ES2257693T3 - Analogos de factor x escindibles por trombina. - Google Patents
Analogos de factor x escindibles por trombina.Info
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Abstract
Análogo de factor X en el que la secuencia Thr- Arg-Ile del sitio de activación de factor X nativo se reemplaza por una secuencia escindible por trombina, caracterizado porque dicha secuencia escindible por trombina es la secuencia Pro-Arg-Ala.
Description
Análogos de factor X escindibles por
trombina.
La presente invención se refiere a derivados de
factor X escindibles por trombina y a usos terapéuticos de los
mismos.
La coagulación sanguínea es el resultado de una
cascada de reacciones enzimáticas cuya etapa final es la generación
de trombina, que induce la formación de un coágulo capaz de obstruir
la abertura vascular. La mayoría de estas reacciones implican la
activación proteolítica de zimógenos inactivos a serinproteasas
activas.
Esta cascada de reacciones se divide
convencionalmente en dos rutas denominadas: "ruta intrínseca" y
"ruta de factor tisular" o "ruta extrínseca".
El proceso de coagulación mediante la ruta
intrínseca se inicia mediante la puesta en contacto de la sangre
con el tejido subendotelial. Este contacto conduce a la activación
del factor XII (FXII) al factor FXIIa, que después cataliza la
activación del factor XI (FXI) al factor XIa (FXIa), que activa a su
vez el factor (IX) (FIX) al factor IXa. Este último se une a su
cofactor, el factor VIIIa (FVIIIa) formando el complejo de tenasa.
Este complejo escinde el factor X (FX) con gran eficacia produciendo
el factor X activado (FXa).
El proceso de coagulación mediante la ruta
extrínseca se inicia mediante el factor tisular (TF), puesto en
contacto con la sangre cuando ocurre la formación de una abertura
vascular. Este factor tisular se une al factor VII activado (FVIIa)
presente en pequeñas cantidades en la sangre. El complejo
FVIIa-TF así formado puede activar los factores IX
y X.
La ruta intrínseca y la ruta extrínseca convergen
así hacia la activación del factor X al factor Xa, que constituye
una de las enzimas clave en la coagulación.
El factor Xa se sintetiza por hepatocitos en
forma de un precursor aminoacídico de 448 aminoácidos que comprende,
desde el extremo N-terminal al extremo
C-terminal: un péptido señal, un propéptido, un
dominio "Gla", dos dominios "EGF" (por factor de
crecimiento epidérmico) de estructura similar a la del factor de
crecimiento epidérmico, un péptido de activación y un dominio
catalítico de tipo serinproteasa. Las modificaciones
postraduccionales del factor X son particularmente complejas: además
de la escisión del péptido señal y el propéptido, incluyen la
carboxilación de los 11 glutamatos del dominio "Gla" a
\gamma-carboxiglutamatos, la escisión del
tripéptido
Arg_{180}-Lys_{181}-Arg_{182}
(la numeración designa el producto de traducción de ADNc de factor
X) la separación del segundo dominio EGF del péptido de activación,
la \beta-hidroxilación del resto de Asp_{103}
del dominio EGF 1 a \beta-hidroxiaspartato y al
menos cinco glicosilaciones, incluyendo cuatro en el péptido de
activación.
Por lo tanto, el factor X maduro en circulación
en el plasma consiste en dos cadenas polipeptídicas ligadas
mediante un puente disulfuro
(Cys_{172}-Cys_{342}): la cadena "ligera"
de 139 aminoácidos está compuesta por el dominio Gla y los dos EGF;
la cadena "pesada" de 306 aminoácidos está compuesta por el
péptido de activación unido al dominio catalítico.
La activación de factor X a una serinproteasa
requiere la escisión proteolítica entre el péptido de activación y
el dominio catalítico. El complejo de tenasa, y también el complejo
FVIIa-TF, realizan esta escisión entre los restos
Arg_{234} e Ile_{235}.
El factor X activado realiza también una escisión
autocatalítica que libera lentamente un pequeño fragmento en el
extremo C-terminal de su cadena pesada. Los factores
Xa \alpha y \beta se distinguen por tanto según si está presente
este péptido C-terminal o no. Sin embargo, la
actividad catalítica de estas dos formas de factor Xa es idéntica
(Jesty, et al., J. Biol. Chem. 250,
4497-4504, 1975); en consecuencia, y a menos que se
especifique otra cosa en la explicación de la presente invención, el
término "factor Xa" designa igualmente una u otra de estas dos
formas.
La unión del factor Xa con su cofactor, el factor
Va, forma el complejo de protrombinasa, que activa la protrombina a
trombina.
La trombina es también una enzima esencial en la
coagulación, y en la hemostasis en general; es una serinproteasa
multifuncional. Induce la agregación de plaquetas mediante la
escisión de su receptor en su superficie, y convierte el fibrinógeno
en circulación en un coágulo de fibrina insoluble. Este coágulo, al
reforzar el trombo de plaquetas ya formado, bloquea la abertura
vascular y hace posible así detener la hemorragia.
La trombina puede activar también los factores V
y VIII, que son respectivamente los cofactores de los complejos de
tenasa y protrombinasa, y también el factor XI (FXI), lo que da como
resultado la amplificación de las reacciones que conducen a su
formación, en las que están implicados estos factores.
La Figura 1 ilustra un diagrama de las reacciones
enzimáticas principales de coagulación mediante la ruta extrínseca
o mediante la ruta intrínseca, y también el mecanismo de
autoamplificación de la formación de trombina (representado por
flechas rayadas).
Una deficiencia cualitativa o cuantitativa de uno
de los factores implicados en la coagulación conduce a
manifestaciones trombóticas o hemorrágicas que son a menudo graves,
y que pueden ser una amenaza para la vida. En este contexto, se hará
particularmente mención a las hemofilias A y B, que son el resultado
respectivamente de una deficiencia de factor VIII o factor IX.
Las hemofilias A y B son coagulopatías de tipo
hemorrágico que son graves y bastante comunes: la incidencia de las
mismas es de aproximadamente 1 caso por 10.000 nacimientos
masculinos para hemofilia A y un caso por 30.000 nacimientos
masculinos para hemofilia B.
En términos clínicos, estas dos afecciones
patológicas son indistinguibles: en ambos casos, es el complejo de
tenasa, resultante de la asociación del factor VIII con el factor
IX, el que está afectado. Como resultado, hay una producción
insuficiente de factor X activado y, en consecuencia, de
trombina.
Esta deficiencia de trombina conduce no sólo a
una reducción de la formación de fibrina, sino también a una
reducción de la autoamplificación de la producción de trombina.
Los tratamientos para la hemofilia propuestos
actualmente son tratamientos de tipo sustitutivo dirigidos a
reestablecer la función del complejo de tenasa, o tratamientos
basados en el uso de una o más moléculas que posibilitarían eludir
el complejo de tenasa (Hedner, Thromb. Haemost., 82,
531-539, 1999).
El tratamiento de sustitución consiste en
administrar el factor VIII o IX que es deficiente. Este es el único
tratamiento disponible hasta la fecha que posibilita reestablecer
correctamente, además de la formación de fibrina, la
autoamplificación de la generación de trombina.
La desventaja principal de este tratamiento se
encuentra en la antigenicidad potencial de la molécula inyectada,
que puede considerarse como extraña por el sistema inmune del
receptor. El desarrollo de aloanticuerpos neutralizantes dirigidos
contra el factor utilizado es una grave complicación del tratamiento
de sustitución, que lo hace gradualmente ineficaz.
Se han propuesto tres enfoques para eludir el
complejo de tenasa:
- -
- inyección de mezclas de factores de coagulación "dependientes de vitamina K", que comprenden en particular protrombina y factores VII, IX y X, estando los factores VII y X parcialmente en forma activada. Sin embargo, este tratamiento induce efectos secundarios infrecuentes pero graves: shock anafiláctico y accidentes trombóticos (infarto de miocardio, coagulación intravascular diseminada) que puede explicarse mediante una acción no localizada en la lesión vascular. Además, este tratamiento reestablece la autoamplificación de la generación de trombina sólo en el caso de hemofílicos de tipo B;
- -
- inyección masiva de factor VII activado que, en presencia de factor tisular, activa el factor X independientemente del complejo de tenasa. El factor VII activado tiene la ventaja de que su acción está localizada en la abertura vascular donde se forma el complejo con factor tisular. Su eficacia en el tratamiento de la hemofilia podría explicarse también mediante un mecanismo independiente de factor tisular que utiliza los fosfolípidos aniónicos expuestos por las plaquetas activadas (Hoffman et al., Blood Coag. Fibrinolysis, 9 (supl. I), S61-65, 1998). Las principales desventajas de utilizar factor VII activado son su semivida plasmática muy corta (menos de tres horas), que hace necesario administrarlo en grandes cantidades, lo que hace al tratamiento muy caro. Además, el factor VII activado no induce la autoamplificacón de la generación de trombina. La cantidad de trombina generada en un plasma de hemofílico después de la adición de una dosis terapéutica de factor VII activado permanece bastante por debajo de la generada en un plasma normal (Butenas et al., Blood, 99, 923-930, 2002);
- -
- la administración de factor X, cuya actividad se libera sólo lentamente en el plasma; en este contexto, se han propuesto tres tipos de administración: administración de factor X activado en combinación con vesículas fosfolipídicas (Ni et al., Thromb. Haemost., 67. 264-271, 1992); la administración de factor X que está activado pero inhibido reversiblemente, por ejemplo, mediante acetilación de la serina del sitio activo, y capaz de reactivarse lentamente en el plasma mediante desacilación gradual (Wolf et al., Blood, 86, 4153-4157, 1995; Lin et al., Thromb. Res., 88, 365-372, 1997); la administración de factor X en forma de un zimógeno que puede activarse en el plasma independientemente del complejo de tenasa. Este último enfoque utiliza análogos de factor X en los que el sitio para escisión por el complejo de tenasa está reemplazado por un sitio para escisión por otra proteasa.
Himmelspach et al., (Thromb. Res.
97, 51-67, 2000) describe así análogos de factor X
en los que el sitio de activación está reemplazado por un sitio de
escisión por furina. Una vez inyectado, este zimógeno puede
convertirse lenta y continuamente en el factor Xa.
La solicitud PCT 98/38317 propone la construcción
de diversos análogos de factor X en los que el sitio de activación
nativo está reemplazado por un sitio para escisión por otra
proteasa, elegida de factor XIa, trombina, factor XIIa, calicreína,
factor Xa y furina. La solicitud PCT WO 01/10896 propone el
reemplazo del sitio nativo para activación por el complejo de tenasa
por un sitio para escisión por el factor XIa.
La principal ventaja del uso de análogos de
factor X se basa en la semivida plasmática de estos análogos, que
es similar a la del factor X (48 horas), y por lo tanto mucho más
larga que la del factor X activado (menos de 1 minuto). Las
desventajas potenciales de estos análogos son el resultado de la
dificultad para controlar sus efectos: la generación de factor X
activado ocurre continuamente, sin estar regulado y sin estar
localizado en la abertura vascular. Además, estos análogos no
posibilitan inducir la amplificación de la generación de
trombina.
Por lo tanto, parece ser deseable tener otros
análogos de factor X que no exhiban estas desventajas. Con este
objetivo, los inventores han buscado derivados de factor X
activables por trombina que posibilitarían no sólo eludir las etapas
deficientes de la cascada de coagulación, y en particular el
complejo de tenasa, sino también reestablecer la autoamplificación
de la generación de trombina, según el mecanismo ilustrado en la
Figura 2. La forma activada de este derivado de factor X (FXa*)
sería capaz de hecho (en combinación con factor V activado) de
formar un complejo de protrombinasa funcional, y por lo tanto, de
activar la protrombina a trombina. A cambio, la trombina activaría
moléculas adicionales de derivado de factor X.
Fisiológicamente, la trombina no activa el factor
X. De hecho, la eficacia de la escisión está condicionada por la
naturaleza de los aminoácidos que encuadran el sitio de escisión, y
en particular por los restos
P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}'
del sitio de activación (apareciendo la escisión entre los restos
P_{1} y P_{1}'). Ahora, en el caso del factor X, la secuencia
Leu-Thr-Arg-Ile-Val-Gly
(LTR-IVG, SEC Nº ID 1) del sitio de activación es
muy distinta de las secuencias
Met-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg
(MPR-SFR, SEC Nº ID 2) o
Val-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg
(VPR-SFR, SEC Nº ID 3), que son particularmente
favorables para escisión por trombina (Marque et al., J. Biol.
Chem., 275, 809-816, 2000; Bianchini et al.,
J. Biol. Chem., 277, 20527-20534, 2002).
Los restos P_{3} a P_{1} que preceden al
sitio de escisión no están implicados en la actividad catalítica del
factor X después de la activación: son parte del péptido de
activación que se libera después de la escisión. Lo mismo no es
cierto para los restos P_{1}' a P_{3}', que siguen
inmediatamente al sitio de escisión: como en todas las
serinproteasas, los restos N-terminales de la cadena
catalítica de factor X activado están implicados en la actividad
enzimática. El resto P_{1}' en particular desempeña un papel
fundamental en el mecanismo catalítico de la enzima.
La sustitución de la secuencia
LTR-IVG del sitio de activación del factor X por la
secuencia VPR-SFR posibilitaría multiplicar por
10^{5} la relación de escisión de factor X por trombina. Sin
embargo, existe el riesgo de que esta sustitución sea perjudicial
para la actividad enzimática del factor Xa. De hecho, no es posible
predecir cuál sería la actividad enzimática de un análogo de factor
X activado en el que la cadena pesada empiece con un resto distinto
de isoleucina.
La solicitud PCT WO 98/38317 describe un análogo
de factor X en el que la secuencia LTR-IVG del sitio
de activación nativo se reemplaza por la secuencia
Thr-Arg-Arg-Ser-Val-Gly
(TRR-SVG, SEC Nº ID 4) y que se presenta como
potencialmente escindible por trombina. Sin embargo, no se dan
indicaciones respecto a la escisión eficaz de este zimógeno por
trombina, y aún menos respecto a la actividad catalítica del análogo
de factor Xa que resultaría de esta escisión.
Los inventores han ensayado diversas
sustituciones en las posiciones
P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}'
del sitio de activación nativo del factor X para estudiar los
efectos de estas sustituciones, en primer lugar, sobre la escisión
por trombina y, en segundo lugar, sobre la actividad enzimática del
análogo de factor Xa resultante de las mismas.
Por tanto, han observado que la sustitución en
las posiciones
P_{2}-P_{1}-P_{1}' de la
secuencia TR-I por la secuencia
PR-A posibilita obtener análogos del factor X que
pueden escindirse eficazmente por trombina, y cuya escisión genera
un análogo de factor Xa que tiene una actividad catalítica que,
aunque reducida, es similar a la de su homólogo no mutado y
compatible con una función fisiológica normal; además, esta
reducción de la actividad catalítica está compensada por un aumento
en la semivida comparado con la del factor Xa nativo. Este aumento
de la semivida es el resultado de una mejor resistencia a las
serpinas (inhibidores de serinproteasas en el plasma) y, en
particular, a la antitrombina.
En consecuencia, es un objeto de la presente
invención un análogo de factor X en el que la secuencia
Thr-Arg-Ile del sitio de activación
del factor X nativo se reemplaza por una secuencia escindible por
trombina, caracterizado porque dicha secuencia escindible por
trombina es la secuencia
Pro-Arg-Ala.
Es también un objeto de la presente invención
cualquier análogo de factor Xa que pueda obtenerse mediante
escisión por trombina de un análogo de factor X según la
invención.
El término "análogo de factor X" designa
aquí tanto la molécula de factor X madura como su precursor
intracelular; el término "análogo de factor Xa" designa la
molécula en la forma activada \alpha o \beta.
Respecto a las sustituciones en las posiciones
P_{3}, P_{2}' y P_{3}' del sitio de activación, tienen menos
influencia sobre la eficacia de la escisión por trombina, y sobre la
actividad enzimática del análogo de factor Xa obtenido, que las
realizadas en las posiciones P_{2}, P_{1} o P_{1}'.
Por tanto, en P_{3}, el resto Leu del factor X
nativo puede conservarse o sustituirse por cualquier aminoácido, con
la excepción de Pro, Asp y Glu; en P_{2}', el resto de Val del
factor X nativo puede conservarse o sustituirse por un aminoácido
preferiblemente elegido de Ile, Leu y Phe; en P_{3}', el resto Gly
del factor X nativo puede conservarse o sustituirse por un
aminoácido preferiblemente elegido de Asn y His.
Opcionalmente, es posible combinar las
modificaciones del sitio de activación específicas de los análogos
de factor X y análogos de factor Xa según la invención con otras
modificaciones referentes a diferentes dominios del factor X o del
factor Xa y posibilitar mejorar varias de sus propiedades. Por
tanto, es posible, por ejemplo, reemplazar el propéptido del factor
X nativo por el de la protrombina, para obtener un mejor rendimiento
de proteína madura \gamma-carboxilada, como se
describe por Camire et al. (Biochemistry, 39,
14322-14329, 2000). Es también un objeto de la
presente invención moléculas de ácido nucleico que codifican
análogos de factor X según la invención.
Estas moléculas de ácido nucleico pueden
obtenerse mediante procedimientos convencionales bien conocidos por
los expertos en la técnica, en particular mediante mutagénesis
dirigida a sitio de una molécula de ácido nucleico que codifica el
factor X nativo.
La presente invención abarca también los módulos
de expresión que comprenden una molécula de ácido nucleico según la
invención asociada a elementos adecuados para controlar la
transcripción (en particular, promotor y, opcionalmente,
terminador) y opcionalmente la traducción, y también los vectores
recombinantes en los que se inserta una molécula de ácido nucleico
según la invención. Estos vectores recombinantes pueden ser, por
ejemplo, vectores de clonación, vectores de expresión o vectores de
transferencia génica que pueden utilizarse en terapia génica.
Es también un objeto de la presente invención
células huésped procarióticas o eucarióticas transformadas
genéticamente con al menos una molécula de ácido nucleico según la
invención. Preferiblemente, para la expresión y la producción de
análogos de factor X según la invención, se elegirán células
eucarióticas, por ejemplo, células de mamífero.
La construcción de vectores según la invención y
la transformación de las células huésped pueden llevarse a cabo
mediante técnicas de biología molecular convencionales.
La presente invención abarca también animales y,
en particular mamíferos transgénicos no humanos, que albergan al
menos un transgén que comprende un módulo de expresión según la
invención. Estos mamíferos transgénicos pueden utilizarse, por
ejemplo, para producir análogos de factor X según la invención de
manera similar a la que se ha propuesto ya para la producción de
otras proteínas de interés terapéutico (Brink et al.,
Theriogenology, 53, 139-148, 2000).
Los análogos de factor X según la invención
pueden obtenerse, por ejemplo, cultivando genéticamente células
transformadas según la invención y recuperando, a partir del
cultivo, el análogo expresado por dichas células. Si es necesario,
pueden purificarse mediante procedimientos convencionales conocidos
por si mismos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante
precipitación fraccionada, en particular precipitación con sulfato
de amonio, electroforesis, filtración en gel, cromatografía de
afinidad, etc.
Es también un objeto de la presente invención el
uso de análogos de factor X o de análogos de factor Xa según la
invención, o de las moléculas de ácido nucleico que codifican estos
análogos, para obtener productos medicinales procoagulantes.
Los productos medicinales obtenidos a partir de
análogos de factor X o análogos de factor Xa según la invención
pueden utilizarse en el contexto de la prevención o el tratamiento
de coagulopatías de tipo hemorrágico, surgidas en particular por una
deficiencia de factor VIII, IX o XI. Éstas pueden ser, en
particular, hemofilia A o hemofilia B, que pueden estar complicadas
o no por la presencia de inhibidores (aloanticuerpos neutralizantes
dirigidos contra factor VIII o IX utilizados convencionalmente para
el tratamiento); pueden ser también hemofilias adquiridas
resultantes de la aparición de autoanticuerpos asociados a otra
afección patológica (enfermedad autoinmune, cáncer, síndrome
linfoproliferativo, trastorno idiopático, etc.).
Las moléculas de ácido nucleico según la
invención pueden incorporarse ventajosamente a productos medicinales
que pueden utilizarse en terapia génica. Los vectores utilizados
convencionalmente en terapia génica, tales como vectores virales
(por ejemplo, un vector de tipo adenovirus o retrovirus), liposomas,
etc., pueden utilizarse para obtener productos medicinales según la
invención.
Los análogos de factor Xa según la invención
tienen, aparte del complejo de protrombinasa, una actividad
catalítica que es mucho más débil que la del factor Xa nativo. Sin
embargo, en el complejo de protrombinasa (concretamente en
condiciones fisiológicas), la reducción de su actividad comparada
con el factor Xa nativo es mucho menor, y son capaces de corregir
eficazmente los efectos de un agotamiento de factor VIII o IX.
Además, debido a su considerable resistencia a la antitrombina, los
análogos de factor Xa según la invención tienen la ventaja de tener
una semivida más larga, que compensa su actividad más débil. Aunque
es mucho más lenta, sigue habiendo inhibición por antitrombina (que
es proporcional a la actividad catalítica), lo que posibilita
conservar un mecanismo de autorregulación similar al del factor Xa
nativo.
Además, la acción de análogos de factor Xa según
la invención permanece localizada en la abertura vascular puesto
que, como se muestra en la Figura 2, la cascada enzimática en la que
están implicados estos análogos es desencadenada por factor
tisular. Finalmente, como se muestra también en la Figura 2, el uso
de análogos de factor X según la invención posibilita reestablecer
la autoamplificación de la generación de trombina.
El resultado global de esto es un efecto
terapéutico que está mejor dirigido y es más fácil de controlar que
el de los análogos de factor X o factor Xa de la técnica
anterior.
Los análogos de factor X según la invención
pueden utilizarse, por ejemplo, a concentraciones plasmáticas del
orden de 0,1 a 0,5 \muM, concretamente 5 a 25 mg/l. Estas
concentraciones pueden obtenerse administrando dosis que son
cercanas a las que se utilizan en el caso de tratamientos con factor
VIIa, pero menos frecuentemente.
La presente invención se entenderá más claramente
a partir de la descripción adicional siguiente, que designa ejemplos
no limitantes de preparación y de caracterización de un análogo de
factor X (GDX-AVG) según la
invención.
invención.
Se construyeron diversos derivados de factor X
humano:
- -
- un derivado, designado en adelante en la presente memoria como "FX recombinante", que difiere de factor X nativo sólo por la adición, en su extremo terminal, de un péptido de 11 aminoácidos (EQKLISEEDLN, SEC Nº ID 5) que es reconocido por el anticuerpo monoclonal 9E10 (Pharmingen, San José, EE.UU.); esta modificación posibilita facilitar la detección y purificación de la proteína expresada;
- -
- un derivado, designado en adelante en la presente memoria como "GD-FX", que difiere del derivado "recombinante" en que carece también de un dominio Gla, lo que posibilita aumentar la cantidad de proteína recombinante expresada, y en que comprende en su extremo N-terminal una secuencia de 12 aminoácidos (EDQVDPRLIDGK, SEC Nº ID 6) que constituye un epítope reconocido por el anticuerpo monoclonal HPC-4 (Roche Diagnostics, Meylan, Francia);
- -
- los derivados, designados en adelante en la presente memoria como GDX-IVG, GDX-IFG, GDX-AVG, GDX-IFR, GDX-SVG, GDX-SFR, que difieren del derivado GD-FX por la modificación de uno o más de los restos en las posiciones P_{3}, P_{2}, P_{1}, P_{1}', P_{2}' o P_{3}' del sitio de activación.
Los restos P_{3} a P_{3}' del sitio de
activación de factor X normal aislado de plasma (FX plasmático), y
de cada uno de los derivados anteriores, se indican en la Tabla
I.
\vskip1.000000\baselineskip
| P_{3} | P_{2} | P_{1} | P_{1}' | P_{2}' | P_{3}' | |
| FX plasmático (SEC Nº ID 1) | Leu | Thr | Arg | Ile | Val | Gly |
| FX recombinante (SEC Nº ID 1) | Leu | Thr | Arg | Ile | Val | Gly |
| GD-FX (SEC Nº ID 1) | Leu | Thr | Arg | Ile | Val | Gly |
| GDX-IVG (SEC Nº ID 7) | Val | Pro | Arg | Ile | Val | Gly |
| GDX-IFG (SEC Nº ID 8) | Val | Pro | Arg | Ile | Phe | Gly |
| GDX-AVG (SEC Nº ID 9) | Val | Pro | Arg | Ala | Val | Gly |
| GDX-IFR (SEC Nº ID 10) | Val | Pro | Arg | Ile | Phe | Arg |
| GDX-SVG (SEC Nº ID 11) | Val | Pro | Arg | Ser | Val | Gly |
| GDX-SFR (SEC Nº ID 12) | Val | Pro | Arg | Ser | Phe | Arg |
\vskip1.000000\baselineskip
Los vectores de expresión utilizados para
construir estos derivados se obtienen a partir del vector
pNUT-hGH (Palmiter et al., Science, 1983,
222, 809-814, 1983) mediante el reemplazo de la
secuencia que codifica hormona de crecimiento humana (hGH) por la
secuencia que codifica el derivado de factor X deseado.
\newpage
El vector designado como
"pNUT-FX" posibilita expresar el derivado "FX
recombinante" en células eucarióticas.
El ADNc completo del factor X humano utilizado
(1467 pares de bases) se clonó inicialmente por Messier et
al. (Gene, 99, 291-294, 1991) en el sitio
SalI del plásmido pBluescript KS(-).
Este ADNc se recuperó mediante amplificación por
PCR a partir del vector pBluescript que lo contiene. Los cebadores
utilizados se representan en la Tabla II siguiente. La temperatura
de fusión utilizada (Th') se indica en la columna final de la
tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
Los cebadores 1 (SEC Nº ID 13) y 2 (SEC Nº ID 14)
introducen respectivamente un sitio de restricción BamHI
posicionado 5' y un sitio XmaI posicionado 3' en la secuencia que
codifica el factor X. Además, el cebador 2 introduce, justo antes
del codón de paro de ADNc del factor X, la secuencia que codifica el
epítope reconocido por el anticuerpo monoclonal 9E10.
El protocolo de amplificación es el siguiente: la
amplificación se lleva a cabo en un volumen de 100 \mul que
contiene 2 \mug (7 nM) de plásmido pBluescript, cada uno de los
cebadores 1 y 2 2 \muM, cada dNTP 0,2 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP;
Amersham Pharmacia Biotech, Orsay, Francia) y 6 unidades de ADN
polimerasa Pfu (Stratagene) en el tampón recomendado por el
fabricante. La amplificación se lleva a cabo en un DNA Thermal
Cycler (modelo 480, Perkine Elmer, Roissy, Francia) según el
programa siguiente: una desnaturalización inicial de 5 minutos a
95ºC, seguida de 30 ciclos, comprendiendo cada uno 45 minutos de
desnaturalización a 95ºC, 45 segundos de hibridación a una
temperatura de al menos 4ºC por debajo de la temperatura de fusión
de los cebadores, y 3,5 minutos de elongación a 72ºC. La
amplificación se termina mediante incubación durante 10 minutos a
72ºC.
El producto de amplificación se purifica mediante
extracción con fenol/cloroformo y se concentra mediante
precipitación con etanol. Después se hacen romos los extremos y se
fosforilan mediante incubación durante 30 minutos a 37ºC en
presencia de 5 unidades de ADN polimerasa T_{4} (New England
Biolabs, Beverly, MA, EE.UU.), 10 unidades de polinucleótido
quinasa T_{4} (New England Biolabs) y dNTP 0,3 mM (Amersham
Pharmacia Biotech). Se purifica el fragmento de interés utilizando
el "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Courtaboeuf, Francia)
después de separación en un gel de agarosa al 1% estándar, según las
instrucciones del fabricante.
En paralelo, se linealizan 40 \mug en 140
\mul (86 nM) de un vector receptor (pBluescript, Stratagene) con
400 unidades de EcoRV durante 90 minutos a 37ºC. Se desfosforilan
los extremos del vector pBluescript linealizado mediante incubación
durante 60 minutos a 37ºC en presencia de 50 unidades de fosfatasa
alcalina intestinal de ternero (New England Biolabs); después se
purifica este vector como anteriormente, utilizando el "QIAquick
Gel Extraction Kit", después de separación en agarosa al 1%
estándar.
Se introduce el inserto en el vector receptor
mediante ligamiento, incubando el vector 10 nM con inserto 20 nM en
presencia de 400 unidades de ADN ligasa T_{4} (New England
Biolabs) durante 24 horas a temperatura ambiente en 10 \mul del
tampón recomendado por el fabricante.
El plásmido resultante
(pBluescript-FX) se amplifica en la cepa DH5\alpha
de E. coli y se purifica según protocolos estándar, descritos
por Sambrook et al. ("Molecular Cloning: A Laboratory
Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
El inserto del plásmido
pBluescript-FX se transfiere al vector
pNUT-hGH mediante intercambio de módulos según el
siguiente protocolo:
Se digieren 2 \mug (4 nM) de
pNUT-hGH con 60 unidades de BamHI durante 2 horas a
37ºC en 100 \mul de mezcla de reacción. Se purifica el vector así
linealizado mediante extracción con fenol/cloroformo, seguido de
precipitación con etanol. Se recoge después en 10 \mul de Tris 10
mM, pH 8,0, que contiene EDTA 1 mM, y se digiere con 30 unidades de
XmaI durante 3 horas a 37ºC.
Se desfosforilan los dos fragmentos derivados de
esta segunda digestión mediante incubación durante una hora a 37ºC
en presencia de 150 unidades de fosfatasa alcalina.
Se separa el vector pNUT linealizado de su
anterior inserto (que contiene la secuencia que codifica hGH)
mediante electroforesis en agarosa al 1% estándar, y se purifica
utilizando el "QIAquick Gel Extraction Kit".
En paralelo, se digieren 130 \mul (1,3 \muM)
de pBluescript-FX con 20 unidades de BamHI durante 1
hora a 37ºC en 30 \mul de meczla de reacción. Se purifica el
vector linealizado mediante extracción con fenol/cloroformo, seguido
de precipitación con etanol. Se suspende después en 10 \mul de
Tris 10 mM, pH 8,0, que contiene EDTA 1 mM, y se digiere con 30
unidades de XmaI durante 3 horas a 37ºC.
Se separa el inserto FX de su anterior vector
mediante electroforesis en agarosa al 1% estándar, y se purifica
utilizando el "QIAquick Gel Extraction Kit".
Se obtiene el vector pNUT-FX
mediante ligamiento del inserto FX en el vector pNUT en presencia de
ADN ligasa T_{4}, como se describe anteriormente.
La presencia de un dominio "Gla" limita
considerablemente la síntesis de una proteína recombinante en una
célula eucariótica. Su retirada posibilita multiplicar por cinco la
cantidad de proteína recombinante expresada.
Además, el dominio "Gla" del factor X es
necesario para su actividad biológica, pero no es esencial para la
actividad proteolítica con respecto a sustratos que interaccionan
sólo con el surco catalítico. La preparación de derivados que
carecen de dominio "Gla" posibilita por lo tanto determinar
rápidamente el efecto de modificaciones de los restos yuxtapuestos
al sitio de activación sobre la actividad serinproteasa.
El vector pNUT-ETW (Le Bonniec
et al., J. Biol. Chem., 267, 6970-6976, 1992)
expresa un derivado de protrombina humana que carece de su dominio
"Gla" y está fusionado, en N-terminal, con el
péptido señal de factor V bovino y con una secuencia de 12
aminoácidos (EDQVDPRLIDGK) que constituye un epítope reconocido por
el anticuerpo monoclonal HPC-4.
Para construir el vector
pNUT-GDX, el conjunto de "péptido señal y dominio
``Gla'' del vector pNUT-FX" se sustituyó por el
conjunto "péptido señal, propéptido y epítope
HPC-4 del vector pNUT-ETW".
Los cebadores utilizados para amplificar los
fragmentos de los vectores pNUT-FX y
pNUT-ETW se representan en la Tabla III siguiente.
La amplificación por PCR se lleva a cabo como se describe
anteriormente para el vector pNUT-FX.
La amplificación del fragmento derivado de
pNUT-ETW (que incluye los sitios BamHI y XmaI de
pNUT, la secuencia que codifica el péptido señal del factor V y la
que codifica el epítope reconocido por el anticuerpo
HPC-4) se lleva a cabo con los cebadores 3 (SEC Nº
ID 15) y 5 (SEC Nº ID 17); la amplificación del fragmento derivado
de pNUT-FX (que incluye la secuencia que codifica
los dos dominios EGF, el péptido de activación y el dominio
serinproteasa del factor X, y también el epítope reconocido por el
anticuerpo 9E10) se lleva a cabo con los cebadores 6 (SEC Nº ID 18)
y 4 (SEC Nº ID 16). Los cebadores 5 y 6 son parcialmente
complementarios (el cebador 6 introduce, posicionado 5' del primer
EGF, una porción de la secuencia que codifica el epítope reconocido
por el anticuerpo HPC-4), lo que posibilita unir los
fragmentos derivados de las dos PCR mediante PCR
"Mega-primer" (Ho et al., Gene, 15,
51-59, 1989) en presencia de los cebadores 3 y 4. El
producto de esta PCR se digiere con 40 unidades de XmaI (en un
volumen de 400 \mul) y se purifica el fragmento de restricción
(con un sitio XmaI en cada extremo) utilizando el QIAquick Gel
Extraction Kit después de separación en un gel de agarosa al 1%.
Además, se digieren 6 \mug en 140 \mul (12
nM) de vector pNUT-hGH con 20 unidades de Xmal
durante 2 horas a 37ºC. El vector así linealizado se separa de su
antiguo inserto (secuencia que codifica hGH) mediante electroforesis
en agarosa al 1% estándar, y se purifica utilizando el QIAquick Gel
Extraction Kit. El vector sin inserto (0,1 \mug en 10 \mul,
concretamente 2,7 nM) se recirculariza mediante ligamiento en
presencia de 400 unidades de ADN ligasa T_{4} durante 16 horas a
temperatura ambiente.
Se amplifica el vector pNUT recircularizado en la
cepa DH5\alpha de E. coli y se purifica.
Se linealizan 40 \mug en 100 \mul
(concretamente 110 nM) del vector pNUT sin inserto con 10 unidades
de XmaI durante 3 horas a 37ºC, y se desfosforilan sus extremos
mediante incubación durante 1 hora a 37ºC en presencia de 150
unidades de fosfatasa alcalina. El vector pNUT así preparado se
aísla utilizando el QIAquick Gel Extraction Kit, después de
separación en un gel de agarosa al 1%.
El vector pNUT-GDX se obtiene
mediante ligamiento del fragmento derivado de PCR
"Mega-primer" en el vector pNUT en presencia
de ADN ligasa T_{4}, como se describe anteriormente, y selección
basándose en los perfiles de restricción de BamHI, XmaI, PstI o
EcoRI de los constructos que contienen el inserto en la orientación
correcta.
En el factor X nativo (y también en el derivado
GDX-FX), la secuencia de los restos
P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}'
que encuadran el sitio de escisión (teniendo lugar la escisión entre
P_{1} y P_{1}') es LTR-IVG.
Los seis análogos de factor X preparados:
GDX-IVG, GDX-IFG,
GDX-AVG, GDX-IFR,
GDX-SVG, GDX-SFR tienen
respectivamente la secuencia
P_{3}-P_{2}-P_{1}-P_{1}'-P_{2}'-P_{3}':
VPR-IVG, VPR-IFG,
VPR-IFR, VPR-AVG,
VPR-SVG y VPR-SFR.
Los vectores que expresan estos análogos de
factor X se prepararon mediante mutagénesis del vector
pNUT-GDX mediante un procedimiento derivado del de
Jones et al., (Nature, 344, 793-794,
1990).
Las secuencias de los cebadores utilizados para
la mutagénesis del vector pNUT-GDX se indican en la
Tabla IV (SEC Nº ID 19 a SEC Nº ID 30).
El cebador "con sentido" (s) hibrida en la
cadena de no codificación, y el cebador "sin sentido" (a)
hibrida en la cadena de codificación.
La mutagénesis se lleva a cabo mediante PCR en un
volumen de 50 \mul que contiene 50 ng (0,2 nM) de
pNUT-GDX como matriz, 125 ng (70 nM) de cada cebador
(con sentido y sin sentido, véase la Tabla 4), una mezcla equimolar
(0,5 mM) de cada dNTP y 2,5 unidades de Pfu polimerasa en el tampón
recomendado por el fabricante, utilizando un DNA Thermal Cycler 480
(Perkin Elmer). La PCR comprende una etapa inicial de
desnaturalización a 95ºC durante 5 minutos, seguida de 16 ciclos
idénticos que están constituidos cada uno por 45 segundos de
desnaturalización a 95ºC, 60 segundos de hibridación a 55ºC y 26
minutos de elongación a 68ºC. Al final de estos 16 ciclos, el vector
que ha servido como matriz se degrada a 37ºC durante 60 minutos con
10 unidades de DpnI.
Las bacterias DH5\alpha, convertidas en
competentes mediante lavado a 4ºC con CaCl_{2} 100 mM, se
transforman con 5 a 10 \mul del producto de PCR digerido con DpnI;
se seleccionan las colonias que han incorporado un plásmido viable y
se verifican la orientación y la secuencia del inserto.
Se expresaron las proteínas recombinantes en
células de riñón de hámster recién nacido (BHK-21)
proporcionadas por la European Collection of Cell Cultures
(Sofia-Antipolis, Francia).
Se cultivan las células BHK-21 en
placas Petri (80 mm de diámetro) en un incubador a 37ºC en atmósfera
de CO_{2} al 5% en medio DMEM completo (medio Eagle modificado
por Dulbecco) (GIBCO BRL) suplementado con 10% de suero fetal de
ternero (GIBCO BRL), L-glutamina 2 mM (GIBCO BRL),
100 unidades/ml de penicilina (GIBCO BRL) y estreptomicina 100
\mug/ml (GIBCO BRL). Cuando alcanzan aproximadamente 80% de
confluencia, se aclaran las células dos veces con tampón PBS
(solución salina tamponada con fosfato, GIBCO BRL) y después se
incuban a 37ºC durante 1 hora en 4 ml de OPTI-MEM
(GIBCO BRL).
Se lleva a cabo la transfección añadiendo el
vector de expresión 40 nM para el derivado de factor X deseado (40
\mug en un volumen de 220 \mul ajustado con agua destilada) a
250 \mul de una solución a un pH de exactamente 7,05, que está
constituido por Hepes 50 mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM, NaCl 280 mM,
KCl 10 mM y dextrosa 12 mM. La coprecipitación del ADN se obtiene
añadiendo gota a gota 31 \mul de CaCl_{2} 2,5 M y con agitación
constante. Después de incubación durante 30 minutos a temperatura
ambiente, se añade el precipitado al medio que cubre las células y
se deja sedimentar durante 3 horas a 37ºC. Se lavan las células con
PBS (para retirar la mayoría del precipitado) y se devuelven al
cultivo en medio DMEM completo durante 24 horas a 37ºC.
Se separan las células de la placa Petri con 2 ml
de una solución de EDTA 54 mM, pH 8,0, que contiene tripsina 0,5
mg/mol, se resuspenden en el medio de selección (DMEM completo que
contiene metotrexato 50 mg/l (TEVA, Courbevoie, Francia)) y se
vuelven a sembrar en dos nuevas placas Petri. Se renueva el medio de
cultivo cada dos días durante 2 a 3 semanas, hasta que se obtienen
colonias. Se aíslan estas colonias y se transfieren a los pocillos
(2 cm^{2}) de una placa de cultivo de 24 pocillos, donde se
multiplican hasta confluencia en el medio de selección.
La detección de los clones que expresan
establemente un derivado de factor X se lleva a cabo mediante
inmunotransferencia.
Se añade una alícuota (30 \mul) de sobrenadante
de cultivo de células BHK-21, que ha permanecido en
contacto con las células transfectadas durante al menos 48 horas, a
10 \mul de Tris-HCl 100 mM, pH 6,8, que contiene
40% (v/v) de glicerol, 8% (p/v) de SDS, 0,04% (p/v) de azul de
bromofenol y 20% (v/v) de \beta-mercaptoetanol. Se
desnaturalizan las proteínas en la muestra a 95ºC durante 5 minutos
y se separan en un gel de poliacrilamida al 12% (reticulación 29/1)
en tampón Tris 25 mM, pH 7,5, que contiene glicina 0,1 M y 0,1%
(p/v) de SDS.
La electroforesis es seguida por transferencia a
membrana de nitrocelulosa (Trans-Blot,
Bio-Rad, Ivry Sur Seine, Francia) en tampón
Tris-HCl 25 mM, glicina 0,1 M, pH 7,5, que contiene
20% de metanol. La membrana se satura mediante incubación durante 1
hora a temperatura ambiente en una solución de 5% (p/v) de leche
desnatada en tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 150 mM,
0,1% de Tween 20 (TTBS), y después se lava 3 veces durante 10
minutos en el mismo tampón. Se incuba después la membrana durante 1
a 12 horas en presencia del anticuerpo monoclonal 9E10 50 ng/ml en
TTBS. Después de tres lavados (como anteriormente), se incuba la
membrana durante una hora a temperatura ambiente en presencia de un
anticuerpo policlonal de cabra IgG anti-ratón
marcado con fosfatasa alcalina (Bio-Rad) diluido a
1/3.000 en TTBS. Se revela la presencia de proteína recombinante
mediante incubación de la membrana en presencia de un sustrato
cromogénico (mezcla en cantidades iguales de fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo,
sal de p-toluidino (BCIPT) y cloruro de
nitrotetrazolio (NTC), diluida en tampón Tris 0,1 M, pH 9,5, que
contiene MgCl_{2} 0,5 M).
Se amplifican los clones que expresan el derivado
de factor X deseado más fuertemente y se conservan congelando en
nitrógeno líquido (aproximadamente 10^{6} células en 1 ml de suero
fetal de ternero a las que se ha añadido 10% (v/v) de DMSO).
La producción de derivados de factor X se lleva a
cabo en medio de selección que contiene cinc 50 \muM (para
inducción del promotor de metalotioneína) y, para los clones que
expresan el derivado recombinante de FX que poseen un dominio Gla,
vitamina K_{1} 5 mg/ml (Roche, Neuilly sur Seine, Francia) para
permitir la \gamma-carboxilación postraduccional.
Se multiplican las células mediante pasadas sucesivas en matraces de
150 cm^{2} que se utilizan para inocular botellas de 850 cm^{2}.
Se recogen los sobrenadantes de cultivo cada 2 a 6 días (dependiendo
de la densidad celular), se clarifican mediante centrifugación
durante 10 minutos a 5.000 g y se conservan a -20ºC, después de la
adición de EDTA 5 mM y benzamidina 10 mM.
Se llevó a cabo la purificación de los derivados
en dos o tres etapas, dependiendo del derivado referido.
La primera etapa es común a todas las
purificaciones: implica una adsorción sobre resina de intercambio
aniónico para concentrar las proteínas contenidas en el sobrenadante
de cultivo.
Se diluyen los sobrenadantes de cultivo a 1/3 en
Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene benzamidina 10 mM y EDTA 5 mM.
Típicamente, se diluyen 2 litros de sobrenadante en 4 litros de
tampón, se añaden 4,5 g de QAE-Sephadex A50
(Amersham Pharmacia Biotech) y se agita lentamente la mezcla durante
30 minutos a temperatura ambiente (utilizando un agitador de palas
rotatorio). Se permiten sedimentar las perlas de Sephadex durante
una hora y se desecha el sobrenadante.
Se transfiere la resina cargada a una columna, y
se eluyen las proteínas adsorbidas con tampón Tris 50 mM, pH 7,5,
que contiene NaCl 0,5 M.
La segunda etapa es una cromatografía de afinidad
que posibilita separar el derivado de factor X de las demás
proteínas contenidas en el eluato de
QAE-Sephadex.
El derivado de FX recombinante se purifica
mediante cromatografía de afinidad sobre un gel
Affi-Prep HZ (Bio-Rad) injertado con
3 mg del anticuerpo monoclonal 9E10 por ml de gel. Después de cargar
la columna con el eluato de QAE-Sephadex y lavar con
tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M, se eluye el
derivado de FX recombinante con tampón HCl-glicina
0,1 M, pH 2,7. Se ajusta el pH del eluato a 7,5 añadiendo 30
\mul/mol de Tris 2 M, y se reequilibra la columna en tampón de
lavado.
La columna de afinidad injertada con el
anticuerpo 9E10 tiene la desventaja de tener una baja capacidad y
de requerir elución en medio desnaturalizante. Es necesaria en este
caso una tercera etapa de purificación, mediante cromatografía de
intercambio aniónico de alta resolución, para retirar el agente
desnaturalizante y concentrar el derivado eluído de la columna.
Se reúnen varios eluatos de la columna de
afinidad, por un total de 2 a 10 mg de derivado de FX recombinante,
se diluyen a ¼ con tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene EDTA 5
mM, y se cargan en una columna Q-Sepharose Fast Flow
(0,8 x 10 cm) (Amersham Pharmacia Biotech). Después de lavar con
tampón de dilución, se eluye la columna en tampón Tris 50 mM, pH
7,5, que contiene NaCl 0,5 M.
Los derivados de factor X que carecen del dominio
Gla, que portan en su extremo N-terminal el epítope
reconocido por el anticuerpo HPC-4, se purificaron
sobre una columna de afinidad injertada con este anticuerpo. Ya que
el anticuerpo HPC-4 es dependiente de calcio, la
columna puede eluirse mediante lavado en presencia de un quelante de
calcio, que no desnaturaliza la proteína. El derivado de factor X
así purificado puede utilizarse directamente.
En este caso, el eluato de
QAE-Sephadex se recalcifica anteriormente a 5 mM
añadiendo CaCl_{2}. Se lava la columna con tampón Tris 50 mM, pH
7,5, que contiene NaCl 0,5 M y CaCl_{2} 1 mM, y se eluye el factor
X con tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 100 mM y EDTA 5
mM.
En total, se prepararon un mínimo de 10 mg de
cada uno de los derivados de factor X.
Independientemente del protocolo utilizado, se
controla la pureza de la preparación, después de desnaturalización y
reducción de una muestra, mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida (12%, reticulación 29/1) y tinción con azul de
Coomasie.
Todas las preparaciones obtenidas parecen ser
puras sobre un gel de SDS-poliacrilamida, pero están
presentes sistemáticamente dos formas: una forma bicatenaria
principal (80 a 90%) con masas moleculares aparentes compatibles con
las esperadas para las cadenas pesada y ligera (50 y 23 kDa para el
FX recombinante; 50 y 18 kDa para los derivados que carecen del
dominio Gla); una forma monocatenaria minoritaria (10 a 20%,
dependiendo de las preparaciones), con una masa molecular de 66 kDa
para el FX recombinante y 60 kDa para los derivados que carecen del
dominio Gla.
El porcentaje de forma monocatenaria parece
depender más del conjunto de sobrenadantes del que deriva la
preparación que de la mutación introducida: para una mutación dada,
el porcentaje de forma monocatenaria varía de una purificación a
otra.
Los derivados purificados se dividen en alícuotas
y se almacenan a -80ºC hasta el uso. Se estima la concentración de
la alícuota mediante su absorbancia a 280 nm, tomando 1,25
g^{-1}cm^{-1} como el coeficiente de absorción molar
(\varepsilon%_{280}).
El factor X nativo puede activarse sólo por sus
activadores fisiológicos (complejos de tenasa o factor tisular) y
por ciertos venenos de serpiente, siendo el más habitualmente
utilizado el extracto de veneno de víbora de Russell
(RVV-X). El dominio Gla del factor X desempeña un
papel muy importante en esta activación: la velocidad de activación
del factor X normal que carece del dominio Gla es de promedio
aproximadamente cien veces más lenta que la del factor X
completo.
El FX recombinante se comporta esencialmente como
factor X plasmático, excepto porque una porción (que está
\gamma-carboxilada incorrectamente por las células
BHK-21) es difícil de activar y es sólo ligeramente
activa en el complejo de protrombinasa. Los derivados de factor X
que carecen del dominio Gla permanecen escindibles (lentamente) por
el activador de veneno de serpiente aislado y (en cierta medida) por
los complejos fisiológicos.
Se ensayó la capacidad de los derivados que
carecen del dominio Gla de escindirse por la trombina.
Se utilizaron dos procedimientos para evaluar la
velocidad de escisión de los derivados de factor X por trombina,
dependiendo de si esta escisión genera o no una actividad
amidolítica detectable. En el primer caso, se mide la actividad
amidolítica generada por el factor activado y, en el segundo caso,
se cuantifica la forma escindida mediante electroforesis.
Se determinan las constantes de velocidad para la
activación de los derivados de factor X por trombina en condiciones
de seudo-primer orden, concretamente, la
concentración del zimógeno es al menos igual a 0,1 veces la
concentración para semisaturación del activador (su K_{m}). En
estas condiciones, la constante de velocidad medida es directamente
proporcional a la constante de especificidad (k_{cat}/K_{m}) del
activador (trombina) por su sustrato (el zimógeno derivado de factor
X). Sin conocer el valor de la K_{m}, es posible verificar que la
condición de seudo-primer orden se respeta midiendo
la velocidad de activación a dos concentraciones de sustrato: la
constante de velocidad medida debería ser la misma (permitiendo el
error experimental) para las dos concentraciones de zimógeno.
Se incuba cada derivado de factor X (entre 1 y 10
\muM) en presencia de trombina (100 nM) en tampón cinético (Tris
50 mM, pH 7,8 que contiene NaCl 150 mM, 0,2% de PEG 8000 (p/v) y
CaCl_{2} 5 mM) a 37ºC. Después de variar los tiempos de
incubación, se muestrea una alícuota de 10 \mul, a la que se
añaden hirudina (Refludan, Hoechst, Frankfurt, Alemania) 1 \muM
(100 unidades por ml) (para detener la reacción neutralizando la
trombina). Se estima la cantidad de forma activa generada por la
actividad amidolítica del derivado activado. Después de haber
añadido
N-\alpha-Z-Arg-Gly-Arg-pNA
100 \muM (S2765, Biogenic, Maurin, Francia), se mide la actividad
amidolítica registrando la variación de absorbancia a 405 nm en
función del tiempo (la velocidad inicial de hidrólisis de S2765)
utilizando un lector de microplacas MR5000 (Dynex, Guyancourt,
Francia). Antes de la adición de trombina, la velocidad de
hidrólisis de S2765 es cero, puesto que el derivado de factor X está
enteramente en forma de zimógeno. Al representar la velocidad
inicial de hidrólisis de S2765 en función del tiempo de incubación
del zimógeno con trombina, se obtiene una curva que posibilita, por
regresión no lineal, estimar la constante de velocidad para la
activación del zimógeno (k) utilizando la ecuación 1 que representa
un aumento exponencial de primer orden:
(ecuación
1)V_{t}= V_{0} + V_{máx}
(1-exp^{(-kt)})
en la que V_{t} representa la
velocidad de hidrólisis del sustrato cromogénico en el tiempo t,
V_{0} la velocidad de hidrólisis del sustrato cromogénico a
tiempo cero (normalmente cero) y V_{máx} la velocidad de
hidrólisis del sustrato cromogénico a tiempo infinito (cuando todo
el zimógeno está activado). Si la condición de
seudo-primer orden se respeta, el valor de k es
igual a la concentración del activador (trombina) multiplicado por
la k_{cat}/K_{m} de la reacción de activación de zimógeno. Por
lo tanto, este procedimiento posibilita comparar la capacidad de la
trombina de activar los derivados de factor X que generan actividad
amidolítica después de la activación. Este procedimiento es
aplicable independientemente de la actividad amidolítica generada,
siendo la única condición que pueda medirse una actividad
catalítica: es de hecho lo mismo que medir el porcentaje de
activación en función del
tiempo.
Como alternativa, si no es detectable actividad
catalítica, se detecta la capacidad de la trombina de escindir el
derivado de factor X en gel de SDS-poliacrilamida.
La incubación del zimógeno sustrato con su activador se lleva a cabo
en las mismas condiciones de seudo-primer orden que
anteriormente. Después de variar los tiempos de incubación, se toma
una alícuota de 20 \mul, y se analiza mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida (12%, reticulación 29/1) después de
desnaturalización y reducción de la muestra.
Después de teñir con azul de Coomasie, se examina
el gel y se estima la intensidad de cada banda de migración con
software de formación de imágenes (Scion-Image,
disponible en la dirección http://www.scioncorp.com).
Este procedimiento posibilita evaluar, para cada
muestra, el porcentaje de cada forma de derivado de factor X
(monocatenaria inactiva, bicatenaria inactiva, activada en forma
\alpha, activada en forma \beta). Al representar la intensidad
de las bandas correspondientes a las formas activadas en función del
tiempo de incubación del zimógeno con trombina, se obtiene una curva
que posibilita, mediante regresión no lineal, estimar la constante
de velocidad para la activación del zimógeno (k) utilizando la
ecuación 1, en la que V_{t}, V_{0} y V_{máx} son,
respectivamente, reemplazados por: la intensidad de la banda a
tiempo t, a tiempo cero (normalmente cero) y a tiempo infinito
(cuando está activado 100% del zimógeno). Si la condición de
seudo-primer orden se respeta, el valor de k es
igual a la concentración del activador (trombina) multiplicada por
el k_{cat}/K_{m} para la reacción de activación de zimógeno. En
la práctica, es más fiable evaluar la desaparición del zimógeno con
el tiempo. Al representar la intensidad de las bandas
correspondientes a las formas de zimógeno en función del tiempo de
incubación con trombina, se obtiene una curva que posibilita,
mediante regresión no lineal, utilizar la ecuación 2 inferior
(representante de una reducción exponencial de primer orden), para
estimar la constante de velocidad del zimógeno:
(ecuación
2)d_{t}= d_{0} + d_{min}
exp^{(-kt)}
En esta ecuación, d_{t} representa la densidad
a tiempo t, d_{0} la densidad a tiempo cero (que está al máximo)
y d_{min} la densidad a tiempo infinito (que es cero cuando todo
el zimógeno está activado). Si la condición de
seudo-primer orden se respeta, el valor de k es
igual a la concentración del activador (trombina) multiplicada por
el k_{cat}/K_{m} para la reacción de activación de zimógeno.
Este procedimiento es aplicable independientemente del factor X
considerado, pero es menos exacta que el procedimiento
cromogénico.
Se dan los resultados en la Tabla V.
Se da el valor de k_{cat}/K_{m} para la
activación de cada derivado de factor X por trombina, así como el
error estándar (expresado como porcentaje del valor obtenido).
\vskip1.000000\baselineskip
| Derivado | k_{cat}/K_{m} (M^{-1}s^{-1}) |
| GD-FX | ND |
| GDX-IVG | <1 |
| GDX-IFG | <1 |
| GDX-AVG | 1 x 10^{2} (\pm9%) |
| GDX-IFR | ND |
| GDX-SVG | <1 |
| GDX-SFR | 4 x 10^{3} (\pm27%) |
Como su homólogo en plasma normal, el FX
recombinante no es escindible detectablemente por trombina (ND),
como con el derivado GD-FX. Por otro lado, el
derivado GDX-SFR se escinde muy rápidamente por
trombina: el valor de k_{cat}/K_{m} es 4 x 10^{3}
M^{-1}s^{-1}; sin embargo, el derivado escindido carece de
actividad amidolítica. El derivado GDX-SVG es
también escindido por trombina, pero no genera actividad amidolítica
detectable tampoco. El valor de k_{cat}/K_{m} para la escisión
del derivado GDX-AVG por trombina es 10^{2}
M^{-1}s^{-1}, y el derivado activado tiene actividad amidolítica
fácilmente detectable. Los otros derivados de factor X
(GDX-IVG, GDX-IFG y
GDX-IFR) parecen ser escindibles por trombina, pero
la reacción es demasiado lenta para que sea posible estimar
fiablemente el valor de k_{cat}/K_{m}.
Para caracterizar más concienzudamente la
actividad catalítica (después de escisión) de cada uno de los
derivados de factor X, se activaron y purificaron varios miligramos
de cada derivado.
Los derivados de factor X que portan en posición
P_{3}, P_{2} y P_{1} de su sitio de activación la secuencia
LTR (FX recombinante y derivado GD-FX) no son
escindibles por trombina. Se activaron pasándolos por una columna
HITRAP activada con NHS (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech)
injertada, a 5 mg/ml de gel, con activador veneno de víbora de
Russell aislado (RVV-X) (Kordia, Leiden, Holanda).
Se introducen 4 mg de derivado de factor X en tampón Tris 50 mM, pH
7,5, que contiene NaCl 150 mM, CaCl_{2} 5 mM y 0,2% (p/v) de PEG
8000 en la columna injertada con RW-X. Se cierra la
columna por ambos extremos y se mantiene la incubación durante 16
horas a temperatura ambiente. Se eluye el derivado activado con Tris
50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M y CaCl_{2} 5 mM. El eluato
contiene principalmente la forma activada, pero la activación no es
siempre completa. Para enriquecer el eluato en forma activada, se
diluye a 1/3 en Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene CaCl_{2} 5 mM
(para reducir la fuerza iónica), se carga en 1 ml de columna HITRAP
heparina-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech) y se
eluye con tampón Tris 50 mM, pH 7,5, que contiene NaCl 0,5 M y
CaCl_{2} 5 mM.
Los otros derivados de factor X, que pueden
activarse (incluso lentamente) por trombina, se activaron todos
pasándolos por una columna HITRAP activada con NHS (1 ml) (Amersham
Pharmacia Biotech) injertada, a 1 mg/ml de gel, con trombina. Las
condiciones de incubación (concentración, tampón, temperatura y
duración) son las mismas que para la activación mediante pasada a
través de la columna injertada con RVV-X, así como
la elución de la columna y la purificación de la forma activada del
derivado en heparina-Sepharose.
La secuencia N-terminal de la
cadena pesada producida mediante la activación de los diversos
derivados de factor X se determinó mediante microsecuenciación.
Cada secuencia obtenida corresponde inequívocamente al extremo
N-terminal esperado para la cadena pesada de la
forma activada del derivado considerado (IVG, IFG, IFR, AVG, SVG o
SFR) después de escisión entre los restos P_{1} y P_{1}' del
sitio de activación.
Los clorometilcetonapéptidos son inhibidores
irreversibles de serinproteasa que forman un complejo equimolecular
y covalente con su diana. La velocidad de interacción de un
clorometilcetonapéptido con una proteasa depende de la secuencia que
precede al grupo clorometilcetona. Estos inhibidores posibilitan de
hecho evaluar la integridad del sitio activo de la diana: la
constante de velocidad para la reacción (la k_{on}) es de hecho
una firma que es específica de cada par inhibidor/proteasa. Uno de
los clorometilcetonapéptidos más reactivos con la forma activada del
factor X es
D-Phe-Phe-Arg-CH_{3}Cl
(D-FFR-CK, comercializado por
Calbiochem, Meudon, Francia). Cuando la reacción se lleva a cabo en
condiciones de seudo-primer orden, la k_{on} puede
estimarse incluso si la concentración precisa de la diana no es
conocida. Una vez es conocida la k_{on}, es posible predecir las
condiciones experimentales que posibilitarán titular exactamente la
concentración de sitio activo para la proteasa (véase a
continuación). Esta titulación es un requisito previo para una
verdadera caracterización funcional.
Se incuba una cantidad de la forma activada del
derivado de factor X suficiente para obtener una actividad
amidolítica fácilmente detectable en un volumen de reacción de 10
\mul, durante un periodo de tiempo dado, en presencia de una
concentración fija de D-FFR-CK en
tampón cinético a 25ºC. La concentración de los reactivos es de
hecho muy variable: de 30 nM a 1,8 \muM de forma activada (según
la absorbancia a 280 nm), dependiendo del derivado de factor X, para
tener una actividad amidolítica fácilmente detectable (10% de
hidrólisis del sustrato cromogénico en 30 minutos). La concentración
de D-FFR-CK añadida debería ser
mucho mayor que la de su diana, de tal modo que la reacción ocurra
en condiciones de seudo-primer orden. Sin embargo,
la concentración de D-FFR-CK no
debería ser demasiado alta, de otro modo la reacción es demasiado
rápida. Típicamente, se utilizan tres concentraciones de
D-FFR-CK, que corresponden a 10, 20
y 40 veces la de la diana (estimada por su absorbancia a 280 nm). Se
repite el mismo experimento doce veces, variando el tiempo de
incubación de un experimento a otro (de 10 segundos para el primero
a 5 horas para el último, de tal modo que el tiempo de incubación
para un experimento dado sea igual al doble del experimento
precedente). Al final de cada incubación, se añaden 190 \mul de
S2765 100 \muM en tampón cinético, y se mide la actividad
amidolítica residual registrando la variación de absorbancia a 405
nm en función del tiempo (concretamente, la velocidad inicial de
hidrólisis de S2765) utilizando un lector de microplacas MR5000. Al
representar la velocidad de hidrólisis de S2765 en función del
tiempo de incubación del inhibidor con su diana, se obtiene una
curva que posibilita, mediante regresión no lineal, utilizar la
ecuación 2 para estimar la constante de velocidad para la
inactivación de la forma activada del derivado de factor X. Los
parámetros d_{t}, d_{0} y d_{min} de la ecuación 2
representan, en este caso, la actividad residual a tiempo t, la
actividad inicial (que está al máximo) y la actividad a tiempo
infinito (que es normalmente cero). Si la condición de
seudo-primer orden se respeta, el valor obtenido
para k es igual a la concentración de inhibidor multiplicada por su
k_{on} para la enzima.
Los valores de k_{on} de
D-FFR-CK para las formas activadas
de los derivados de factor X obtenidos se resumen en la Tabla VI,
así como el error estándar (expresado como el porcentaje del valor
obtenido). La k_{on} para los derivados que carecen de actividad
catalítica no puede determinarse mediante el procedimiento utilizado
(ND).
\vskip1.000000\baselineskip
| Derivado | k_{on} (M^{-1}s^{-1}) |
| FX plasmático | 2304 (\pm1%) |
| GD-FX | 2233 (\pm3%) |
| GDX-IVG | 2250 (\pm4%) |
| GDX-IFG | 104 (\pm4%) |
| GDX-AVG | 2 (\pm10%) |
| GDX-IFR | ND |
| GDX-SVG | ND |
| GDX-SFR | ND |
Los valores de k_{on} de la forma activada del
derivado de FX recombinante, de la forma activada del derivado
GF-FX y de la forma activada del derivado
GDX-IVG son todos similares a los obtenidos con la
forma activada del factor X plasmático. Este resultado se esperaba:
los zimógenos de estos derivados de factor X difieren por la
presencia o ausencia de un dominio Gla y también por los restos
P_{3} y P_{2} cadena arriba del sitio de activación, pero el
dominio catalítico del producto de su activación es idéntico.
El valor de k_{on} para la forma activada del
derivado GDX-IFG es 20 veces menor; esto sugiere que
el surco catalítico de este derivado de factor X no está conservado
estrictamente por la mutación. El valor de la k_{on} para la forma
activada del derivado GDX-AVG es 1.000 veces menor.
Los derivados de factor X que, después de la escisión, carecen de
actividad amidolítica detectable (GDX-IFR,
GDX-SVG y GDX-SFR) no pueden
analizarse mediante este procedimiento.
La concentración de sitio activo para la forma
activada de derivados del factor X es un valor que es esencial
determinar para poder evaluar la actividad catalítica eficaz de cada
mutante. La absorbancia a 280 nm misma posibilita calcular la
concentración de proteasa purificada, pero no proporciona la
proporción de muestra que está en forma activa. Por otro lado, la
titulación posibilita estimar la concentración de forma activa,
independientemente del porcentaje de forma zimogénica residual o de
la actividad intrínseca del mutante comparada con la proteasa
normal.
Un procedimiento muy exacto para titular
serinproteasas está basado en el uso de un clorometilcetonapéptido,
a condición de que la enzima tenga una actividad catalítica
mensurable y que pueda predecirse la semivida de la reacción de la
sustancia de titulación con su diana. Tres de las formas activadas
de derivados de factor X satisfacen estos criterios, y se titularon
mediante este procedimiento: midiendo la actividad amidolítica
residual después de incubación con concentraciones crecientes de
inhibidor. El clorometilcetonapéptido utilizado es
D-FFR-CK, cuya k_{on} para cada
diana se determinó anteriormente.
Se incuban concentraciones crecientes de
D-FFR-CK, de entre 20 nM y 12
\muM, con una cantidad fija (0,5 a 1 \muM) de la forma activa
del derivado de factor X para titular en tampón cinético a 25ºC. Se
mantiene la incubación hasta que se completa la reacción:
concretamente, se cubre un mínimo de 10 semividas (la semivida de la
reacción es igual al logaritmo natural de 2 dividido entre el
producto de la k_{on} y la concentración del inhibidor). Al final
de esta incubación, se añaden 190 \mul de S2765 100 \muM en
tampón cinético y se mide la actividad amidolítica residual
registrando la variación de absorbancia a 405 nm en función del
tiempo (concretamente, la velocidad inicial de hidrólisis de S2765)
utilizando un lector de microplacas MR5000. Al representar la
velocidad de hidrólisis de S2765 en función de la concentración de
D-FFR-CK, se obtiene una línea recta
para la que la abscisa en el origen corresponde a la concentración
inicial de enzima activa (Le Bonniec et al., Biochemistry,
33, 3959-3966, 1994).
La forma activada del derivado
GDX-AVG no podía titularse mediante este
procedimiento debido a que el valor de la k_{on} de
D-FFR-CK (2 M^{-1}s^{-1}) es
demasiado bajo para poder acabar la reacción en una cantidad
razonable de tiempo: en presencia de
D-FFR-CK 1 \muM, sería necesario
mantener la reacción durante 15 días para cubrir aproximadamente 10
semividas, mientras que la estabilidad de
D-FFR-CK no supera las 48 horas a pH
7,5. Las formas "activadas" de derivados del factor X que
carecen de actividad amidolítica detectable
(GDX-IFR, GDX-SVG y
GDX-SFR) no podían titularse tampoco utilizando
D-FFR-CK. Para estos derivados, se
estimó simplemente el porcentaje de forma activa mediante
densitometría después de electroforesis en gel de poliacrilamida
(12%, reticulación 29/1), después de desnaturalización y reducción
de la muestra (como se describe anteriormente para identificar los
clones BHK-21 productores de un derivado de factor
X). Después de teñir con azul de Coomasie, se examina el gel y se
compara la intensidad de las bandas correspondientes a las cadenas
pesadas \alpha y \beta activadas con la de las formas no
escindidas residuales utilizando el software de análisis
Scion-Image. Este procedimiento posibilita evaluar
el porcentaje de forma activada de cada alícuota de derivado de
factor X. Al comparar este porcentaje de formas activadas con la
concentración total estimada mediante la absorbancia a 280 nm, se
deduce a partir de ella la concentración eficaz de formas \alpha y
\beta activadas.
Este procedimiento es más laborioso que el
precedente, pero suficientemente fiable para poder realizar una
caracterización funcional de los mutantes referidos.
La actividad amidolítica de las serinproteasas
implica sólo a su surco catalítico y a su sistema de relé de carga.
Se mide utilizando sustratos sintéticos constituidos por un pequeño
péptido que porta, en C-terminal, un grupo
para-nitroanilida; durante la hidrólisis de estos sustratos,
se libera para-nitroanilina (pNA), que es fácilmente
detectable a 405 nm. Estos péptidos permiten una caracterización muy
fina de la maquinaria catalítica de una proteasa: la k_{cat} y la
K_{m} para la hidrólisis de uno de estos sustratos constituye aquí
de nuevo una firma que es única para cada par enzima/sustrato. Por
lo tanto, medir la actividad amidolítica de las formas activadas de
los derivados de factor X posibilita detectar si su maquinaria
catalítica se alteró o no. Se utilizaron dos sustratos cromogénicos
para este análisis: S2765 y
bencil-CO-Ile-Glu-(\gamma-OR)-Gly-Arg-pNA
(S2222) comercializados por Biogenic.
Los valores de k_{cat} y K_{m} de las formas
activadas de los derivados de factor X se determinan en tampón
cinético a 25ºC. Se incuban concentraciones variables (de entre 6 y
800 \muM) con una cantidad fija de la forma activada del derivado
de factor Xa (10 nM a 0,5 \muM, dependiendo de la forma activada
del derivado de factor X, de tal modo que al menos un 10% del
sustrato cromogénico se hidroliza en 30 minutos). La variación de
absorbancia a 405 nm en función del tiempo se registra utilizando un
lector de microplacas MR5000, y la velocidad inicial de hidrólisis
se estima mediante regresión lineal (sólo las absorbancias
correspondientes como máximo a un 15% de hidrólisis del sustrato se
tienen en cuenta para el análisis). Los valores de k_{cat} y
K_{m} se estiman mediante regresión no lineal de la variación en
la velocidad inicial de hidrólisis en función de la concentración
inicial de sustrato, utilizando la ecuación de
Michaelis-Menten.
Se dan en la Tabla VII los valores de k_{cat} y
K_{m} y de la relación k_{cat}/K_{m} de S2222 y S2765, y
también el error estándar (expresado como un porcentaje del valor
obtenido) para las formas activadas de derivados de factor X.
Estas constantes no pueden estimarse para los
derivados que carecen de actividad amidolítica detectable (ND).
| Bencil-CO-Ile-Glu-(\gamma-OR)-Gly-Arg-pNA (S2222) | |||
| Derivado | K_{m} (\muM) | k_{cat} (s^{-1}) | k_{cat}/K_{m} (M^{-1}s^{-1}) |
| FX plasmático | 260 (\pm15%) | 79 (\pm6%) | 3 x 10^{5} |
| FX recombinante | 210 (\pm5%) | 59 (\pm2%) | 3 x 10^{5} |
| GD-FX | 480 (\pm5%) | 68 (\pm2%) | 1 x 10^{5} |
| GDX-IVG | 410 (\pm6%) | 107 (\pm3%) | 3 x 10^{5} |
| GDX-IFG | 1500 (\pm8%) | 8 (\pm5%) | 5 x 10^{3} |
| GDX-AVG | 1300 (\pm28%) | 1 (\pm17%) | 5 x 10^{2} |
| GDX-IFR | ND | ND | ND |
| GDX-SVG | ND | ND | ND |
| GDX-SFR | ND | ND | ND |
| N-\alpha-Z-Arg-Glu-Arg-pNA (S2765) | |||
| Derivado | K_{m} (\muM) | k_{cat} (s^{-1}) | k_{cat}/K_{m} (M^{-1}s^{-1}) |
| FX plasmático | 90 (\pm24%) | 182 (\pm7%) | 2 x 10^{6} |
| FX recombinante | 65 (\pm6%) | 126 (\pm2%) | 2 x 10^{6} |
| GD-FX | 80 (\pm14%) | 89 (\pm4%) | 1 x 10^{6} |
| GDX-IVG | 75 (\pm14%) | 153 (\pm4%) | 2 x 10^{6} |
| GDX-IFG | 820 (\pm6%) | 61 (\pm3%) | 7 x 10^{4} |
| GDX-AVG | 3750 (\pm21%) | 19 (\pm18%) | 5 x 10^{3} |
| GDX-IFR | ND | ND | ND |
| GDX-SVG | ND | ND | ND |
| GDX-SFR | ND | ND | ND |
Los valores de k_{cat} y K_{m} para la forma
activada del derivado FX recombinante, aquellos de la forma
activada de FX recombinante que carece de dominio Gla y aquellos del
derivado GDX-IVG, son similares a los obtenidos
para la forma activada de factor X plasmático (difieren como máximo
por un factor de dos). Además del epítope
C-terminal, el dominio catalítico que se forma
durante la activación de estos derivados de factor X es idéntico;
por tanto, como para la k_{on} de
D-FFR-CK, se esperaba que sus
actividades amidolíticas fueran al menos comparables. Es interesante
observar que la ausencia del dominio Gla no tiene influencias
notables sobre la actividad amidolítica de la forma activada del
derivado; esto sugiere que no influye en la estructura del surco
catalítico de la forma activada de factor X. En comparación, el
valor de k_{cat} de la forma activada del derivado
GDX-IFG se reduce (10 veces para S2222 y 3 veces
para S2765); el valor de K_{m} se reduce similarmente (5 a 10
veces). Globalmente, la k_{cat}/K_{m} para estos sustratos
cromogénicos es de 30 a 50 veces menor que para la forma activada de
factor X normal, una reducción que es por lo tanto del mismo orden
de magnitud que la observada para la k_{on} de
D-FRR-CK (2 veces). La reducción del
valor de k_{cat} de la forma activada del derivado
GDX-AVG es en mucha mayor proporción
(aproximadamente 100 veces para S2222, aproximadamente 10 veces para
S2765) que el aumento en la K_{m} (5 veces mayor para S2222, 40
veces mayor para S2765). Globalmente, la k_{cat}/K_{m} para
estos sustratos cromogénicos es 400 a 600 veces menor que para la
forma activada de factor X normal; estos valores están de acuerdo
con la reducción observada para la k_{on} de
D-FFR-CK (1000 veces).Estos
resultados confirman que las mutaciones portadas por los derivados
GDX-IFG y GDX-AVG inducen claramente
modificaciones estructurales en el surco catalítico y/o alteran la
actividad del sistema de relé de carga.
El factor Xa nativo no es una enzima muy activa
comparada con tripsina o trombina. Fisiológicamente, es sólo cuando
la enzima se une a su cofactor (factor de coagulación Va), en
presencia de fosfolípidos y calcio, cuando la reacción de activación
de protrombina se vuelve muy rápida (la reacción es miles de veces
más rápida en presencia de los cofactores que en su ausencia). Sin
embargo, la actividad en el complejo de protrombinasa depende en
gran medida de la presencia de un dominio Gla; sin él, la velocidad
aumenta como máximo sólo 50 veces. Sin embargo, esta diferencia es
más que suficiente para posibilitar detectar si la forma activada de
los derivados de factor X interacciona o no con el factor Va, y
especialmente si el cofactor posibilita o no que se active
eficazmente la protrombina. Por lo tanto, los inventores han
comparado la velocidad de activación de la protrombina por cada una
de las formas activadas de los derivados de factor X, en presencia
así como en ausencia de factor Va, de fosfolípidos y de calcio.
El efecto cofactor del factor Va (Kordia) se
estudia en un sistema purificado estrictamente controlado: la
protrombina en particular se immunopurifica (Le Bonniec et al.,
J. Biol. Chem., 266, 13796-13803, 1991; Le
Bonniec et al., 1992, citado anteriormente) para liberar de
cualquier traza de forma activada (de factor X o de trombina). La
activación de esta protrombina se detecta mediante la formación de
la trombina que resulta a partir de la misma. La reacción se sigue
continuamente en virtud de la presencia en el medio de reacción de
un sustrato cromogénico,
H-D-Phe-Pip-Arg-PNA
(S2238, Biogenic), que es mucho más sensible a la trombina que la
forma activada de factor X. A tiempo cero, no hay trombina y hay
sólo una hidrólisis insignificante de S2238 por la forma activada
del derivado de factor X. Durante la reacción, la concentración de
trombina aumenta de manera lineal con el tiempo (cuando la reacción
para activación de protrombina por la forma activada del derivado
de factor X está en estado estacionario). La velocidad de hidrólisis
de S2238 es directamente proporcional a la concentración de
trombina, pero ésta aumenta con el tiempo. Por lo tanto, la
velocidad de escisión no es constante; va cada vez más rápida: la
reacción acelera. Es posible mostrar (Kosow, Thromb. Res.
Suppl. 4, 219-227, 1974) que la cantidad de pNA
liberada por el S2238 hidrolizado (por lo tanto la absorbancia a 405
nm de la mezcla) es proporcional al coeficiente de aceleración de la
reacción multiplicado por el tiempo al cuadrado; siendo el
coeficiente de aceleración mismo directamente proporcional a la
velocidad inicial de formación de trombina. En la práctica, se
preincuban 195 \mul de tampón cinético que contiene S2238 100
\muM, protrombina 0,5 \muM y vesículas fosfolipídicas 35 \muM
(mezcla de fosfatidilserina y fosfatidilcolina en una proporción de
20%-80% p/p), en presencia o ausencia de factor Va 20 nM a 37ºC en
una placa de microtitulación. Se desencadena la reacción añadiendo
la forma activada del derivado de factor X 2,5 nM (5 \mul a 50
nM), y se registra la variación de la absorbancia a 405 nm en
función del tiempo utilizando un lector de microplacas MR5000. Al
representar la absorbancia a 405 nm en función del tiempo de
incubación, se obtiene una curva que posibilita, mediante regresión
no lineal, estimar c, el coeficiente de aceleración de la reacción,
utilizando la ecuación 3:
(ecuación
3)A_{405}: A_{0} + bt +
ct^{2}
en la que A_{0} representa la
absorbancia inicial de la mezcla a 405 nm (antes de la adición de la
enzima) y b la velocidad de hidrólisis de S2238 por la forma
activada del derivado de factor X (que es insignificante en la
práctica). Si la reacción para activación de protrombina por la
forma activada del derivado de factor X está en estado estacionario,
y si la concentración residual de S2238 no hidrolizado sigue siendo
mucho mayor que su K_{m} por trombina (3,6 \muM), el parámetro
c es eficazmente proporcional a la velocidad inicial de activación
de la protrombina por la forma activada del derivado de factor X.
Para satisfacer estas condiciones, sólo se tienen en cuenta los
puntos experimentales correspondientes a menos de 15% de hidrólisis
de cada sustrato (protrombina y S2238) para análisis mediante
regresión no lineal. Este enfoque no posibilita estimar las
constantes catalíticas para la activación de protrombina por la
forma activada de los derivados de factor X; sólo posibilita, cuando
la reacción se lleva a cabo en condiciones idénticas, comparar la
actividad de las dos enzimas (aquí la actividad de cada forma
activada de los derivados de factor X se compara con la de la forma
activada que carece de dominio Gla que sirve como
referencia).
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla
VIII.
Se indican los coeficientes de aceleración de la
liberación de pNA por la trombina generada por el complejo de
protrombinasa (+ factor Va) o por el derivado de factor X activado
solo (- factor Va), junto con el error estándar (expresado como un
porcentaje del valor obtenido).
| Derivado | + factor Va | - factor Va |
| GD-FX | 4,2 x 10^{-4} (\pm2%) | 8,8 x 10^{-6} (\pm2%) |
| GDX-IVG | 1,1 x 10^{-4} (\pm1%) | 2,8 x 10^{-5} (\pm2%) |
| GDX-IFG | 4,9 x 10^{-6} (\pm1%) | 1,0 x 10^{-7} (\pm2%) |
| GDX-AVG | 3,1 x 10^{-5} (\pm1%) | 9,6 x 10^{-7} (\pm2%) |
| GDX-IFR | 3,3 x 10^{-6} (\pm1%) | ND |
| GDX-SVG | ND | ND |
| GDX-SFR | ND | ND |
En presencia de fosfolípidos y calcio (pero en
ausencia de factor Va), la activación de la protrombina es muy
lenta y difícil de detectar, incluyendo por la forma activada de
factor X que carece del dominio Gla o la de su derivado
GDX-IVG; la adición de factor Va aumenta la
velocidad de activación de la protrombina 50 veces y 10 veces,
respectivamente. En ausencia de factor Va, la activación de la
protrombina no es detectable por ninguna de las otras formas
activadas de derivados del factor X (GDX-AVG,
GDX-IFG, GDX-IFR,
GDX-SVG y GDX-SFR). La adición de
factor Va posibilita aumentar considerablemente la velocidad de
activación de la protrombina por la forma activada del derivado
GDX-IVG; ésta es entonces sólo 13 veces menor que la
obtenida por la forma activada de su homólogo no mutado
(GDX-IVG). Por lo tanto, parece que el factor Va
restaura en gran medida la actividad catalítica de la forma activada
del derivado GDX-AVG ya que, comparado con su
homólogo no mutado, las muestras de surco catalítico
(D-FFR-CK, S2765 y S2222) reflejan
una eficacia de catálisis que se reduce en al menos 400 veces. Con
las otras formas activadas de los derivados de factor X
(GDX-IFG, GDX-IFR,
GDX-SVG y GDX-SFR), la adición de
factor Va está lejos de tener dicho efecto: sigue sin hacer posible
detectar ninguna activación de la protrombina (ND).
El inhibidor plasmático más potente de la forma
activada de factor X es el inhibidor de la ruta de factor tisular
(TFPI); el valor de su k_{on} para la interacción con la forma
activada de factor X es mayor de 10^{5} M^{-1}s^{-1}. Sin
embargo, la concentración plasmática de TFPI (2,5 nM) significa que
este inhibidor desempeña un papel relativamente minoritario en la
inhibición de la forma activada de factor X (su diana fisiológica
es más bien el factor de coagulación VIIa).
La antitrombina (sola) es un inhibidor
relativamente menos potente, ya que el valor de su k_{on} para la
interacción con la forma activada de factor X es sólo del orden de
10^{4} M^{-1}s^{-1}. Sin embargo, la concentración plasmática
de antitrombina (2,3 \muM) la hace el inhibidor fisiológico
principal del factor Xa; a esta concentración, la semivida
plasmática de la forma activada de factor X sería sólo de 30
segundos (se ha medido experimentalmente un minuto, véase a
continuación). En particular, en presencia de heparina, el valor de
la k_{on} de antitrombina para la interacción con la forma
activada del factor X supera 10^{6} M^{-1}s^{-1},
concretamente, para una concentración plasmática de antitrombina de
2,3 \muM, la neutralización de la proteasa aparece en unos pocos
segundos (la semivida sería entonces de sólo 0,3 segundos). Por lo
tanto, era esencial determinar la k_{on} de la interacción de
antitrombina con las formas activadas de los derivados de factor X,
ya que cualquier aumento de la semivida plasmática prolongaría la
acción procoagulante del derivado de factor X, y por lo tanto
potenciaría su efecto antihemofílico.
Los inventores determinaron la capacidad de cada
forma activada de los derivados de factor X de formar un complejo
covalente estable con antitrombina. Estimaron también el valor de la
k_{on} de antitrombina (en presencia y ausencia de heparina) para
las formas activadas de derivados de factor X que tienen actividad
amidolítica detectable (derivado que carece del dominio Gla, y
derivados GDX-IVG, GDX-IFG y
GDX-AVG).
La demostración de complejos covalentes entre la
forma activada de los derivados de factor X (1 \muM) y la
antitrombina (2 \muM, purificada a partir de plasma humano según
la técnica descrita por McKay (Thromb. Res. 21,
375-382, 1981)) se lleva a cabo en presencia de 2
unidades/ml de heparina (Kordia). La incubación se mantiene durante
1 hora a 25ºC y la mezcla de reacción se analiza mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida (10%, reticulación 29/1),
después de desnaturalización y reducción de la muestra. Después de
teñir con azul de Coomasie, la presencia de complejos covalentes
entre la forma (inactivada) del derivado de factor X y la
antitrombina da como resultado una reducción de la intensidad de la
banda correspondiente a la antitrombina (60 kDa), una reducción de
la intensidad de la banda correspondiente a la forma activada del
derivado de factor X (31 kDa), y la aparición de una nueva banda de
mayor peso molecular (aproximadamente 100 kDa) correspondiente al
complejo covalente.
Los resultados se dan en la Figura 3.
Carriles 1 y 8: antitrombina sola; carriles 2 y
3: derivado GDX-IVG sin y con antitrombina; carriles
4 y 5: derivado GDX-IFG sin y con antitrombina;
carriles 6 y 7: derivado GDX-IFR sin y con
antitrombina; carriles 9 y 10: derivado GDX-SVG sin
y con antitrombina; carriles 11 y 12: derivado
GDX-SFR sin y con antitrombina; carriles 13 y 15:
derivado GDX-AVG sin y con antitrombina.
La formación de un complejo da como resultado la
aparición de una banda de alto peso molecular (carriles 3, 5, 7, 10
y 14) que está ausente cuando la antitrombina (carriles 1 y 8) o una
de las formas activadas de los análogos de factor X (carriles 2, 4,
6, 9, 11, 13) se utilizan solos. Un solo análogo de factor X
(GDX-SFR, carril 12) no permite la formación de un
complejo covalente detectable.
Todas las formas activadas de los derivados de
factor X (excepto el derivado GDX-SFR) son por lo
tanto capaces, en presencia de heparina, de formar un complejo
covalente estable con antitrombina, incluyendo el derivado
GDX-SVG, que sin embargo está desprovisto de
actividad catalítica detectable.
El procedimiento seleccionado para estimar la
k_{on} de la antitrombina para la forma activada del derivado de
factor X depende de la semivida de los reactivos. El procedimiento
no es igual dependiendo de si la semivida es mayor de 3 minutos,
entre 15 segundos y 3 minutos o menor de 15 segundos. La reacción
debe llevarse a cabo (a menos que sea imposible, véase a
continuación) en condiciones de seudo-primer orden:
concretamente la concentración del inhibidor (antitrombina) debe ser
como mínimo 10 veces la de su diana (la forma activada del derivado
de factor X). Además, la concentración de la diana debe ser
suficiente para poder detectar fácilmente su actividad amidolítica
residual (10 nM a 1 \muM, dependiendo de la forma activada del
derivado de factor X de tal modo que, idealmente, se hidrolice un
10% del sustrato cromogénico en 30 minutos). Estas dos limitaciones
limitan considerablemente la elección de la concentración de los
reactivos: la concentración de antitrombina debe ser al menos de 0,1
a 10 \muM (dependiendo de la diana). La semivida de la diana
(igual al logaritmo natural de 2 dividido entre el producto de la
concentración del inhibidor y su k_{on} para la diana) determina
el procedimiento a utilizar. Para semividas mayores de tres minutos,
el procedimiento utilizado es el mismo que el descrito para estimar
la k_{on} de D-FFR-CK: consiste en
determinar la actividad residual contenida en alícuotas tomadas a
tiempos variados, de modo que se cubran aproximadamente diez
semividas. Para concentraciones de antitrombina entre 0,1 y 10
\muM, este enfoque posibilita estimar sólo valores de k_{on} que
son como máximo iguales a 2 x 10^{4} M^{-1}s^{-1}. Cuando la
semivida de la reacción es menor de tres minutos, la medida por
lotes de la actividad residual (mediante muestreo de alícuotas) se
vuelve difícil de poner en práctica. En este caso, aún con
concentraciones de antitrombina entre 0,1 y 10 \muM (por lo tanto,
valores de k_{on} mayores de 2 x 10^{4} M^{-1}s^{-1}), la
reacción es seguida continuamente en virtud de la presencia en el
medio de reacción de S2765. La velocidad de hidrólisis de S2765 es
directamente proporcional a la concentración residual de la forma
activada de factor X. A tiempo cero, la actividad amidolítica está
al máximo, ya que no ha aparecido todavía inhibición. Si las
condiciones de seudo-primer orden se respetan, la
concentración de la forma activada del derivado de factor X se
reduce con el tiempo, según un exponencial decreciente de primer
orden. La velocidad de escisión no es constante: se retarda hasta
convertirse en cero (cuando se ha neutralizado toda la diana). Es
posible mostrar (Cha, Biochem. Pharmacol., 24,
2177-2185, 1975; Stone y Hofsteenge,
Biochemistry, 25, 4622-4628, 1986) que la
cantidad de pNA liberada por la hidrólisis de S2765 (por lo tanto
la absorbancia a 405 nm de la mezcla de reacción) aumenta según un
aumento exponencial de primer orden que puede analizarse mediante
regresión no lineal utilizando la ecuación 4:
(ecuación
4)A_{405} \approx A_{0} + V_{i}
(1-exp^{(-Ikt)})/k
en la que A_{0} representa la
absorbancia inicial a 405 nm, V_{i} la velocidad de hidrólisis de
S2765 en ausencia de antitrombina, I la concentración de
antitrombina y k la constante de velocidad de
seudo-primer orden para la reacción de inhibición.
Durante la reacción, el inhibidor está en competición con el
sustrato por la interacción con la enzima; por tanto, el valor de la
k_{on} de antitrombina para la forma activada del derivado de
factor X está relacionada con k por la
ecuación:
(ecuación
5)k_{on}= k
(1+s/k_{m})
en la que S representa la
concentración inicial de sustrato cromogénico (S2765) y K_{m} su
constante de Michaelis por la forma activada del derivado de factor
X (determinada durante la caracterización de la actividad
amidolítica). Este procedimiento posibilita medir semividas del
orden de 15 segundos, concretamente, estimar valores de k_{on}
como máximo iguales a 2 x 10^{5} M^{-1}s^{-1} (para
concentraciones de antitrombina entre 0,1 y 10 \muM). Para
concentraciones de formas activadas de derivados de factor X entre
10 nM y 1 \muM, cuando la semivida de la reacción es menor de 15
segundos, la amplitud de la señal (la absorbancia a 405 nm) es
demasiado pequeña para permitir una medida continua fiable de la
actividad residual (aumentar la concentración de la enzima
requeriría que la antitrombina aumentara para respetar la condición
de seudo-primer orden y, por lo tanto, la semivida
se reduciría adicionalmente). Por tanto, cuando la k_{on} es mayor
de 2 x 10^{5} M^{-1}s^{-1}, la reacción no se lleva a cabo ya
en condiciones de seudo-primer orden, sino en
condiciones de segundo orden. La condición de
seudo-primer orden significa que la concentración de
antitrombina permanece (aparentemente) constante a lo largo de la
reacción; este es el caso cuando está en gran exceso comparada con
la diana. Si la concentración del inhibidor es menos de 10 veces
mayor que la de su diana, la reducción de la concentración del
inhibidor (mediante la formación de un complejo con su diana) no
puede ya ignorarse. Durante la reacción, las concentraciones del
inhibidor y de su diana varían ambas con el tiempo, lo que complica
en gran medida el análisis. Sin embargo, sigue siendo posible
obtener una amplitud de señal suficiente y seguir la cinética de la
inhibición en presencia de un sustrato cromogénico en condiciones de
segundo orden. Es posible mostrar que, en este caso, la absorbancia
a 405 nm de la mezcla de reacción aumenta según una curva que puede
analizarse mediante regresión no lineal utilizando la ecuación 6,
denominada "inhibición de unión estrecha lenta" (Cha, 1975,
citado anteriormente; Biochem. Pharmacol., 25,
2695-2702, 1976; Williams y Morrison, Methods
Enzymol. 63, 437-467,
1979):
(ecuación 6)P =
V_{s}t + (V_{0}-V_{s})
(1-d)/(dk')ln\{(1-d
exp^{(-k't)})/(1/d)
en la que P representa la
concentración de pNA liberada en el tiempo t (directamente
proporcional a la absorbancia a 405 nm), V_{0} la velocidad de
hidrólisis de S2765 en ausencia de inhibidor y V_{s} la velocidad
final de hidrólisis de S2765 (cuando la reacción ha terminado). Los
parámetros d y k' mismos dependen de dos parámetros (F_{1} y
F_{2}) de tal modo
que:
d = (F_{1} -
F_{2})/(F_{1} +
F_{2})
k' =
kF_{2};
F_{1} =
K_{I}' + I +
E;
F_{2} =
(F_{1}^{2} -
4EI)^{1/2}.
En estas ecuaciones, I representa la
concentración inicial de antitrombina, E la de diana y K_{1}' la
constante de inhibición aparente para la interacción. La k_{on} de
la antitrombina para la forma activada del derivado de factor X está
relacionada con k (que tiene el mismo significado que en la ecuación
4) mediante la relación dada en la ecuación 5.
El procedimiento de muestreo por lotes de
alícuotas se utiliza para estimar la k_{on} de la antitrombina
para la forma activada del derivado GDX-AVG (en
presencia y en ausencia de heparina).
La reacción se lleva a cabo en tampón cinético
que contiene albúmina bovina exenta de proteasa 1 mg/ml (Sigma, St.
Quentin-Fallavier, Francia) y, cuando sea apropiado,
2 unidades por ml de heparina (Kordia). En un volumen de reacción de
10 \mul, se incuba una cantidad suficiente de la forma activada
del derivado GDX-AVG (0,5 \muM en presencia de
heparina, 1 \muM en su ausencia) en presencia de un gran exceso de
antitrombina (5 \muM en presencia de heparina, 10 \muM en su
ausencia) durante una cantidad de tiempo variable a 25ºC. Se repite
el mismo experimento doce veces, variando el tiempo de incubación de
un experimento a otro (de 10 segundos para el primero a 5 horas para
el último, de tal modo que el tiempo de incubación para un
experimento dado sea igual al doble del precedente). Al final de
cada incubación, se añaden 190 \mul de S2765 (200 \muM en tampón
cinético) y se mide la actividad amidolítica residual registrando la
variación de absorbancia a 405 nm en función del tiempo
(concretamente, la velocidad inicial de hidrólisis de S2765)
utilizando un lector de microplacas MR5000. Representando la
velocidad de hidrólisis de S2765 en función del tiempo de incubación
del inhibidor con su diana, se obtiene una curva que posibilita,
mediante regresión no lineal utilizando la ecuación 2, estimar la
constante de velocidad para inactivación de la forma activada del
derivado de factor X. Los parámetros d_{t}, d_{0} y d_{min} de
la ecuación 2 representan respectivamente: la actividad residual a
tiempo t, la actividad inicial (que está al máximo) y la actividad a
tiempo infinito (que es habitualmente cero). Si la condición de
seudo-primer orden se respeta, el valor obtenido
para k es igual a la concentración del inhibidor multiplicada por la
k_{on} de la reacción para inactivación de la forma activada del
derivado de factor X.
El procedimiento mediante registro continuo de la
absorbancia a 405 nm en condiciones de seudo-primer
orden se utiliza para estimar (en ausencia de heparina) la k_{on}
de la antitrombina para la forma activada del derivado de factor X
que carece de dominio Gla, y las de las formas activadas de los
derivados GDX-IVG y GDX-IFG.
Las cinéticas se estudian a 25ºC, en tampón
cinético que contiene albúmina bovina exenta de proteasa 1 mg/ml, y
se siguen continuamente en virtud de la presencia en el medio de
reacción de S2765 100 \muM. La reacción se lleva a cabo en una
microplaca, en un volumen de 200 \mul, si la amplitud de la señal
posibilita seguir la cinética con un lector de placa. Si no es éste
el caso, la reacción se lleva a cabo en una microcubeta de 600
\mul y la cinética se sigue utilizando un espectrofotómetro
(Lambda 14, Perkin-Elmer (Courtaboeuf, Francia)).
La reacción se desencadena añadiendo la forma activada del derivado
de factor X 10 a 25 nM (idealmente de tal modo que, en ausencia de
inhibidor, se hidrolice un 10% del sustrato cromogénico en 60
minutos). Para cada forma activada de derivado de factor X, la
reacción se lleva a cabo en presencia de tres concentraciones de
antitrombina, iguales a 10, 20 y 40 veces la concentración de la
diana. Al representar la absorbancia a 405 nm en función del tiempo,
se obtiene una curva que posibilita, mediante regresión no lineal
utilizando la ecuación 4 (que representa un crecimiento exponencial
de primer orden), estimar la constante de velocidad para la
inactivación de la forma activada del derivado de factor X. Si la
condición de seudo-primer orden se respeta, la
k_{on} de la antitrombina para la forma activada del derivado de
factor X está dada por la ecuación 5, que tiene en consideración la
competición introducida por el sustrato durante la
cinética.
cinética.
\newpage
En presencia de heparina, si las condiciones de
seudo-primer orden se respetan, las semividas de la
forma activada del derivado de factor X que carece de dominio Gla,
y también las de las formas activadas de los derivados
GDX-IVG y GDX-IFG son menores de 15
segundos. Reducir las concentraciones de antitrombina y las de su
diana podría posibilitar respetar la condición de
seudo-primer orden aumentando al mismo tiempo la
semivida, pero se reduciría la amplitud de la señal; entonces, la
sensibilidad del espectrofotómetro se vuelve insuficiente para
seguir la cinética continua cuando la amplitud es sólo de unas pocas
miliunidades de absorbancia. En consecuencia, la cinética de la
inhibición por antitrombina, en presencia de heparina, de la forma
activada del derivado de factor X que carece de dominio Gla, y
también de las formas activadas de los derivados
GDX-IVG y GDX-IFG, es seguida en
condiciones de segundo orden.
Las cinéticas se estudian a 25ºC en tampón
cinético que contiene albúmina bovina exenta de proteasa 1 mg/ml y
2 unidades por ml de heparina; son seguidas continuamente en virtud
de la presencia en el medio de reacción de S2765 400 \muM. La
reacción se lleva a cabo en una microcubeta en un volumen de 600
\mul, siguiendo la cinética utilizando un espectrofotómetro Lambda
14. La reacción se desencadena mediante la adición de la cantidad
mínima de forma activada de derivado de factor X que sea compatible
con una señal fiable (1 a 2,5 nM dependiendo del derivado de tal
modo que, en ausencia de inhibidor, se hidrolice aproximadamente un
10% del sustrato cromogénico en 60 minutos). Para cada forma
activada de derivado de factor X, la reacción se lleva a cabo en
presencia de dos concentraciones de antitrombina, iguales a 2 y 3
veces la concentración de la diana. Al representar la absorbancia a
405 nm en función del tiempo, se obtiene una curva que posibilita,
mediante regresión no lineal utilizando la ecuación 6, estimar la
constante de velocidad de segundo orden para la reacción. La
k_{on} de la antitrombina para la forma activada del derivado de
factor X está dada por la ecuación 5, que tiene en consideración la
competición introducida por el sustrato durante la cinética.
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla
IX. Se indican los valores de k_{on} (en M^{-1}s^{-1}) de la
antitrombina en presencia de heparina (+heparina) o en su ausencia
(-heparina), junto con el error estándar (expresado como un
porcentaje del valor obtenido).
| Derivado | k_{on} (M^{-1}s^{-1}) | |
| - heparina | + heparina | |
| GD-FX | 1,2 x 10^{4} (\pm4%) | 1,3 x 10^{7} (\pm1%) |
| GDX-IVG | 5,8 x 10^{3} (\pm3%) | 2,0 x 10^{7} (\pm1%) |
| GDX-IFG | 1,8 x 10^{2} (\pm2%) | 7,6 x 10^{5} (\pm1%) |
| GDX-AVG | 10,0 (\pm17%) | 3,0 x 10^{2} (\pm6%) |
| GDX-IFR | ND | ND |
| GDX-SVG | ND | ND |
| GDX-SFR | ND | ND |
En ausencia de heparina, los valores de k_{on}
de la antitrombina para la forma activada del derivado de factor X
que carece de dominio Gla y la forma activada del derivado
GDX-IVG son similares (difieren como máximo por un
factor de dos). En comparación, el valor de la k_{on} de la
antitrombina para la forma activada del derivado
GDX-IFG es 66 veces menor. En particular, el valor
de la k_{on} para la forma activada del derivado
GDX-AVG es más de 1.000 veces menor que el de su
homólogo no mutado (la inhibición es, de hecho, difícil de
detectar). En presencia de heparina, el valor de k_{on} de la
antitrombina para los derivados activados de factor X aumenta 1.000
a 4.000 veces mientras que, incluso en presencia de heparina, la
k_{on} de la antitrombina para la forma activada del derivado
GDX-AVG no supera 3 x 10^{2} M^{-1}s^{-1}.
Esta importante observación sugiere que, después de la activación,
el derivado GDX-AVG podría permanecer activo durante
mucho más tiempo que su homólogo no mutado (su semivida plasmática
podría ser de varias horas en ausencia de heparina, 17 minutos en su
presencia).
La k_{on} de la antitrombina para la forma
activada de derivados de factor X sugiere que la semivida plasmática
de la forma activada del derivado GDX-AVG podría
extenderse considerablemente, lo que reforzaría su potencial
antihemofílico. Para verificar esta hipótesis, los inventores
determinaron la semivida plasmática de la forma activada de cada uno
de los derivados de factor X.
Se estima la semivida plasmática de las formas
activadas de derivados de factor X midiendo su actividad residual
después de incubación durante una cantidad variable de tiempo en un
conjunto de plasmas humanos normales. Para evitar la formación de un
coágulo, se vuelve no coagulable el conjunto de plasma añadiendo
hirudina 0,8 \muM (80 unidades por ml) antes de recalcificar
(añadiendo CaCl_{2} 8 mM). La mezcla de reacción está constituida
por 80% (v/v) de plasma y 20% (v/v) de tampón cinético que contiene
hirudina, calcio y la forma activada de uno de los derivados de
factor X a una concentración suficiente para permitir su detección
(concentración final 20 a 300 nM). Después de variar los tiempos de
incubación, se retira una alícuota (40 \mul) y se mide la
actividad amidolítica residual, después de haber añadido 160 \mul
de S2765 (1 mM para la forma activada del derivado
GDX-AVG, 100 \muM para las demás formas activadas
de derivados de factor X), registrando la variación en la
absorbancia a 405 nm en función del tiempo (velocidad de hidrólisis
inicial de S2765) utilizando un lector de microplacas MR5000. La
constante de velocidad por la reducción de actividad se estima
mediante regresión no lineal de la variación de la actividad
residual en función del tiempo utilizando la ecuación 2, en la que
d_{t}, d_{0} y d_{min} representan la actividad residual a
tiempo t, la actividad inicial (que está al máximo) y la actividad a
tiempo infinito (que está al mínimo), respectivamente. Aunque la
hirudina neutraliza cualquier traza de trombina, la actividad mínima
no es cero ni siquiera si se neutraliza toda la forma activada de
factor X: el ruido de fondo viene de otras proteasas contenidas en
el plasma, capaces de hidrolizar lentamente S2765. Si la condición
de seudo-primer orden se respeta, la semivida
plasmática es igual a la relación del logaritmo natural de 2 entre k
(la constante de velocidad para reducción). La semivida plasmática
observada no depende de la concentración de la diana ni de la
amplitud de la actividad amidolítica medida, depende sólo de la
concentración inicial del inhibidor contenido en el plasma (y, por
supuesto, de su reactividad con respecto a la diana): si la
antitrombina es realmente el inhibidor plasmático principal
implicado, la condición de seudo-primer orden se
respeta ya que, durante toda la incubación, permanece en gran exceso
(1,8 \muM) comparado con su diana.
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla
X. Se dan los valores de semivida (en minutos) de la forma activada
de derivados de factor X en presencia de heparina (+heparina) o en
su ausencia (-heparina), así como el error estándar (expresado como
un porcentaje del valor obtenido). La semivida de las formas
activadas de derivados que carecen de actividad amidolítica
detectable no se determinó (ND).
| Derivado | Semivida (minutos) | |
| - heparina | + heparina | |
| GD-FX | 1,1 (\pm2%) | < 0,5 |
| GDX-IVG | 1,1 (\pm19%) | < 0,5 |
| GDX-IFG | 12,5 (\pm5%) | < 0,5 |
| GDX-AVG | > 60 | 5,5 (\pm19%) |
| GDX-IFR | ND | ND |
| GDX-SVG | ND | ND |
| GDX-SFR | ND | ND |
En ausencia de heparina, la semivida plasmática
de la forma activada de factor X que carece de dominio Gla y de la
forma activada del derivado GDX-IVG son comparables
(un minuto); en presencia de heparina, la semivida plasmática de
estas formas activadas es demasiado corta para medirse fiablemente.
En ausencia de heparina, la semivida de la forma activada del
derivado GDX-AVG está notablemente extendida: es 55
veces más larga que la de la forma activada de factor X que carece
de dominio Gla. El aumento de la semivida plasmática en presencia de
heparina es también notable, ya que puede medirse fácilmente (5
minutos y 30 segundos), al contrario que su homólogo no mutado. La
semivida plasmática de la forma activada del derivado
GDX-IFG está también extendida (12 veces comparada
con la forma activada del factor X que carece de dominio Gla). La
semivida plasmática de las demás formas activadas de derivados de
factor X (que carecen de actividad amidolítica) no pueden estimarse
mediante el procedimiento utilizado.
Se ensayó la actividad procoagulante de las
formas activadas de los derivados de factor X en plasmas que simulan
hemofilia A o B grave. Estos plasmas se obtienen agotando el factor
VIII o IX de un plasma normal y se comportan, in vitro, como
plasmas auténticos de hemofílicos. Los análogos de factor X
ensayados (GDX-IVG, GDX-IFG,
GDX-AVG, GDX-IFR,
GDX-SFR, GDX-SVG) carecen todos de
dominio Gla. En plasma normal, la acción procoagulante del factor X
que carece de dominio Gla es mucho menor que la del factor X normal,
porque el dominio Gla contribuye a la actividad del complejo de
protrombinasa.
La actividad procoagulante de estos derivados de
factor X no puede ser comparable con la del factor X normal. De
hecho, cualquier derivado de factor X que carece de dominio Gla es
un inhibidor del complejo de protrombinasa; específicamente, compite
con la forma activada de factor X plasmático que, teniendo su
dominio Gla, es mucho más activo. En otras palabras, en un plasma
normal, la adición de cualquier derivado de factor X que carece de
dominio Gla retarda la formación de un coágulo en lugar de
promoverla.
El hecho de que la actividad procoagulante de los
derivados que carecen de dominio Gla sea mucho menor que la del
factor X normal no evita, sin embargo, que se hagan comparaciones
entre estos derivados. Específicamente, la contribución del dominio
Gla a la actividad procoagulante es uniforme independientemente del
derivado: es independiente de su actividad catalítica. Un derivado
de factor X que, comparado con el derivado normal, reduce el
"tiempo de coagulación" (tiempo necesario para que el plasma
pierda su fluidez) refleja por lo tanto una mejor actividad
procoagulante; un aumento del tiempo de coagulación indica, por otro
lado, que el derivado es menos activo que su homólogo normal. Por lo
tanto, se comparó la actividad procoagulante de los derivados de
factor X (activados o no) con la del homólogo normal que carece de
dominio Gla (GD-FX).
La adición de la forma activada de un derivado de
factor X a plasma de un hemofílico no ensaya la ciclación de la
activación de protrombina: refleja sólo la capacidad del derivado
activado de funcionar en condiciones cercanas a las encontradas
in vivo. En ausencia de factor tisular y de factor VIII o IX,
no tiene lugar amplificación de la cascada de coagulación, sólo la
forma activada del derivado de factor X posibilita la formación de
trombina y, en consecuencia, la formación de un coágulo. El estudio
de la actividad en el complejo de protrombinasa (véase el ejemplo 5)
muestra que la adición de factor V activado restaura la actividad
catalítica de la forma activada del análogo GDX-AVG;
es entonces sólo 13 veces menor que la de su homólogo no mutado
(GDX-IVG). Este efecto está lejos de ser tan marcado
con las demás formas activadas de análogos de factor X
(GDX-IFG, GDX-IFR,
GDX-SVG y GDX-SFR). El uso de plasma
con factor VIII o factor IX agotado posibilita estudiar la posible
interferencia con otros factores de coagulación, en particular el
efecto de los mecanismos regulatorios (antitrombina, etc.).
El efecto procoagulante de la forma activada de
los derivados de factor X se detecta mediante la capacidad de
inducir la formación de un coágulo en un plasma con factor VIII o
factor IX agotado (Diagnostica Stago, Asnières, Francia). Al añadir
factor tisular a uno de estos plasmas, es posible desencadenar la
formación de suficiente trombina para inducir la formación de un
coágulo, pero el tiempo de coagulación es extremadamente largo y no
puede medirse mediante procedimientos convencionales. Por tanto, la
reacción se lleva a cabo en una microplaca, y la formación de
coágulo es seguida por turbidimetría, registrando la densidad óptica
a 405 nm en función del tiempo (independientemente de la longitud de
onda, la absorbancia aumenta con la turbidimetría). La formación de
coágulo, que es relativamente brusca, está precedida por un periodo
de latencia más o menor largo: típicamente la turbidimetría sigue
una curva sigmoidea en función del tiempo. El tiempo necesario para
alcanzar un 50% de la turbidimetría máxima es representativo del
"tiempo de coagulación" de ensayos de coagulación
convencionales.
En la práctica, se preincubaron 100 \mul de
plasma con factor VIII o factor IX agotado en una microplaca a
25ºC, y se desencadenó la reacción añadiendo 100 \mul de tampón
cinético que contenía CaCl_{2} 20 mM y derivado de factor X
activado 200 nM. Se registra la variación de la absorbancia a 405 nm
en función del tiempo utilizando un lector de microplaca MR5000. Al
representar la variación de la absorbancia a 405 nm en función del
tiempo, se obtiene una curva que posibilita, mediante regresión no
lineal, estimar el tiempo de coagulación (V_{50}) utilizando la
ecuación de Boltzmann 7:
(ecuación
7)A_{405} = A_{min} + (A_{max} -
A_{min})/(1+e^{((V_{50}-t)/pendiente)})
en la que A_{405} representa la
absorbancia a 405 nm a tiempo t, A_{min} la absorbancia inicial a
405 nm y A_{máx} la absorbancia final a 405 nm (después de la
formación del coágulo). La pendiente es un parámetro que tiene en
cuenta la naturaleza relativamente breve de la fase ascendente en la
formación del coágulo (la pendiente aumenta a medida que se reduce
el periodo de
latencia).
Los resultados obtenidos se resumen en la Tabla
XI.
Se indica el tiempo de coagulación (en minutos)
de un plasma con factor VIII agotado (-factor VIII) o factor IX
agotado (-factor IX) después de la adición de la forma activada de
uno de los derivados de factor X, así como el error estándar
(expresado como un porcentaje del valor obtenido). Más allá de 50
minutos, el valor de tiempo de coagulación no es ya fiable
(<50).
| Derivado | Tiempo de coagulación (minutos) | |
| - factor VIII | - factor IX | |
| GD-FX | 10,5 (\pm1%) | 6,5 (\pm3%) |
| GDX-IVG | 12,6 (\pm3%) | 6,7 (\pm1%) |
| GDX-IFG | >50 | 22,9 (\pm1%) |
| GDX-AVG | 10,9 (\pm3%) | 7,4 (\pm3%) |
| GDX-IFR | >50 | >50 |
| GDX-SVG | >50 | >50 |
| GDX-SFR | >50 | >50 |
La forma activada del derivado
GD-FX y la del derivado GDX-IVG
tienen un marcado efecto procoagulante.
Además, se confirma el potencial de la forma
activada del derivado GDX-AVG: en plasma con factor
VIII o factor IX agotado, este derivado acorta el tiempo de
coagulación tanto como la forma activada del derivado
GD-FX. Lo mismo no es cierto para la forma activada
del derivado GDX-IFG: su actividad procoagulante en
plasma con factor IX agotado es detectable, pero este derivado sigue
siendo incapaz de inducir la formación de un coágulo en menos de 50
minutos en un plasma con factor VIII agotado. Las formas activadas
de derivados de factor X que carecen de actividad catalítica
detectable (GDX-SFR, GDX-SVG y
GDX-IFR) no tienen actividad procoagulante
detectable.
Sin factor tisular no hay formación de coágulo,
tanto si el plasma es de un hemofílico como si no: la cascada de
coagulación no se inicia. Un plasma normal coagula, por otro lado,
muy rápidamente tras la adición de factor tisular; el de un
hemofílico eventualmente también coagula, porque el complejo de
coagulación extrínseco (formado entre el factor tisular y el factor
VIIa) activa el factor X que, en el complejo de protrombinasa
(formado con factor V activado) activa la protrombina a trombina,
que eventualmente escinde suficiente fibrinógeno para formar un
coágulo. La reacción es mucho más lenta porque no hay amplificación
que implique al complejo de tenasa. La presencia de un factor X
activable por trombina debería reestablecer una amplificación de la
generación de trombina: estarían disponibles dos activadores: el
complejo de factor tisular con factor VIIa como anteriormente, pero
también la trombina. A medida que aumenta la concentración de
trombina, se activan más y más derivados de factor X, lo que genera
más trombina y por tanto la amplificación.
Un derivado de factor X que carece de dominio Gla
no posibilita realmente ensayar su potencial antihemofílico, ya que
su acción procoagulante está limitada en cualquier caso. Sin
embargo, es posible verificar si, en presencia de dicho derivado,
tiene lugar una amplificación de la formación de trombina después de
la adición de factor tisular.
El procedimiento utilizado para detectar el
efecto procoagulante de derivados de factor X (no activados) es muy
similar al descrito para detectar la actividad de sus formas
activadas. La diferencia principal es que la reacción se inicia
añadiendo una mezcla de factor tisular y fosfolípidos (además del
hecho de que estos derivados no están preactivados). Como para el
estudio de las formas activadas, la reacción se lleva a cabo en una
microplaca a 25ºC, y la formación de coágulo es seguida por
turbidimetría, registrando la densidad óptica a 405 nm en función
del tiempo. Es la capacidad de los derivados de factor X de acortar
el tiempo de coagulación de un plasma con factor VIII o factor IX
agotado lo que se estudia.
En la práctica, el derivado de factor X (0,5
\muM) se añade a 100 \mul de plasma con factor VIII o factor IX
agotado, y se desencadena la reacción añadiendo 100 \mul de tampón
cinético que contiene CaCl_{2} 20 mM y factor tisular
recombinante 2 pM mezclado con fosfolípidos (Innovin, Dade Behring,
La Défense, Francia). Se registra la variación en la absorbancia a
405 nm en función del tiempo utilizando un lector de microplaca
MR5000, y se estima el tiempo necesario para alcanzar la mitad de la
turbidimetría máxima mediante regresión no lineal utilizando la
ecuación 7 como se describe anteriormente para estudiar la actividad
procoagulante de las formas activadas de los derivados de factor
X.
Los resultados obtenidos con el derivado
GDX-AVG (zimógeno) se dan en la Figura 4, que
compara el efecto procoagulante de este derivado (\circ) (no
activado) con el derivado GD-FX (\Box) (no
activado) en plasma con factor VIII agotado (4A) o con factor IX
agotado (4B). En presencia del derivado GDX-AVG, el
tiempo de coagulación es más corto que en presencia del derivado
GD-FX (tanto en plasma con factor VIII agotado como
plasma con factor IX agotado). La forma zimogénica del derivado
GDX-AVG tiene por lo tanto claramente una acción
procoagulante, a pesar de la ausencia de dominio Gla y de su
actividad catalítica reducida comparado con su homólogo no mutado.
El hecho de que el derivado GDX-AVG sea más activo
que el derivado GD-FX sugiere que ha tenido lugar
realmente una amplificación de la generación de trombina en
presencia de GDX-AVG. De hecho, comparado con el
derivado GD-FX, el derivado GDX-AVG
es 13 veces menos activo en el complejo de protrombinasa, donde es
al menos dos veces más activo que en plasma de un hemofílico: existe
por lo tanto la producción de una forma al menos 26 veces más
activada del derivado GDX-AVG durante la formación
de coágulo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA SANTÉ ET DE
LA RECHERCHE MEDICALE (INSERM)
\hskip1cmLOUVAIN, Virginie
\hskip1cmBIANCHINI, Elsa
\hskip1cmMARQUE, Pierre-Emmanuel
\hskip1cmCALMEL-TAREU, Claire
\hskip1cmALACH, Martine
\hskip1cmLE BONNIEC, Bernard
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> ANÁLOGOS DE FACTOR X ESCINDIBLES POR
TROMBINA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> MJPah598/68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR 02 08299
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
03-07-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sitio de activación de factor X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Thr Arg Ile Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Pro Arg Ser Phe Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Arg Ser Phe Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Arg Arg Ser Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
Asn}
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<210> 6
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<211> 12
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<212> PRT
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<213> Artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg Leu Ile Asp Gly
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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\sa{Val Pro Arg Ile Val Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de sitio de activación de
factor X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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\sa{Val Pro Arg Ile Phe Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de sitio de activación de
factor X
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Arg Ala Val Gly}
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<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de sitio de activación de
factor X
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<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Arg Ile Phe Arg}
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<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> variante de sitio de activación de
factor X
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<400> 11
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\sa{Val Pro Arg Ser Val Gly}
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<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> variante de sitio de activación de
factor X
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<400> 12
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\sa{Val Pro Arg Ser Phe Arg}
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<210> 13
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<211> 30
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<400> 13
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\hskip-.1em\dddseqskipacgcggatcc gcgatggggc gcccactgca
\hfill30
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<210> 14
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<211> 68
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador de PCR
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<400> 14
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\hskip-.1em\dddseqskiptcccccgggg gatcagttca ggtcttcctc gctgatcagc ttctgctcct ttaatggaga
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\hfill68
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador de PCR
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\hskip-.1em\dddseqskiptatgcgtggg ctggagcaac c
\hfill21
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<210> 16
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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\hskip-.1em\dddseqskipttattaggac aaggctggtg gg
\hfill22
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador de PCR
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\hskip-.1em\dddseqskipcttcccatca atgagccgcg g
\hfill21
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<211> 42
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> cebador de PCR
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\hskip-.1em\dddseqskipccgcggctca ttgatgggaa ggatggcgac cagtgtgaga cc
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<212> ADN
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<220>
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<223> cebador de PCR
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\hskip-.1em\dddseqskipaggggcgaca acaacgtgcc taggatcgtg ggcggccagg aatgcaag
\hfill48
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<210> 20
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<211> 48
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador de PCR
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<400> 20
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\hfill48
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<210> 21
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\hfill55
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<211> 6
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<212> PRT
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<223> variantes de sitio de activación de
factor X
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (1)...(1)
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<223> xaa= Ala, Cys, Phe, Gly, His, Ile,
Lys, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp o Tyr
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (5)...(5)
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<223> Xaa= Val, Ile, Leu o Phe
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (6)...(6)
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<223> xaa= Gly, Asn o His
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<400> 31
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\sa{Xaa Pro Arg Ala Xaa Xaa}
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Claims (10)
1. Análogo de factor X en el que la secuencia
Thr-Arg-Ile del sitio de activación
de factor X nativo se reemplaza por una secuencia escindible por
trombina, caracterizado porque dicha secuencia escindible por
trombina es la secuencia
Pro-Arg-Ala.
2. Análogo de factor X según la reivindicación 1,
caracterizado porque la secuencia
Leu-Thr-Arg-Ile-Val-Gly
del sitio de activación de factor X nativo se reemplaza por la
secuencia
P_{3}-Pro-Arg-Ala-P_{2}'-P_{3}'
(SEC Nº ID 31), en la que P_{3} representa cualquier aminoácido,
con la excepción de Pro, Asp o Glu, P_{2}' representa Val, Ile,
Leu o Phe y P_{3}' representa Gly, Asn o His.
3. Análogo de factor X según la reivindicación 2,
caracterizado porque la secuencia
Leu-Thr-Arg-Ile-Val-Glu
del sitio de activación de factor X nativo se reemplaza por la
secuencia
Val-Pro-Arg-Ala-Val-Gly.
4. Análogo de factor Xa que puede obtenerse
mediante escisión de un análogo de factor X, según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, por trombina.
5. Molécula de ácido nucleico según un análogo de
factor X según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o que
codifica un análogo de factor Xa según la reivindicación 4.
6. Vector recombinante, caracterizado
porque comprende una molécula de ácido nucleico según la
reivindicación 5.
7. Célula huésped transformada genéticamente con
una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5.
8. Uso de un análogo de factor X según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o de un análogo de
factor Xa según la reivindicación 4 o de una molécula de ácido
nucleico según la reivindicación 5, para obtener un producto
medicinal procoagulante.
9. Uso según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho producto medicinal se pretende
para el tratamiento de una coagulopatía resultante de una
deficiencia de factor VIII, factor IX o factor XI.
10. Uso según la reivindicación 9,
caracterizado porque dicha coagulopatía es hemofilia de tipo
A o hemofilia de tipo B.
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