JPH08504575A - トロンビン活性化プラスミノーゲン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ArgとP1’の間でトロンビンによって切断可能である切断部位配列P4−P3−Pro−Arg−P1’−P2’（P3は塩基性アミノ酸残基であり、P4は疎水性アミノ酸残基であり、P1’及びP2’はそれぞれ独立して非酸性アミノ酸残基である）を含む、トロンビンによって活性化されてプラスミン活性を持つことができるプラスミノーゲン類似体。

Description

【発明の詳細な説明】 トロンビン活性化プラスミノーゲン誘導体 この発明は、共継続中の我々の特許出願ＷＯ-Ａ-9109118に開示された発明を 改良したものであり、トロンビンによって活性化されて繊維素溶解活性を示すか もしくは血餅形成を阻害するプラスミノーゲン類似体に関する。また、そのよう な化合物の全部もしくは一部をコードする核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）にも関する 。この発明はまた、それらの製法、それらを含有する医薬組成物、及び血栓性疾 患の治療におけるそれらの用途にも関する。 プラスミノーゲンは、血液における凝固系の天然の相対物である繊維素溶解系 の主要成分である。血液凝固の過程において、酵素活性のカスケードは、血餅又 は血栓のフレームワークを形成するフィブリンネットワークの生成に関連してい る。フィブリンネットワークの崩壊（繊維素溶解）は、酵素プラスミンの作用に よって行われる。プラスミノーゲンは、プラスミンの不活性前駆体であり、プラ スミノーゲンのアルギニン561とバリン562との間のペプチド結合の切断によって 、プラスミノーゲンからプラスミンへと変換する。生理学的条件下では、この切 断は、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）もしくはウロキナーゼ型プ ラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）によって触媒される。 凝固と繊維素溶解系との間の平衡が局所的に損なわれるようになると、冠状動 脈血栓症や心筋梗塞、深静脈血栓症、卒中、末梢動脈閉塞、及び塞栓症のような 病態に導く不適切な部位に、脈管 内血餅が形成されるであろう。このような場合には、繊維素溶解剤の投与が、血 餅溶解を促進するための効果的な治療法であることが示されている。抗血栓剤も また、血餅形成の予防に有用である。 しかしながら、大多数の繊維素溶解治療に用いられる剤に伴う問題点は、それ らが全身循環中におけるプラスミノーゲンを活性化するので、臨床的に有用な投 与量では、血栓に特異的ではないということである。繊維素溶解を増強するため の他の方法は、我々の共継続中の特許出願ＷＯ-Ａ-9109118に開示されており、 繊維素溶解活性を示すかもしくは血餅形成を阻害するために活性化することがで きる分子の使用に基づいている。活性化は、血液凝固に関速する一以上の内因性 酵素によって触媒される。この方法の利点は、繊維素溶解の血栓選択性又は血餅 形成活性の阻害が、活性化酵素の血栓特異的局在によって達成されることである 。特に、ＷＯ-Ａ-9109118は、とりわけトロンビンによる切断によってプラスミ ンに活性化することができるプラスミノーゲン類似体を開示している。 トロンビン（E.C.3.4.21.5）は、フィブリノーゲン（Ａアルファ及びＢベータ 鎖）、因子XIII、因子Ｖ、因子VII、因子VIII、プロテインＣ及び抗トロンビンI IIを含むいくらかの蛋白における蛋白分解を触媒するセリンプロテアーゼである 。トロンビンによって認識されるのに必要な構造は、部分的には、切断部位周辺 の局所的アミノ酸配列によって決定されるようであるが、変動可能な程度で、切 断部位から遠く離れた配列によっても決定される。例えば、フィブリノーゲンＡ アルファ鎖においては、残基P2 （Val）、P9（Phe）及びP10（Asp）が、Arg（16）−Gly（17）ペプチド結合にお けるα−トロンビンによって触媒される切断に重要である（Ni，F．et al 1989 ，Biochemistry 28 3082-3094）。ＷＯ-Ａ-9109118は、アルファートロンビンに よる最適切断部位が、次の構造：（i）P4−P3−Pro−Arg−P1’−P2’｛P3とP4 は各々独立して（バリンのような）疎水性アミノ酸残基であり、P1’とP2’は各 々独立して非酸性アミノ酸残基である｝、又は（ii）P2−Arg−P1’｛P2又はP1 ’はグリシン残基である｝ を持つことを開示している。従って、ＷＯ-Ａ-9109118において好ましいと開示 されているトロンビン活性化プラスミノーゲン類似化合物、及びその中で特に例 示されているものはすべて、前述の構造（i）もしくは（ii）と一致する切断部 位を有している。ＷＯ-Ａ-9109118において報告されたデータは、特別に例示さ れたトロンビンによって切断可能なプラスミノーゲン類似体のうち、T19と名づ けられたものが、使用した分析系において最も有効であることを示唆している。 それは、野生型プラスミノーゲンのPro（559）及びGly（560）がVal−Glu−Leu −Gln−Gly−Val−Val−Proで置き換えられている因子XIIIに基づく切断部位を 有している。従って、特別に例示された化合物の中で最も有効であるT19のトロ ンビン切断部位は、ＷＯ-Ａ-9109118によれば好ましいとされている上記の構造 （i）の要件と一致している。 補助因子がない場合には、因子XIはトロンビンによって切断されない｛Naito ，K．and Fujikawa，K．（1991），J．Biol． Chem．266 7353-7358｝か、もしくはｋ_cat／Ｋ_m＝1.6×10⁵Ｍ-1min-1で非常にゆ っくり切断される（Gailani，D．and Broze，G．J．1991，Science 253，909-91 2）ことが報告されている。このトロンビン基質の切断部位配列は、ＷＯ-Ａ-910 9118おける好ましい一般式（i）及び（ii）とは異なっている。因子XIにおいて 、塩基性アミノ酸Lysは、P3部位にある。しかしながら、因子XIのこの部位での トロンビン切断活性は、因子XIIIの活性（ｋ_cat／Ｋ_m＝1.4×10⁵Ｍ-1sec-1；Nas ki et al.，1991，Biochemistry 30 934-941）に比べると非常に低いけれども、 この発明において、P3部位に塩基性アミノ酸残基を有するトロンビン切断配列を 持つプラスミノーゲン類似体が、Ｔ19に比べて驚くほど増大した活性を有するこ とが発見された。そのような新規な類似体は、トロンビンによってより迅速に切 断され、連鎖色素分析において増大した活性を示す。より重要なことには、その ような類似体は、生体内条件に非常に類似している血餅溶解分析（plasma clot lysis assay）において活性を有している。 P3が塩基性アミノ酸残基であるトロンビン切断部位のさらなる例は、P3がアル ギニンである一本鎖ウロキナーゼに見られる。この部位での切断は、不活性二本 鎖ウロキナーゼを産生する｛Ichinose et al.，（1986）J．Biol．Chem．261 34 86-9｝。補助因子がない場合には、一本鎖ウロキナーゼのトロンビンによる切断 もまた、ｋ_cat／Ｋ_m＝3.8×10⁴Ｍ-1sec-1でかなりゆっくりである（de Munk et al.，1990 Fibrinolysis 4 161）。しかし ながら、今では、ウロキナーゼ切断部位を担持するプラスミノーゲン類似体は、 Ｔ19に比べて増大した活性を有することが示されている。 従って、本発明は、（一般的にＷＯ-Ａ-9109118に開示されているような）ト ロンビンにより活性化されてプラスミン活性を有するプラスミノーゲン類似体を 提供するという点で、ＷＯ-Ａ-9109118に開示されている発明の改良であるが、 そのプラスミノーゲン類似体が、トロンビン切断部位配列P4−P3−Pro−Arg−P1 ’−P2’（P3は塩基性アミノ酸残基であり、P4は疎水性アミノ酸残基であり、P1 ’及びP2’はそれぞれ独立して非酸性アミノ酸残基である）を含み、その部位が Argと−P1’の間でトロンビンによって切断可能であるという点に特に特徴があ る。 プラスミノーゲンは、プラスミノーゲンが790アミノ酸蛋白であり、その切断 部位がArg（560）−Val（561）ペプチド結合であることを示したSottrup-Jensen らの蛋白配列研究｛Atlas of Protein Sequence and Structure（Dayhoff，M．O .，ed．）5 suppl．3，p.95（1978）｝に従って番号付けされた。しかしながら 、この発明の具体例に有用で、かつForsgrenら｛FEBS Letters 213 254-260（19 87）｝により単離された、適切なプラスミノーゲンｃＤＮＡは、部位65に余分の Ileを持つ791残基の蛋白をコードしている。この明細書では、プラスミノーゲン のアミノ酸番号は、使用したｃＤＮＡの番号に対応している。プラスミノーゲン の構造には多形性があるかもしれず、切断部位の番号が異なるプラスミノーゲン の形態があるかもしれない。しかし、 この発明は、そのような変形を具体例の中に含むことを意図するものである。 従って、この明細書において使用される用語「プラスミノーゲン類似体」は、 野生型プラスミノーゲンとは異なる分子で、かつプラスミン活性を有する分子を 形成するために切断されるかもしくは作用を受ける能力を持つ分子を意味してい る。 この発明の具体例の範囲内のプラスミノーゲン類似体は、野生型プラスミノー ゲンのフィブリン結合作用を適度に残すが、阻害特性における変化があるかもし れない。好ましいプラスミノーゲン類似体は、野生型プラスミノーゲンに匹敵す る血漿半減期を持つが、この特性は、本質的なものではない。 この発明のプラスミノーゲン類似体に存在するトロンビン切断部位配列（thro mbin-cleavable site sequence）においては、塩基性アミノ酸残基P3は、リジン 又はアルギニン残基であることができる；疎水性アミノ酸残基P4は、バリン、イ ソロイシン又はロイシン残基であることができる；非酸性アミノ酸残基P1’及び P2’のそれぞれは、独立してバリン又はイソロイシン残基であることができる。 この発明の範囲内の特別なプラスミノーゲン類似体は、切断部位Thr−Thr−Ly s−Ile−Lys−Pro−Arg−P1’−P2’又は切断部位Leu−Arg−Pro−Arg（P1’及 びP2’はそれぞれ独立して非酸性アミノ酸である）を含有する。前述した様に、 P1’及びP2’は、イソロイシン又はバリン残基であることができる。 この発明の特別かつ好ましい化合物は、次のプラスミノーゲン 類似体である： ａ）Pro（559）、Gly（560）がThr、Thr、Lys、Ile、Lys、Proで置換され、かつ Val（562）がIleで置換されているプラスミノーゲン類似体。この類似体では、 アミノ酸563は、野生型と同様にバリンである。この突然変異体は、ＢＢ10151と 名付けられている。 ｂ）Cys（558）、Pro（559）、Gly（560）がAla、Gly、Gln、Lys、Thr、Leu、Ar g、Proで置換され、かつCys（566）がAlaで置換されているプラスミノーゲン類 似体。この類似体では、アミノ酸562及び563は、野生型と同様にバリンである。 この突然変異体は、ＢＢ10156と名付けられている。 ｃ）Cys（558）、Pro（559）、Gly（560）が、Ala、Leu、Arg、Proで置換され、 かつCys（566）がAlaで置換されているプラスミノーゲン類似体。この類似体で は、アミノ酸562及び563は、野生型と同様にバリンである。この突然変異体は、 ＢＢ10170と名付けられている。 ｄ）Pro（559）、Gly（560）がVal、Glu、Leu、Gln、Gly、Leu、Arg、Proで置換 されているプラスミノーゲン類似体。この類似体では、アミノ酸562及び563は、 野生型と同様にバリンである。この突然変異体は、ＢＢ10171と名付けられてい る。 ｅ）Cys（558）、Pro（559）、Gly（560）がAla、Thr、Thr、Lys、Ile、Lys、Pr oで置換され、Val（562）がIleで置換され、かつCys（566）がAlaで置換されて いるプラスミノーゲン類似体。この突然変異体は、ＢＢ10158と名付けられてい る。 この発明のプラスミノーゲン類似体は、トロンビン切断部位配列の性質を特に 参照することによって定義された。それは、その類似体が、その部位で驚くほど 迅速に切断され、そのことが、その化合物の改良された血栓溶解活性の基礎とな るからである。しかしながら、この発明によるプラスミノーゲン類似体（即ち、 今定義された新しい切断部位配列を含んでいる）は、迅速に切断されるという利 点を失うことなく、切断部位からより遠方もしくはあまり遠方ではない部位で、 一以上の付加、欠失又は置換といった（野生型プラスミノーゲンと比較されるよ うな）他の修飾を含んでいてもよい。そのような修飾の例には、フィブリン結合 活性を変えるか、もしくはα２−アンチプラスミン結合を抑制するための一以上 のクリングルドメインの付加、除去、置換又は改変が挙げられるであろう。特別 な例としては、この部位へのα２−アンチプラスミンの結合を防ぐためのクリン グル１に位置するリジン結合部位の突然変異が挙げられるであろう。このような 変異型は、α２−アンチプラスミンによる阻害に対して耐性であろう。好ましい 具体例としては、ＢＢ10189、ＢＢ10190及びＢＢ10192があり、それらは各々、As p 137＞Ser及びAsp 139＞Serの追加の突然変異を有するプラスミノーゲン類似体 ＢＢ10153、ＢＢ10170及びＢＢ10171である。 別の例としては、例えば、システイン残基間に形成されるジスルフィド結合に よって切断部位に加えられる制約を除去するために、一つもしくは両方のシステ インをアラニン残基で置換することによって、Cys（558）とCys（566）との間の ジスルフィド結合形成を防止するための突然変異が挙げられるであろう。上記の 好ましい具体例の中で、変異型ＢＢ10156、ＢＢ10158及びＢＢ10170は、このよ うな開ループ（open-loop）修飾を有している。 欠失に関連する修飾の例としては、アミノ末端の68、77又は78個のアミノ酸が 除去されているプラスミノーゲン類似体のLys−プラスミノーゲン変異型が挙げ られるであろう。このような変異型は、野生型Glu−プラスミノーゲンと比較し た場合にLys−プラスミノーゲンにおいて観察されたように、フィブリン結合活 性を増大しているであろう（Bok，R．A．and Mangel，W．F．1985，Biochemistr y 24 3279-3286）。欠失に関連するさらなる例には、クリングル１もしくはクリ ングル１〜４ドメインがα２−アンチプラスミン結合を抑制するために除去され ているプラスミノーゲン類似体の変異型が挙げられるであろう。このような変異 型は、α２−アンチプラスミンによる阻害に対して耐性であろう。クリングル１ 〜４の欠失はまた、分子のフィブリン結合及び薬物動態学的特性を変化させるで あろう。 本発明における高い血餅選択性を示すプラスミノーゲン類似体については、プ ラスミン阻害剤結合を防止するセリンプロテアーゼドメイン中に突然変異を導入 することが好ましいであろう｛配列番号２（ＳＥＱ ＩＤ ２）は、野生型プラス ミンのセリンプロテアーゼドメインを示し、この明細書では、そのドメインに対 する番号付けは、配列番号２の番号を用いている）。この突然変異は、組織プラ スミノーゲン活性化因子に対する阻害剤結合を防止することが示された位置に類 似する位置に存在していてもよく（Madison，E．L．et al 1989 Nature 339 721 -724）、又はプ ラスミノーゲンに対する阻害剤結合を防止する別の位置に存在していてもよい。 そのような修飾は、セリンプロテアーゼ阻害剤に対して耐性を示すキモトリプシ ンスーパーファミリーのエンドペプチダーゼを開示している、共継続中の特許出 願ＰＣＴ／ＧＢ9301632に記載されている。そのような耐性は、下記の一つを誘 発するエンドペプチダーゼもしくはその前駆体の修飾によって提供される： ａ）プロテアーゼの局部の折りたたみにおける立体配座の変化； ｂ）複合体形成に関するプロテアーゼと阻害剤の相対配向における変化； ｃ）阻害剤の領域におけるプロテアーゼの立体的なバルクにおける変化； ｄ）阻害剤結合部位の領域における静電的ポテンシャル場における変化；又は ｅ）上記の何れかの組み合わせ。 好ましい具体例は、ＰＣＴ／ＧＢ9301632（ＢＢ10199）に記載されているＡ４ 突然変異（Glu 606からLysへ）を有するＢＢ10158である（ＢＢ10199）。この突 然変異は、アンチプラスミンへの結合を防止する、プラスミノーゲンの表面上の イオン相互作用を遮るために設計されている。突然変異誘発は、Glu 606をLysに 変換するために設計された、24塩基オリゴヌクレオチド５’ＣＴＴ ＧＧＧ Ｇ ＡＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＡＡＧ ＣＡＧＴＧＧ３’を用いて行われた。他の好ま しい具体例は、単独もしくは組み合わせて、Glu 606、Glu 623、Phe 583、Met 5 85又はLys 607に突然変異を有している。Glu 606及びGlu 623突然変異は、ＰＣＴ／ＧＢ9301632に例示された。この具体例における１つの 例は、ＢＢ10153であり、それは、Glu 606からLysへ及びGlu 623からLysへの追 加の突然変異を有するプラスミノーゲン類似体ＢＢ10151である。 この発明による他の複数修飾プラスミノーゲン類似体は、グリコシル化パター ンを防止、抑制又は変化させるための一以上の修飾を含んでいてもよい。そのよ うな修飾が導入されているプラスミノーゲン類似体は、より長い半減期、減少し た血漿クリアランス及び／又はより高い比活性を有するであろう。 この発明の範囲内のプラスミノーゲン類似体の好ましい特徴は、適切な場合に は、必要な変更を加えて、この発明の他の化合物にも適用される。 この発明の第一の観点におけるプラスミノーゲン類似体は、何れかの便利な方 法で合成することができる。この発明の第二の観点によれば、連続するアミノ酸 残基を共にカップリングすること、及び／又はオリゴペプチドを結合することか らなる、そのようなプラスミノーゲン類似体の製法方法が提供される。原則とし て、蛋白は、化学的手段によって完全に又は部分的に合成することができるけれ ども、対応する核酸配列の、好ましくはin vivoでのリボソーム翻訳によって製 造するのが好ましい。蛋白は、適切にグリコシル化されてもよい。 組み換えＤＮＡ技術を用いてこの発明の蛋白を製造するのが好ましい。天然に 生じるプラスミノーゲンをエンコードするＤＮＡは、ｃＤＮＡもしくはゲノムク ローンから得ることができるか、又は合成することができる。アミノ酸置換、付 加又は欠失は、部位 特異的突然変異誘発によって導入されるのが好ましい。プラスミノーゲン類似体 をエンコードするＤＮＡ配列は、遺伝子工学の分野における当業者が熟知してい る手順によって得ることができる。 組み換えＤＮＡ技術を用いて蛋白を製造する方法は、通常、発現ベクター中に 適切なコーディング配列を挿入し、そのベクターを宿主細胞中に移す工程を含む であろう。従って、この発明の第三の観点によれば、上記の蛋白性化合物をコー ドする合成もしくは組み換え核酸が提供される。核酸は、ＲＮＡでもＤＮＡでも よく、プラスミド、コスミド又はファージのようなベクターの形態であってもよ い。ベクターは、原核（例えば、細菌）細胞及び／又は真核（例えば、酵母もし くは哺乳動物）細胞を形質移入もしくは形質転換するのに適応することができる 。ベクターは、クローニング部位及び通常少なくとも一つのマーカー遺伝子を含 むであろう。発現ベクターは、クローニング部位に挿入される配列に操作的に連 結されたプロモーター、及び好ましくは蛋白産物を分泌させることができる配列 を有するであろう。 この発明のプラスミノーゲン類似体は、ＷＯ-Ａ-9109118に記載されたタイプ のベクターを用いて発現させることができる。そのベクターは、ヒトサイトメガ ロウイルス由来の強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含む第二核酸配列 に操作的に連結された、蛋白をコードするか又はクローニング部位を表現する第 一核酸配列、ＳＶ40由来のポリアデニル化配列をエンコードする第三核酸配列、 及びＳＶ40プロモーターから発現される選択可能なマーカーをコードし、その選 択可能なマーカー配列の３’末端に追加のＳＶ40ポリアデニル化シグナルを持つ 第四核酸配列からな っている。用語「ベクター」は、この明細書中においては、機能的な意味で用い られると理解されるべきであり、必ずしも単一の核酸分子に限定されると解釈さ れるべきではない。それで、例えば、上記で定義されたベクターの第一、第二及 び第三配列が第一核酸分子中で表現され、第四配列が第二核酸分子中で表現され てもよい。 このベクターは、プラスミノーゲン類似体を、どんな追加の生物学的もしくは 化学的手順も必要とすることなく、生物学的に活性な形態で発現させかつ細胞培 養培地中に分泌させることができる。 この発明の第三の観点によれば、連続するヌクレオチドを共にカップリングす ること、及び／又はオリゴ−及び／又はポリ−ヌクレオチドを結合することから なる、上記のプラスミノーゲン類似体をエンコードする核酸を製造する方法が提 供される。 本発明のさらなる観点によれば、上記のような核酸及び／又はベクターによっ て形質転換された細胞もしくは細胞系が提供される。形質転換される適切な細胞 もしくは細胞系には、原核細胞（例えば、大腸菌）及び酵母細胞｛サッカロミセ ス・セレビシエ（Sacchromyces cerevisiae）及びピチア・パストリス（Pichia pastoris）を含む｝及び哺乳動物細胞のような真核細胞の両方が含まれる。連続 培養で生育し、かつ標準技術によって形質移入もしくは形質転換されることがで きる哺乳動物細胞が好ましい。適切な細胞の例には、チャイニーズハムスター卵 巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ及びP3X63-Ag8.653のようなマウス骨髄腫細胞系、Ｃ ＯＳ細胞、ヒーラ細胞、ＢＨＫ細胞、ボウス（Bowes）細胞系の ようなメラノーマ細胞系、マウスＬ細胞、ＨｅｐＧ2のようなヒト肝癌細胞系、 マウス繊維芽細胞及びマウスＮＩＨ3Ｔ3細胞が含まれる。ＣＨＯ細胞は、プラス ミノーゲン及びプラスミノーゲン類似体を発現するための宿主として特に好まし い。 形質転換は、いずれかの便利な方法によって達成することができ、エレクトロ ポレーションが特に適切である。 この発明のプラスミノーゲン類似体は、プラスミノーゲン類似体の有効量を患 者に投与することからなる、凝固と繊維素溶解間の不均衡によって引き起こされ る病態の予防及び／又は治療に用いることができる。従って、この発明のさらな る観点によれば、医薬、特に局部的な繊維素溶解及び／又は抗凝固活性を生じる ことが望まれる、凝固と繊維素溶解間の不均衡によって引き起こされる病態の予 防及び／又は治療に用いるための、この明細書中に開示されたプラスミノーゲン 類似体が提供される。そのような病態には、心筋及び脳梗塞、動脈及び静脈血栓 症、血栓塞栓症、外科的手術後癒着、血栓性静脈炎及び糖尿病性血管障害、及び 癌に関連した凝固不均衡が含まれる。 この発明は、また、血栓溶解、抗血栓もしくは血栓溶解抗血栓剤の製造におけ る、この明細書に開示されたプラスミノーゲン類似体の用途を提供する。 さらに、この明細書に開示された１以上のプラスミノーゲン類似体と、医薬的 に及び／又は獣医学的に許容される担体とからなる医薬もしくは獣医用組成物も 提供される。そのような組成物は、経口、静脈内もしくは筋肉内注射によるか、 又は注入による投与に適応させることができる。適切な注射可能な組成物には、 等張 の生理的塩類溶液及び／又は緩衝液中の滅菌したプラスミノーゲン類似体が含ま れ、それはまた、注射の痛みを緩和するために局所麻酔剤を含んでいてもよい。 類似の組成を、注入用に用いることができる。化合物が局所治療剤として投与さ れる場合には、適切な基材中のクリーム、軟膏又はローション剤として処方する ことができる。 この発明の化合物は、例えばアンプル又は袋のような密封して閉じられた容器 中のドライパウダー又は無水濃縮物として、単一投与量形態で供給することがで きる。 投与される材料の量は、必要とされる繊維素溶解もしくは凝固阻害の量、必要 とされる作用速度、血栓塞栓部位の重大さ、及び血餅の大きさに依存するであろ う。正確な投与量は、本発明の化合物によって治療を意図する病態の性質のため に、医者によって決定されるであろう。しかしながら、ガイドラインとして、成 熟血栓の治療が行われる患者は、一般に、例えば５回までの投薬における注射か 、又は注入のいずれかで、0.01〜10mg／kg体重のプラスミノーゲン類似体の一日 当たの投与量を受けるであろう。 この発明における以下の図面及び実施例は、例証するために提供されるもので 、それによって限定されるものではない。実施例に言及された図面において、 図１は、トロンビンによるＢＢ10151の切断速度を示している。 図２は、トロンビンによるＢＢ10151とＴ19の活性化を比較する色素分析の結 果を示している。 図３は、ＢＢ10151の凝固溶解活性を示している。 実施例１−ＢＢ10151の構築発現及び精製 プラスミノーゲンｃＤＮＡの単離及びベクターｐＧＷＨとｐＧＷＨｇＰの構築 は、ＷＯ-Ａ-9109118に記載されている。ｐＧＷＨｇＰにおいて、プラスミノー ゲンｃＤＮＡをとおしての転写は、ＨＣＭＶプロモーター／エンハンサーで開始 することができ、選択可能なマーカーgptが用いられる。 以下の修飾プラスミノーゲン例の製造に用いた遺伝子操作、発現及び蛋白精製 の技術は、遺伝子工学の分野における当業者に公知である。その技術のほとんど の記載は、以下の実験便覧の１つに見ることができる：Cold Spring Harbor Lab oratory，Box100，New York，によって出版されたT．Maniatis，E．F．Fritsch 及びJ．Sambrookによる”Molecular Cloning”又はElsevier Science publishin g Co．Inc.，New Yorkによって出版されたL．G．Davis，M．D．Dibner及びJ．F ．Batteyによる”Basic Methods in Molecular Biology”。 追加及び修正された方法は、以下の方法の項で詳述される。 ＢＢ10151は、トロンビンによって切断可能な切断ループを生じるために、ア ミノ酸残基Pro（559）、Gly（560）がThr、Thr、Lys、Ile、Lys、Proで置き換え られ、Val（562）がIleで置き換えられているプラスミノーゲン類似体である（ 配列番号１）。この部位は、因子ＸＩにおける潜在的トロンビン切断部位に基づ いている。この実施例で用いた手順は、本質的に、突然変異誘発反応がバクテリ オファージＭ13mp18中にクローン化されたプラスミノーゲンの1.87kb KpnI〜Hin cIIフラグメントに関して行われたＷＯ−Ａ−9109118の実施例２及び３に記載の とおりである。一本鎖の鋳型を調製し、突然変異を、オリゴヌクレオチ ド特異的突然変異誘発によって作成した。この場合、48塩基長のオリゴヌクレオ チド（５’ＣＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＧＡＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＧ ＴＴＧＴＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣ３’）（配列番号４）を突然変異誘発を指 示するために用いた。 プラスミドＤＮＡを、800Ｖ及び25μＦを用いてエレクトロポレーシヨンによ ってＣＨＯ細胞中に導入した。選択培地｛250μl/mlキサンチン、５μg/mlミコ フェノール酸、１×ヒポキサンチン−チミジン（ＨＴ）を含む｝を形質移入24時 間後の細胞に加え、培地を２〜３日毎に交換した。gpt−耐性コロニーを生じる プレートを、エライザ（ＥＬＩＳＡ）分析を用いてプラスミノーゲン産生に関し てスクリーニングした。高レベルの抗原を産生する細胞を再クローン化し、最高 の産生物を、産生を注意深くモニターするためのフラスコ中に拡大化した。これ らの全ての細胞系の凍結ストックを貯蔵した。産生細胞を、条件培地を提供する ためにローラーボトル中に拡大化し、それからプラスミノーゲン蛋白をリジンセ ファロース４Ｂ（用語セファロースは商品名である）を用いて精製した。この突 然変異蛋白を産生するために用いた細胞系は、123.C6であった。 実施例２−ＢＢ1O153の構築 ＢＢ10153は、ａ２−アンチプラスミンの結合を抑制するために二つの追加突 然変異（Glu606をLysに、Glu623をLysに）を含むＢＢ10151の誘導体である。Ｂ Ｂ10151（ｐＵＣにクローン化されたもの、実施例１参照）の663bp EcoRV〜SphI フラグメントを除去し、アンチプラスミン耐性を持つ突然変異体A3A4らの同等の 663bpフ ラグメントで置き換えた。この構築は、ＰＣＴ／ＧＢ9301632の実施例５に記載 されている。24塩基オリゴヌクレオチド５’ＣＴＴ ＧＧＧＧＡＣ ＴＴＣ ＴＴ Ｃ ＡＡＧ ＣＡＧ ＴＧＧ３’（配列番号３）が、Glu−606をLysに変換するのに 用いられ、27塩基オリゴヌクレオチド ５’ＧＴＴＣＧＡＧＡＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＧＧＴＧＴＧＣＡＣ３’（配列番号 ５）が、Glu623をLysに変換するのに用いられた。次いで、ＷＯ-Ａ-9109118の実 施例２に記載されたgpt選択マーカーを挿入する前に、完全長のプラスミノーゲ ンを、発現ベクターｐＧＷ１Ｈ中にクローン化した。 実施例３−ＢＢ10156、ＢＢ10158及びＢＢ10170の構築 プラスミノーゲン突然変異体ＢＢ10150をエンコードするＤＮＡを、ＢＢ10156 、ＢＢ10158、ＢＢ10170を産生するための鋳型として用いた。ＢＢ10150は、ア ミノ酸残基Pro（559）、Gly（560）がVal、Val、Proに置き換えられ、かつジス ルフィド結合形成を防止するためにCys（558）からAlaへの、及びCys（566）か らAlaへの追加突然変異を有するプラスミノーゲン類似体である。ＢＢ10150の開 切断ループ配列（opened cleavage loop seqence）は、配列番号６に示されてい る。ＢＢ10150は、二つのオリゴヌクレオチドプライマー｛５’ＣＴＡＧＧＴＡ ＣＡＡＣＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＧＧＣＴ３’（配列番号７）及び５’ＧＧＴＧＧ ＧＣＣＡＣＣＧＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣ３’（配列番号８）｝と、Ｍ13中にクロー ン化された突然変異体Ｔ13（特許出願ＷＯ-Ａ-9109118、実施例13及び配列番号 ９参照）の1.87kbKpnI〜HincIIフラグメントを用いて突然変異誘発によって作成 された。 プラスミノーゲン類似体ＢＢ10156、ＢＢ10158及びＢＢ10170はすべて、残基5 58及び566に、同じCysからAlaへの突然変異を有するように、鋳型として前記の Ｍ13中における変異体ＢＢ10150を用いて、部位特異的突然変異誘発によって構 築された。ＢＢ10156は、アミノ酸残基Pro（559）とGly（560）がGly、Gln、Lys 、Thr、Leu、Arg、Proで置き換えられているプラスミノーゲン類似体である（配 列番号10）。ＢＢ10158は、アミノ酸残基Pro（559）とGly（560）がThr、Thr、L ys、Ile、Lys、Proで置き換えられ、かつVal（562）がIleで置き換えられている プラスミノーゲン類似体である（配列番号11）。ＢＢ10170は、アミノ酸残基Pro （559）とGly（560）がLeu、Arg、Proで置き換えられているプラスミノーゲン類 似体である（配列番号12）。それぞれの突然変異を誘発するために用いられたオ リゴヌクレオチドを、以下に示す：突然変異体 オリゴヌクレオチド配列 ＢＢ10156 （配列番号13） ５’ＣＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＡＡＧＴＧＴＴＴＴＣＴＧＡＣＣＣＧＣＴＴＴ ＣＴＴＣＧ３’ ＢＢ10158 （配列番号14） ５’ＣＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＴＴＣＧＴＴＧＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴ ＣＧ３’ ＢＢ10170 （配列番号15） ５’ＣＡＣＡＡＣＣＣＴＡＧＧＴＣＴＡＡＧＣＧＣＴＴＴＣＴＴＣＧＧ３’ 各々の場合について、ＤＮＡ配列決定に従い、突然変異が、制限酵素HindIII 及びSplIを用いて、ｐＧＷ１Ｈｇ・プラスミノーゲン発現ベクター中に直接クロ ーン化された。これこれらの部位は、突然変異誘発を介して、それぞれプラスミ ノーゲンの５’末端及び1850に予め導入されていた。プラスミノーゲンアミノ酸 コーディング配列は、この手順によって影響されなかった。 実施例４−ＢＢ10169及びＢＢ10171の構築 ＢＢ10169は、アミノ酸残基Pro（559）とGly（560）がVal、Glu、Leu、Gln、G ly、Ile、Lys、Proに置き換えられ、かつVal（562）がIleに置き換えられている プラスミノーゲン類似体である（配列番号16）。ＢＢ10169は、42塩基オリゴヌ クレオチド５’ＧＡＴＴＣＴＡＧＧＴＴＴＡＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＡ ＣＡＣＡＴＴＴＣＴＴＣＧＧ３’（配列番号17）を用いる、Ｍ13中におけるＢＢ 10151のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発と、それに続くHindIII及びSplI を用いる、ｐＧＷ１Ｈｇプラスミノーゲン中へのクローン化によって作成された 。ＢＢ10171は、アミノ酸残基Pro（559）とGly（560）がVal、Glu、Leu、Gln、G ly、Leu、Arg、Proに置き換えられているプラスミノーゲン類似体である（配列 番号18）。ＢＢ10169からの１本鎖Ｍ13を、ＢＢ10171構築用の鋳型として用いた 。突然変異誘発を、39塩基オリゴヌクレオチド５’ＣＡＣＣＣＣＣＣＴＡＣＣＡ ＣＴＣＴＧＧＧＴＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣ３’（配列番号19）を 用いて行い、ＤＮＡ配列決定に従って、HindIII及びSplIを用いて、発現ベクタ ー中にクローン化した。 実施例５−ＢＢ10189、ＢＢ10190及びＢＢ10191の構築及び発現 プラスミノーゲン類似体ＢＢ10189、ＢＢ10190及びＢＢ10191は、リジン結合 部位を不能にするために、Asp（137）からSerへ、Asp（139）からSerへのクリン グル１二重突然変異（kringle 1 doublemutation）を有している。突然変異を、 ＢＢ10153、ＢＢ10170及びＢＢ10171を基本に（実施例２、３及び４参照）、28 塩基長のオリゴヌクレオチド５’ＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＧＴＴＧＧＡＴＧＧＡ ＴＴＣＣＴＧＣ３’（配列番号20）を用いて行った。次いで、突然変異を、制限 酵素HindIII及びSplIを用いて、ｐＧＷ１Ｈｇ-・プラスミノーゲン中に直接クロ ーン化した。 実施例６−ＢＢ10181の構築 ＢＢ10181は、ＢＢ10170の切断部位配列と、α２−アンチプラスミンの結合を 防止するためのPhe（583）からArgへの追加突然変異を有している。ＢＢ10181は 、鋳型として完全長のＢＢ10150を含むＭ13を、プライマーとしてオリゴヌクレ オチド５’ＧＡＡＧＴＧＣＡＴＴＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＴＡＣＧＡＡＧ３’（配 列番号21）を用いて、中間のＢＢ10150に基づく構築物を介して構築された。次 いで、突然変異したＢＢ10150遺伝子を、制限酵素HindIII及びSmaIを用いて、ｐ ＧＷ１Ｈｇ中にクローン化した。次いで、この中間構築物から、このプラスミド からのHindIII〜SplIフラグメントをＢＢ10170からの対応する部分で置き換える ことによって、ＢＢ10181発現ベクターを作成した（実施例３参照）。 実施例７−ＢＢ10186の構築 ＢＢ10186は、ＢＢ10171の切断部位配列と、α２−アンチプラスミンの結合を 防止するためのMet（585）からArgへの追加突然変異を有している。ＢＢ10186は 、ＢＢ10181のための上記実施例６に記載さ れた方法に類似の方法で作成された。中間のＢＢ10150構築物は、25塩基長のオ リゴヌクレオチド５’ＣＣＡＣＡＧＡＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＣＣＴＣＧ３ ’（配列番号22）を用いて作成され、ｐＧＷ１Ｈｇ中にクローン化された。次い で、ＢＢ10186を、ＢＢ10171からのHindIII〜SplIフラグメントを用いて、フラ グメントスイッチ（fragment awitch）によって作成した（実施例４参照）。 実施例８−ＢＢ10199の構築 ＢＢ10199は、ＢＢ10158の切断部位配列と、α２−アンチプラスミンの結合を 防止するためのGlu（606）からLysへの追加突然変異を有している。ＢＢ10199は 、本質的に、ＰＣＴ／ＧＢ9301632の実施例２及び３に記載されたように作成さ れた。ＢＢ10158のKpnI〜EcoRVフラグメント（上記実施例３参照）が、ｐＵＣ中 にクローン化されたＢＢ10151のGlu（606）からLysへの構築物の対応するフラグ メントを置き換えるために用いられ、次いで、ＰＣＴ／ＧＢ9301632に記載され ているような最終発現ベクター中にクローン化された。 実施例９−ＢＢ10151の切断 プラスミノーゲン突然変異体（12.5μｇ）を、方法１に記載されたように、2. 8μｇのトロンビンとともにインキュベートした。プラスミノーゲン突然変異体 の切断に関するタイムコースを、定量的ゲルスキャニング（quantitative gel s canning）により測定した。Ｔ19及びＢＢ10151の50％切断時間は、それぞれ９分 と３分であった。 ＢＢ10151の切断に関するゲルスキャンデータを、図１に示す。 実施例１０−ＢＢ10151の活性化 精製されたＢＢ10153蛋白を、連鎖色素分析を用いて活性化に関して分析した （方法2.1参照）。この分析の結果を、図２に示す。図２ においては、時間とともに405nmの吸光度が上昇しており、それは、トロンビン とともにＢＢ10151をインキュベートすることにより、プラスミン活性が生じる ことを例証している。Ｔ19は、比較のために示され、この分析では、ＢＢ10151 の約２分の１の効果であることが分かった。 実施例１１−血餅（plasma clot）溶解 ＢＢ10153とＴ19の血餅を溶解する能力を、方法2.2に記載されているように測 定し、その分析の結果を図３に示す。ＢＢ10151（20μｇ／ml）は、血餅を完全 に溶解することができたが、一方Ｔ19は、150μｇ／mlまでの濃度では、血餅を 溶解しなかった。従って、ＢＢ10151は、血餅の溶解を誘発することに関して、 Ｔ19より少なくとも７倍高い活性を持つことが分かった。この発明の他のプラス ミノーゲン類似体の代表的な例について、40μｇ／mlの濃度で、血餅溶解活性を 比較した。表１におけるその結果は、それらがＢＢ10151と同様の活性を有して いることを示している。 方法 １．切断分析 プラスミノーゲン類似体を、還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気 泳動（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）を用いて、トロンビンによる切断に対する感受性に関 して評価する。100ｍＭトリス塩酸塩ｐＨ7.4中の0.125mlの典型的なインキュベ ーション容量は、実施例に示された濃度でのプラスミノーゲン類似体と、実施例 に示された濃度でのトロンビンとから成っている。インキュベーションを、37℃ で行う。対照のインキュベーションを、トロンビンを入れずに同じ条件下で行う 。活性化反応を、20％の最終濃度になるまでトリクロロ酢酸を加えて蛋白を沈澱 させ、４℃で４時間以上放置することにより停止した。次いで、沈殿をペレット 化し、アセトンで洗浄し、ＳＤＳ ＰＡＧＥサンプル緩衝液（0.1ｍトリスｐＨ6. 8、10％グリセロール、１％ＳＤＳ、0.5％メルカプトエタノール及び0.5％ブロ モフェノールブルー）中に懸濁した。サンプルを、８−25％勾配ゲルか又は12％ ゲル上で分析した。結果として得られたゲルを、ゲルを走査し、かつピーク下面 積を測定することによってバンド中の蛋白濃度を計算する、島津ゲルスキャナー を用いて分析した（用語島津は、商品名である）。従って、プラスミノーゲンの 切断速度を、約92kDaにおけるプラスミノーゲンバンドの消失と、約66kDaにおけ るプラスミンＨ鎖バンドの出現を測定することによって、決定した。 ２． 活性化分析 2.1連鎖色素分析 プラスミノーゲン類似体とトロンビンを、色素基質S2251の存在下で共にイン キュベートする。活性化によって産生されたプラスミンは、S2251を直接切断し 、それによって405nmでの吸光度が上昇する。分析は、50ｍＭトリス塩酸塩、0.1 ｍＭ ＥＤＴＡ、0.005％トリトンＸ100及び0.1％ＨＳＡを含む緩衝液中の総容量 880μｌで行われる。S2251を終濃度0.35mg／mlになるまで加える。用いたプラス ミン類似体濃度は、３μｇ／mlである。用いたトロンビン濃度は、4.55ＮＩＨＵ ／mlである。反応の100μｌアリコートを、37℃でのインキュベーション中に除 去し、反応を停止するために、マイクロタイタプレート中の25μｌの４％酢酸に 加える。タイムコースが完了した時点で、プレートを、405nmの波長のマイクロ プレートリーダーで読み取る。 2.2生体内（in vitro）での血餅溶解分析 0.1Ｍトリス塩酸塩ｐＨ7.4中における、50μｌのうさぎ血漿（3.8％のクエン 酸三ナトリウムで凝固阻止されている）、50μｌのＡＰＴＴ試薬（Instrumentat ion Labs）及び適当な容量のプラスミノーゲン類似体の混合物を、96穴マイクロ タイタプレートのウエル中で、同じ緩衝液を用いて200μｌに調製する。異なる ウエルには、50.6μｌの同じ緩衝液で混合された4.4μｌの500ｍＭ塩化カルシウ ムが含まれている。プレートを37℃で30分間インキュベートし、50μｌの塩化カ ルシウムをプラスミノーゲン類似体を含むウエルに移すことによって、凝固を開 始する。血餅の形成及び溶解の進行を、37℃で１時間連続してインキュベートす る間、間隔を置いて405nm（620nmのリファレンス）での吸光度を測定することに よって、追跡する。 配列番号

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 7/06 8318−4Ｈ 7/08 8318−4Ｈ 14/47 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 9/68 9152−4Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＣＡ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＳ，ＦＩ， ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＵＡ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ハンター，マイケル，ジョージ イギリス国、オックスフォード オーエッ クス４ ５エルワイ、カウリー、ウォトリ ントン ロード（番地なし）ブリティッシ ュ バイオ−テクノロジー リミテッド内 (72)発明者 ダウソン，ケイス，マーチン イギリス国、オックスフォード オーエッ クス４ ５エルワイ、カウリー、ウォトリ ントン ロード（番地なし）ブリティッシ ュ バイオ−テクノロジー リミテッド内

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ArgとP1’の間でトロンビンによって切断可能である切断部位配列P4−P3−P ro−Arg−P1’−P2’（P3は塩基性アミノ酸残基であり、P4は疎水性アミノ酸残 基であり、P1’及びP2’はそれぞれ独立して非酸性アミノ酸残基である）を含む 、トロンビンによって活性化されてプラスミン活性を持つことができるプラスミ ノーゲン類似体。 ２．塩基性アミノ酸残基P3が、リジン又はアルギニン残基である請求項１記載の 化合物。 ３．疎水性アミノ酸残基P4が、バリン、イソロイシン又はロイシンである請求項 １又は２記載の化合物。 ４．非酸性アミノ酸残基P1’及びP2’が、それぞれ独立してバリン、イソロイシ ン又はロイシンである請求項１〜３の何れかに記載の化合物。 ５．塩基性アミノ酸残基P3がリジン残基であり、疎水性アミノ酸残基P4がイソロ イシンである請求項１〜４の何れかに記載の化合物。 ６．非酸性アミノ酸残基P1’及びP2’が、それぞれイソロイシン及びバリンであ る請求項５記載の化合物。 ７．切断部位Ile−Lys−Pro−Arg−P1’−P2’（P1’及びP2’はそれぞれ独立し て非酸性アミノ酸である）を含む請求項１記載の北合物。 ８．切断部位配列Ile−Lys−Pro−Arg−Ile−Valを含む請求項７記載の化合物。 ９．切断部位配列が、野生型プラスミノーゲンのPro（559）、Gly（560）に対応 する配列がThr−Thr−Lys−Ile−Lys−Proで置換され、かつVal（562）がIleで 置換されるように挿入されている請求項８記載の化合物。 10．塩基性アミノ酸残基P3がアルギニン残基であり、疎水性アミノ酸残基P4がロ イシンである請求項１〜４の何れか一つに記載の化合物。 11．非酸性アミノ酸残基P1’及びP2’が、共にバリンである請求項10記載の化合 物。 12．切断部位Leu−Arg−Pro−Arg−P1’−P2’（P1’及びP2’はそれぞれ独立し て非酸性アミノ酸である）を含む請求項１記載の化合物。 13．切断部位配列Val−Glu−Leu−Gln−Gly−Leu−Arg−Pro−Arg−Val−Valを 含む請求項12記載の化合物。 14．Pro（559）、Gly（560）が、Val、Glu、Leu、Gln、Gly、Leu、Arg、Proで置 換されている請求項１３記載の化合物。 15．切断部位配列Gly−Gln−Lys−Thr−Leu−Arg−Pro−Arg−Val−Valを含む請 求項12記載の化合物。 16．切断部位配列が、野生型プラスミノーゲンのPro（559）、Gly（560）に対応 する配列がGly、Gln、Lys、Thr、Leu、Arg、Proで置換されるように挿入されて いる請求項15記載の化合物。 17．前記の切断部位配列に加えて、野生型プラスミノーゲンに関して付加、欠失 又は置換を含む請求項１〜１６の何れか一つに記載の化合物。 18．野生型プラスミノーゲンのCys（558）及びCys（566）に対応する一つもしく は両方のアミノ酸が、置換もしくは欠失されている請求項17記載の化合物。 19．前記残基の一つもしくは両方が、アラニンもしくはセリン残基で置換されて いる請求項18記載の化合物。 20．切断部位配列Ala−Gly−Gln−Lys−Thr−Leu−Arg−Pro−Arg−Val−Valを 含む請求項１〜４、10〜12、15又は17〜19の何れか一つに記18記載の化合物。 21．切断部位配列が、野生型プラスミノーゲンのCys（558）、Pro（559）、Gly （560）に対応する配列がAla、Gly、Gln、Lys、Thr、Leu、Arg、Proで置換され 、かつCys（566）がAlaで置換されるように挿入されている請求項20記載の化合 物。 22．切断部位配列Ala−Leu−Arg−Pro−Arg−Val−Valを含む請求項１〜４、10 〜12又は17〜19の何れか一つに記載の化合物。 23．切断部位配列が、野生型プラスミノーゲンのCys（558）、Pro（559）、Gly （560）に対応する配列が、Ala、Leu、Arg、Proで置換され、かつCys（566）がA laで置換されるように挿入されている請求項22記載の化合物。 24．切断部位配列Ala−Thr−Thr−Lys−Ile−Lys−Pro−Arg−Ile−Valを含む請 求項１〜８及び17〜19の何れか一つに記載の化合物。 25．Cys（558）、Pro（559）、Gly（560）がAla、Thr、Thr、Lys、Ile、Lys、Pr oで置換され、Val（562）がIleで置換され、かつCys（566）がAlaで置換されて いる請求項24 記載の化合物。 26．前記配列の付加、欠失又は置換が、その化合物における野生型プラスミノー ゲンのセリンプロテアーゼドメイン（配列番号２）に対応するドメイン内にある 請求項17〜19の何れか一つに記載の化合物。 27．前記配列の付加、欠失又は置換が、その化合物における野生型プラスミノー ゲンのセリンプロテアーゼドメイン（配列番号２）に対応するドメインの外側に ある請求項17〜19の何れか一つに記載の化合物。 28．前記配列の付加、欠失又は置換が、その化合物とアンチプラスミン間の相互 作用部位に連続した近接以外に、空間的に非常に近接している１以上の残基にあ る請求項26記載の化合物。 29．前記配列の付加、欠失又は置換が、プラスミンのプロテアーゼドメインの残 基17−20、44−54、62、154、158又は193−213（配列番号２の番号を使用）に対 応する領域における一つもしくは複数の残基にある請求項28記載の化合物。 30．次の突然変異：即ち、野生型プラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメイ ン（配列番号２）におけるGlu-62からLys又はAla、Ser-17からLeu、Arg-19からG lu又はAla、Glu-45からLys、Arg又はAlaへの１以上の突然変異を有する請求項29 記載の化合物。 31．前記配列の付加、欠失又は置換が、プラスミンのプロテアーゼドメインの残 基22又は24（配列番号２の番号を使用）に対応する領域における一つもしくは複 数の残基にある請求項26記載の化合物。 32．次の突然変異：即ち、Phe（583）からArg、又はMet（585）からArgへの１つ もしくは両方の突然変異を有する請求項31記載の化合物。 33．野生型プラスミノーゲンのGlu（606）に対応するアミノ酸残基が、リジン残 基によって置換されている請求項26記載の化合物。 34．Ｎ−末端ドメインが欠失されているlys−プラスミノーゲンに対応する請求 項27記載の化合物。 35．野生型プラスミノーゲンのアミノ末端の68、77又は78アミノ酸残基に対応す るアミノ酸残基が、欠失されている請求項17〜34の何れか一つに記載の化合物。 36．野生型プラスミノーゲンのクリングルドメインに対応する１以上のクリング ルドメインが欠失されている請求項17〜34の何れか一つに記載の化合物。 37．次の突然変異：即ち、Asp（137）からSer、又はAsp（139）からSerへの１つ もしくは両方の突然変異を含む請求項17〜36の何れか一つに記載の化合物。 38．連続するアミノ酸残基を共にカップリングすること、及び／又はオリゴペプ チドを結合することからなる請求項１〜37の何れか一つに記載の化合物の製造方 法。 39．対応する核酸配列のリボソーム翻訳からなる請求項38記載の方法。 40．請求項１〜37の何れか一つに記載の化合物をエンコードする核酸。 41．ベクター、例えばプラスミド、コスミド又はファージである 請求項40記載の核酸。 42．ヒトサイトメガロウイルス由来の強力なプロモーター及びエンハンサー配列 を含む第二核酸配列に操作的に連結された、蛋白をコードするか又はクローニン グ部位を表現する第一核酸配列、ＳＶ40由来のポリアデニル化配列をエンコード する第三核酸配列、及びＳＶ40プロモーターから発現される選択可能なマーカー をコードし、その選択可能なマーカー配列の３’末端に追加のＳＶ40ポリアデニ ル化シグナルを持つ第四核酸配列からなる請求項41記載の核酸。 43．連続するヌクレオチドを共にカップリングすること、及び／又はオリゴー及 び／又はポリーヌクレオチドを結合することからなる請求項40〜42の何れか一つ に記載のプラスミノーゲン類似体をエンコードする核酸の製造方法。 44．請求項40〜42の何れかに記載の核酸によって形質転換された細胞もしくは細 胞系。 45．真核細胞、例えば酵母細胞（サッカロミセス・セレビシェ及びピチア・パス トリスを含む）、又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ及び P3X63-Ag8.653 のようなマウス骨髄腫細胞系、ＣＯＳ細胞、ヒーラ細胞、ＢＨ Ｋ細胞、ボウス細胞系のようなメラノーマ細胞系、マウスＬ細胞、ＨｅｐＧ２の ようなヒト肝癌細胞系、マウス繊維芽細胞及びマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞のような 哺乳動物細胞である請求項44記載の細胞もしくは細胞系。 46．凝固と繊維素溶解間の不均衡によって引き起こされる病態の予防及び／又は 治療に用いるための請求項１〜37の何れか一つに記載の化合物。 47．凝固と繊維素溶解間の不均衡によって引き起こされる病態の予防及び／又は 治療剤の製造における請求項１〜37の何れか一つに記載の化合物の用途。 48．請求項１〜37の何れか一つに記載の１以上の修飾プラスミノーゲン類似体と 、医薬的もしくは獣医学的に許容される担体とからなる医薬もしくは獣医用組成 物。