JP2006507806A - トロンビン切断可能な第ｘ因子アナログ - Google Patents

Abstract

本発明は、ネイティブな第Ｘ因子の活性化部位の配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅの代わりにトロンビン切断可能な配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａを含む第Ｘ因子アナログに関する。これらの第Ｘ因子アナログは、凝血促進性医薬品を得るために使用され得る。

Description

本発明は、トロンビン切断可能な第Ｘ因子誘導体およびその治療用途に関する。

血液凝固は、酵素反応のカスケードの結果であり、この最終段階は、トロンビンの生産であり、これは、血管開口部を塞ぎ得る血塊の形成を誘導する。これらの反応の多くは、活性なセリンプロテアーゼへの不活性チモーゲンのタンパク分解性活性化を含む。

この反応のカスケードは、「内因性経路」および：「組織因子経路」または「外因性経路」と呼ばれる２つの経路に慣用的に分けられる。

内因性経路を介する凝固のプロセスは、内皮下組織と接触する血液によって開始される。この接触は、第ＸＩＩ因子（ＦＸＩＩ）から第ＦＸＩＩａ因子への活性化を生じ、次いで、これは、第ＸＩ因子（ＦＸＩ）の第ＸＩａ因子（ＦＸＩａ）への活性化を触媒し、これは、それ自体、第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を第ＩＸａ因子に活性化する。後者は、その補助因子である第ＶＩＩＩａ因子（ＦＶＩＩＩａ）に結合し、テナーゼ(tenase)複合体を形成する。この複合体は、非常に高い効率で第Ｘ因子（ＦＸ）を切断し、活性化第Ｘ因子（ＦＸａ）を生成する。

外因性経路を介する凝固のプロセスは、組織因子（ＴＦ）によって開始され、血管開口の形成が生じる際に血液と接触される。この組織因子は、血液中に少量で存在する活性化第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）に結合する。このようにして形成されたＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体は、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を活性化し得る。

従って、内因性経路および外因性経路は、第Ｘ因子の第Ｘａ因子への活性化に向けて収斂し、これは、凝固における重要な酵素の１つを構成する。

第Ｘ因子は、Ｎ末端からＣ末端まで：単一ペプチド、プロペプチド、「Ｇｌａ」ドメイン、表皮成長因子のそれに類似する構造の２つの「ＥＧＦ」（表皮成長因子について）ドメイン、活性化ペプチド、およびセリンプロテアーゼ型の触媒ドメインを含む、４４８アミノ酸前駆体の形態の肝細胞によって合成される。第Ｘ因子の翻訳後修飾は、特に複雑である：シグナルペプチドおよびプロペプチドの切断に加えて、これらは、「Ｇｌａ」ドメインの１１のグルタミン酸のγ−カルボキシグルタメートへのカルボキシル化、第２のＥＧＦドメインを活性化ペプチドから分離するトリペプチドＡｒｇ_１８０−Ｌｙｓ_１８１−Ａｒｇ_１８２（数は、第Ｘ因子ｃＤＮＡの翻訳産物を指す）の切断、ＥＧＦドメインのＡｓｐ_１０３残基のβ−ヒドロキシアスパラギン酸へのβ−ヒドロキシル化、および活性化ペプチドに関して４つを含む少なくとも５つのグリコシル化を含む。

従って、血漿中に循環する成熟第Ｘ因子は、ジスルフィド架橋（Ｃｙｓ_１７２−Ｃｙｓ_３４２）によって結合される２つのポリペプチド鎖からなる：１３９アミノ酸の「軽」鎖は、Ｇｌａドメインおよび２つのＥＧＦから構成され；３０６アミノ酸「重」鎖は、触媒ドメインに結合した活性化ペプチドから構成される。

第Ｘ因子のセリンプロテアーゼへの活性化は、活性化ペプチドと触媒ドメインとの間のタンパク質分解性切断を必要とする。テナーゼ複合体およびＦＶＩＩａ−ＴＦ複合体は、Ａｒｇ_２３４とＩｌｅ_２３５残基との間のこの切断を行う。

活性化第Ｘ因子はまた、その重鎖のＣ末端において小さいフラグメントをゆっくり放出する自己触媒性切断を行い得る。従って、第Ｘａ因子αおよびβは、このＣ末端ペプチドが存在するか否かに従って区別される。しかし、第Ｘａ因子のこれらの２つの形態の触媒活性は、同一である(JESTY et al., J. Biol. Chem, 250, 4497-4504, 1975)；結果として、他に特定されない限り、本発明の説明において、用語「第Ｘａ因子」は、これら２つの形態の一方または他方を等しく示す。

第Ｘａ因子のその補助因子（第Ｖａ因子）との結合は、プロトロンビンをトロンビンに活性化する、プロトロンビナーゼ複合体を形成する。

トロンビンはまた、凝固および一般に出血において必須酵素である；これは、多機能セリンプロテアーゼである。これは、表面においてそのレセプターを切断することによって血小板凝集を誘導し、循環するフィブリノゲンを不溶性フィブリン血塊に変換する。この血塊は、すでに形成された血小板血栓を強化することによって、血管開口をブロックし、従って、出血を停止することが可能である。

トロンビンは、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子（これらは、それぞれ、テナーゼおよびプロトロンビナーゼ複合体の補助因子である）、ならびに第ＸＩ因子（ＦＸＩ）を活性化し得、これは、これらの因子が関与する、その形成を導く反応の増幅を生じる。

図１は、外因性経路を介するかまたは内因性経路を介する凝固の主要な酵素反応、およびトロンビン形成の自己増幅機構（破線矢印によって示す）を概略的に示す。

凝固に関与する因子の１つにおける定性的または定量的欠乏は、しばしば重篤であり、そして生命を脅かし得る、血栓または出血発現を生じる。この文脈において、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子における欠乏からそれぞれ生じる血友病Ａおよび血友病Ｂが特に言及される。

血友病ＡおよびＢは、重大かつかなり一般的である出血型の凝固障害である：その発生率は、血友病Ａについて１００００人の男性の出生当たり約１ケース、そして血友病Ｂについて３００００人の男性の出生当たり１ケースである。

臨床用語において、これら２つの病理学的状態は、区別可能でない：両方の場合において、これは、第ＶＩＩＩ因子の、影響される第ＩＸ因子との会合から生じるテナーゼ複合体である。結果として、活性化第Ｘ因子および結果としてトロンビンの不十分な生成が生じる。

このトロンビン欠乏は、フィブリン形成における減少だけでなく、トロンビン生成の自己増幅における減少もまた生じる。

現在提案される血友病の処置は、テナーゼ複合体の機能を再確立することを目的とした置換型処置、またはこのテナーゼ複合体を迂回することを可能にする１つ以上の分子の使用に基づく処置のいずれかである(HEDNER, Thromb. Haemost., 82,51-539,1999)。

置換処置は、欠乏している第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を投与することを包含する。これは、フィブリンの形成の他に、トロンビン生成の自己増幅を正確に再確立することを可能にする現在利用可能な唯一の処置である。

この処置の主要な欠点は、レシピエントの免疫系によって外来と見られ得る、注射された分子の潜在的な抗原性にある。使用される因子に対する中和アロ抗体の発生は、置換処置の重大な合併症であり、これは、それを徐々に非効果的にする。

テナーゼ複合体を迂回するための３つのアプローチが提案されている：
−特にプロトロンビンならびに第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子および第Ｘ因子を含む、「ビタミンＫ−依存」凝固因子の混合物の注射。第ＶＩＩ因子および第Ｘ因子は、部分的に活性型で存在する。しかし、この処置は、まれであるが、重大な副作用：アナフィラキシーショックおよび血栓アクシデント（心筋梗塞、播種性血管内凝固症候群）を誘導し、これらは、血管外傷に局在しない作用によって説明され得る。さらに、この処置は、血友病タイプＢの場合においてのみトロンビン生成の自己増幅を再確立する；
−組織因子存在下で、テナーゼ複合体と独立して第Ｘ因子を活性化する、活性化第ＶＩＩ因子の大規模注射。活性化第ＶＩＩ因子は、組織因子との複合体が形成する血管開口部にその作用が位置するという利点を有する。血友病を処置する際のその効果はまた、活性化血小板によって暴露されるアニオン性ホスホリピドを使用する組織因子独立機構によって説明され得る(HOFFMAN et al., Blood Coag. Fibrinolysis, 9 (suppl1), S61-65, 1998)。活性化第ＶＩＩ因子を使用する主要な欠点は、その非常に短い血漿半減期（３時間より短い）であり、これは、大量に投与することを必要とし、これは、処置を非常に高価にする。さらに、活性化第ＶＩＩ因子は、トロンビン生成の自己増幅を誘導しない。活性化第ＶＩＩ因子の治療用量の添加後に血友病者の血漿において生成されるトロンビンの量は、通常の血漿において生成されるよりもずっと少ない(BUTENAS et al., Blood, 99, 923-930, 2002)。
−第Ｘ因子の投与、その活性は、血漿においてごくゆっくりと放出される；この文脈において、投与の３つの型が提案されている：ホスホリピド小胞と組み合わせた活性化第Ｘ因子の投与(NI et al., Thromb. Haemost., 67, 264-271, 1992)；活性化されるが、例えば、活性化部位のセリンのアセチル化によって可逆的に阻害され、徐々に脱アセチル化することによって血漿中でゆっくりと再活性化し得る、第Ｘ因子の投与(WOLF et al., Blood, 86, 4153-4157, 1995;LIN et al., Thromb. Res., 88, 365-372, 1997)；血漿中でテナーゼ複合体と独立して活性化され得るチモーゲンの形態での第Ｘ因子の投与。後者のアプローチは、テナーゼ複合体による切断についての部位が別のプロテアーゼによる切断についての部位と置換される第Ｘ因子アナログを使用する。

HIMMELSPACH et al. (Thromb. Res., 97, 51-67 2000) は、このようにして、活性化部位がフューリン(furin)についての切断部位と置換される第Ｘ因子アナログを記載する。一旦注射されると、このチモーゲンは、ゆっくりとそして連続して、第Ｘａ因子に変換される。

ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３８３１７は、ネイティブな活性化部位が別のプロテアーゼ（第ＸＩａ因子、トロンビン、第ＸＩＩａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子およびフューリンより選択される）による切断部位と置換される種々の第Ｘ因子アナログの構築を提案する。ＰＣＴ出願ＷＯ０１／１０８９６は、第ＸＩａ因子による切断部位と、テナーゼ複合体による活性化のためのネイティブな部位の置換を提案する。

第Ｘ因子アナログの使用の主要な利点は、これらのアナログの血漿半減期にあり、これは、第Ｘ因子のそれと類似し（４８時間）、従って、活性化第Ｘ因子のそれ（１分未満）よりもはるかに長い。これらのアナログの潜在的な欠点は、それらの効果を制御する際の困難性より生じる：活性化第Ｘ因子の生成は、調節されることなく、そして血管開口部において局在化することなく、連続して生じる。さらに、これらのアナログは、トロンビン生成の増幅を誘導することを可能としない。

従って、これらの欠点を示さない他の第Ｘ因子アナログを有することが所望であるように見える。この目的で、本発明者らは、図２に示される機構に従って、凝固カスケードの欠乏ステップ、特にテナーゼ複合体を迂回するだけでなく、トロンビン生成の自己増幅を再確立することを可能にするトロンビン活性可能な第Ｘ因子誘導体を求めている。この第Ｘ因子誘導体の活性型（ＦＸａ^＊）は、機能的なプロトロンビナーゼ複合体を（活性化第Ｖ因子と組み合わせて）形成し得、従って、プロトロンビンをトロンビンへ活性化し得る。次いで、このトロンビンは、第Ｘ因子誘導体の分子をさらに活性化する。

生理学的に、トロンビンは、第Ｘ因子を活性化しない。実際に、切断の効率は、切断部位をフレームするアミノ酸の性質によって、特に、活性化部位の残基Ｐ_３−Ｐ_２−Ｐ_１−Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’（残基Ｐ_１とＰ_１’との間で切断が生じる）によって条件付けされる。現在、第Ｘ因子の場合には、活性化部位の配列Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（ＬＴＲ−ＩＶＧ；配列番号１）は、トロンビンによる切断について特に好ましい、配列Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（ＭＰＲ−ＳＦＲ；配列番号２）またはＶａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ（ＶＰＲ−ＳＦＲ；配列番号３）と非常に異なっている(MARQUE et al., J. Biol. Chem., 275, 809-816, 2000; BIANCHINI et al., J. Biol. Chem., 277, 20527-20534, 2002)。

切断部位に先行する残基Ｐ_３〜Ｐ_１は、活性化後の第Ｘ因子の触媒活性に関与しない；これらは切断後に放出される活性化ペプチドの一部である。同じことが残基Ｐ_１’〜Ｐ_３’（これは、切断部位の直後に続く）について当てはまらない：全てのセリンプロテアーゼにおけるように、活性化第Ｘ因子の触媒鎖のＮ末端残基は、酵素活性に関与する。特に残基Ｐ_１’が酵素の触媒機構において基本的な役割を果たす。

第Ｘ因子の活性化部位の配列ＬＴＲ−ＩＶＧの配列ＶＰＲ−ＳＦＲとの置換は、トロンビンによる第Ｘ因子の切断の速度を１０^５倍増幅することを可能にする。しかし、この置換は第Ｘａ因子の酵素活性に有害であるという危険が存在する。実際に、重鎖がイソロイシン以外の残基で始まる活性化第Ｘ因子アナログの酵素活性がどんなものかを予測することは可能ではない。

ＰＣＴ出願ＷＯ９８／３８３１７は、ネイティブな活性化部位の配列ＬＴＲ−ＩＶＧが配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ（ＴＲＲ−ＳＶＧ；配列番号４）で置換された第Ｘ因子アナログを記載し、これは、潜在的にトロンビン切断可能であると示される。しかし、トロンビンによるこのチモーゲンの効果的な切断に関して、そしてこの切断から生じる第Ｘａ因子アナログの触媒活性に関しては何の示唆も与えられていない。

本発明者らは、第１に、トロンビンによる切断に関して、第２に、それから生じる第Ｘａ因子アナログの酵素活性に関して、これらの置換の効果を研究するために、第Ｘ因子のネイティブな活性化部位のＰ_３−Ｐ_２−Ｐ_１−Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’位における種々の置換を試験した。

従って、彼らは、配列ＴＲ−ＩのＰ_２−Ｐ_１−Ｐ_１’における配列ＰＲ−Ａでの置換は、トロンビンによって効果的に切断され得る第Ｘ因子アナログ、および減少するがその非変異型ホモローグのそれと類似しそして通常の生理学的機能に匹敵する、触媒活性を有する第Ｘａ因子アナログを生成する切断を得ることを可能にすること；さらに、触媒活性における減少は、ネイティブな第Ｘａ因子のそれと比較される半減期の増加によって補償される。半減期におけるこの増加は、セルピン(serpines)（血漿中のセリンプロテアーゼインヒビター）に対する、特にアンチトロンビンに対する、より優れた耐性より生じる。

結果として、本発明の主題は、ネイティブな第Ｘ因子の活性化部位の配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅがトロンビン切断可能な配列で置換され、該トロンビン切断可能な配列が配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａであることを特徴とする、第Ｘ因子アナログである。

本発明の主題はまた、本発明に従う、第Ｘ因子アナログのトロンビンによる切断によって得られ得る任意の第Ｘａ因子アナログである。

本明細書中において、用語「第Ｘ因子アナログ」は、成熟な第Ｘ因子分子およびその細胞内前駆体の両方を示す；用語「第Ｘａ因子アナログ」は、活性化されたαまたはβ形態の分子を示す。

活性化部位のＰ_３、Ｐ_２’およびＰ_３’位における置換に関して、これらは、トロンビンによる切断の効果に対して、およびＰ_２、Ｐ_１またはＰ_１’位において行われるものより得られる第Ｘａ因子アナログの酵素活性に対して、あまり影響しない。

従って、Ｐ_３において、ネイティブな第Ｘ因子のＬｅｕ残基は、保存されても良いし、Ｐｒｏ、ＡｓｐおよびＧｌｕを除く任意のアミノ酸で置換されても良い；Ｐ_２’において、ネイティブな第Ｘ因子のＶａｌ残基は、保存されても良いし、好ましくはＩｌｅ、ＬｅｕおよびＰｈｅより選択されるアミノ酸で置換されても良い；Ｐ_３’において、ネイティブな第Ｘ因子のＧｌｙ残基は、保存されても良いし、好ましくはＡｓｎおよびＨｉｓより選択されるアミノ酸で置換されても良い。

必要に応じて、本発明に従って、第Ｘ因子アナログおよび第Ｘａ因子アナログに特異的な活性部位改変を、第Ｘ因子または第Ｘａ因子の異なるドメインに関する他の改変と組み合わせることが可能であり、それらの特性のいくつかを改善することを可能にする。従って、例えば、CAMIRE et al.(Biochemistry, 39, 14322-14329, 2000)によって記載されるように、γ−カルボキシル化成熟タンパク質のよりよい収率を得るために、ネイティブな第Ｘ因子のプロペプチドをプロトロンビンのそれと置換することが可能である。

本発明の主題はまた、本発明に従う第Ｘ因子アナログをコードする核酸分子である。

これらの核酸分子は、当業者に周知の従来の方法によって、特に、ネイティブな第Ｘ因子をコードする核酸分子の部位特異的突然変異誘発によって、得られ得る。

本発明はまた、転写（特にプロモーターおよび必要に応じてターミネーター）および必要に応じて翻訳の制御についての適切なエレメントに関連する、本発明に従う核酸分子を含む発現カセット、また、本発明に従う核酸分子が挿入される組換えベクターを包含する。これらの組換えベクターは、例えば、クローニングベクター、発現ベクター、または遺伝子治療において使用され得る遺伝子移入ベクターであり得る。

本発明の主題はまた、本発明に従う少なくとも１つの核酸分子で遺伝的に形質転換された原核生物または真核生物宿主細胞である。好ましくは、本発明に従う第Ｘ因子アナログの発現および生成のために、真核生物（例えば、哺乳動物細胞）が選択される。

本発明に従う、ベクターの構築および宿主細胞の形質転換は、従来の分子生物学技術によって実施され得る。

本発明はまた、本発明に従う発現カセットを含む少なくとも１つのトランスジーンを有する、動物、特に非ヒトトランスジェニック哺乳動物を包含する。これらのトランスジェニック哺乳動物は、例えば、治療目的の他のタンパク質の生成についてすでに提案されているものと類似する様式で、本発明に従う第Ｘ因子アナログを製造するために使用され得る(BRINK et al., Theriogenology, 53, 139-148 2000)。

本発明に従う第Ｘ因子アナログは、例えば、本発明に従う遺伝的形質転換された細胞を培養することによって、そして該細胞によって発現されるアナログを培養物から回収することによって、得られ得る。次いで、これらは、必要な場合、当業者に公知の従来の手順によって、例えば、分画沈殿、特に硫酸アンモニウムでの沈殿、電気泳動、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィーなどによって、精製され得る。

本発明の主題はまた、凝血促進性医薬品を得るための、本発明に従う第Ｘ因子アナログもしくは第Ｘａ因子アナログ、またはこれらのアナログをコードする核酸分子の使用である。

本発明に従う、第Ｘ因子アナログまたは第Ｘａ因子アナログより得られる医薬品は、出血性型の凝固障害の予防または処置の文脈において、特に第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第ＸＩ因子における欠乏に続いて使用され得る。これらは、特に、血友病Ａまたは血友病Ｂであり得、これらは、インヒビター（処置のために従来使用される第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子に対する中和アロ抗体）の存在によって複雑化されてもよいしされなくてもよい；これらはまた、別の病理学的状態（自己免疫疾患、癌、リンパ球増殖症候群、突発性障害など）に関連する自己抗体の出現より生じる後天性血友病であり得る。

本発明に従う核酸分子は、遺伝子治療において使用され得る医薬品に有利に組み込まれ得る。遺伝子治療において従来使用されるベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスまたはレトロウイルス型のベクター））、リポソームなどが、本発明に従う医薬品を得るために使用され得る。

本発明に従う第Ｘａ因子アナログは、プロトロンビナーゼ複合体の外側で、ネイティブな第Ｘａ因子のそれよりも遙かに弱い触媒活性を有する。しかし、プロトロンビナーゼ複合体内で（すなわち、生理学的条件下で）、ネイティブな第Ｘａ因子と比較したそれらの活性の減少は、遙かに少なく、そしてこれらは、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子の欠失の影響を効果的に補正し得る。さらに、アンチトロンビンに対するかなりの耐性に起因して、本発明に従う第Ｘａ因子アナログは、それらのより弱い活性を補償する、より長い半減期を有するという利点を有する。これは遙かにゆっくりであるが、アンチトロンビンによる阻害（これは、触媒活性に比例する）が依然として存在し、ネイティブな第Ｘａ因子のそれと類似する自己調節の機能を保存することを可能にする。

さらに、本発明に従う第Ｘａ因子アナログの作用は、図２において示されるように、これらのアナログが関与する酵素カスケードが組織因子によって引き起こされるので、血管開口部に局在化したままである。最終的に、また、図２において示されるように、本発明に従う第Ｘ因子アナログの使用は、トロンビン生成の自己増幅を再確立することを可能にする。

この全体結果は、先行技術の第Ｘ因子または第Ｘａ因子アナログのそれよりも、よりよく標的化され、制御が容易な治療効果である。

本発明に従う第Ｘ因子アナログは、例えば、０．１〜０．５μＭ、すなわち、５〜２５ｍｇ/ｌのオーダーの血漿濃度で使用され得る。これらの濃度は、第ＶＩＩａ因子での処置の場合において使用されるものと近い用量を投与することによって得られ得るが、あまり頻繁ではない。

本発明は、以下に続くさらなる説明よりより明確に理解され、これは、本発明に従う第Ｘ因子アナログの調製および特徴付けの非制限的な例をいう。

実施例１：第Ｘ因子アナログについての発現ベクターの構築
種々のヒト第Ｘ因子誘導体を構築した：
−そのＣ末端において、モノクローナル抗体９Ｅ１０(PHARMINGEN, San Jose, USA)によって認識される１１アミノ酸ペプチド（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮ；配列番号５）の添加によってのみネイティブな第Ｘ因子と異なる誘導体（以下「ＦＸ−組換え体」という）；この改変は、発現されるタンパク質の検出および精製を容易にするのを可能にする；
−Ｇｌａドメインを欠き（これは、発現される組換えタンパク質の量を増加するのを可能にする）、そしてそのＮ末端において、モノクローナル抗体ＨＰＣ−４(ROCHE DIAGNOSTIC, Meylan, France)によって認識されるエピトープを構成する、１２アミノ酸配列（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ；配列番号６）を包含する点で、「組換え」誘導体と異なる誘導体（以下「ＧＦ−ＦＸ」という）；
−活性化部位のＰ_３、Ｐ_２、Ｐ_１、Ｐ_１’、Ｐ_２’、Ｐ_３’位における残基の１つ以上の改変によってＧＤ−ＦＸ誘導体と異なる、誘導体（以下ＧＤＸ−ＩＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＧ、ＧＤＸ−ＡＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧ、ＧＤＸ−ＳＦＲという）。

血漿から単離される通常の第Ｘ因子（ＦＸ−血漿）および上の誘導体の各々の活性化部位の残基Ｐ_３〜Ｐ_３’は、表Ｉに示される。

これらの誘導体を構築するために使用される発現ベクターは、所望の第Ｘ因子誘導体をコードする配列を有するヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列の置換によって、ベクターpNUT-hGH(PALMITER et al., Science, 1983,222, 809-814,1983)より得る。

ベクターPNUT-FXの構築
「pNUT-FX」と称されるベクターは、真核生物細胞において「ＦＸ−組換え体」誘導体を発現するのを可能にする。

使用されるヒト第Ｘ因子の完全なｃＤＮＡ（１４６７塩基対）をプラスミドpBluescript KS(-)のＳａｌＩ部位にMESSIER et al.(Gene, 99,291-294, 1991)によって、最初にクローニングした。

このｃＤＮＡを、それを含むベクターpBluescriptよりＰＣＲ増幅によって回収した。使用したプライマーを以下の表ＩＩに示す。使用される融解温度（Ｔｈ°）は、表の最終列に示す。

プライマー１（配列番号１３）および２（配列番号１４）は、第Ｘ因子をコードする配列のぞれぞれ、５’側に位置するＢａｍＨＩ制限部位および３’側に位置するＸｍａＩ部位を導入する。さらに、プライマー２は、第Ｘ因子ｃＤＮＡの停止コドンのすぐ前に、モノクローナル抗体９Ｅ１０によって認識されるエピトープをコードする配列を導入する。

増幅プロトコルは、以下の通りである：増幅は、製造業者によって推奨される緩衝液中で、２μｇ（７ｎＭ）のプラスミドpBluescript、２μＭの各プライマー１および２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Orsay, France）および６ユニットのPfu ＤＮＡポリメラーゼ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）を含む１００μｌの容量で、実施される。増幅は、以下のプログラムに従って、DNA THERMAL CYCLER(model 480, PERKIN ELMER, Roissy, France)において実施される；９５℃で５分の最初の変性、続いて、９５℃での４５秒の変性、プライマーの融解温度より少なくとも４℃低い温度での４５秒のハイブリダイゼーション、および７２℃での３．５分の伸長を各々含む３０サイクル。この増幅は、７２℃で１０分間のインキュベーションによって終了する。

増幅生成物は、フェノール/クロロホルム抽出によって精製され、そしてエタノールでの沈殿によって濃縮される。次いで、末端を、５ユニットのＴ_４ＤＮＡポリメラーゼ(NEW ENGLAND BIOLABS, Beverly, MA, USA)、１０ユニットのＴ_４ポリヌクレオチドキナーゼ(NEW ENGLAND BIOLABS)および０．３ｍＭのｄＮＴＰ(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)の存在下で、３７℃で３０分間のインキュベーションによって、平滑化およびリン酸化した。目的のフラグメントを、製造業者の指示に従って、標準１％アガロースゲルでの分離後、”QIAquick Gel Extraction Kit”(QIAGEN, Courtaboeuf, France)を使用して精製する。

並行して、レシピエントベクター(pBluescript, STRATAGENE)の１４０μｌ中の４０μｇ（８６ｎＭ）を、３７℃で９０分間、４００ユニットのＥｃｏＲＶで直鎖状にする。直鎖状のpBluescriptベクターの末端を、５０ユニットのウシ小腸アルカリホスファターゼ(NEW ENGLAND BIOLABS)の存在下で３７℃で６０分間のインキュベーションによって脱リン酸化する；次いで、このベクターを、標準１％アガロース中での分離後、”QIAquick Gel Extraction Kit”を使用して、上のように精製する。

製造業者によって推奨される１０μｌの緩衝液中で、周囲温度で２４時間の４００ユニットのＴ_４ＤＮＡリガーゼ(NEW ENGLAND BIOLABS)の存在下で、インサート２０ｎＭと共に１０ｎＭのベクターをインキュベートするライゲーションによって、インサートをレシピエントベクターに導入した。

得られたプラスミド(pBluscript-FX)を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α中で増幅し、SAMBROOK et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)によって記載されるように、標準的なプロトコルに従って精製する。

プラスミドpBluscript-FXのインサートを、以下のプロトコルに従って、カセット交換によってベクターpNUT-hGHに移入する。

２μｇ（４ｎＭ）のpNUT-hGHを、１００μｌの反応混合物中で、３７℃で２時間、６０ユニットのＢａｍＨＩで消化する。このように、直鎖化したベクターを、フェノール/クロロホルム抽出によって精製し、続いて、エタノールで沈殿させる。次いで、１ｍＭのＥＤＴＡを含む、１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中にとり、３０ユニットのＸｍａＩで、３７℃で３時間消化した。

この第２の消化に由来する２つのフラグメントを、１５０ユニットのアルカリホスファターゼの存在下で、３７℃で１時間のインキュベーションによって脱リン酸化する。

直鎖状のｐＮＵＴベクターを、標準１％アガロース中の電気泳動によって、その先のインサート（ｈＧＨをコードする配列を含む）から分離し、”QIAquick Gel Extraction Kit”を使用して精製する。

並行して、１３０μｇ（１．３μＭ）のpBluscript-FXを、３０μｌの反応混合物中で、３７℃で１時間の２０ユニットのＢａｍＨＩで消化する。直鎖化したベクターを、フェノール/クロロホルム抽出、続いてエタノールでの沈殿によって精製する。次いで、１ｍＭのＥＤＴＡを含む、１０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０中にとり、３０ユニットのＸｍａＩで、３７℃で３時間消化する。

ＦＸインサートを、標準１％アガロース中での電気泳動によってその先のベクターから分離し、”QIAquick Gel Extraction Kit”を使用して精製する。

ベクターpNUT-FXは、上に記載されるように、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼの存在下で、ベクターｐＮＵＴへのＦＸインサートのライゲーションによって得られる。

ベクターpNUT-GDXの構築
「Ｇｌａ」ドメインの存在は、真核生物細胞中の組換えタンパク質の合成をかなり制限する。その除去は、発現される組換えタンパク質の量を５倍に増加させることを可能にする。

さらに、第Ｘ因子の「Ｇｌａ」ドメインは、その生物学的活性について必要であるが、触媒の溝とのみ相互作用する基質に関するタンパク質分解活性について必須ではない。従って、「Ｇｌａ」ドメインを欠く誘導体の調製は、セリンプロテアーゼ活性に関して、活性化部位を並列する残基の改変の影響を迅速に決定することを可能にする。

ベクターpNUT-ETW (LE BONNIEC et al., J. Biol. Chem., 267, 6970-6976, 1992) は、その「Ｇｌａ」ドメインを欠き、Ｎ末端において、ウシ第Ｖ因子のシグナルペプチドおよび１２アミノ酸配列（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ）（モノクローナル抗体ＨＰＣ−４によって認識されるエピトープを構成する）に融合される、ヒトプロトロンビンの誘導体を発現する。

ベクターpNUT-GDXを構築するために、「ベクターpNUT-FXのシグナルペプチドおよび“Ｇｌａ”ドメイン」アセンブリは、「ベクターpNUT-ETWのシグナルペプチド、プロペプチドおよびＨＰＣ−４エピトープ」アセンブリと置換される。

ベクターpNUT-FXおよびpNUT-ETWのフラグメントを増幅するために使用されるプライマーは、以下の表ＩＩＩにおいて示される。ＰＣＴ増幅は、ベクターpNUT-FXについて上に記載されるように実施される。

ｐＮＵＴ−ＥＴＷに由来するフラグメント（これは、ｐＮＵＴのＢａｍＨＩおよびＸｍａＩ部位、第Ｖ因子のシグナルペプチドをコードする配列および抗体ＨＰＣ−４によって認識されるエピトープをコードする配列を含む）の増幅を、プライマー３（配列番号１５）および５（配列番号１７）を用いて行う；ｐＮＵＴ−ＦＸ由来のフラグメント（これは、２つのＥＧＦドメインをコードする配列、活性化ペプチド、および第Ｘ因子のセリンプロテアーゼドメイン、ならびに抗体９Ｅ１０によって認識されるエピトープを含む）の増幅は、プライマー６（配列番号１８）および４（配列番号１６）を用いて行われる。プライマー５および６は、部分的に相補的であり（プライマー６は、第１のＥＧＦの５’側に位置する、抗体ＨＰＣ−４によって認識されるエピトープをコードする配列の一部を導入する）、これは、プライマー３および４の存在下で、“メガ−プライマー”ＰＣＲ(HO et al., Gene, 15, 51-59, 1989)によって２つのＰＣＲに由来するフラグメントを結合する(join up)のを可能にする。このＰＣＲの産物は、４０ユニットのＸｍａＩ（４００μｌの容量で）で消化され、そして制限フラグメント（各末端にＸｍａＩ部位を有する）を、１％アガロースゲル中での分離後に、QIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製する。

さらに、６μｇ（１４０μｌ中（１２ｎＭ））のベクターｐＮＵＴ−ｈＧＨを、３７℃で２時間、２０ユニットのＸｍａＩで消化する。このようにして直鎖化したベクターを、標準１％アガロース中での電気泳動によってその以前のインサート（ｈＧＨをコードする配列）から分離し、そしてQIAquick Gel Extraction Kitを使用して精製する。インサートのないベクター（１０μｌ中０．１μｇ、すなわち、２．７ｎＭ）を４００ユニットのＴ_４ＤＮＡリガーゼの存在下で、周囲温度で１６時間、ライゲーションによって再環状化する。

再環状化したｐＮＵＴベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５α中で増幅され、精製される。

インサートなしの１００μｌ中の４０μｇ（すなわち、１１０ｎＭ）のベクターｐＮＵＴを、３７℃で３時間、１０ユニットのＸｍａＩで直鎖化し、その末端を、１５０ユニットのアルカリホスファターゼの存在下で、３７℃で１時間のインキュベーションによって脱リン酸化する。このようにして調製したベクターｐＮＵＴを、１％アガロースゲル中での分離後、QIAquick Gel Extraction Kitを使用して単離する。

ベクターｐＮＵＴ−ＧＤＸを、上に記載されるように、Ｔ_４ＤＮＡリガーゼの存在下で、“メガ−プライマー”ＰＣＲ由来のフラグメントのベクターｐＮＵＴへのライゲーション、およびＢａｍＨＩ、ＸｍａＩ、ＰｓｔＩまたはＲｃｏＲＩ制限プロフィールに基づく、正しい方向でインサートを含む構築物の選択によって得る。

ベクターｐＮＵＴ−ＧＤＸの部位特異的突然変異誘発
ネイティブな第Ｘ因子において（およびＧＤＸ−ＦＸ誘導体において）、切断部位（Ｐ_１とＰ_１’との間に生じる切断）をフレームする、残基Ｐ_３−Ｐ_２−Ｐ_１−Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’の配列は、ＬＴＲ−ＩＶＧである。

６つの第Ｘ因子アナログが調製される：ＧＤＸ−ＩＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＧ、ＧＤＸ−ＡＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧ、ＧＤＸ−ＳＦＲは、それぞれ配列Ｐ_３−Ｐ_２−Ｐ_１−Ｐ_１’−Ｐ_２’−Ｐ_３’：ＶＰＲ−ＩＶＧ、ＶＰＲ−ＩＦＧ、ＶＰＲ−ＩＦＲ、ＶＰＲ−ＡＶＧ、ＶＰＲ−ＳＶＧおよびＶＰＲ−ＳＦＲを有する。

これらの第Ｘ因子アナログを発現するベクターは、JONES et al.(Nature, 344, 793-794, 1990)のそれに由来する方法によって、ベクターｐＮＵＴ−ＧＤＸの変異誘発によって調製した。

ベクターｐＮＵＴ−ＧＤＸの変異誘発について使用されるプライマーの配列は、表ＩＶ（配列番号１９〜配列番号３０）において示される。

「センス」プライマーは、非コード鎖上でハイブリダイズし、そして「アンチセンス」プライマーは、コード鎖上でハイブリダイズする。

変異誘発は、DNA thermal cycler 480 (PERKIN ELMER)を使用して、製造業者によって推奨される緩衝液中に、マトリックスとして５０ｎｇ（０．２ｎＭ）のｐＮＵＴ−ＧＤＸ、１２５ｎｇ（７０ｎＭ）の各プライマー（センスおよびアンチセンス、表４を参照のこと）、各ｄＮＴＰの当モル混合物（０．５ｍＭ）、および２．５ユニットのPfuポリメラーゼを含む、５０μｌの容量でのＰＣＲによって行われる。ＰＣＲは、９５℃で５分間の最初の変性工程、続いて、９５℃で４５秒の変性、５５℃で６０秒のハイブリダイゼーション、および６８℃で２６分の伸長から各々なる同一の１６サイクルである。これらの１６サイクル後に、マトリックスとして機能するベクターを、３７℃で６０分間、１０ユニットのＤｐｎＩで分解する。

ＤＨ５α細菌を、１００ｍＭ ＣａＣｌ_２中４℃での洗浄によってコンピテントにし、そしてＤｐｎＩで消化した５〜１０μｌのＰＣＲ産物で形質転換する；生存可能なプラスミドを取り込むコロニーを選択し、インサートの方向および配列を確認する。

実施例２：真核生物細胞中の第Ｘ因子誘導体の生成
ＢＨＫ−２１細胞のトランスフェクション
組換えタンパク質を、European Collection of Cell Cultures (Sofia-antipolis, France)によって提供される新生児ハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１）中で発現した。

ＢＨＫ−２１細胞を、１０％の胎児ウシ血清（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、１００ユニット/ｍｌのペニシリン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）、および１００μｇ/ｍｌのストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）で補充した、完全なＤＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）：（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中、５％ＣＯ_２の雰囲気下で、３７℃でインキュベーター中で、ペトリ皿（直径８０ｍｍ）中で培養する。約８０％コンフルエントに達したとき、細胞をＰＢＳ緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中で２回リンスし、次いで、４ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中で、３７℃で１時間インキュベートする。

トランスフェクションを、所望の第Ｘ因子誘導体について４０ｎＭの発現ベクター（蒸留水で調整した２２０μｌの容量中４０μｇ）を、正確にｐＨ７．０５で、２５０μｌの溶液に添加することによって実施し、これは、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１．５ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌおよび１２ｍＭデキストロースからなる。ＤＮＡの同時沈殿は、３１μｌの２．５Ｍ ＣａＣｌ_２を添加し、絶えず撹拌することによって得られる。周囲温度で３０分間のインキュベーション後、沈殿を、細胞をカバーする培地に添加し、そして３７℃で３時間、沈殿させた。細胞を（ほとんどの沈殿を除去するために）ＰＢＳで洗浄し、そして３７℃で２４時間、完全なＤＭＥＭ培地中の培養物に戻した。

細胞を、０．５ｍｇ/ｍｌトリプシンを含む、２ｍｌの５４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０の溶液で、ペトリ皿から剥離し、選択培地（５０ｍｇ/ｌのメトトレキセート(TEVA, Courbevoie, France)を含む完全なＤＭＥＭ）中で再懸濁し、そして、新しいペトリ皿に再播種する。培養培地を、コロニーが得られるまで、２日毎に２〜３週間更新する。これらのコロニーを単離し、２４ウェル培養プレートのウェル（２ｃｍ^２）中に移し、ここで、これらは、選択培地中でコンフルエントまで増殖される。

第Ｘ因子誘導体を生成するクローンの同定
第Ｘ因子誘導体を安定して発現するクローンの検出を、免疫ブロッティングによって実施する。

ＢＨＫ−２１細胞培養物上清（これは、少なくとも４８時間トランスフェクトした細胞と接触したままである）のアリコート（３０μｌ）を、４０％（ｖ/ｖ）のグリセロール、８％（ｖ/ｖ）のＳＤＳ、０．０４％（ｗ/ｖ）のブロモフェノールブルーおよび２０％（ｖ/ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含む、１０μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８に添加する。サンプル中のタンパク質を、９５℃で５分間変性し、０．１Ｍグリシンおよび０．１％（ｗ/ｖ）ＳＤＳを含む、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中の１２％ポリアクリルアミドゲル（架橋２９／１）で分離する。

電気泳動に続いて、２０％メタノールを含む、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、０．１Ｍグリシン、ｐＨ７．５中のニトロセルロースメンブレン(TRANS-BLOT, BIO-RAD, Ivry sur Serine, France)へ移した。メンブレンを、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＴＢＳ）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中の５％（ｗ/ｖ）スキムミルクの溶液中で、周囲温度で１時間のインキュベーションによって飽和し、次いで、同じ緩衝液中で、１０分間３回洗浄する。メンブレンを、次いで、ＴＴＢＳ中の５０ｎｇ/ｍｌのモノクローナル抗体９Ｅ１０の存在下で、１〜１２時間インキュベートする。３回の洗浄後（先のように）、メンブレンを、ＴＴＢＳ中で１／３０００まで希釈したアルカリホスファターゼ標識抗マウスＩｇＧヤギポリクローナル抗体（ＢＩＯ−ＲＡＤ）の存在下で、周囲温度で１時間インキュベートする。組換えタンパク質の存在は、色素産生基質（０．５ＭのＭｇＣｌ_２を含む、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ９．５中で希釈された、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート、ｐ−トルイジン塩（ＢＣＩＰＴ）およびニトロテトラゾリウムクロライド（ＮＴＣ）の等量の混合物）の存在下で、メンブレンのインキュベーションによって明らかにされる。

細胞培養および生成：
所望の第Ｘ因子誘導体を最も強力に発現するクローンを増幅し、そして液体窒素中で凍結することによって保存する（１０％（ｖ/ｖ）ＤＭＳＯを添加した１ｍｌの胎児ウシ血清中の約１０^６細胞）。

第Ｘ因子誘導体の生成を、５０μＭの亜鉛（メタロチオネインプロモーターの誘導のための）、およびＧｌａドメインを有するＦＸ−組換え誘導体を発現するクローンのために、翻訳後のγ−カルボキシル化を可能にする５ｍｇ/ｍｌのビタミンＫ_１(ROCHE, Neuilly sur Seine, France)を含む選択培地で、行う。細胞を、８５０ｃｍ^２ボトルを接種するために使用される１５０ｃｍ^２フラスコ中の連続的な継代によって増殖する。培養物上清を、２〜６日毎に収穫し（細胞密度に依存して）、５０００ｇでの１０分間の遠心分離によって清澄化し、そして５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭのベンズアミジンの添加後に−２０℃で保存する。

実施例３：第Ｘ因子誘導体の精製
誘導体の精製を、関連する誘導体に依存して、２または３工程で行った。

第１の工程は、全ての精製に共通である：これは、培養上清に含まれるタンパク質を濃縮するために、アニオン交換樹脂への吸着を含む。

培養上清を、１０ｍＭのベンズアミジンおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５中の１／３に希釈する。代表的に、２リットルの上清を、４リットルの緩衝液で希釈し、４．５グラムのＱＡＥ ＳＥＰＨＡＤＥＸ Ａ５０（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）を添加し、混合物を、（回転式ブレード撹拌機を使用して）周囲温度で３０分間ゆっくりと撹拌する。ＳＥＰＨＡＤＥＸビーズを１時間沈降させ、上清を捨てる。

ローディングした樹脂を、カラムに移し、吸着したタンパク質を、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５で溶出する。

第２の工程は、ＱＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ溶出液に含まれる他のタンパク質から第Ｘ因子誘導体を分離することを可能にするアフィニティークロマトグラフィーである。

ＦＸ−組換え誘導体は、ゲルｍｌ当たり３ｍｇのモノクローナル抗体９Ｅ１０でグラフトされたＡＦＦＩ−ＰＲＥＰ ＨＺゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。ＱＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ溶出液でのカラムのローディングおよび０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中での洗浄後、ＦＸ−組換え誘導体を、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ２．７中で溶出する。溶出液のｐＨを、３０μｌ/ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓを添加することによって７．５に調整し、カラムを洗浄緩衝液中で再平衡化する。

抗体９Ｅ１０でグラフトしたアフィニティーカラムは、低容量を有し、そして変性培地における溶出を必要とするという欠点を有する。第３の精製工程（高分離能アニオン交換クロマトグラフィーによる）は、変性剤を除去し、そしてカラムから溶出した誘導体を濃縮するために必要である。

アフィニティーカラム由来のいくつかの溶出液（全部で２〜１０ｍｇのＦＸ−組換え誘導体）をプールし、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で１／４に希釈し、Q-SEPHAROSE FAST FLOWカラム（０．８×１０ｃｍ）(AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH)にローディングする。希釈緩衝液での洗浄後、カラムを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で溶出する。

Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子誘導体（これは、そのＮ末端において、抗体ＨＰＣ−４によって認識されるエピトープを有する）を、この抗体でグラフトしたアフィニティーカラムで精製した。抗体ＨＰＣ−４は、カルシウム依存性であるので、カラムは、タンパク質を変性しないカルシウムキレート剤の存在下で洗浄することによって溶出し得る。このようにして精製された第Ｘ因子誘導体は、直接使用され得る。

この場合において、ＱＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ溶出液は、５ｍＭでＣａＣｌ_２を添加することによって、予め再石灰化される。カラムは、０．５ＭのＮａＣｌおよび１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で洗浄され、第Ｘ因子誘導体は、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中で溶出される。

全部で、最小１０ｍｇの各第Ｘ因子誘導体が調製された。

どのプロトコルが使用されるかに関わらず、調製物の純度は、サンプルの変性および還元後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％、架橋２９／１）およびクマシーブルーでの染色によって、制御される。

得られた全ての調製物は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで純粋であるように見えるが、２つの形態が全体的に存在する；重鎖および軽鎖について予想されるものと比較可能な見かけの分子量を有する（ＦＸ−組換え体について５０および２３ｋＤａ；Ｇｌａドメインを欠く誘導体について５０および１８ｋＤａ）主要な二重鎖形態（８０〜９０％）；ＦＸ−組換え体について６６ｋＤａおよびＧｌａドメインを欠く誘導体について６０ｋＤａの分子量を有するマイナーな単鎖形態（調製物に依存して１０〜２０％）。

単鎖形態の割合は、導入された変異ではなく、調製物が由来する上清のプールに依存するようである：所定の変異について、単鎖形態の割合は、１つの精製ごとに変化する。

精製された誘導体は、アリコートされ、使用まで−８０℃で貯蔵される。アリコートの濃度は、１．２５ｇ^−１１ｃｍ^−１がモル吸着係数（ε％_２８０）であるとして、２８０ｎｍでのその吸光度によって推定される。

実施例４：第Ｘ因子誘導体のトロンビン活性化
ネイティブな第Ｘ因子は、その生理学的アクチベーター（テナーゼまたは組織因子複合体）によって、そして特定のヘビ毒によってのみ活性化され得、その最も一般的に使用されるものは、Ｒｕｓｓｅｌｌの毒蛇の毒抽出物（ＲＶＶ−Ｘ）である。第Ｘ因子のＧｌａドメインは、この活性化において非常に重要な役割を果たす：Ｇｌａドメインを欠く正常な第Ｘ因子の活性化速度は、完全な第Ｘ因子のそれよりも平均して約１００倍遅い。

ＦＸ−組換え体は、（ＢＨＫ−２１細胞によって不正確にγ−カルボキシル化される）部分はプロトロンビナーゼ複合体内で活性化が困難でありそしてごくわずかに活性であることを除き、血漿第Ｘ因子と本質的に同様に振る舞う。Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子誘導体は、単離されたヘビ毒アクチベーターおよび（ある程度）生理学的な複合体によって、（ゆっくりと）切断可能なままである。

トロンビンによって切断されるＧｌａドメインを欠く誘導体の能力を試験した。

２つの方法を使用して、この切断が検出可能なアミド分解活性を生じるか否かに依存して、トロンビンによる第Ｘ因子誘導体の切断速度を評価した。第１のケースにおいて、活性化因子によって生成されるアミド分解活性は測定され、第２のケースにおいて、切断された形態は、電気泳動によって定量化される。

アミド分解活性の測定：
トロンビンによる第Ｘ因子誘導体の活性化についての速度定数は、偽一次条件下で測定する。すなわち、チモーゲンの濃度は、アクチベーターの半数飽和濃度（そのＫ_ｍ）の最大０．１倍に等しい。これらの条件下で、測定される速度定数は、その基質（第Ｘ因子に由来するチモーゲン）についてのアクチベーター（トロンビン）の特異性定数（k_cat/K_m）に正比例する。Ｋ_ｍ値を知ることなく、偽一次条件が２つの基質の濃度での活性化速度を測定することによって関係することを証明することは可能である：測定される速度定数は、チモーゲンの２つの濃度について同じであるべきである（実験誤差を許容する）。

各第Ｘ因子誘導体（１と１０μｍの間）は、トロンビン（１００ｎＭ）の存在下で、キネティックス緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．２％ＰＥＧ８０００（ｗ/ｖ）および５ｍＭＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．８）中で３７℃で、インキュベートされる。種々のインキュベーション時間後、１０μｌアリコートをサンプルにとり、これに、１μＭ（ｍｌ当たり１００ユニット）のヒルジン(REFLUDAN, HOECHST, Frankfurt, Germany)を（トロンビンを中和することによって反応を停止させるために）添加する。生成される活性型の量は、活性化誘導体のアミド分解活性によって推定される。１００μＭのＮ−α−Ｚ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ(S2765,BIOGENIC,Maurin,France)を添加した後、アミド分解活性を、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダー(DYNEX, Guyancourt, France)を使用して、時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度（Ｓ２７６５の加水分解の最初の速度）におけるバリエーションを記録することによって測定する。トロンビンの添加前、Ｓ２７６５の加水分解速度は、０である。なぜなら、第Ｘ因子誘導体は、完全にチモーゲン形態で存在するからである。Ｓ２７６５の加水分解の最初の速度を、チモーゲンのトロンビンとのインキュベーションの時間の関数としてプロットすることによって、曲線を得る。これは、非線形回帰によって、一次関数増加を示す等式１を使用して、チモーゲンの活性化についての速度定数（ｋ）を推定することを可能にする：
Ｖ_ｔ＝Ｖ_０＋Ｖ_ｍａｘ（１−ｅｘｐ^{（−ｋｔ）}） （等式１）
ここで、Ｖ_ｔは、時間ｔにおける色素産生基質の加水分解速度を示し、Ｖ_０は、時間０における色素産生基質の加水分解速度を示し（通常０）、そしてＶ_ｍａｘは、無限大時間における色素産生基質の加水分解速度を示す（全てのチモーゲンが活性化される場合）。偽一次条件に関する場合、ｋの値は、チモーゲン活性化反応についてk_cat/K_mを掛けたアクチベーター（トロンビン）の濃度に等しい。従って、この方法は、活性化後にアミド分解活性を生成する第Ｘ因子誘導体を活性化するトロンビンの能力を比較することを可能にする。この方法は、触媒活性が測定され得るという条件でのみ、いずれのアミド分解活性が生成されても適用可能である：実際に、それは、時間の関数として活性化割合を測定することと同じである。

電気泳動による定量化
あるいは、触媒活性が検出可能でない場合、トロンビンの第Ｘ因子誘導体を切断する能力は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで検出される。そのアクチベーターとの基質チモーゲンのインキュベーションは、上のように同じ偽一次条件下で実施される。種々のインキュベーション時間後、２０μｌのアリコートを取り、サンプルの変性および還元後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％、架橋２９／１）によって分析する。

クマシーブルーで染色した後、ゲルをスキャンし、そして各移動バンドの強度を、画像化ソフトウェア(SCION-IMAGE,アドレス
1109049063500_0
で入手可能)を用いて推定する。

この方法は、第Ｘ因子誘導体の各形態（不活性単鎖、不活性二重鎖、α形態で活性化された、β形態で活性化された）の割合を評価することを可能にする。活性化形態に対応するバンドの強度を、トロンビンとのチモーゲンのインキュベーションの時間の関数としてプロットすることによって、曲線を得る。これは、非線形回帰によって、等式１を使用して、チモーゲンの活性化についての速度定数（ｋ）を推定することを可能にする。ここで、Ｖ_ｔ、Ｖ_０、およびＶ_ｍａｘは、それぞれ以下と交換される：時間ｔ、時間０（通常０）、無限大時間（１００％のチモーゲンが活性化される場合）でのバンドの強度。偽一次条件に関する場合、ｋ値は、チモーゲン活性化反応について、k_cat/K_mを掛けたアクチベーター（トロンビン）の濃度に等しい。実際には、経時的にチモーゲンの消滅を評価することがより信頼性がある。チモーゲン形態に対応するバンドの強度を、トロンビンとのインキュベーション時間の関数としてプロットすることによって、曲線を得、これは、以下の等式２（一次関数減少を示す）を使用して、非線形回帰によって、チモーゲンの活性化についての速度定数を推定することを可能にする：
ｄ_ｔ＝ｄ_０＋ｄ_ｍｉｎｅｘｐ^{（−ｋｔ）} （等式２）
この等式において、ｄ_ｔは、時間ｔにおける密度を示し、ｄ_０は、時間０における密度を示し（これは最大である）、そしてｄ_ｍｉｎは、無限大時間における密度を示す（これは、全てのチモーゲンが活性化される場合に０である）。偽一次条件に関する場合、ｋ値は、チモーゲン活性化反応についてのk_cat/K_mを掛けたアクチベーター（トロンビン）の濃度に等しい。この方法は、いずれの第Ｘ因子誘導体が考慮されても適用可能であるが、色素産生方法よりもあまり正確でない。

結果を表Ｖに示す。

トロンビンによる各第Ｘ因子誘導体の活性化のためのk_cat/K_m値が、標準誤差（得られた値の割合として表される）と同様に、与えられる。

その通常の血漿ホモローグと同様に、ＦＸ−組換え体は、ＧＤ−ＦＸ誘導体と同様に、トロンビンによって検出可能に切断可能ではない（ＮＤ）。他方、ＧＤＸ−ＳＦＲ誘導体は、トロンビンによって非常に迅速に切断される：k_cat/K_m値は、４×１０^３Ｍ^−１ｓ^−１である；しかし、切断された誘導体は、アミド分解活性を欠く。ＧＤＸ−ＳＶＧ誘導体はまた、トロンビンによって切断されるが、検出可能なアミド分解活性もまた生じない。トロンビンによる、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の切断のためのk_cat/K_m値は、１０^２Ｍ^−１ｓ^−１であり、活性化誘導体は、容易に検出可能なアミド分解活性を有する。他の第Ｘ因子誘導体（ＧＤＸ−ＩＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＧおよびＧＤＸ−ＩＦＲ）は、トロンビン切断可能であるようであるが、反応が遅すぎてk_cat/K_m値を信頼できるように推定するのが可能でない。

実施例５：第Ｘ因子誘導体の活性化形態の調製および特徴付け
第Ｘ因子誘導体の各々の触媒活性（切断後）をより完全に特徴付けるために、数ミリグラムの各誘導体を活性化および精製した。

その活性化部位のＰ_３、Ｐ_２およびＰ_１位に配列ＬＴＲ（ＦＸ−組換え体およびＧＤ−ＦＸ誘導体）を有する第Ｘ因子誘導体は、トロンビン切断可能でない。これらは、単離されたＲｕｓｓｅｌｌのヘビ毒（ＲＶＶ−Ｘ）アクチベーター(KORDIA, Leiden, The Netherlands)を用いて、５ｍｇ/ｍｌのゲルで、グラフトしたＨＩＴＲＡＰ ＮＨＳ活性化カラム（５ｍｌ）（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）を通過させることによって活性化した。１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ_２および０．２％（ｗ/ｖ）ＰＥＧ８０００を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．５中の４ミリグラムの第Ｘ因子誘導体を、ＲＶＶ−Ｘでグラフトしたカラムに導入する。カラムを両端で閉じ、周囲温度で１６時間、インキュベーションを保持する。活性化誘導体を、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５で溶出する。この溶出液は、主に活性化形態を含むが、活性化は必ずしも完全ではない。活性化形態の溶出液を濃縮するために、これを、５ｍＭのＣａＣｌ_２（イオン強度を減少させるため）を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．５中で１／３に希釈し、１ｍｌ ＨＩＴＲＡＰヘパリン−セファロースカラム（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）にローディングし、０．５Ｍ ＮａＣｌおよび５ｍＭのＣａＣｌ_２を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ７．５で溶出する。

他の第Ｘ因子誘導体（これは、トロンビンによって（はるかにゆっくりと）活性化され得る）は、１ｍｇ/ｍｌのゲルにおいて、トロンビンでグラフトしたＨＩＴＲＡＰ ＮＨＳ活性化カラム（１ｍｌ）（ＡＭＥＲＳＨＡＭ ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ ＢＩＯＴＥＣＨ）にそれらを通過させることによって全て活性化した。インキュベーション条件（濃度、緩衝液、温度および期間）は、カラムからの溶出およびヘパリン−セファロースでの誘導体の活性化形態の精製と同様に、ＲＶＶ−Ｘでグラフトしたカラムを通過させることによる活性化と同じである。

種々の第Ｘ因子誘導体の活性化によって生成される重鎖のＮ末端配列は、微小配列決定によって決定した。得られた各配列は、活性化部位のＰ_１残基とＰ_１’残基との間の切断後に考慮される誘導体（ＩＶＧ、ＩＦＧ、ＩＦＲ、ＡＶＧ、ＳＶＧまたはＳＦＲ）の活性化形態の重鎖について予想されるＮ末端に明らかに対応する。

クロロメチルケトンペプチドとの相互作用：
クロロメチルケトンペプチドは、それらの標的との等モルかつ共有結合の複合体を形成する不可逆的なセリンプロテアーゼインヒビターである。プロテアーゼとのクロロメチルケトンペプチドの相互作用の速度は、クロロメチルケトン基に先行する配列に依存する。これらのインヒビターは、実際、標的の活性化部位の完全性を評価することを可能にする：反応についての速度定数（k_on）は、実際に、各インヒビター/プロテアーゼ対に特異的なシグネチャーである。第Ｘ因子の活性化形態と最も反応性であるクロロメチルケトンペプチドの１つは、Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−ＣＨ_３Ｃｌ(CALBIOCHEM, Meudon, Franceによって市販されるD-FFR-CK)である。反応が偽一次条件下で実施される場合、k_onは、標的の正確な濃度が未知である場合でさえ、推定され得る。一旦k_onが公知となると、プロテアーゼ（以下を参照のこと）についての活性部位濃度を正確に滴定することを可能にする実験条件を予想することが可能である。この力価決定は、本当の機能的特徴付けのための必要条件である。

容易に検出可能なアミド分解活性を得るために十分な第Ｘ因子誘導体の活性化形態の量が、２５℃で、キネティック緩衝液中の固定濃度のＤ−ＦＦＲ−ＣＫの存在下で所定の期間にわたり、１０μｌの反応溶液中でインキュベートされる。試薬の濃度は、実際に非常に変動する：容易に検出可能なアミド分解活性（３０分での色素産生基質の１０％加水分解）を有するように、第Ｘ因子誘導体に依存して、３０ｎＭ〜１．８μＭの活性化形態（２８０ｎｍでの吸光度に従う）。添加されるＤ−ＦＦＲ−ＣＫの濃度は、その標的のものよりも遙かに大きいはずであり、その結果、反応が偽一次条件下で生じる。しかし、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫの濃度は、高すぎるべきでなく、そうでなければ、反応が速すぎる。代表的に、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫの３つの濃度が使用され、これは、標的のそれの１０、２０および４０倍に対応する（２８０ｎｍでのその吸光度によって推定される）。実験毎のインキュベーション時間を変化させて（最初の実験について１０秒〜最後の実験について５時間、その結果、所定の実験についてのインキュベーション時間は、先行する実験のものの２倍に等しい）、同じ実験が１２回繰り返される。各インキュベーションの終わりに、キネティック緩衝液中の１９０μｌの１００μＭ Ｓ２７６５が添加され、そして残りのアミド分解活性が、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して、時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度（すなわち、Ｓ２７６５の加水分解の最初の速度）のバリエーションを記録することによって測定する。Ｓ２７６５の加水分解の速度を、その標的とのインヒビターのインキュベーション時間の関数としてプロットすることによって、曲線が得られ、これは、等式２を使用して、非直線回帰によって、第Ｘ因子誘導体の活性化形態の不活化のための速度定数を推定することを可能とする。この場合において、等式２のパラメーターｄ_ｔ、ｄ_０およびｄ_ｍｉｎは、時間ｔでの残余活性、最初の活性（これは最大である）および無限大時間での活性（これは通常０である）を示す。偽一次条件に関する場合、ｋについて得られた値は、酵素についてそのk_onで掛けたインヒビターの濃度に等しい。

得られた第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのＤ−ＦＦＲ−ＣＫのk_on値は、標準誤差（得られた値の割合として表される）と同様に、表ＶＩに要約される。触媒活性を欠く誘導体についてのk_onは、使用される方法によって測定され得ない（ＮＤ）。

ＦＸ−組換え誘導体の活性化形態、ＧＤ−ＦＸ誘導体の活性化形態、およびＧＤＸ−ＩＶＧ誘導体の活性化形態のk_on値は、血漿由来の第Ｘ因子の活性化形態で得られたものと全て類似する。この結果は、予想されていた：これらの第Ｘ因子誘導体のチモーゲンは、Ｇｌａドメインの存在または非存在によって、また、活性化部位の上流のＰ_３残基およびＰ_２残基によって異なるが、それらの活性化の産物の触媒ドメインは同一である。

ＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態についてのk_on値は、２０倍低い；これは、この第Ｘ因子誘導体の触媒グルーブが変異によって厳密に保存されていないことを示唆する。ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態についてのk_on値は、１０００倍少ない。第Ｘ因子誘導体（これは、切断後に、検出可能なアミド分解活性（ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧおよびＧＤＸ−ＳＦＲ）を欠く）は、この方法によって分析され得ない。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態の滴定：
第Ｘ因子誘導体の活性化形態についての活性部位濃度は、各変異体の有効な触媒活性を評価し得るように、測定するのに必須である値である。２８０ｎｍでの吸光度は、確かに、精製されたプロテアーゼの濃度を計算することを可能にするが、活性化形態であるサンプルを比例して提供しない。他方、滴定は、通常のプロテアーゼと比較した残余チモーゲン形態の割合または変異体の固有の活性がどうであっても、活性化形態の濃度を推定することを可能にする。

セリンプロテアーゼを滴定するための非常に正確な方法は、酵素が測定可能な触媒活性を有し、その標的との滴定物質の反応の半減期が予想され得るという条件で、クロロメチルケトンペプチドの使用に基づく。第Ｘ因子誘導体の活性化形態の３つは、これらの条件を満たし、そしてこの方法によって：増加濃度のインヒビターとのインキュベーション後に残余アミド分解活性を測定することによって滴定した。使用されるクロロメチルケトンペプチドは、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫであり、各標的についてのk_on値は、上で決定した。

２０ｎＭと１２μＭとの間の増加濃度のＤ−ＦＦＲ−ＣＫを、２５℃で、キネティックス緩衝液中で、滴定される第Ｘ因子誘導体の活性化形態の固定量（０．５〜１μＭ）と共にインキュベートする。インキュベーションは、反応が完了するまで保持される：すなわち、最小で１０倍半減期をカバーする（反応の半減期は、k_onの生成およびインヒビターの濃度によって２を除算した自然対数に等しい）。このインキュベーションの終わりに、キネティックス緩衝液中の１９０μｌの１００μＭ Ｓ２７６５を添加し、そして残渣アミド分解活性を、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して、時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度（すなわち、Ｓ２７６５の加水分解の最初の速度）におけるバリエーションを記録することによって測定する。Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫの濃度の関数として、Ｓ２７６５の加水分解の速度をプロットすることによって、直線を得、これについて、元の横座標は、活性酵素の最初の濃度に対応する(LE BONNIEC et al., Biochemistry, 33, 3959-3966, 1994)。

ＧＤＸ−ＡＶＸ誘導体の活性化形態は、この方法によって滴定され得ない。なぜなら、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫ（２Ｍ^−１Ｓ^−１）のk_on値は、低すぎて合理的な量の時間で反応を終了できないからである：１μＭのＤ−ＦＦＲ−ＣＫの存在下で、約１０半減期をカバーするために、１５日間反応を保持することが必要であるが、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫの安定性は、ｐＨ７．５で４８時間を超えない。検出可能なアミド分解活性（ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧおよびＧＤＸ−ＳＦＲ）を欠く、第Ｘ因子誘導体の「活性化」形態は、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫを使用して滴定され得ない。これらの誘導体について、活性化形態の割合は、サンプルの変性および還元後（第Ｘ因子誘導体を生成するＢＨＫ−２１クローンを同定するために上に記載されるように）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２％、架橋２９／１）後にデンシトメーターによって簡単に推定した。クマシーブルーでの染色後、ゲルをスキャンし、そして活性化αおよびβ重鎖に対応するバンドの強度を、分析ソフトウェアＳＣＩＯＮ−ＩＭＡＧＥを使用して残余非切断形態のものと比較する。この方法は、第Ｘ因子誘導体の各アリコートの活性化形態の割合を評価することを可能にする。活性化形態のこの割合を、２８０ｎｍでの吸光度を介して推定される全濃度と比較することによって、活性化αおよびβ形態の有効濃度をそこから推定する。

この方法は、先のものよりもより困難であるが、関連する変異体の機能的な特徴付けを行い得るように十分信頼性がある。

アミド分解活性：
セリンプロテアーゼのアミド分解活性は、それらの触媒グルーブおよびそれらの荷電リレーシステムのみに関与する。これは、Ｃ末端におけるパラ−ニトロアニリド基を有する小さいペプチドからなる合成基質を使用して測定される；これらの基質の加水分解の間、パラ−ニトロアニリン（ｐＮＡ）（これは、４０５ｎｍで容易に検出可能である）が放出される。これらのペプチドは、プロテアーゼの触媒機構の非常に微細な特徴付けを可能にする：これらの基質の１つについての加水分解のためのk_catおよびK_mは、本明細書中で再び、各酵素/基質対について唯一のシグネチャー(signature)を構成する。従って、第Ｘ因子誘導体の活性化形態のアミド分解活性を測定することは、それらの触媒機構が変更されたか否かを検出するのを可能にした。２つの色素産生基質をこの分析のために使用した：Ｓ２７６５、およびＢＩＯＧＥＮＩＣによって販売されるベンジル−ＣＯ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−（γ−ＯＲ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ２２２２）。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態のk_catおよびK_m値を、２５℃で、キネティックス緩衝液中で測定する。種々の濃度の基質（６と８００μＭとの間の）を、固定量の第Ｘａ因子誘導体の活性化形態とともにインキュベートする（第Ｘ因子誘導体の活性化形態に依存して１０ｎＭ〜０．５μＭ、その結果、少なくとも１０％の色素産生基質が３０分で加水分解される）。時間の関数としての４０５ｎｍでの吸光度におけるバリエーションは、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して記録され、そして加水分解の最初の速度は、直線回帰によって推定される（基質の最大１５％の加水分解に対応する吸光度のみが、分析について考慮される）。K_catおよびK_mの値は、ミカエリス−メンテンの等式を使用して、基質の最初の濃度の関数として、加水分解の最初の速度におけるバリエーションの非線形回帰によって推定する。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態についての、Ｓ２２２２およびＳ２７６５のk_cat値およびKm値およびk_cat/K_m比の値、ならびに標準誤差（得られる値の割合として表される）は、表ＶＩＩに与えられる。

これらの定数は、検出可能なアミド分解活性を欠く誘導体について推定され得ない（ＮＤ）。

ＦＸ−組換え誘導体の活性化形態についてのk_catおよびＫ_ｍ値、Ｇｌａドメインを欠くＦＸ−組換え体の活性化形態のもの、およびＧＤＸ−ＩＶＧ誘導体のものは、血漿由来の第Ｘ因子の活性化形態について得られるものと類似である（これらは、最大２倍異なる）。Ｃ末端エピトープに加えて、これらの第Ｘ因子誘導体の活性化の間に形成される触媒ドメインは、同一である；従って、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫのk_onについてと同様に、それらのアミド分解活性は、少なくとも比較可能であると予測される。Ｇｌａドメインの非存在は、誘導体の活性化形態のアミド分解活性に顕著な影響を与えないことに注目するのは興味深い；これは、それが第Ｘ因子の活性化形態の触媒グルーブの構造に影響しないことを示唆する。比較によって、ＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態のk_cat値は、減少する（Ｓ２２２２について１０倍、そしてＳ２７６５について３倍）；K_m値は、同様に増加する（５〜１０倍）。全体的に、これらの色素産生基質についてのk_cat/K_mは、通常の第Ｘ因子の活性化形態よりも３０〜５０倍小さい（従って、その減少はＤ−ＦＲＲ−ＣＫについて観察されるものと同じオーダーの規模である（２倍））。ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態のk_cat値における減少は、K_mにおける増加の場合のように（Ｓ２２２２について５倍高く、Ｓ２７６５について４０倍高い）、遙かに大きい割合で存在する（Ｓ２２２２について約１００倍、Ｓ２７６５について約１０倍）。全体的に、これらの色素産生基質についてのk_cat/K_mは、通常の第Ｘ因子の活性化形態よりも４００〜６００倍小さい；これらの値は、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫについて観察される減少と一致している（１０００倍）。これらの結果は、ＧＤＸ−ＩＦＧおよびＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体によって保有される変異が、触媒グルーブにおける構造的な改変を明確に誘導し、そして/または電荷リレーシステムの活性を妨げることを確認する。

プロトロンビナーゼ複合体内の活性：
ネイティブな第Ｘａ因子は、トリプシンまたはトロンビンと比較してあまり活性な酵素ではない。生理学的に、プロトロンビン活性化反応が非常に迅速になるのは、ホスホリピドおよびカルシウムの存在下で、酵素がその補助因子（第Ｖａ凝固因子）に結合する場合のみである（反応は、それらの非存在下よりも補助因子の存在下で数千倍迅速である）。しかし、プロトロンビナーゼ複合体内の活性は、Ｇｌａドメインの存在に大きく依存する：それなしでは、速度は、多くても５０倍のみ増加する。しかし、この差異は、第Ｘ因子誘導体が第Ｖａ因子と相互作用するか否か、そして特に、補助因子がそれがプロトロンビンを効果的に活性化し得るか否かを検出することを可能にするのに主として十分である。従って、本発明者らは、第Ｖａ因子、ホスホリピドおよびカルシウムの存在下、ならびに非存在下で、第Ｘ因子誘導体の活性化形態の各々によってプロトロンビンの活性化の速度を比較する。

第Ｖａ因子（ＫＯＲＤＩＡ）の補助因子効果は、厳密に制御された精製システムにおいて研究される：特にプロトロンビンは、活性化形態（第Ｘ因子またはトロンビン）のいずれのトレースもないように、免疫精製される(LE BONNIEC et al. J. Biol. Chem., 266,13796-803, 1991;LE BONNIEC et al., 1992,上述)。このプロトロンビンの活性化は、それから生じるトロンビンの形成によって検出される。反応は、色素産生基質、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（Ｓ２２３８，ＢＩＯＧＥＮＩＣ）の反応培地中の存在が続き、これは、第Ｘ因子の活性化形態よりもトロンビンに遙かにより感受性である。時間０において、トロンビンは存在せず、第Ｘ因子誘導体の活性化形態によるＳ２２３８の顕著でない加水分解のみが存在する。反応の間、トロンビン濃度は、経時的に直線様式で増加する（第Ｘ因子誘導体の活性化形態によるプロトロンビンの活性化のための反応が、定常状態である場合）。Ｓ２２３８の加水分解の速度は、トロンビン濃度に正比例するが、これは、経時的に増加する。切断の速度は、従って一定ではない；それは、漸増的に速く進む：反応は加速する。加水分解されたＳ２２３８によって放出されるｐＮＡの量（従って、混合物の４０５ｎｍでの吸光度）は、時間の二乗の反応の促進係数に比例することを示すのは可能である(KOSOW,Thromb. Res. Suppl., 4,219-227, 1974)；加速係数自体は、トロンビン形成の最初の速度に正比例する。実際には、２０ｎＭの第Ｖａ因子の存在下または非存在下で、１００μＭのＳ２２３８、０．５μＭのプロトロンビンおよび３５μＭのホスホリピド小胞体（２０％〜８０％ｗ/ｗの割合のホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンの混合物）を含む、１９５μｌのキネティックス緩衝液は、マイクロタイタープレートで３７℃でプレインキュベートされる。第Ｘ因子誘導体の２．５ｎＭの活性化形態（５０ｎＭで５μｌ）を添加することによって、反応を引き起こし、時間の関数として、４０５ｎｍでの吸光度におけるバリエーションを、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して記録する。インキュベーション時間の関数として、４０５ｎｍでの吸光度をプロットすることによって、曲線を得、これは、等式３を使用して、非線形回帰によって、ｃ、反応の加速の係数を予測することを可能にする：
Ａ_４０５＝Ａ_０＋ｂｔ＋ｃｔ^２ （等式３）
ここで、Ａ_０は、４０５ｎｍでの混合物の最初の吸光度を示し（酵素の添加前）、そしてｂは、第Ｘ因子誘導体の活性化形態によるＳ２２３８の加水分解の速度を示す（これは、実際に無視できる）。第Ｘ因子誘導体の活性化形態によるプロトロンビンの活性化のための反応が定常状態にある場合、そして、加水分解されていないＳ２２３８の残余濃度がトロンビンについてのそのK_m（３．６μＭ）より遙かに大きいままである場合、パラメーターｃは、第Ｘ因子誘導体の活性化形態によるプロトロンビンの活性化の最初の速度に効果的に比例する。これらの条件を満たすために、各基質（プロトロンビンおよびＳ２２３８）の１５％未満の加水分解に対応する実験地点のみが、非線形回帰による分析について考慮される。このアプローチは、第Ｘ因子誘導体の活性化形態によるプロトロンビンの活性化についての触媒定数を推定することを可能にしない；それは、反応が同一条件下で行われる場合に、２つの酵素の活性を比較することを可能にするのみである（ここで、第Ｘ因子誘導体の各活性化形態の活性は、リファレンスとして機能するＧｌａドメインを欠く活性化形態のそれと比較される）。

得られた結果を表ＶＩＩＩに要約する。

プロトロンビナーゼ複合体（＋第Ｖａ因子）または活性化第Ｘ因子誘導体のみ（−第Ｖａ因子）によって生成されたトロンビンによるｐＮＡ放出の加速の係数を、標準誤差と共に示す（得られた値の割合として表される）。

ホスホリピドおよびカルシウムの存在下で（しかし、第Ｖａ因子の非存在下で）、プロトロンビンの活性化（Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子の活性化形態またはＧＤＸ−ＩＶＧ誘導体の活性化形態を含む）は、非常にゆっくりであり、そして検出するのが難しい；第Ｖａ因子の添加は、プロトロンビンの活性化の速度をそれぞれ５０倍および１０倍増加させる。第Ｖａ因子の非存在下で、プロトロンビンの活性化は、第Ｘ因子誘導体（ＧＤＸ−ＡＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＧ、ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧおよびＧＤＸ−ＳＦＲ）の他の活性化形態のいずれも検出可能でない。第Ｖａ因子の添加は、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態によるプロトロンビンの活性化の速度をかなり増加させることを可能にする：これは、現在、その非変異型ホモローグ（ＧＤＸ−ＩＶＧ）の活性化形態について得られるものよりも１３倍のみ少ない。従って、第Ｖａ因子は、大部分、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態の触媒活性を回復するようである。なぜなら、非変異型ホモローグと比較して、触媒グルーブプローブ（Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫ、Ｓ２７６５およびＳ２２２２）は、少なくとも４００倍減少する触媒の効率を反映するからである。第Ｘ因子誘導体（ＧＤＸ−ＩＦＧ、ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧおよびＧＤＸ−ＳＦＲ）の他の活性化形態を用いて、第Ｖａ因子の添加は、このような効果を有することから遙かに遠い：それは、依然として、プロトロンビンの任意の活性化を検出するのを可能にしない（ＮＤ）。

アンチトロンビンによる阻害：
第Ｘ因子の活性化形態の最も強力な血漿インヒビターは、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）である；第Ｘ因子の活性化形態との相互作用についてのそのk_on値は、１０^５Ｍ^−１ｓ^−１よりも大きい。しかし、ＴＦＰＩの血漿濃度（２．５ｎＭ）は、このインヒビターが第Ｘ因子（その生理学的標的は、むしろ第ＶＩＩａ凝固因子である）の活性化形態を阻害する際に比較的重要でない役割を果たすことを意味する。

アンチトロンビン（単独）は、比較的強力でないインヒビターである。なぜなら、第Ｘ因子の活性化形態との相互作用についてのそのk_on値は、１０^４Ｍ^−１ｓ^−１のオーダーであるからである。しかし、アンチトロンビンの血漿濃度（２．３μＭ）は、それを第Ｘａ因子の主要な生理学的インヒビターにする：この濃度で、第Ｘ因子の活性化形態の血漿半減期は、たった３０秒である（本発明者らは、実験的に１分測定した、以下を参照のこと）。特に、ヘパリンの存在下で、第Ｘ因子の活性化形態との相互作用についてのアンチトロンビンのk_on値は、１０^６Ｍ^−１ｓ^−１を超える（すなわち、２．３μＭのアンチトロンビン血漿濃度について、プロテアーゼの中和化が数秒で起こる（半減期は現在たった０．３秒である））。従って、第Ｘ因子誘導体の活性化形態とのアンチトロンビンの相互作用のk_onを測定することは必須である。なぜなら、血漿半減期における何らかの増加は、第Ｘ因子誘導体の凝血促進作用を延長し、従って、その抗血友病効果を強化する。

本発明者らは、第Ｘ因子誘導体の各活性化形態がアンチトロンビンと安定した共有結合複合体を形成する能力を測定した。本発明者らはまた、検出可能なアミド分解活性を有する第Ｘ因子誘導体（Ｇｌａドメインを欠く誘導体、ならびにＧＤＸ−ＩＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＧおよびＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体）の活性化形態について、アンチトロンビンのk_on値を（ヘパリンの存在下および非存在下で）推定した。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態（１μＭ）とアンチトロンビン（２μＭ；MCKAY (Thromb. Res., 21, 375-382, 1981) によって記載される技術に従ってヒト血漿から精製された）との間の共有結合複合体の証明は、２ユニット/ｍｌのヘパリン（ＫＯＲＤＩＡ）の存在下で行われる。インキュベーションは、２５℃で１時間保持され、反応混合物は、サンプルの変性および還元後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％、架橋２９／１）によって分析する。クマシーブルーでの染色後、第Ｘ因子誘導体の（不活化）形態とアンチトロンビンとの間の共有結合複合体の存在は、アンチトロンビンに対応するバンド（６０ｋＤａ）の強度の減少、第Ｘ因子誘導体の活性化形態に対応するバンド（３１ｋＤａ）の強度における減少、および共有結合複合体に対応するより大きい分子量の新しいバンド（約１００ｋＤａ）の出現を生じる。

結果を図３に示す。

レーン１および８：アンチトロンビン単独；レーン２および３：アンチトロンビンを用いないかまたは用いるＧＤＸ−ＩＶＧ誘導体；レーン４および５：アンチトロンビンを用いないかまたは用いるＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体；レーン６および７：アンチトロンビンを用いないかまたは用いるＧＤＸ−ＩＦＲ誘導体；レーン９および１０：アンチトロンビンを用いないかまたは用いるＧＤＸ−ＳＶＧ誘導体；レーン１１および１２：アンチトロンビンを用いないかまたは用いるＧＤＸ−ＳＦＲ誘導体；レーン１３および１４：アンチトロンビンを用いないかまたは用いるＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体。

複合体の形成は、高分子量バンドの出現（レーン３，５，７，１０および１４）を生じ、これは、アンチトロンビン（レーン１および８）または第Ｘ因子アナログの活性化形態の１つ（レーン２，４，６，９，１１，１３）が単独で使用される場合に存在しない。単一の第Ｘ因子アナログ（ＧＤＸ−ＳＦＲ、レーン１２）は、検出可能な共有結合複合体の形成を可能にしない。

第Ｘ因子誘導体の全ての活性化形態（ＧＤＸ−ＳＦＲ誘導体を除く）は、従って、ヘパリンの存在下で、ＧＤＸ−ＳＶＧ誘導体（これは、それにもかかわらず、いずれの検出可能な触媒活性を欠く）を含む、アンチトロンビンとの安定な共有結合複合体を形成し得る。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてアンチトロンビンのk_onを推定するために選択される方法は、試薬の半減期に依存する。この方法は、半減期が３分より大きいか、１５秒と３分との間であるか、または１５秒より短いかに依存して異なる。反応は、（不可能でない限り、以下を参照のこと）偽一次条件下で、行われなければならない：すなわち、インヒビター（アンチトロンビン）の濃度は、その標的（第Ｘ因子誘導体の活性化形態）の少なくとも１０倍でなければならない。さらに、標的の濃度は、その残余アミド分解活性を容易に検出し得るのに十分であるべきである（第Ｘ因子誘導体の活性化形態に依存して１０ｎＭ〜１μＭ、その結果、理想的には、１０％の色素産生基質が３０分で加水分解される）。これらの２つの制約は、試薬の濃度の選択をかなり制限する：アンチトロンビンの濃度は、（標的に依存して）少なくとも０．１〜１０μＭであるべきである。標的の半減期（インヒビターの濃度の生成物および標的についてのそのk_onで除算した２の自然対数に等しい）は、使用される方法を決定する。３分よりも大きい半減期について、使用される方法は、Ｄ−ＦＦＲ−ＣＫのk_onを推定するために記載されるものと同じである：それは、種々の時間において採取されるアリコートに含まれる残余活性を測定することを包含し、約１０倍の半減期をカバーする。０．１と１０μＭとの間のアンチトロンビン濃度について、このアプローチは、最大で２ １０^４Ｍ^−１ｓ^−１に等しいk_on値のみを推定することを可能にする。反応の半減期が３分未満である場合、残余活性の（アリコートをサンプリングすることによる）バッチ式(batchwise)測定は、実施するのが困難となる。この場合において、依然として、０．１と１０μＭとの間のアンチトロンビン濃度（従って、k_on値は、２ １０^４Ｍ^−１ｓ^−１より大きい）を用いて、反応は、Ｓ２７６５の反応媒体中の存在のために、連続して続けられる。Ｓ２７６５の加水分解速度は、第Ｘ因子の活性化形態の残余濃度に正比例する。０時間において、アミド分解活性は最大である。なぜなら阻害がまだ生じていないからである。偽一次条件が考慮され、第Ｘ因子誘導体の活性化形態の濃度は、一次減少関数に従って、経時的に減少する。切断の速度は一定ではない：これは、ゼロ（全ての標的が中和されるとき）になるまでスローダウンする。Ｓ２７６５の加水分解によって放出されるｐＮＡの量（従って、反応混合物の４０５ｎｍでの吸光度）は、一次指数関数増加に従って増加することを示すのは可能であり(CHA, Biochem. Pharmacol., 24, 2177-2185, 1975; STONE & HOFSTEENGE, Biochemistry, 25, 4622-4628, 1986)、これは、等式４を使用して非線形回帰によって分析され得る：
Ａ_４０５＝Ａ_０＋Ｖ_ｉ（１−ｅｘｐ^{（−Ｉｋｔ）}）/ｋ （等式４）
ここで、Ａ_０は、４０５ｎｍでの最初の吸光度を示し、Ｖｉは、アンチトロンビンの非存在下でのＳ２７６５の加水分解速度を示し、Ｉは、アンチトロンビンの濃度を示し、そしてｋは、阻害反応についての偽一次速度定数を示す。反応の間、インヒビターは、酵素との相互作用のための基質と競合する；したがって、第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_on値は、等式：
k_on=k(1+S/K_m) （等式５）
によってｋに関連付けられ、ここで、Ｓは、色素産生基質（Ｓ２７６５）の最初の濃度を示し、Ｋ_ｍは、第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのそのミカエリス定数を示す（アミド分解活性の特徴付けの間に測定される）。この方法は、１５秒のオーダーで半減期を測定する（すなわち、最大で２ １０^５Ｍ^−１ｓ^−１に等しいk_on値を推定する）のを可能にする（０．１と１０μＭとの間のアンチトロンビン濃度について）。１０ｎＭと１μＭとの間の第Ｘ因子誘導体の活性化形態の濃度について、反応の半減期が１５秒未満である場合、シグナルの振幅（４０５ｎｍにおける吸光度）は、小さすぎて残余活性の信頼できる連続的な測定が可能でない（酵素の濃度の増加は、偽一次条件に関連づけるために増加されるアンチトロンビンのそれを必要とし、従って半減期はさらに減少する）。従って、k_onが２ １０^５Ｍ^−１ｓ^−１よりも大きい場合、反応は、偽一次条件下でもはや行われないが、二次条件下で行われる。偽一次条件は、アンチトロンビンの濃度が反応中（見かけ上）一定のままであることを意味する；これは、標的と比較して過剰に存在する場合である。インヒビターの濃度がその標的のそれの１０倍より少ない場合、インヒビターの濃度の減少（その標的との複合体の形成による）は、もはや無視できない。反応の間、インヒビターの濃度およびその標的の濃度は共に、経時的に変化し、これは、分析を非常に複雑化する。しかし、十分なシグナル振幅を得ること、そして二次条件下で色素産生基質の存在下で阻害のキネティックスをフォローすることは可能なままである。この場合において、反応混合物の４０５ｎｍにおける吸光度が、「緩やかな堅い結合阻害(slow tight-binding inhibition)」と呼ばれる、等式６を使用する非線形回帰によって分析され得る曲線に従って増加する(CHA, 1975, 上述; Biochem. Pharmacol, 25, 2695-2702, 1976; WILLIAMS and MORRISON, Methods Enzymol, 63, 437-467, 1979)：
P=V_st+(V₀-V_s)(1-d)/(dk’)In{(1-d exp^(-k’t))/(1-d)} （等式６）
ここで、Ｐは、時間ｔで放出されるｐＮＡの濃度を示し（４０５ｎｍでの吸光度に正比例する）、Ｖ_０は、インヒビターの非存在下でのＳ２７６５の加水分解速度を示し、そしてＶ_ｓは、Ｓ２７６５の加水分解の最終速度を示す（反応が終了する場合）。パラメーターｄおよびｋ’自体は、２つのパラメーター（Ｆ_１およびＦ_２）に依存し、その結果：
d=(F₁-F₂)/(F₁+F₂);
k’=kF₂;
F₁=K_I’+I+E;
F₂=(F₁ ²-4EI)^1/2.
これらの等式において、Ｉは、アンチトロンビンの最初の濃度を示し、Ｅは、標的のそれを示し、そしてＫ_Ｉ’は、相互作用についての見かけの阻害定数を示す。第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_onは、等式５において与えられる関係によってｋ（これは、等式４における意味と同一の意味を有する）に関連する。

アリコートのバッチ式サンプリングによる方法は、（ヘパリンの存在下および非存在下で）ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_onを推定するために使用される。

１ｍｇ/ｍｌのプロテアーゼフリーウシアルブミン(SIGMA, St Quentin-Fallavier, France)および適切な場合に１ｍｌ当たり２ユニットのヘパリン（ＫＯＲＤＩＡ）を含むキネティックス緩衝液中で反応を実施する。１０μｌの反応容積中で、十分な量の活性化形態のＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体（ヘパリンの存在下で０．５μＭ、その非存在下で１μＭ）を、２５℃で種々の時間で、大過剰のアンチトロンビン（ヘパリンの存在下で５μＭ、その非存在下で１０μＭ）の存在下でインキュベートする。同じ実験を、実験毎にインキュベーション時間を変化させて（最初について１０秒〜最後について５時間、その結果、所定の実験についてのインキュベーション時間は、前のものの２倍に等しい）、１２回繰り返す。各インキュベーションの終わりにおいて、１９０μｌのＳ２７６５（キネティックス緩衝液中２００μＭ）を添加し、残余アミド分解活性を、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して、時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度（すなわち、Ｓ２７６５の加水分解の最初の速度）におけるバリエーションを記録することによって測定する。インヒビターのその標的とのインキュベーション時間の関数として、Ｓ２７６５の加水分解の速度をプロットすることによって、曲線を得、これは、等式２を使用する非線形回帰によって、第Ｘ因子誘導体の活性化形態の不活化についての速度定数を推定することを可能にする。等式２のパラメーターｄ_ｔ、ｄ_０およびｄ_ｍｉｎは、それぞれ以下を示す：時間ｔにおける残余活性、最初の活性（これは最大である）、そして無限大時間での活性（これは通常０である）。偽一次条件に関する場合、ｋについて得られた値は、第Ｘ因子誘導体の活性化形態の不活化のための反応のk_onを掛けたインヒビターの濃度に等しい。

偽一次条件下で４０５ｎｍでの吸光度の連続記録による方法を使用して、Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_on、ならびにＧＤＸ−ＩＶＧおよびＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態のそれを（ヘパリンの非存在下で）推定する。

キネティックスを、１ｍｇ/ｍｌのプロテアーゼフリーウシアルブミンを含むキネティックス緩衝液中で２５℃で研究し、１００μＭのＳ２７６５の反応媒体中での存在について連続して行う。シグナルの振幅がプレートリーダーを用いてキネティックスをフォローすることを可能にする場合には、反応を、２００μｌの容量で、マイクロプレート中で行う。そうでない場合、反応を６００μｌマイクロキュベットで行い、キネティックスを分光光度計(LAMBDA 14, PERKIN-ELMER (Courtaboeuf, France))を使用して続ける。反応を、１０〜２５ｎＭの第Ｘ因子誘導体の活性化形態を添加することによって引き起こす（理想的には、その結果、インヒビターの非存在下で、１０％の色素産生基質が６０分で加水分解される）。第Ｘ因子誘導体の各活性化形態について、反応を、標的の濃度の１０、２０および４０倍に等しい、３つのアンチトロンビンの濃度の存在下で行う。時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度をプロットすることによって、曲線を得、これは、等式４を使用する非線形回帰（一次指数関数増加を示す）によって、第Ｘ因子誘導体の活性化形態の不活化のための速度定数を推定するのを可能にする。偽一次条件に関する場合、第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_onは、等式５（キネティックスの間に基質によって導入される競合を考慮に入れる）によって与えられる。

ヘパリンの存在下で、偽一次条件に関する場合、Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子誘導体の活性化形態の半減期、ならびにＧＤＸ−ＩＶＧおよびＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態のそれは、１５秒より短い。アンチトロンビンの濃度およびその標的の濃度を減少させることは、同時に半減期を増加させながら、偽一次条件に関連づけることを可能にするが、シグナルの振幅を減少させる；現在、分光光度計の感受性は、振幅が数ミリユニットの吸光度である場合、連続するキネティックスをフォローするのに不十分となる。結果として、ヘパリンの存在下で、Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子誘導体の活性化形態のアンチトロンビンによる阻害のキネティックス、並びに、ＧＤＸ−ＩＶＧおよびＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態のそれは、二次条件下でフォローされる。

キネティックスを、１ｍｇ/ｍｌのプロテアーゼフリーウシアルブミンおよび１ｍｌ当たり２ユニットのヘパリンを含むキネティックス緩衝液中で、２５℃で研究する；これらは、４００μＭ Ｓ２７６５の反応媒体中の存在によって連続的に続ける。反応を、６００μｌの容量でマイクロキュベット中で行い、続いてラムダ１４分光光度計を使用するキネティックスを行う。反応を、信頼できるシグナルに対応する第Ｘ因子誘導体の活性化形態の最小量を添加することによって引き起こす（誘導体に依存して１〜２．５ｎＭ、その結果、インヒビターの非存在下で、色素産生基質の約１０％が６０分で加水分解される）。第Ｘ因子誘導体の各活性化形態について、反応を、標的の濃度の２および３倍に等しい、２つのアンチトロンビンの濃度の存在下で行う。時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度をプロットすることによって、曲線を得、これは、等式６を使用する非線形回帰によって、反応についての二次速度定数を推定することを可能とする。第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_onを等式５によって与え、これは、キネティックスの間の基質によって導入される競合を考慮する。

得られた結果は、表ＩＸに要約する。ヘパリン存在下（＋ヘパリン）または非存在下（−ヘパリン）でのアンチトロンビンのk_on（Ｍ^−１ｓ^−１）値を、標準誤差と共に示す（得られた値の割合として示される）。

ヘパリンの非存在下で、Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子誘導体の活性化形態およびＧＤＸ−ＩＶＧ誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_on値は、類似している（これらは、最大で２倍異なる）。比較すると、ＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_on値は、６６倍小さい。特に、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態についてのk_on値は、その非変異ホモローグのそれよりも１０００倍を超えて小さい（阻害は実際に検出するのが困難である）。ヘパリンの存在下で、第Ｘ因子の活性化誘導体についてのアンチトロンビンのk_on値は、１０００〜４０００倍増加するが、ヘパリンの存在下でさえ、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_onは、３ １０^２Ｍ^−１ｓ^−１を超えない。重要な観察は、活性化後、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体がその非変異ホモローグよりも遙かに長く活性なままであることを示唆する（その血漿半減期は、ヘパリンの非存在下で数時間、その存在下で１７分である）。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態の血漿半減期：
第Ｘ因子誘導体の活性化形態についてのアンチトロンビンのk_onは、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態の血漿半減期がかなり延長されることを示唆し、これは、その抗血友病の可能性を強化する。この仮説を証明するために、本発明者らは、第Ｘ因子誘導体の各々の活性化形態の血漿半減期を測定した。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態の血漿半減期は、通常のヒト血漿のプール中の種々の時間量のインキュベーション後のそれらの残余活性を測定することによって推定される。血塊の形成を妨げるために、血漿のプールは、（８ｍＭ ＣａＣｌ_２を添加することによって）再石灰化する前に、０．８μＭのヒルジン（１ｍｌ当たり８０ユニット）を添加することによって非凝固性とされる。反応混合物は、８０％（ｖ/ｖ）の血漿、ならびにヒルジン、カルシウムおよびその検出を可能にするのに十分な濃度（２０〜３００ｎＭ最終濃度）の第Ｘ因子誘導体の１つの活性化形態を含む、２０％（ｖ/ｖ）のキネティックス緩衝液からなる。種々のインキュベーション時間後、アリコート（４０μｌ）を取り出し、１６０μｌのＳ２７６５（ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態について１ｍＭ、第Ｘ因子誘導体の他の活性化形態について１００μＭ）の添加後、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して、時間の関数として４０５ｎｍでの吸光度（Ｓ２７６５の加水分解の最初の速度）におけるバリエーションを記録することによって、残余アミド分解活性を測定する。活性における減少についての速度定数は、等式２を使用して、時間の関数として、残存活性におけるバリエーションの非線形回帰によって推定し、ここで、ｄ_ｔ、ｄ_０およびｄ_ｍｉｎは、それぞれ、時間ｔにおける残余活性、最初の活性（これは最大である）、および無限大時間での活性（これは最小である）を示す。ヒルジンは、トロンビンの任意のトレースを中和するが、第Ｘ因子の全ての活性化形態が中和されたとしても、最小活性は、０ではない：このバックグラウンドノイズは、Ｓ２７６５をゆっくり加水分解し得る、血漿中に含まれる他のプロテアーゼに由来する。偽一次条件が関連する場合、血漿半減期は、自然対数２とｋ（減少についての速度定数）の比に等しい。観察される血漿半減期は、標的の濃度または測定されるアミド分解活性の大きさのいずれにも依存せず、これは、血漿中に含まれるインヒビターの最初の濃度（およびもちろん、標的に関するその反応性）のみに依存する：アンチトロンビンが本当に関与する主要な血漿インヒビターである場合、偽一次条件が考慮される。なぜなら、インキュベーション全体の間、それは、その標的と比較して大過剰（１．８μＭ）のままだからである。

得られた結果を表Ｘに要約する。ヘパリンの存在下（＋ヘパリン）またはその非存在下（−ヘパリン）での第Ｘ因子誘導体の活性化形態の半減期（分）についての値が、標準誤差におけるように与えられる（得られる値の割合として表される）。検出可能なアミド分解活性を欠く誘導体の活性化形態の半減期は、測定されていない（ＮＤ）。

ヘパリンの非存在下で、Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子の活性化形態およびＧＤＸ−ＩＶＧ誘導体の活性化形態の血漿半減期は比較可能である（１分）；ヘパリン存在下で、これらの活性化形態の血漿半減期は、短すぎて信頼可能に測定できない。ヘパリンの非存在下で、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態の半減期は、顕著に延長される：これは、Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子の活性化形態のそれよりも５５倍長い。ヘパリンの存在下での血漿半減期における増加もまた顕著である。なぜなら、これは、その非変異体ホモローグのそれとは異なり、容易に測定され得るからである（５分および３０秒）。ＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態の血漿半減期はまた、延長される（Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子の活性化形態のそれと比較して１２倍）。第Ｘ因子誘導体（アミド分解活性を欠く）の他の活性化形態の血漿半減期は、使用される方法によって推定できない。

実施例６：第Ｘ因子誘導体の抗血友病活性
第Ｘ因子誘導体の活性化形態の凝血促進活性を、重篤な血友病ＡまたはＢをシミュレートする血漿において試験した。これらの血漿は、正常血漿の第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子を欠乏させることによって得られ、インビトロで、血友病患者由来の本物の血漿のように振る舞う。試験された第Ｘ因子アナログ（ＧＤＸ−ＩＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＧ、ＧＤＸ−ＡＶＧ、ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧ）はすべて、Ｇｌａドメインを欠く。正常な血漿において、Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子の凝血促進作用は、正常な第Ｘ因子のそれよりも遙かに少ない。なぜなら、Ｇｌａドメインは、プロトロンビナーゼ複合体の活性に貢献するからである。

これらの第Ｘ因子誘導体の凝血促進活性は、正常な第Ｘ因子のそれと比較可能となり得ない。実際に、Ｇｌａドメインを欠く任意の第Ｘ因子誘導体は、プロトロンビナーゼ複合体のインヒビターである；詳細には、これは、血漿第Ｘ因子の活性化形態（これは、そのＧｌａドメインを有し、はるかにより活性である）と競合する。言い換えると、正常な血漿において、Ｇｌａドメインを欠く任意の第Ｘ因子誘導体の添加は、促進するのではなく血塊の形成を遅らせる。

しかし、Ｇｌａドメインを欠く誘導体の凝血促進活性が正常な第Ｘ因子のそれよりも遙かに小さいという事実は、これらの誘導体間で行われる比較を妨げない。詳細には、凝血促進活性におけるＧｌａドメインの貢献は、どの誘導体であっても均一である：それは、その触媒活性とは独立している。第Ｘ因子誘導体（これは、正常な誘導体と比較して「凝固時間」（血漿がその流動性を失うのに要する時間）を減少させる）は、従って、より優れた凝血促進活性を反映する；他方、凝固時間における増加は、誘導体がその正常なホモローグよりもより活性でないことを示す。従って、第Ｘ因子誘導体（活性化されているかまたはされていない）の凝血促進活性を、Ｇｌａドメインを欠く正常なホモローグ（ＧＤ−ＦＸ）のそれと比較した。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態の凝血促進効果：
第Ｘ因子誘導体の活性化形態の血友病患者由来の血漿への添加は、プロトロンビンの活性化のサイクル化を試験しない：それは、インビボで遭遇する条件に近い条件下で機能する活性化された誘導体の能力を反映する。組織因子および第ＶＩＩＩ因子またはＩＸ因子の非存在下で、凝固カスケードの増幅は起こらず、第Ｘ因子誘導体の活性化形態のみが、トロンビンの形成、引き続く血塊の形成を可能にする。プロトロンビナーゼ複合体内の活性の研究（参考、実施例５）は、活性化第Ｖ因子の添加が、ＧＤＸ−ＡＶＧアナログの活性化形態の触媒活性を部分的に回復させることを示す：これは、現在、その非変異ホモローグ（ＧＤＸ−ＩＶＧ）のそれよりも１３倍のみ少ない。この効果は、第Ｘ因子アナログ（ＧＤＸ−ＩＦＧ、ＧＤＸ−ＩＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧ、およびＧＤＸ−ＳＦＲ）の他の活性化形態で記録されるものとは遙かに異なる。第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠乏血漿の使用は、他の凝固因子とのあり得る干渉、特に、調節機構（アンチトロンビンなど）の効果を研究するのを可能にする。

第Ｘ因子誘導体の活性化形態の凝血促進効果は、第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠乏血漿(DIAGNOSTICA STAGO, Asnieres, France)中の血塊の形成を誘導する能力によって検出される。これらの血漿の１つに組織因子を添加することによって、血塊の形成を誘導するのに十分なトロンビンの形成を引き起こすことが可能であるが、凝固時間は、極端に長く、従来の方法で測定され得ない。従って、反応は、マイクロプレートで行われ、そして血塊形成に続いて、濁度測定され、時間の関数として４０５ｎｍでの光学密度を記録する（波長がどうであれ、吸光度は濁度と共に増加する）。血塊形成（これは、比較的突然である）は、いくらか長い潜伏期間が先にある：代表的に、濁度測定は、時間の関数としてＳ字状曲線に従う。最大濁度の５０％に達するのに必要な時間は、従来の凝固アッセイの「凝固時間」の代表である。

実際には、１００μｌの第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠乏血漿が、２５℃でマイクロプレート中でプレインキュベートされ、そして反応は、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２および２００ｎＭの活性化第Ｘ因子誘導体を含む１００μｌのキネティックス緩衝液を添加することによって引き起こされる。時間の関数として、４０５ｎｍでの吸光度におけるバリエーションが、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して記録される。時間の関数として、４０５ｎｍでの吸光度のバリエーションをプロットすることによって、曲線を得、これは、非線形回帰によって、「ボルツマン等式７」を使用して、凝固時間（Ｖ_５０）を推定することが可能となる：
Ａ_４０５＝Ａ_min＋（Ａ_max−Ａ_min）/（１＋ｅ^（（Ｖ _５０ ^{−ｔ）／スロープ）}） （等式７）
ここで、Ａ_４０５は、時間ｔでの４０５ｎｍでの吸光度を示し、Ａ_ｍｉｎは、４０５ｎｍでの最初の吸光度を示し、そしてＡ_ｍａｘは、４０５ｎｍでの最終吸光度を示す（血塊の形成後）。スロープは、血塊の形成における上昇する相の比較的簡単な性質を考慮するパラメーターである（潜伏期間が減少するにつれて、スロープは増加する）。

得られる結果を表ＸＩに要約する。

第Ｘ因子誘導体の１つの活性化形態の添加後の第ＶＩＩＩ因子欠乏（−第ＶＩＩＩ因子）または第ＩＸ因子欠乏（−第ＩＸ因子）血漿の凝固時間（分）が、標準誤差と同様に示される（得られた値の割合として表される）。５０分を超えると、凝固時間についての値は、もはや信頼可能でない（＞５０）。

ＧＤ−ＦＸ誘導体の活性化形態およびＧＤＸ−ＩＶＧ誘導体の活性化形態は、顕著な凝血促進効果を有する。

さらに、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態の可能性が確認される：第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠乏血漿において、この誘導体は、ＧＤ−ＦＸ誘導体の活性化形態と同じくらい多く凝固時間を短くする。同じことは、ＧＤＸ−ＩＦＧ誘導体の活性化形態について当てはまらない：第ＩＸ欠乏血漿中のその凝血促進活性は検出可能であるが、この誘導体は、第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿中で５０分よりも短いうちに、血塊の形成を誘導し得るままである。検出可能な触媒活性を欠く第Ｘ因子誘導体の活性化形態（ＧＤＸ−ＳＦＲ、ＧＤＸ−ＳＶＧおよびＧＤＸ−ＩＦＲ）は、検出可能な凝血促進活性を有さない。

ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体（活性化されていない）の凝血促進効果：
組織因子なしで、血漿が血友病患者のものであるかに関わらず、血塊形成はない：凝血カスケードは開始されない。他方、正常な血漿は、組織因子の添加後、非常に迅速に凝固する；血友病患者の血漿はまた、最終的に凝固する。なぜなら、内因性凝固複合体（組織因子と第ＶＩＩａ因子との間で形成される）は、第Ｘ因子を活性化し、これは、プロトロンビナーゼ複合体（活性化第Ｖ因子と形成される）内で、プロトロンビンをトロンビンに活性化し、これは、最終的に、十分なフィブリノゲンを切断して血塊を形成する。反応は、テナーゼ複合体を含む増幅がないので、はるかにゆっくりである。トロンビン活性化可能な第Ｘ因子の存在は、トロンビン生成の増幅を確立すべきである：２つのアクチベーターが利用可能である：以前のように第ＶＩＩａ因子と組織因子の複合体だけでなく、トロンビン。トロンビン濃度が増加するにつれて、より多くの第Ｘ因子誘導体が活性化され、これは、より多くのトロンビンを生成し、従って増幅を生成する。

Ｇｌａドメインを欠く第Ｘ因子誘導体は、本当は、その抗血友病可能性を試験することを可能にしない。なぜなら、その凝血促進作用は、いずれの場合においても制限されるからである。しかし、このような誘導体の存在下で、トロンビン形成の増幅が組織因子の添加後に生じるか否かを証明することは可能である。

第Ｘ因子誘導体（活性化されていない）の凝血促進効果を検出するために使用される方法は、それらの活性化形態の活性を検出するために記載される方法に非常に類似している。主な違いは、反応が、組織因子およびホスホリピドの混合物の添加によって開始されることである（これらの誘導体は予め活性化されていないという事実に加えて）。活性化形態の研究に関して、反応は２５℃でマイクロプレート中で行われ、血塊形成に続き、濁度測定、時間の関数として４０５ｎｍでの光学濃度を記録する。これは、研究される第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠乏血漿の凝固時間を短くする第Ｘ因子誘導体の能力である。

実際には、第Ｘ因子誘導体（０．５μＭ）が、１００μｌの第ＶＩＩＩ因子または第ＩＸ因子欠乏血漿に添加され、反応は、２０ｍＭ ＣａＣｌ_２およびホスホリピドと混合した２ｐＭの組換え組織因子(INNOVIN, DADE BEHRING, La Defense, France)を含む１００μｌのキネティックス緩衝液の添加によって引き起こされる。時間の関数としての４０５ｎｍでの吸光度におけるバリエーションは、ＭＲ５０００マイクロプレートリーダーを使用して記録され、そして最大の濁度の半分に達するのに必要とされる時間を、第Ｘ因子誘導体の活性化形態の凝血促進活性を研究するための上に記載されるような等式７を使用して非線形回帰によって推定する。

ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体（チモーゲン）で得られた結果を図４に示す。これは、この誘導体（○）（活性化されていない）の凝血促進効果を、第ＶＩＩＩ因子欠乏（４Ａ）または第ＩＸ因子欠乏（４Ｂ）血漿中のＧＤ−ＦＸ誘導体（□）（活性化されていない）と比較する。ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の存在下で、凝固時間は、ＧＤ−ＦＸ誘導体の存在下よりもより短い（第ＶＩＩＩ因子欠乏血漿と第ＩＸ因子欠乏血漿の両方で）。従って、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体のチモーゲン形態は、Ｇｌａドメインの非存在およびその非変異ホモローグと比較したその減少した触媒活性にかかわらず、明らかに凝血促進活性を有する。ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体は、ＧＤ−ＦＸ誘導体よりもより活性であるという事実は、トロンビン生成の増幅が、ＧＤＸ−ＡＶＧの存在下で確かに生じていることを示唆する。実際に、ＧＤ−ＦＸ誘導体と比較して、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体は、プロトロンビナーゼ複合体内で１３倍活性が低く、ここで、それは、血友病患者由来の血漿において少なくとも２倍活性である：従って、血塊形成の間に、ＧＤＸ−ＡＶＧ誘導体の活性化形態よりも少なくとも２６倍の生成が存在する。

図１は、外因性経路を介するかまたは内因性経路を介する凝固の主要な酵素反応、およびトロンビン形成の自己増幅機構（破線矢印によって示す）を概略的に示す。 なし なし なし

配列番号１の人工配列は第Ｘ因子活性化部位である。
配列番号２〜６は、人工配列である。
配列番号７〜１２の人工配列は第Ｘ因子活性化部位の改変体である。
配列番号１３〜３０の人工配列はＰＣＲプライマーである。
配列番号３１の人工配列は第Ｘ因子活性化部位の改変体である。

Claims (10)

1. トロンビン切断可能な配列が配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａであることを特徴とする、ネイティブな第Ｘ因子の活性化部位の配列Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅがトロンビン切断可能な配列で置換された第Ｘ因子アナログ。
2. ネイティブな第Ｘ因子の活性化部位の配列Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙが、配列Ｐ_３−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｐ_２’−Ｐ_３’（配列番号３１）で置換され、ここで、Ｐ_３が、Ｐｒｏ、ＡｓｐまたはＧｌｕを除く任意のアミノ酸を示し、Ｐ_２’がＶａｌ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＰｈｅを示し、Ｐ_３’がＧｌｙ、ＡｓｎまたはＨｉｓを示すことを特徴とする、請求項１に記載の第Ｘ因子アナログ。
3. ネイティブな第Ｘ因子の活性化部位の配列Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｇｌｙが配列Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙで置換されることを特徴とする、請求項２に記載の第Ｘ因子アナログ。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の第Ｘ因子アナログのトロンビンによる切断によって得られ得る第Ｘａ因子アナログ。
5. 請求項１〜３のいずれか１項に記載の第Ｘ因子アナログをコードするか、または請求項４に記載の第Ｘａ因子アナログをコードする、核酸分子。
6. 請求項５に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、組換えベクター。
7. 請求項５に記載の核酸分子で遺伝的形質転換された宿主細胞。
8. 凝血促進性医薬品を得るための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の第Ｘ因子アナログ、請求項４に記載の第Ｘａ因子アナログ、または請求項５に記載の核酸分子の使用。
9. 前記医薬品が、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第ＸＩ因子における欠乏に由来する凝固障害の処置について意図される、請求項８に記載の使用。
10. 前記凝固障害が血友病タイプＡまたは血友病タイプＢであることを特徴とする、請求項９に記載の使用。
    
    

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