これに対して軽鎖（分子量３３，０００）はＣ末端側に由来する。

ｔ−ＰＡは、線溶系において、次の４種の異なった特性を有する：（１）プラスミノーゲンを開裂して、フィブリンを分解するプラスミンを生産するプロテアーゼ機能、（２）プラスミノーゲン分解活性におけるプラスミノーゲンアクチベーターのフィブリン依存性、（３）ｔ−ＰＡのフィブリン表面への結合性、（４）プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤の阻害に対する感受性、である。

これらの要因の各々が、フィブリン血栓存在下でのｔ−ＰＡによるプラスミノーゲンからプラスミンへの変換、フィブリン血栓を溶解するまでの速さや特異性などに影響している。従って、ｔ−ＰＡが、これらの特性を発揮できる最も高活性な分子形態をとることが、医薬用途への応用では特に求められる。

ｔ−ＰＡの分子形態については、野生型のｔ−ＰＡは十分に成熟型のセリンプロテアーゼとしては産生されていないことが知られている。すなわち、ｔ−ＰＡは天然には分子量約６５，０００〜７２，０００の１本鎖のポリペプチド（１本鎖ｔ−ＰＡ）として血管内皮細胞から産生され、この１本鎖ｔ−ＰＡが、Ａｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６の部位で特異的に切断されて２本鎖ｔ−ＰＡへとなり、高活性型へと変換される。フィブリン存在下では、２本鎖は１本鎖の５〜１０倍も、プラスミノーゲンからのプラスミンへの変換に関し、高活性であることが報告されている（非特許文献１）。したがって、この１本鎖から２本鎖への変換操作も、またｔ−ＰＡの高活性化のための重要な検討事項である。

２本鎖ヒトｔ−ＰＡの調製については、ヒトメラノーマ細胞の培養液からクロマトグラフィー法により精製するという方法が報告されている（非特許文献２）。

また、ヒトメラノーマ細胞が産生した１本鎖ｔ−ＰＡが、インビトロにおいて、トリプシン、血液凝固因子Ｘａ、プラスミン、および膵臓カリクレインによって２本鎖ｔ−ＰＡに変換されるという報告がある（非特許文献３）。しかしながら、この変換操作に関しては、ものの、まだ見るべき技術は確立していない。現実にヒトｔ−ＰＡ製剤として利用されているものは、１本鎖ヒトｔ−ＰＡである。

また、本発明者らのグループでは、排卵前の卵巣濾胞液中のα２マクログロブリン／プロテアーゼ複合体が、非会合状態で１本鎖ｔ−ＰＡから２本鎖ｔ−ＰＡに変換するらしいことを観察している（非特許文献４）。

しかしながら、これらの技術においては、２本鎖ヒトｔ−ＰＡの効率的な調製方法は未だ確立されてはおらず、また、卵巣濾胞液中の非会合状態でのプロテアーゼ分子の実体は明らかにされておらず、このプロテアーゼの産業上の利用についても何ら示唆されてはいない。
ウォレンら（Ｗａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．）、ヨーロピアン・ジャーナル・オブ。バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第１３２巻、ｐｐ．６８１−６８６、１９８３年。 Ｋ．．タチアスとＥ．Ｌ．．マジソン（Ｋ．Ｔｃｈｉａｓ ＆ Ｅ．Ｌ．Ｍａｄｉｓｏｎ）著、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）誌、第２７１巻、第４６号、ｐｐ．２８７４９−２８７５２、１９９６年。 Ａ．イチノセ（Ａ．Ｉｃｈｉｎｏｓｅ）他著、フェブスレター（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ）誌、第１７５巻、ｐｐ．４１２−４１８、１９８４年。 Ｊ．オーニシ（Ｊ．Ｏｈｎｉｓｈｉ）他著、モレキュラー・レプロダクション・アンド・デベロップメント（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）誌、第６７巻、ｐｐ．１７８−１８５、２００４年。

上述のとおり、ｔ−ＰＡを２本鎖ヒトｔ−ＰＡとして高活性化することは、ｔ−ＰＡの医薬としての有用性をさらに高めることになるため、その技術開発が待ち望まれている。

本発明者らは、１本鎖ヒトｔ−ＰＡが２本鎖ｔ−ＰＡへと変換される生化学的制御機構について研究を行った結果、カリクレイン８と称される蛋白質がその変換を触媒していること、ならびにこの反応がインビトロでも再現され得ることを確認し、本発明を完成した。すなわち、本発明は、２本鎖ヒトｔ−ＰＡからなる医薬の製造におけるヒトカリクレイン８の使用に関し、詳しくは、１本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質からの２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造におけるヒトカリクレイン８の使用に関する。

（カリクレイン８）
カリクレインは、キニンの活性化に関与するエンドプロテアーゼの一種であり、キニノゲンを蛋白分解によりブラジキニンまたはカリジンに変換する酵素群として見出された蛋白質の総称である。

現在までに１５種の遺伝子（ヒトカリクレイン１〜ヒトカリクレイン１５）が同定され、一部は癌のバイオマーカーとしての意義も報告されている。また、これまでの研究により、ヒトカリクレイン８（別名ｏｖａｓｉｎ／ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ）は、中枢神経系や皮膚、卵巣等で発現されており、神経疾患や卵巣癌に関係していることが示唆されている（Ｇ．Ｍ．Ｙｏｕｓｅｆ ＆ Ｅ．Ｐ．Ｄｉａｍａｎｄｉｓ著、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ誌、第２２巻、第２号、ｐｐ．１８４−２０４、２００１年）。しかしながら、ヒトカリクレイン８を含め、カリクレインが、１本鎖ｔ−ＰＡから２本鎖ｔ−ＰＡへの変換に関与することについては、いまだ報告はなされていない。

ヒトカリクレイン８自体は公知の蛋白質であり、それをコードする遺伝子も既に単離され、その具体的な塩基配列がＤＤＢＪ Ｎｏ．ＡＢ００９８４９として登録されている。

本発明により利用可能なヒトカリクレイン８は、典型的には、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるヒトカリクレイン８である。このヒトカリクレイン８のアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ Ｎｏ．ＡＢ００９８４９に登録されているＤＮＡ（配列番号２）の核酸配列にコードされているものである。しかしながら、１本鎖ヒトｔ−ＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６の部位を特異的に切断する機能を有している限り、本発明において使用可能なヒトカリクレイン８は、配列番号１に示されたアミノ酸配列からなるヒトカリクレイン８には限られない。

例えば、配列番号１に示されたアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、置換等された変異体であっても、１本鎖ヒトｔ−ＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６の部位を特異的に切断して、プラスミノーゲンをプラスミンに変換する機能を有する２本鎖ヒトｔ−ＰＡを生成させる機能を有している限り、それら変異体は、本発明において使用可能なヒトカリクレイン８に該当する。

かかる変異の例としては、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えない保存性の高いアミノ酸残基相互の変換を挙げることができる。例えば、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能を失わない変異も許容される。

（ｔ−ＰＡ）
本発明によりヒトカリクレイン８と接触させる１本鎖ヒトｔ−ＰＡは、典型的には、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる１本鎖ヒトｔ−ＰＡである。この１本鎖ヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列は、ＤＤＢＪ Ｎｏ．ＮＭ＿０００９３０に登録されているＤＮＡ（配列番号４）の核酸配列にコードされているものである。しかしながら、ヒトカリクレイン８と接触させることで切断を受けるＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６に相当する部位が保持され、かつ２本鎖の形態となった場合にプラスミノーゲンをプラスミンに変換する機能を有している限り、本発明において使用可能な１本鎖ヒトｔ−ＰＡは、配列番号３に示されたアミノ酸配列からなる１本鎖ヒトｔ−ＰＡには限られない。

例えば、糖鎖結合部位の減少とＣ末端でのアミノ酸の欠失ならびに開裂部位でのアミノ酸の置換等を有する変異体（特許第２５７５３６号参照）、野生型ｔ−ＰＡの４６６から４７０位に連なるアミノ酸を欠失させたり、あるいは野生型ｔＰＡの２９６−２９９位（両端を含む）内のアミノ酸残基が置換されている変異体（特許第３０８１２３８号参照）、成長因子ドメインを欠失させて血中クリアランスを延長させた変異体（Ｊ．Ｍｉｃｈａｅｌ他著、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２６３巻、第４号、ｐｐ．１５９９−１６４２、１９８８年参照）、より高機能化を目指したウロキナーゼとｔ−ＰＡのハイブリッド体（Ｓ．Ｇ．Ｌｅｅｓ他著、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌、第２６３巻、第６号、ｐｐ．２９１７−２９２４、１９８８年参照）などの形態であっても、当該変異を有する１本鎖ヒトｔ−ＰＡの形態から、対応する２本鎖ヒトｔ−ＰＡを調製することができる。

また、かかる公知の変異体以外であっても、先に述べたヒトカリクレイン８と同様に、配列番号３に示されたアミノ酸配列において１以上のアミノ酸残基が欠失、付加、置換等された変異体であっても、Ａｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６に相当する部位が保持されており、かつ２本鎖の形態としてプラスミノーゲンをプラスミンに変換する機能を有している限り、本発明において使用可能な１本鎖ヒトｔ−ＰＡに該当する。

（２本鎖ヒトｔ−ＰＡの製造法）
本発明によれば、上記の１本鎖ヒトｔ−ＰＡとヒトカリクレイン８とを、適当な条件下で接触させることで、２本鎖ヒトｔ−ＰＡを製造することができる。

適当な条件としては、溶媒中、例えばｐＨが調節された緩衝液中での接触を挙げることができる。この場合、ヒトカリクレイン８と１本鎖ヒトｔ−ＰＡは、ともに緩衝液に溶解させて接触させてもよく、またいずれか一方、例えばヒトカリクレイン８を適当な固相に結合させておき、遊離のあるいは別の固相に結合させた１本鎖ヒトｔ−ＰＡと接触させてもよい。また、ｐＨは、ヒトカリクレイン８が１本鎖ヒトｔ−ＰＡを特異的に切断する機能を保持し得る範囲、例えばｐＨ３〜１０、好ましくは５〜８の概ね中性に維持することが好適である。

また、温度を適当に調節することも好ましい。温度は、ヒトカリクレイン８が１本鎖ヒトｔ−ＰＡを特異的に切断する活性を維持し得る範囲であればよく、例えば、１０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃とすることが好適である。好適な温度は、ヒトカリクレイン８を遊離状態で使用する場合、固相に結合させて使用する場合、後述する培養細胞を用いる場合などに応じて変化し得る。

ヒトカリクレイン８と１本鎖ヒトｔ−ＰＡとの比率は、バッチ式で両者を接触させる場合には、重量比で、ｔ−ＰＡ：ヒトカリクレイン８＝５０：１から５：１、好ましくは１０：１で接触させることができる。ヒトカリクレイン８を結合させた固相を用いてカラム式で接触させる場合には、１のヒトカリクレイン８に対して、５〜１０倍の１本鎖ヒトｔ−ＰＡを接触させればよい。

接触後に生じた２本鎖ヒトｔ−ＰＡは、適当なクロマトグラフィーその他の方法により、ヒトカリクレイン８から分離して精製してもよく、あるいはヒトカリクレイン８との共存状態のまま、医薬等として使用することもできる。かかる分離精製操作あるいは医薬としての調製作業については、蛋白質の分離精製あるいは医薬の剤型化について広く用いられている一般的な手法から、適宜好適な方法を選択して用いることができる。

（組換え宿主細胞を用いた共発現による製造法）
本発明では、１本鎖ヒトｔ−ＰＡをコードする遺伝子ならびにヒトカリクレイン８をコードする遺伝子を共に発現することのできる適当な組換え宿主細胞を、両遺伝子が発現し得る条件下で培養することにより、該宿主細胞内あるいは細胞外へと両遺伝子産物を産生させて、２本鎖ヒトｔ−ＰＡを調製することもできる。

１本鎖ヒトｔ−ＰＡをコードする遺伝子ならびにヒトカリクレイン８をコードする遺伝子は何れも公知であり、例えばＤＤＢＪ Ｎｏ．ＡＢ００９８４９（配列番号２、ヒトカリクレイン８）あるいはＤＤＢＪ Ｎｏ．ＮＭ＿０００９３０（配列番号４、１本鎖ヒトｔ−ＰＡ）それ自体を、本発明において使用することもできる。また、かかる公知の核酸配列に基いて、使用する宿主において好適に選ばれるコドンへの変更のため、または適当な制限酵素切断部位を生じさせるため、ｍＲＮＡなどに生じ得る不適切な２次構造の解消のため、その他の理由による核酸配列の改変は、もちろん許容される。さらには、ヒトカリクレイン８または１本鎖ヒトｔ−ＰＡのアミノ酸配列が変化するような核酸配列の変異または改変であっても、変異した核酸配列あるいは改変された核酸配列が、本願発明で使用可能なヒトカリクレイン８あるいは１本鎖ヒトｔ−ＰＡをコードする場合には、かかる変異核酸配列からなる遺伝子も、本発明において使用することができる。

上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号２または配列番号４に記載のＤＮＡ配列に、例えばＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、３２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ベーリンガー・マンハイム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションでハイブリダイズする程度であればよい。

両遺伝子を発現させるための宿主細胞としては、組換え体ヒトカリクレイン８、組換え体１本鎖ヒトｔ−ＰＡあるいは組換え体２本鎖ヒトｔ−ＰＡなどを産生することのできる細胞としてこれまでに報告されている種々の宿主細胞を使用することができる。また、該宿主細胞への両遺伝子の導入と発現は、上述の宿主細胞を基に組換え宿主細胞を構築する際に使用された発現ベクター、該ベクターを用いた形質転換方法、該ベクターに含まれているプロモーター遺伝子、ターミネーター遺伝子などによる発現制御方法などを、適宜使用することができる。また、上記以外にも、組換え蛋白質の発現、生成を目的として種々開発されている一般的な、宿主ベクター系もまた、利用可能である。

共発現により産生される２本鎖ヒトｔ−ＰＡは、宿主細胞内あるいは細胞外の培地から、回収してもよく、あるいは当該培地をそのまま使用してもよい。

本発明は、１本鎖ｔ−ＰＡから簡便に、かつ効率よく２本鎖ｔ−ＰＡに変換する技術を提供することにより、経済的に高活性型の製品を製造することを可能とする。また、医薬品としては、２本鎖ｔ−ＰＡは従来の１本鎖ｔ−ＰＡに比べてタンパク質分子あたりの活性が高いため、投与量を減らして抗原性の低下や副作用を軽減することが可能となる。

ヒトカリクレイン８ならびに１本鎖ヒトｔ−ＰＡは、ヒト組織あるいは培養細胞培養上清からの精製分離などにより、天然組織から抽出して使用することもでき、またはかかる蛋白質をコードする遺伝子を用いた組み換え手法により調製される組換え体も、使用することができる。さらには、胎児胚に当該遺伝子を適当なベクター系に注入して得られた、いわゆるトランスジェニック動物を作製し、乳などの体液成分から精製分離することによって得ることもできる。あるいは、試薬又は医薬として市販されている１本鎖ヒトｔ−ＰＡを用いてもよい。

工業的に均一の品質で２本鎖ヒトｔ−ＰＡを大量に製造することを考慮すれば、ヒトカリクレイン８ならびに１本鎖ヒトｔ−ＰＡとしては、遺伝子組み換え技術によって生産される組換え体の使用が好ましい。かかる組換え体の調製に際しては、格別の操作は必要ではなく、組換え体蛋白質を調製する一般的な方法に準じて調製することができる。

宿主細胞としては、哺乳動物の細胞または微生物を用いることができる。好ましい微生物はバクテリア、特に大腸菌や枯草菌、および真核動物の微生物、とくに酵母菌および糸状菌類、例えば、アスペルギルス属を包含する。昆虫細胞では、カイコ、夜盗蛾など、哺乳動物細胞であれば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞、ヒトＫＢ細胞など、さらに、トランスジェニック動物を宿主とする場合は、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを用いることができる。

組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法があるが、いずれの方法を用いても構わない。

当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換体を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製すればよく、形質転換体の培養は、各種の成書を参考にして一般的な方法で行うことができる。

また、トランスジェニック非ヒト哺乳動物により、ヒトカリクレイン８あるいは１本鎖ヒトｔ−ＰＡを調製する場合には、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような常法（例、最新動物細胞実験マニュアル、エル・アイ・シー発行、第７章、第３６１〜第４０８頁、１９９０年）に従って該動物を調製し、乳、血清あるいは組織より目的とする蛋白質を回収すればよい。

適当な宿主細胞により産生されるヒトカリクレイン８並びに１本鎖ヒトｔ−ＰＡは、原料となる細胞培養上清、虫体抽出液、菌抽出液、生体抽出液などから、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、種々のクロマトグラフィーにより精製分離することができる。

クロマトグラフィーは、分子ふるいクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィ、当該因子に親和性を有するアフィニティクロマトグラフィあるいはこれらを適宜組み合わせて使用すればよく、例えば、二酸化ケイ素（シリカ）やリン酸カルシウムを吸着素材とするカラム、ヘパリンや色素や疎水基をリガンドとするカラム、金属キレートカラム、イオン交換カラム、ゲル瀘過カラムなどを挙げることができる。

また、ヒトカリクレイン８あるいは１本鎖ヒトｔ−ＰＡを、他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すことが可能であり、蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。

ｔ−ＰＡの例としては、宿主細胞をＣＯＳ−１細胞、ベクターをｐＳＶＴ７、プロモーターをＳＶＴ７とした例（Ｋ．Ｔａｃｈｉａｓ，ａｎｄ Ｅ．Ｌ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８３１９−１８３２２，１９９５）、宿主細胞を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ベクターをｐＢＲ３２２由来のｐＡＰ−ｓｔＩＩ−ｔＰＡ、プロモーターをｐｈｏＡとした例（Ｊ．Ｉ．Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｓｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６４：４８９１−４８９６，１９９８）、宿主細胞を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ベクターをｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ、プロモーターをｌａｃプロモーターとした例（Ｊ．Ｍａｎｏｓｒｏｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２：６０−６６，２００２）など、その他多数を挙げることができる。

また、ヒトカリクレイン８の調製例としては、昆虫細胞を用いた例が報告されている（Ｔ．Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４９：８７−９６，２００３）。

（固相への固定化）
ヒトカリクレイン８あるいは１本鎖ヒトｔ−ＰＡ、特にカリクレイン８を固定化して本発明に用いる場合には、対象物を適当な固相担体、例えばアガロースゲル、セルロースゲル、ポリビニルゲル、シリカゲル、ポリスチレン、ポリプロピレンなどの固相に結合させ、このレジンに１本鎖ｔ−ＰＡ溶液を接触させることができる。かかるヒトカリクレイン８の固相への結合方法については、かかる実験手法を紹介する数多くの成書を参考に、適宜使用することができる。

本発明では、かかるヒトカリクレイン８または１本鎖ヒトｔ−ＰＡを結合させた固相とを、容器の中で混合するバッチ式やカラムに通液させるカラム式などを用いることができる。

（２本鎖ヒトｔ−ＰＡの製造法）
ヒトカリクレイン８と１本鎖ヒトｔ−ＰＡとの接触は、溶媒中、好ましくはリン酸緩衝液あるいはトリス緩衝液等の緩衝液中で行うことができる。１本鎖ヒトｔ−ＰＡとヒトカリクレイン８を接触させる場合には、両者を、重量比で、１本鎖ヒトｔ−ＰＡ：ヒトカリクレイン８＝５０：１から５：１、好ましくは１０：１前後で接触させることで、効率的に１本鎖ヒトｔ−ＰＡを２本鎖ヒトｔ−ＰＡへと変換させることができる。

また、緩衝液のｐＨは、ヒトカリクレイン８が１本鎖ヒトｔ−ＰＡのＡｒｇ２７５−Ｉｌｅ２７６を切断することのできる範囲にすればよく、概ね３〜１０、好ましくは中性付近、特に好ましくはｐＨ５〜８であればよい。本発明で使用することのできる緩衝液としては、前述のリン酸緩衝液、トリス緩衝液の他、ＨＥＰＥＳ緩衝液、クエン酸等の有機酸緩衝液、その他の汎用されている緩衝液を使用することができる。

また、ヒトカリクレイン８と１本鎖ヒトｔ−ＰＡとの接触時の温度は、ヒトカリクレイン８が失活しない温度であればよく、概ね１０〜４０°Ｃ、特に２５〜３７°Ｃを保つことが好ましい。

接触時間は、使用するヒトカリクレイン８あるいは１本鎖ヒトｔ−ＰＡの量、温度等の反応条件により、適宜調節すればよいが、例えば、バッチ式で接触させる場合には、概ね１〜２４時間、好ましくは４〜８時間で完了させることができる。

（組換え宿主細胞を用いた共発現による２本鎖ヒトｔ−ＰＡの製造法）
１本鎖ヒトｔ−ＰＡをコードする遺伝子ならびにヒトカリクレイン８をコードする遺伝子を共に発現することのできる宿主細胞としては、組換え体ヒトカリクレイン８、組換え体１本鎖ヒトｔ−ＰＡあるいは組換え体２本鎖ヒトｔ−ＰＡなどを産生することのできる細胞として、これまでに報告されている種々の宿主細胞を使用することができる。

例えば、好ましい微生物はバクテリア、特に大腸菌や枯草菌、および真核動物の微生物、とくに酵母菌および糸状菌類、例えば、アスペルギルス属を包含する。昆虫細胞では、カイコ、夜盗蛾など、哺乳動物細胞であれば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、マウスＣ１２７細胞、ヒトＫＢ細胞などを挙げることができる。

発現ベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルスなど、プロモーター遺伝子としてはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーターなどを、それぞれ適宜組み合わせて利用することができる。

また、上記以外にも、組換え蛋白質の発現、生成を目的として種々開発されている一般的な宿主ベクター系もまた、利用可能である。

組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法がある。

（２本鎖ヒトｔ−ＰＡを含む医薬）
ヒトカリクレイン８によって生成される２本鎖ｔ−ＰＡは、そのままで、ヒトカリクレイン８と共に、あるいは安定化剤などを加えた形で、医薬または医薬組成物として提供される。必要により、夾雑物を除去して２本鎖ヒトｔ−ＰＡを医薬品用にまで純化し、そのまま、もしくは公知の薬理学的に許容される酸、糖、担体、賦形剤などと混合し、溶液、凍結溶液、凍結乾燥物の医薬組成物として、非経口的に投与することができる。

非経口剤としては、注射剤、経皮吸収剤、テープ剤、軟膏剤、クリ−ム剤、湿布剤、塗布剤、貼付剤、外用液剤、点眼剤、点耳剤、点鼻剤として等を調製して用いることもできる。注射剤では、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース、グルコースなどを賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製され得る。さらにこれを粉体化して用いることもできる。ゲル化剤としては、自体公知の方法、例えば、２本鎖ｔ−ＰＡをグリセリン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシルメチルセルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸などの増粘剤や多糖に溶解した状態で調製され得る。安定化剤としてヒト血清アルブミン、アミノ酸などを添加することができ、また分散剤あるいは吸収促進剤として、２本鎖ヒトｔ−ＰＡの生理活性を損なわない範囲で、アルコール、糖アルコール、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などを添加することができる。また、微量金属や有機酸塩も必要に応じて加えることができる。

本発明の２本鎖ｔ−ＰＡの投与は、全身投与あるいは局所投与で行われ，有効投与量および投与回数は，投与剤形、投与ルート、患者の年齢、体重、治療対象疾患、症状もしくは重篤度によっても異なり、薬効量を一回または数回に分けて投与することができる。

同様に、１本鎖ヒトｔ−ＰＡとヒトカリクレイン８を含む医薬組成物も調製できる。注射剤として投与する際に、１本鎖ヒトｔ−ＰＡとヒトカリクレイン８が混合され、体内において２本鎖ヒトｔ−ＰＡに変換されるのを目的とした製剤である。これも上記の通り、製剤学的に公知の方法により、医薬組成物とすることができる。

以下、非限定的な実施例を挙げて、本発明をさらに具体的に説明する。

ヒトカリクレイン８による１本鎖ｔ−ＰＡの２本鎖ｔ−ＰＡへの変換
（１）ＲＴ−ＰＣＲによるヒトカリクレイン８のｃＤＮＡの単離
市販のヒト卵巣の全ＲＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）から、逆転写反応を用いてｃＤＮＡを得た。逆転写反応は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲを用い、プロトコールに従って行った。合成したｃＤＮＡを鋳型として、以下のように、ヒトカリクレイン８のｃＤＮＡをＰＣＲにより単離した。

公共のデータベースに登録されているヒトカリクレイン８（ＤＤＢＪ Ｎｏ．ＡＢ００９８４９）のヌクレオチド配列を基に、センスプライマーとして、制限酵素ＫｐｎＩサイトおよびエンテロペプチダーゼ切断サイト（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）を含むオリゴヌクレオオチド５’−ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＧＧＧＴＣＡＴ−３’を、アンチセンスプライマーとして、制限酵素ＥｃｏＲＩサイトを含むオリゴヌクレオオチド５’−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＴＧＣＴＧＣＣ−３’を合成した。

上記のヒト卵巣ｃＤＮＡとプライマーを用い、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡社製）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成は以下の通りである。

上記反応液をよく混合後、ＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲは、最初に９４°Ｃで３分間熱した後、９４°Ｃで３０秒間の熱変性、６０°Ｃで３０秒間のアニーリング、６８°Ｃで６０秒間の伸長反応の条件を１サイクルとして、３５サイクル行った。反応終了後、このＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲル電気泳動に供試した。ＰＣＲ産物は、電気泳動後のゲルを、エチジウムブロマイドを加えた緩衝液に１５分間浸した後に、ＵＶ照射により検出した。増幅された産物は、約７２０ヌクレオチドのからなるＤＮＡであった。

上記の増幅されたＰＣＲ産物を、ジーンクリーンキット（Ｑ−ＢＩＯ ｇｅｎｅ社）を用いて、アガロースゲルから切り出し精製を行った。次いで、このＰＣＲ産物を、Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒに連結し、この組換えプラスミドを大腸（ＪＭ１０９）に形質転換した。単一コロニーをＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地中で培養し、プラスミドを精製して、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｂｉｇ−Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｋｉｔ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用い、蛍光自動ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、３７３型）により解析した。その結果、単離されたＰＣＲ産物が、ヒトカリクレイン８の翻訳領域のうち、成熟活性型酵素と予想される２２８アミノ酸残基（バリン−３３からグリシン−２６０）をコードするｃＤＮＡを含むことが確認された。

（２）組換え体ヒトカリクレイン８の作製
実施例１でクローン化したｃＤＮＡを用いて、大腸菌発現系により、ヒトカリクレイン８の組換え体を以下のように合成した。

上記のｃＤＮＡを鋳型として、実施例１に記載したセンスプライマーとアンチセンスプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡを、初めに制限酵素ＫｎｐＩで、続いてＥｃｏＲＩで消化し、５’側に制限酵素ＫｎｐＩサイトを、３’側にはＥｃｏＲＩサイトを創出した。これを予めＫｎｐＩ及びＥｃｏＲＩでカットしたｐＥＴ３０プラスミドに連結した。インサートが入った発現ベクターを選別し、導入されたインサートの配列確認を行い、正しい配列が導入されたベクターを以下の実験に用いた。

上記のｐＥＴ３０プラスミドを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に形質転換し、大腸菌をカナマイシン（３０μｇ／ｍｌ）及びクロラムフェニコール（３４μｇ／ｍｌ）を含む培地で３７°Ｃで培養した。Ａ_６００が０．５に達したところで培地にイソプロピルチオβガラクトシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｔｈｉｏ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を０．５ｍＭ濃度で加え、さらに３時間培養した後、細胞を遠心により回収した。

上記の細胞を凍結融解処理し、その後、０．５％トリトンＸ−１００で２回洗浄した。得られた試料を、６Ｍ尿素と０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．６）で、室温で１２時間インキュベートすることにより可溶化した。

上記の可溶化された試料を、予め６Ｍ尿素と０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．８で平衡化されたＮｉ^２＋−キレートカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に直接アプライした。カラムを、２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８ １００ｍｌで洗浄した後、カラムに結合したタンパク質を６Ｍ尿素、０．５Ｍ ＮａＣｌ及び５０ｍＭヒスチジンを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ７．８緩衝液により溶出した。溶出画分は、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０緩衝液２０００ｍｌに対して透析した。

上記のカラム溶出画分には、Ｎ末端からヒスチジンタグ、Ｓ−プロテイン、エンテロペプチダーゼ切断サイト、ヒトカリクレイン８（成熟活性型）の順に配列する融合タンパク質が含まれていた。この融合タンパク質を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（Ａｍａｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に固定化したウシエンテロペプチダーゼで消化した後、固定化プロテアーゼを遠心により除去して、成熟活性型のヒトカリクレイン８酵素標品を得た。

融合タンパク質及び成熟活性型ヒトカリクレイン８をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により検出した。その結果、Ｎｉ^２＋−キレートカラムから溶出された画分が融合タンパク質（３５ｋＤａ）を高純度で含むこと、さらに、このようにして得られた融合タンパク質を固定化エンテロペプチダーゼで処理によって、成熟活性型カリクレイン８（３０ｋＤａ）が産生されることが判明した（図１）。

（３）ヒトカリクレイン８の酵素活性の測定
４−メチルクマリル−７−アミド（ＭＣＡ）を含む合成基質（ペプチド研究所）に対するヒトカリクレイン８の活性は、Ｂａｒｒｅｔｔの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１８７：９０９−９１２，１９８０）に基づき、以下のように行った。すなわち、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液ｐＨ８．０、酵素試料及び０．１ｍＭ ＭＣＡ基質を含む５００μｌ（終量）の反応液で、３７°Ｃでインキュベートした後、０．１Ｍモノクロロ酢酸、３０ｍＭ酢酸ナトリウム及び２９ｍＭ酢酸を含む溶液（ｐＨ４．３）２．５ｍｌを加えて反応を停止した。酵素により合成基質から切断・遊離された７−アミノ−４−メチルクマリンは、励起波長３７０ｎｍと蛍光波長４６０ｎｍを用いて測定した。

（２）で調製した成熟活性型ヒトカリクレイン８の活性を、Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて測定した。ヒトカリクレイン８は、酵素量依存的にかつ反応時間依存的に、このＭＣＡ合成基質を切断した（図２及び図３）。

ヒトカリクレイン８の各種ＭＣＡ合成基質に対する活性を測定した。Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡが最も迅速に分解された（表１）。Ｚ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ＭＣＡ及びＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＭＣＡも本酵素のよい基質となった。概して、Ｎ末端に保護基をもちＰ１サイトがアルギニン残基であるＭＣＡ基質が、ヒトカリクレイン８の有効な基質となりうるが、Ｐ２及びＰ３サイトのアミノ酸残基の重要性が示唆された。

アミノペプチダーゼ様酵素の基質（Ａｒｇ−ＭＣＡ）、キモトリプシン様酵素の基質（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ＭＣＡ、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ）、エラスターゼ様酵素の基質（Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−ＭＣＡ）及び酸性アミノ酸のＣ末端側切断酵素の基質（Ａｃ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＭＣＡ）に対する活性は、本酵素では検出されなかった。

Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ ＭＣＡに対する活性１００％として、他の基質に対する活性を相対値として表した。ＮＤは活性が検出されなかったことを示す。

（４）ヒトカリクレイン８の酵素活性に対する阻害剤の効果
実施例２で調製した成熟活性型ヒトカリクレイン８の酵素活性に及ぼす各種プロテアーゼ阻害剤の影響を調査した。本酵素の酵素活性の測定は合成基質Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて行い、反応溶液中に阻害剤を添加して活性を測定した。ヒトカリクレイン８の酵素活性は、アンチパイン、アプロチニン、ロイペプチン、大豆トリプシンインヒビター（ＳＢＴＩ）及びベンズアミジンで強く阻害され、本酵素がセリンプロテアーゼであることが示された（表２）。一方、システインプロテアーゼ阻害剤（Ｅ−６４）、金属プロテアーゼ阻害剤（ｏ−フェナントロリン）及びアスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤（ペプスタチン）では全く阻害されなかった。

（５）ヒトカリクレイン８による１本鎖ｔ−ＰＡの２本鎖ｔ−ＰＡへの変換
ヒトカリクレイン８による組換え体ヒト１本鎖ｔ−ＰＡ（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製）の２本鎖ｔ−ＰＡへの変換反応とその確認を行った。

１μｇのヒト・リコンビナント１本鎖ｔ−ＰＡを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）緩衝液に、（２）で得られた組換え体ヒトカリクレイン８．１μｇと０．０２μｇをそれぞれ添加し、終量２０μｌ（終量）の反応液を調製した。３７°Ｃで６時間反応液をインキュベートした後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプルバッファー（５×溶液）４μｌを加えて加熱し、この全量を還元条件下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％ ｇｅｌ）で分画し、ゲルをクマーシーブリリアントブルーにより染色した。

その結果、ヒトカリクレイン８による１本鎖ｔ−ＰＡ（６５ｋＤａ）の２本鎖ｔ−ＰＡ（３１ｋＤａと３４ｋＤａ）への変換が明らかになった（図４）。２本鎖ｔ−ＰＡへの変換の割合は、基質：酵素の比が１０：１の方が５０：１よりも高率であった。

（６）１本鎖ｔ−ＰＡから２本鎖ｔ−ＰＡへの変換に伴うｔ−ＰＡ活性の上昇
（５）で産生された２本鎖ｔ−ＰＡが酵素活性を有するか否かを、以下のように、合成基質Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いて検討した。

１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００μｌ（終量）中で、組換え体ヒトカリクレイン８ ０．０５μｇを１本鎖ｔ−ＰＡ ０．５μｇと３７°Ｃで６時間インキュベートした。その後、ヒトカリクレイン８の活性を完全に抑えるために、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でアプロチニンを添加した。

アプロチニンを加えたこの反応溶液２０μｌを用いて、実施例３に記した方法に従い活性を測定した。活性測定にはＰｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡを基質として用い、３７°Ｃで１時間インキュベートした。アプロチニン存在下で、かつヒトカリクレイン８に対して全く活性を示さない合成基質Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡを用いることによって、ｔ−ＰＡに由来する酵素活性のみを検出した。その結果、ヒトカリクレイン８処理により生じた２本鎖ｔ−ＰＡが、Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する強い活性を示すことが判明した（図５）。２本鎖ｔ−ＰＡがアプロチニンによる阻害を受けないことはすでに知られており、本実験の結果は、それに矛盾しなかった。従って、本発明によって、ヒトカリクレイン８が１本鎖ｔ−ＰＡを高活性型の２本鎖ｔ−ＰＡへと変換できることが明らかにされた。

図１は、大腸菌発現系において合成されたリコンビナント融合タンパク質と、融合タンパク質の固定化エンテロペプチダーゼ処理により得られた成熟活性型ヒト・カリクレイン８のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンである。 図２は、ヒト・カリクレイン８の合成基質Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する活性を示す。分解活性は酵素量依存的に上昇することを示す。 図３は、ヒト・カリクレイン８の合成基質Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する活性を示す。分解活性は酵素反応時間依存的に上昇することを示す。 図４は、ヒト・カリクレイン８によって、１本鎖ｔ−ＰＡ（６５ｋＤａ）が２本鎖ｔ−ＰＡ（３１ｋＤａと３４ｋＤａ）に変換されることを示したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターンである。 図５は、ヒト・カリクレイン８により１本鎖ｔ−ＰＡから産生された２本鎖ｔ−ＰＡが、Ｐｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡに対する強い活性をもつことを示す。

Claims (12)

1. ２本鎖ヒトｔ−ＰＡからなる医薬の製造におけるヒトカリクレイン８の使用。
2. １本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質からの２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造におけるヒトカリクレイン８の使用。
3. １本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質とヒトカリクレイン８とを接触させることを特徴とする、２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造法。
4. １本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質と固相に結合したカリクレイン８とを接触させることを特徴とする、２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造法。
5. ヒトカリクレイン８が、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは配列番号１に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換されたアミノ酸配列からなり、かつ１本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質を２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターへ変換する活性を有する蛋白質である、請求項１〜４に記載の方法。
6. ヒトカリクレインが、請求項５に規定される蛋白質をコードする遺伝子を組み換えて得られる組換え体であることを特徴とする、請求項１〜５に記載の製造法。
7. １本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質が、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、あるいは配列番号３に示されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、付加、置換されたアミノ酸配列からなり、かつプラスミノーゲンをプラスミンへ変換する活性を有する蛋白質である、請求項１〜６に記載の方法。
8. １本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質が、請求項７に規定される蛋白質をコードする遺伝子を組み換えて得られる組換え体であることを特徴とする、請求項１から請求項７に記載の製造法。
9. 請求項７に規定されるヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質をコードする遺伝子と請求項５に規定されるヒトカリクレイン８をコードする遺伝子とを共発現する組換え宿主細胞を培養することで、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターとヒトカリクレイン８とを接触させることを特徴とする、請求項３に記載の２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターの製造法。
10. 請求項１〜９に記載の製造法で得られる２本鎖ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターからなる医薬。
11. １本鎖のヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質とヒト・カリクレイン８を含むことを特徴とする医薬組成物。
12. １本鎖のヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター蛋白質とヒト・カリクレイン８が遺伝子組み換え型であることを特徴とする、請求項１１に記載の医薬組成物。

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