DE60303312T2

DE60303312T2 - Thrombin-spaltbare faktor x-derivate

Info

Publication number: DE60303312T2
Application number: DE60303312T
Authority: DE
Inventors: Virginie Louvain; Elsa Bianchini; Pierre-Emmanuel Marque; Claire Calmel-Tareau; Martine Aiach; Bernard Le Bonniec
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2002-07-03
Filing date: 2003-06-30
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2023-07-01
Also published as: ATE316101T1; EP1539816A1; FR2841904A1; AU2003250095A1; AU2003250095B2; EP1539816B1; US8168753B2; DE60303312D1; CA2491040A1; US20060148038A1; WO2004005347A1; ES2257693T3; JP4533137B2; FR2841904B1; JP2006507806A; CA2491040C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Thrombin-spaltbare Faktor X-Derivate und therapeutische Verwendungen derselben.
Blutgerinnung ist das Resultat einer Kaskade von Enzymreaktionen, deren Endschritt die Bildung von Thrombin ist, das die Bildung eines Koagulums induziert, das fähig ist, die Gefäßöffnung zu verstopfen. Die meisten dieser Reaktionen involvieren die proteolytische Aktivierung von inaktiven Zymogenen, um Serinproteasen zu aktivieren.
Diese Kaskade von Reaktionen wird herkömmlicherweise in zwei Wege aufgeteilt, die als "intrinsischer Weg" und "Gewebefaktor-Weg" oder "extrinsischer Weg" bezeichnet werden.
Der Gerinnungsprozess über den intrinsischen Weg wird durch Blut initiiert, das mit dem Subendothelgewebe in Kontakt kommt. Dieser Kontakt führt zur Aktivierung von Faktor XII (FXII) zu Faktor FXIIa, welcher dann die Aktivierung von Faktor XI (FXI) zu Faktor XIa (FXIa) katalysiert, der selbst Faktor IX (FIX) zu Faktor IXa aktiviert. Der Letztgenannte bindet an seinen Cofaktor, Faktor VIIIa (FVIIIa), unter Bildung des Tenase-Komplexes. Dieser Komplex spaltet Faktor (X) (FX) mit großer Effizienz unter Erzeugung von aktiviertem Faktor X (FXa).
Der Gerinnungsprozess über den extrinsischen Weg wird durch Gewebefaktor (TF) initiiert, der mit Blut in Kontakt gebracht wird, wenn die Bildung einer Gefäßöffnung erfolgt. Dieser Gewebefaktor bindet an aktivierten Faktor VII (FVIIa), der in geringen Mengen im Blut vorliegt. Der FVIIa-TF-Komplex, der auf diese Weise gebildet wird, kann die Faktoren IX und X aktivieren.
Der intrinsische Weg und der extrinsische Weg konvergieren somit in Richtung der Aktivierung von Faktor X zu Faktor Xa, der eines der Schlüsselenzyme bei der Gerinnung bildet.
Faktor X wird durch Hepatozyten in Form eines 448-Aminosäure-Vorläufers synthetisiert, der vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende umfasst: ein Signalpeptid, ein Propeptid, eine "Gla"-Domäne, zwei "EGF" (für epidermalen Wachstumsfaktor)-Domänen mit ähnlicher Struktur wie die des epidermalen Wachstumsfaktors, ein Aktivierungspeptid und eine katalytische Domäne des Serinprotease-Typs. Die posttranslationalen Modifikationen von Faktor X sind besonders komplex: neben einer Exzision des Signalpeptids und des Propeptids umfassen sie eine Carboxylierung der 11 Glutamate der "Gla"-Domäne zu γ-Carboxyglutamaten, eine Exzision des Tripeptids Arg₁₈₀-Lys₁₈₁-Arg₁₈₂ (die Nummerierung bezieht sich auf das Translationsprodukt der Faktor X-cDNA), das die zweite EGF-Domäne vom Aktivierungspeptid trennt, β-Hydroxylierung des Asp₁₀₃-Restes der EGF-Domäne 1 zu β-Hydroxyaspartat und wenigstens fünf Glykosylierungen, einschließlich vier am Aktivierungspeptid.
Der reife Faktor X, der im Plasma zirkuliert, besteht daher aus zwei Polypeptidketten, die durch eine Disulfid-Brücke verknüpft sind (Cys₁₇₂-Cys₃₄₂): die "leichte" Kette aus 139 Aminosäuren besteht aus der Gla-Domäne und den zwei EGFs; die "schwere" Kette mit 306 Aminosäuren besteht aus dem Aktivierungspeptid, das mit der katalytischen Domäne verknüpft ist.
Die Aktivierung von Faktor X zu einer Serinprotease erfordert eine proteolytische Spaltung zwischen dem Aktivierungspeptid und der katalytischen Domäne. Der Tenase-Komplex und auch der FVIIa-TF-Komplex führen diese Spaltung zwischen den Arg₂₃₄- und Ile₂₃₅-Resten durch.
Der aktivierte Faktor X kann auch eine autokatalytische Spaltung durchführen, die langsam ein kleines Fragment am C-terminalen Ende seiner schweren Kette freisetzt. Faktoren Xa-α und -β werden, je nachdem, ob dieses C-terminale Peptid vorliegt oder nicht, unterschieden. Die katalytische Aktivität dieser zwei Formen von Faktor Xa ist allerdings identisch (JESTY et al., J. Biol. Chem, 250, 4497-4504, 1975). Folglich, und wenn nichts anderes in der Erläuterung der vorliegenden Erfindung angegeben ist, bezeichnet der Ausdruck "Faktor Xa" gleichermaßen die eine oder die andere dieser zwei Formen.
Die Bindung von Faktor Xa mit seinem Cofaktor, Faktor Va, bildet den Prothrombinase-Komplex, der Prothrombin zu Thrombin aktiviert.
Thrombin ist auch ein essentielles Enzym bei der Gerinnung und bei der Hämostase allgemein; es ist eine multifunktionelle Serinprotease. Es induziert Plättchenaggregation durch Abspaltung seines Rezeptors an ihrer Oberfläche und wandelt zirkulierendes Fibrinogen in ein unlösliches Fibrin-Koagulum um. Dieses Koagulum bzw. Gerinnsel blockiert durch Verstärkung des bereits gebildeten Thrombozyten-Thrombus die vaskuläre Öffnung und macht es so möglich, die Blutung zu stoppen.
Thrombin kann auch die Faktoren V und VIII aktivieren, die jeweils Cofaktoren der Tenase- und Prothrombinase-Komplexe sind, und kann auch Faktor XI (FXI) aktivieren, was in der Amplifikation der Reaktionen resultiert, die zu seiner Bildung führen, wobei diese Faktoren in diesen involviert sind.
1 veranschaulicht die Hauptenzymreaktionen der Gerinnung über den extrinsischen Weg oder über den intrinsischen Weg und auch den Mechanismus der Autoamplifikation der Thrombinbildung schematisch (dargestellt durch unterbrochene Pfeile).
Eine qualitative oder quantitative Defizienz bei einem der Faktoren, die in der Gerinnung involviert sind, führt zu thrombotischen oder hämorrhagischen Manifestationen, die oft schwer sind und die lebensbedrohend sein können. In diesem Kontext werden insbesondere Hämophilie A und B genannt, die jeweils aus einer Defizienz an Faktor VIII oder an Faktor IX resultieren.
Hämophilie A und B sind Koagulopathien des hämorrhagischen Typs, die schwer und ziemlich häufig sind: das Auftreten derselben ist etwa 1 Fall pro 10.000 männlicher Geburten bei Hämophilie A und 1 Fall pro 30.000 männliche Geburten für Hämophilie B.
In klinischer Hinsicht sind diese zwei pathologischen Zustände nicht unterscheidbar: in beiden Fällen ist es der Tenase-Komplex, der aus der Assoziierung von Faktor VIII mit Faktor IX resultiert, der betroffen ist. Als Folge gibt es eine ungenügende Produktion an aktiviertem Faktor X, und folglich an Thrombin.
Dieser Thrombinmangel bzw. diese Thrombindefizienz führt nicht nur zu einer Abnahme der Fibrinbildung, sondern auch zu einer Verringerung bei der Autoamplifikation der Thrombinproduktion.
Behandlungen für Hämophilie, die derzeit vorgeschlagen werden, sind entweder Behandlungen des Substitutionstyps, die darauf abzielen, die Funktion des Tenase-Komplexes wieder zu etablieren, oder Behandlungen, die auf der Verwendung eines Moleküls oder mehrerer Moleküle basieren, die es möglich machen würden, diesen Tenase-Komplex zu umgehen (HEDNER, Thromb. Haemost., 82, 531-539, 1999).
Die Substitutionsbehandlung besteht in einer Verabreichung des Faktors VIII oder IX, an dem Mangel besteht. Dies ist die einzige derzeit verfügbare Behandlung, die es möglich macht, außer der Bildung von Fibrin, die Autoamplifikation der Thrombinerzeugung wieder korrekt herzustellen. Der Hauptnachteil dieser Behandlung liegt in der potentiellen Antigenität des injizierten Moleküls, das vom Immunsystem des Empfängers als fremd angesehen werden kann. Die Entwicklung von neutralisierenden Allo-Antikörpern, die gegen den verwendeten Faktor gerichtet sind, ist eine ernste Komplikation der Substitutionsbehandlung, was sie allmählich unwirksam macht.
Es wurden drei Ansätze zur Umgehung des Tenase-Komplexes vorgeschlagen:

– Injektion von Gemischen aus "Vitamin K-abhängigen" Gerinnungsfaktoren, die insbesondere Prothrombin und die Faktoren VII, IX und X, wobei die Faktoren VII und X partiell in aktivierter Form sind, umfassen. Diese Behandlung induziert allerdings selten, aber ernste Nebenwirkungen: anaphylaktische Schocks und thrombotische Ereignisse (Myokardinfarktbildung, disseminierte intravaskuläre Koagulation), die durch eine nicht auf die vaskuläre Läsion lokalisierte Wirkung erklärt werden können. Außerdem stellt diese Behandlung eine Autoamplifikation der Thrombinbildung nur im Falle vom hämophilen Typ B wieder her;
– massive Injektion von aktiviertem Faktor VII, der in Gegenwart von Gewebefaktor den Faktor X unabhängig vom Tenase-Komplex aktiviert. Aktivierter Faktor VII hat den Vorteil, dass seine Wirkung auf die vaskuläre Öffnung lokalisiert ist, wo er den Komplex mit Gewebefaktor bildet. Seine Wirksamkeit bei der Behandlung von Hämophilie könnte auch durch einen Gewebefaktor-unabhängigen Mechanismus erklärt werden, der die anionischen Phospholipide verwendet, die durch die aktivierten Thrombozyten freigelegt werden (HOFFMAN et al., Blood Coag. Fibrinolysis, 9 (Erg. 1), S. 61-65, 1998). Die Hauptnachteile einer Verwendung von aktiviertem Faktor VII sind seine sehr kurze Plasma-Halbwertszeit (weniger als drei Stunden), die es notwendig macht, ihn in großen Mengen zu verabreichen, was die Behandlung sehr teuer macht. Außerdem induziert der aktivierte Faktor VII keine Autoamplifikation der Thrombinbildung. Die Menge an Thrombin, die im Plasma eines Hämophilen nach Zusatz einer therapeutischen Dosis an aktiviertem Faktor VII erzeugt wird, bleibt deutlich unter der, die in einem normalen Plasma erzeugt wird (BUTENAS et al., Blood, 99, 923-930, 2002);
– Verabreichung von Faktor X, dessen Aktivität nur langsam im Plasma freigesetzt wird; in diesem Kontext wurden drei Verabreichungstypen vorgeschlagen: Verabreichung von aktiviertem Faktor X in Kombination mit Phospholipid-Vesikeln (NI et al., Thromb. Haemost., 67, 264-271, 1992); Verabreichung von Faktor X, der aktiviert, aber reversibel inhibiert ist, z.B. durch Acetylierung des Serins der aktiven Stelle, und der fähig ist, durch allmähliche Deacylierung langsam im Plasma reaktiviert zu werden (WOLF et al., Blood, 86, 4153-4157, 1995; LIN et al., Thromb. Res., 88, 365-372, 1997); Verabreichung von Faktor X in Form eines Zymogens, das unabhängig vom Tenase-Komplex im Plasma aktiviert werden kann. Der letztgenannte Ansatz verwendet Faktor X-Analoga, bei denen die Stelle zur Spaltung durch den Tenase-Komplex durch eine Stelle zur Spaltung durch eine andere Protease ersetzt ist.

HIMMELSPACH et al. (Thromb. Res., 97, 51-67, 2000) beschreibt so Faktor X-Analoga, in denen die Aktivierungsstelle durch eine Spaltungsstelle für Furin ersetzt ist. Sobald dieses Zymogen injiziert ist, kann es langsam und kontinuierlich zu Faktor Xa umgewandelt werden.
Die PCT-Anmeldung WO 98/38317 schlägt die Konstruktion von verschiedenen Faktor X-Analoga vor, in denen die native Aktivierungsstelle durch eine Stelle zur Spaltung durch eine andere Protease, ausgewählt aus Faktor XIa, Thrombin, Faktor XIIa, Kallikrein, Faktor Xa und Furin, ersetzt ist. Die PCT-Anmeldung WO 01/10896 schlägt den Ersatz der nativen Stelle zur Aktivierung durch den Tenase-Komplex durch eine Stelle zur Spaltung durch Faktor XIa vor.
Der Hauptvorteil der Verwendung von Faktor X-Analoga liegt in der Plasma-Halbwertszeit dieser Analoga, die ähnlich der von Faktor X ist (48 Stunden), und daher viel länger als die von aktiviertem Faktor X (weniger als 1 Minute) ist. Die potentiellen Nachteile dieser Analoga resultieren aus der Schwierigkeit bei der Kontrolle ihrer Wirkungen: die Erzeugung von aktiviertem Faktor X erfolgt kontinuierlich, ohne dass er reguliert ist und ohne dass er auf die Gefäßöffnung lokalisiert ist. Zusätzlich machen diese Analoga es nicht möglich, die Amplifikation der Thrombinerzeugung zu induzieren.
Es scheint daher wünschenswert zu sein, andere Faktor X-Analoga zu haben, die diese Nachteile nicht aufweisen. Mit diesem Ziel haben die Erfinder nach Thrombin-spaltbaren Faktor X-Derivaten gesucht, die es möglich machen würden, nicht nur die defizienten Schritte der Gerinnungskaskade, und insbesondere den Tenase-Komplex, zu umgehen, sondern auch eine Autoamplifikation der Thrombinerzeugung nach dem in 2 dargestellten Mechanismus wieder herzustellen. Die aktivierte Form dieses Faktor X-Derivats (FXa*) wäre in der Tat fähig (in Kombination mit aktiviertem Faktor V), einen funktionellen Prothrombinase-Komplex zu bilden und daher Prothrombin zu Thrombin zu aktivieren. Umgekehrt würde das Thrombin weitere Moleküle des Faktor X-Derivats aktivieren.
Physiologisch aktiviert Thrombin nicht den Faktor X. In der Tat wird die Effizienz der Spaltung durch die Natur der Aminosäuren konditioniert, die die Spaltungsstelle umrahmen, und insbesondere durch die Reste P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃' der Aktivierungsstelle (die Spaltung tritt zwischen den Resten P₁ und P₁' auf). Im Fall des Faktors X ist nun die Sequenz Leu-Thr-Arg-Ile-Val-Gly (LTR-IVG; SEQ ID NO:1) der Aktivierungsstelle sehr verschieden von den Sequenzen Met-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg (MPR-SFR; SEQ ID NO:2) oder Val-Pro-Arg-Ser-Phe-Arg (VPR-SFR; SEQ ID NO:3), die für eine Spaltung durch Thrombin besonders günstig sind (MARQUE et al., J. Biol. Chem., 275, 809-816, 2000; BIANCHINI et al., J. Biol. Chem., 277, 20527-20534, 2002).
Die Reste P₃ bis P₁, die der Spaltungsstelle vorausgehen, sind bei der katalytischen Aktivität des Faktors X nach Aktivierung nicht beteiligt: sie sind Teil des Aktivierungspeptids, das nach Spaltung freigesetzt wird. Dasselbe gilt nicht für die Reste P₁' bis P₃', die unmittelbar auf die Spaltungsstelle folgen: wie in allen Serinproteasen, sind die N-terminalen Reste der katalytischen Kette des aktivierten Faktors X bei der enzymatischen Aktivität involviert. Der Rest P₁' spielt insbesondere eine fundamentale Rolle im katalytischen Mechanismus des Enzyms.
Ein Ersatz der Sequenz LTR-IVG der Aktivierungsstelle von Faktor X mit der Sequenz VPR-SFR würde es möglich machen, die Spaltungsrate von Faktor X durch Thrombin mit 10⁵ zu multiplizieren. Allerdings gibt es die Gefahr, dass dieser Ersatz für die enzymatische Aktivität des Faktors Xa schädlich ist. Es ist in der Tat nicht möglich, vorauszusagen, was die enzymatische Aktivität eines aktivierten Faktor X-Analogons, in dem die schwere Kette mit einem anderen Rest als Isoleucin beginnt, wäre.
Die PCT-Anmeldung WO 98/38317 beschreibt ein Faktor X-Analogon, in dem die Sequenz LTR-IVG der nativen Aktivierungsstelle mit der Sequenz Thr-Arg-Arg-Ser-Val-Gly (TRR-SVG; SEQ ID NO:4) ersetzt ist, und das als potentiell Thrombin-spaltbar präsentiert wird. Allerdings wird kein Hinweis bezüglich der wirksamen Spaltung dieses Zymogens durch Thrombin gegeben, und noch weniger bezüglich der katalytischen Aktivität des Faktor Xa-Analogons, die aus dieser Spaltung resultieren würde.
Die Erfinder haben verschiedene Substitutionen in Positionen P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃' der nativen Aktivierungsstelle von Faktor X getestet, um die Effekte dieser Substitutionen erstens auf die Spaltung durch Thrombin, und zweitens auf die enzymatische Aktivität des Faktor Xa-Analogons, das daraus resultiert, zu untersuchen.
Sie haben so betont, dass eine Substitution an den Positionen P₂-P₁-P₁' der Sequenz TR-I mit der Sequenz PR-A es möglich macht, Faktor X-Analoga zu erhalten, die wirksam durch Thrombin gespalten werden können, und die Spaltung ein Faktor Xa-Analogon erzeugt, das eine katalytische Aktivität hat, die, obgleich vermindert, ähnlich der seines nicht-mutierten Homologen ist und kompatibel mit einer normalen physiologischen Funktion ist; außerdem wird diese Abnahme in der katalytischen Aktivität durch eine Zunahme in der Halbwertszeit im Vergleich zu der des nativen Faktors Xa kompensiert. Diese Zunahme bei der Halbwertszeit resultiert aus einer besseren Resistenz gegenüber Serpinen (Serinprotease-Inhibitoren im Plasma), und insbesondere gegen Antithrombin.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich ein Faktor X-Analogon, in dem die Sequenz Thr-Arg-Ile der Aktivierungsstelle von nativem Faktor X durch eine Thrombin-spaltbare Sequenz ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Thrombin-spaltbare Sequenz die Sequenz Pro-Arg-Ala ist.
Ein Faktor Xa-Analogon, das durch Spaltung eines Faktor X-Analogons gemäß der Erfindung durch Thrombin erhalten werden kann, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Der Ausdruck "Faktor X-Analogon" bezeichnet hier sowohl das reife Faktor X-Molekül als auch seine intrazelluläre Vorstufe; der Ausdruck "Faktor Xa-Analogon" bezeichnet das Molekül in der aktivierten α- oder β-Form.
Was die Substitution in den Positionen P₃, P₂' und P₃' der Aktivierungsstelle angeht, so haben sie weniger Einfluss auf die Wirksamkeit der Spaltung durch Thrombin und auf die enzymatische Aktivität des erhaltenen Faktor Xa-Analogons als solche, die in den Positionen P₂, P₁ oder P₁' gemacht wurden.
So kann in P₃ der Leu-Rest von nativem Faktor X konserviert werden oder durch eine beliebige Aminosäure, ausgenommen Pro, Asp und Glu, ersetzt werden; in P₂' kann der Val-Rest von nativem Faktor X konserviert werden oder mit einer Aminosäure, die vorzugsweise aus Ile, Leu und Phe ausgewählt ist, substituiert werden; in P₃' kann der Gly-Rest von nativem Faktor X konserviert werden oder mit einer Aminosäure ersetzt werden, die vorzugsweise aus Asn und His ausgewählt wird.
Gegebenenfalls ist es möglich, die Aktivierungsstellen-Modifikationen, die für die Faktor X-Analoga und Faktor Xa-Analoga gemäß der Erfindung spezifisch sind, mit anderen Modifikationen, die unterschiedliche Domänen von Faktor X oder Faktor Xa betreffen, und die es möglich machen, einige ihrer Eigenschaften zu verbessern, zu kombinieren. So ist es z.B. möglich, das Propeptid von nativem Faktor X durch das von Prothrombin zu ersetzen, um eine bessere Ausbeute an γ-carboxyliertem reifen Protein zu erhalten, wie es in CAMIRE et al. (Biochemistry, 39, 14322-14329, 2000) beschrieben ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nucleinsäuremoleküle, die für Faktor X-Analoga gemäß der Erfindung codieren.
Diese Nucleinsäuremoleküle können durch herkömmliche Methoden, die dem Fachmann bekannt sind, insbesondere durch ortsspezifische Mutagenese eines Nucleinsäuremoleküls, das für den nativen Faktor X codiert, erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Expressionskassetten, die ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung in Verbindung mit geeigneten Elementen zur Kontrolle der Transkription (insbesondere Promotor und gegebenenfalls Terminator) und gegebenenfalls Translation umfassen, und auch die rekombinanten Vektoren, in die ein Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung insertiert ist. Diese rekombinanten Vektoren können z.B. Klonierungsvektoren, Expressionsvektoren oder Gentransfervektoren, die in der Gentherapie eingesetzt werden können, sein.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen, die genetisch mit wenigstens einem Nucleinsäuremolekül gemäß der Erfindung transformiert sind. Für die Expression und die Produktion der Faktor X-Analoga gemäß der Erfindung werden vorzugsweise eukaryotische Zellen, z.B. Säugerzellen, ausgewählt.
Die Konstruktion von Vektoren gemäß der Erfindung und die Transformation der Wirtszellen kann durch herkömmliche Techniken der Molekularbiologie durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Tiere, und insbesondere nicht-humane transgene Tiere, die wenigstens ein Transgen beherbergen, das eine Expressionskassette gemäß der Erfindung umfasst. Diese transgenen Säuger können z.B. zur Produktion von Faktor X-Analoga gemäß der Erfindung in einer Weise ähnlich der, die bereits für die Produktion von anderen Proteinen mit therapeutischem Interesse vorgeschlagen wurde, verwendet werden (BRINK et al., Theriogenology, 53, 139-148, 2000).
Die Faktor X-Analoga gemäß der Erfindung können z.B. durch Kultivieren genetisch transformierter Zellen gemäß der Erfindung und Gewinnung des Analogons, das durch die Zellen exprimiert wird, aus der Kultur erhalten werden. Sie können dann, wenn notwendig, durch herkömmliche Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, z.B. durch fraktionierte Präzipitation, insbesondere Präzipitation mit Ammoniumsulphat, Elektrophorese, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, usw., gereinigt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung von Faktor X-Analoga oder von Faktor Xa-Analoga gemäß der Erfindung oder der Nucleinsäuremoleküle, die für diese Analoga codieren, zur Herstellung medizinischer Prokoagulanzprodukte.
Medizinische Produkte, die aus Faktor X-Analoga oder Faktor Xa-Analoga gemäß der Erfindung erhalten werden, können im Kontext der Prävention oder Behandlung von Koagulopathien des hämorrhagischen Typs, die insbesondere aus einer Defizienz beim Faktor VIII, IX oder XI herrühren, verwendet werden. Diese können insbesondere Hämophilie A oder Hämophilie B sein, die durch das Vorliegen von Inhibitoren (neutralisierende Allo-Antikörper, die gegen Faktor VIII oder IX gerichtet sind, die herkömmlicherweise für die Behandlung eingesetzt werden) kompliziert werden oder nicht; sie können auch erworbene Hämophilien sein, die aus dem Auftreten von Auto-Antikörpern, die mit einem anderen pathologischen Zustand assoziiert sind (Autoimmunerkrankung, Krebs, lymphoproliferatives Syndrom, idiopathische Störung, usw.), resultieren.
Nucleinsäuremoleküle gemäß der Erfindung können vorteilhafterweise in medizinische Produkte eingearbeitet sein, die in der Gentherapie eingesetzt werden können. Die herkömmlicherweise in der Gentherapie verwendeten Vektoren, z.B. virale Vektoren (z.B. ein Vektor des Adenovirus- oder Retrovirus-Typs), Liposome, usw., können eingesetzt werden, um medizinische Produkte gemäß der Erfindung zu erhalten.
Die Faktor Xa-Analoga gemäß der Erfindung haben außerhalb des Prothrombinase-Komplexes eine katalytische Aktivität, die viel schwächer ist als die von nativem Faktor Xa. Innerhalb des Prothrombinase-Komplexes (d.h., unter physiologischen Bedingungen) ist die Abnahme in ihrer Aktivität im Vergleich zu nativem Faktor Xa viel geringer, und sie sind effektiv in der Lage, die Effekte einer Verarmung an Faktor VIII oder IX zu korrigieren. Infolge ihrer beträchtlichen Resistenz gegen Antithrombin haben die Faktor Xa-Analoga gemäß der Erfindung zusätzlich den Vorteil, dass sie eine längere Halbwertszeit haben, welche ihre schwächtere Aktivität kompensiert. Obgleich sie viel langsamer ist, gibt es Inhibierung durch Antithrombin (die proportional zur katalytischen Aktivität ist), die es möglich macht, einen Autoregulationsmechanismus zu konservieren, der ähnlich dem von nativem Faktor Xa ist.
Außerdem bleibt die Wirkung der Faktor Xa-Analoga gemäß der Erfindung an der Gefäßöffnung lokalisiert, da, wie es in 2 gezeigt ist, die Enzymkaskade, in der diese Analoga involviert sind, durch Gewebefaktor ausgelöst wird. Wie auch in 2 gezeigt ist, macht die Verwendung der Faktor X-Analoga gemäß der Erfindung es schließlich möglich, die Autoamplifikation der Thrombinerzeugung wieder herzustellen.
Das Gesamtresultat davon ist eine therapeutische Wirkung, die besser targetiert ist und einfacher zu kontrollieren ist als die der Faktor X- oder Faktor Xa-Analoga des Standes der Technik.
Die Faktor X-Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung können z.B. in Plasmakonzentrationen in der Größenordnung von 0,1 bis 0,5 μM, d.h., 5 bis 25 mg/l, eingesetzt werden. Diese Konzentrationen können durch Verabreichung von Dosen, die denen nahe kommen, die im Fall von Behandlungen mit Faktor VIIa eingesetzt werden, allerdings weniger häufiger, erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun aus der folgenden weiteren Beschreibung klarer, wobei sich diese auf nicht-limitierende Beispiele zur Herstellung und Charakterisierung eines Faktor X-Analogons (GDX-AVG) gemäß der Erfindung bezieht.
BEISPIEL 1: KONSTRUKTION VON EXPRESSIONSVEKTOREN FÜR FAKTOR X-ANALOGA
Es wurden verschiedene humane Faktor X-Derivate konstruiert:

– Ein Derivat, das im Folgenden als "FX-rekombinant" bezeichnet wird, das sich vom nativen Faktor X nur durch Addition eines 11-Aminosäure-Peptids (EQKLISEEDLN; SEQ ID NO:5) an seinem C-terminalen Ende unterscheidet, wobei dieses durch den monoklonalen Antikörper 9E10 (PHARMINGEN, San Jose, USA) erkannt wird; diese Modifikation macht es möglich, die Detektion und Reinigung des exprimierten Proteins zu erleichtern;
– ein Derivat, das im Folgenden als "GD-FX" bezeichnet wird, das sich von dem "rekombinanten" Derivat dadurch unterscheidet, dass ihm auch eine Gla-Domäne fehlt, die es möglich macht, die Menge an rekombinantem Protein, das exprimiert wird, zu erhöhen, und dadurch, dass es an seinem N-terminalen Ende eine 12-Aminosäure-Sequenz (EDQVDPRLIDGK; SEQ ID NO:6), umfasst, die ein Epitop bildet, das durch den monoklonalen Antikörper HPC-4 (ROCHE DIAGNOSTIC, Meylan, Frankreich) erkannt wird;
– die Derivate, die im Folgenden als GDX-IVG, GDX-IFG, GDX-AVG, GDX-IFR, GDX-SVG, GDX-SFR bezeichnet werden, die sich von dem GD-FX-Derivat durch die Modifikation eines Rests oder mehrerer der Reste in den Positionen P₃, P₂, P₁, P₁', P₂', oder P₃' der Aktivierungsstelle unterscheiden.

Die Reste P₃ bis P₃' der Aktivierungsstelle von normalem Faktor X, der aus Plasma isoliert wurde (FX-Plasma), und von jedem der obigen Derivate sind in Tabelle I angegeben.
TABELLE I
Die Expressionsvektoren, die verwendet werden, um diese Derivate zu konstruieren, werden aus dem Vektor pNUT-hGH (PALMITER et al., Science, 1983, 222, 809-814, 1983) durch Ersatz der Sequenz, die für humanes Wachstumshormon (hGH) codiert, mit der Sequenz, die für das gewünschte Faktor X-Derivat codiert, erhalten.
KONSTRUKTION DES VEKTORS PNUT-FX
Der Vektor, der als "PNUT-FX" bezeichnet wird, macht es möglich, das "FX-rekombinant"-Derivat in eukaryotischen Zellen zu exprimieren.
Die vollständige cDNA von humanem Faktor X, die verwendet wurde (1467 Basenpaare), wurde ursprünglich von MESSIER et al. (Gene, 99, 291-294, 1991) in die SalI-Stelle des Plasmids pBluescript KS(–) cloniert.
Diese cDNA wurde durch PCR-Amplifikation aus dem Vektor pBluescript, der sie enthält, gewonnen. Die verwendeten Primer sind in Tabelle II unten dargestellt. Die verwendete Schmelztemperatur (Th°) ist in der letzten Spalte der Tabelle angegeben.
TABELLE II
Primer 1 (SEQ ID NO:13) und 2 (SEQ ID NO:14) führen jeweils eine BamHI-Restriktionsstelle, die 5' der Sequenz, die für Faktor X codiert, positioniert ist, und eine XmaI-Stelle, die 3' positioniert ist, ein. Darüber hinaus führt Primer 2 unmittelbar vor dem Stoppkodon der Faktor X-cDNA die Sequenz ein, die für das Epitop codiert, das durch den monoklonalen Antikörper 9E10 erkannt wird.
Das Amplifikationsprotokoll ist wie folgt: die Amplifikation wird in einem Volumen von 100 μl durchgeführt, das enthält: 2 μg (7 nM) Plasmid pBluescript, 2 μM jedes der Primer 1 und 2, 0,2 mM jedes dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP; AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, Orsay, Frankreich) und 6 Einheiten an kbE-DNA-Polymerase (STRATAGENE) in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer. Die Amlifikation wird in einem DNA THERMAL CYCLER (Modell 480, PERKIN ELMER, Roissy, Frankreich) nach dem folgenden Programm durchgeführt: eine Anfangsdenaturierung von 5 Minuten bei 95°C, gefolgt von 30 Zyklen, die jeweils 45 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 45 Sekunden Hybridisierung bei einer Temperatur von wenigstens 4°C unter der Schmelztemperatur der Primer und 3,5 Minuten Elongation bei 72°C umfassen. Die Amplifikation wird durch Inkubation für 10 Minuten bei 72°C beendet.
Das Amplifikationsprodukt wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt und durch Präzipitation mit Ethanol konzentriert. Die Enden werden dann stumpf gemacht und phosphoryliert, und zwar durch Inkubation für 30 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 5 Einheiten T₄-DNA-Polymerase (NEW ENGLAND BIOLABS, Beverly, MA, USA), 10 Einheiten T₄-Polynucleotidkinase (NEW ENGLAND BIOLABS) und 0,3 mM dNTP (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH). Das Fragment von Interesse wird unter Verwendung des "QIAquick Gel Extraction Kit" (QIAGEN, Courtaboeuf, Frankreich) an einem Standard-1 %-Agarosegel nach den Anweisungen des Herstellers gereinigt.
Parallel dazu werden 40 μg in 140 μl (86 nM) eines Empfängervektors (pBluescript, STRATAGENE) mit 400 Einheiten EcoRV für 90 Minuten bei 37°C linearisiert. Die Enden des linearisierten pBluescript-Vektors werden durch Inkubation für 60 Minuten bei 37°C in Gegenwart von 50 Einheiten alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (NEW ENGLAND BIOLABS) dephosphoryliert; dieser Vektor wird dann wie oben unter Verwendung des "QIAquick Gel Extraction Kit" nach Trennung an Standard-1%-Agarose gereinigt.
Das Insert wird in den Empfängervektor durch Ligation eingeführt, indem 10 nM Vektor mit 20 nM Insert in Gegenwart von 400 Einheiten T₄-DNA-Ligase (NEW ENGLAND BIOLABS) für 24 Stunden bei Umgebungstemperatur in 10 μl des Puffers, der vom Hersteller empfohlen ist, inkubiert werden.
Das resultierende Plasmid (pBluescript-FX) wird im E. coli-Stamm DH5α amplifiziert und nach Standardprotokollen, die von SAMBROOK et al. (Molecular Cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschrieben sind, gereinigt.
Das Insert des Plasmids pBluescript-FX wird durch Kassettenaustausch nach dem folgenden Protokoll in den Vektor pNUT-hGH transferiert:
Zwei μg (4 nM) pNUT-hGH werden mit 60 Einheiten BamHI für 2 Stunden bei 37°C in 100 μl Reaktionsgemisch verdaut. Der so linearisierte Vektor wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion, gefolgt von Präzipitation mit Ethanol, gereinigt. Er wird dann in 10 μl 10 mM Tris, pH 8,0, der 1 mM EDTA enthält, aufgenommen und mit 30 Einheiten XmaI für 3 Stunden bei 37°C verdaut.
Die aus diesem zweiten Verdau stammenden zwei Fragmente werden durch Inkubation für eine Stunde bei 37°C in Gegenwart von 150 Einheiten alkalischer Phosphatase dephosphoryliert.
Der linearisierte pNUT-Vektor wird von seinem früheren Insert (das die Sequenz enthält, die für hGH codiert) durch Elektrophorese in Standard-1 %-Agarose getrennt und unter Verwendung des "QIAquick Gel Extraction Kit" gereinigt.
Parallel dazu werden 130 μg (1,3 μM) pBluescript-FX mit 20 Einheiten BamHI für eine Stunde bei 37°C in 30 μl Reaktionsgemisch verdaut. Der linearisierte Vektor wird durch Phenol/Chloroform-Extraktion, gefolgt von Präzipitation mit Ethanol, gereinigt. Er wird in 10 μl 10 mM Tris, pH 8,0, der 1 mM EDTA enthält, aufgenommen und mit 30 Einheiten XmaI für 3 Stunden bei 37°C verdaut.
Das FX-Insert wird durch Elektrophorese in Standard-1 %-Agarose von seinem früheren Vektor getrennt und unter Verwendung des "QIAquick Gel Extraction Kit" gereinigt.
Der Vektor pNUT-FX wird durch Ligation des FX-Inserts in den Vektor pNUT in Gegenwart von T₄-DNA-Ligase, wie es oben beschrieben wurde, erhalten.
Konstruktion des Vektors pNUT-GDX
Das Vorliegen einer "Gla"-Domäne limitiert die Synthese eines rekombinanten Proteins in einer eukaryotischen Zelle beträchtlich. Ihre Entfernung macht es möglich, die Menge an rekombinantem Protein, die exprimiert wird, zu verfünffachen.
Außerdem ist die "Gla"-Domäne von Faktor X für seine biologische Aktivität notwendig, ist aber für die proteolytische Aktivität für Substrate, die nur mit der katalytischen Furche wechselwirken, nicht essentiell. Die Herstellung von Derivaten, denen die "Gla"-Domäne fehlt, macht es daher möglich, den Effekt von Modifikationen der Reste, die genau neben der Aktivierungsstelle liegen, auf die Serinprotease-Aktivität schnell zu bestimmen.
Der Vektor pNUT-ETW (LE BONNIEC et al., J. Biol. Chem., 267, 6970-6976, 1992) exprimiert ein Derivat von humanem Prothrombin, dem seine "Gla"-Domäne fehlt und das am N-Terminus an das Signalpeptid von Rinderfaktor V und an eine 12-Aminosäure-Sequenz (EDQVDPRLIDGK), die ein Epitop bildet, das durch den monoklonalen Antikörper HPC-4 erkannt wird, fusioniert ist.
Um den Vektor pNUT-GDX zu konstruieren, wurde die Anordnung "Signalpeptid und "Gla"-Domäne des Vektors pNUT-FX" durch die Anordnung "Signalpeptid, Propeptid und HPC-4-Epitop des Vektors pNUT-ETW" ersetzt.
Die Primer, die verwendet werden, um die Fragmente der Vektoren pNUT-FX und pNUT-ETW zu amplifizieren, sind in der folgenden Tabelle III dargestellt. Die PCR-Amplifikation wird ausgeführt, wie es oben für den Vektor pNUT-FX beschrieben ist.
TABELLE III
Die Amplifikation des Fragments, das von pNUT-ETW stammt (das die BamHI- und XmaI-Stellen von pNUT, die Sequenz, die für das Signalpeptid von Faktor V codiert, und die, die für das Epitop codiert, das durch den Antikörper HPC-IV erkannt wird) wird mit den Primern 3 (SEQ ID NO:15) und 5 (SEQ ID NO:17) durchgeführt; die Amplifikation des Fragments, das von pNUT-FX stammt (das die Sequenz, die für die zwei EGF-Domänen, das Aktivierungspeptid und die Serinprotease-Domäne von Faktor X und auch für das Epitop, das durch den Antikörper 9E10 erkannt wird, codiert, umfasst), wird mit den Primern 6 (SEQ ID NO:18) und 4 (SEQ ID NO:16) durchgeführt. Die Primer 5 und 6 sind partiell komplementär (Primer 6 führt, positioniert 5' vom ersten EGF, einen Teil der Sequenz ein, die für das Epitop codiert, das durch den Antikörper HPC-4 codiert wird), was es möglich macht, die Fragmente, die aus den zwei PCRs durch "Mega-Primer"-PCR (HO et al., Gene, 15, 51-59, 1989) in Gegenwart der Primer 3 und 4 stammen, zu verknüpfen. Das Produkt dieser PCR wird mit 40 Einheiten XmaI (in einem Volumen von 400 μl) verdaut, und das Restriktionsfragment (mit einer XmaI-Stelle an jedem Ende) wird unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit nach Trennung an 1 % Agarosegel gereinigt.
Darüber hinaus werden 6 μg in 140 μl (12 nM) Vektor pNUT-hGH mit 20 Einheiten XmaI für 2 Stunden bei 37°C verdaut. Der so linearisierte Vektor wird von seinem früheren Insert (Sequenz, die für hGH codiert) durch Elektrophorese in Standard-1 %-Agarose getrennt und unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit gereinigt. Der Vektor ohne Insert (0,1 μg in 10 μl, d.h. 2,7 nM) wird durch Ligation in Gegenwart von 400 Einheiten T₄-DNA-Ligase für 16 Stunden bei Umgebungstemperatur rezirkularisiert.
Der rezirkularisierte pNUT-Vektor wird im E. coli-Stamm DH5α amplifiziert und gereinigt.
40 μg in 100 μl (d.h. 110 nM) des Vektors pNUT ohne Insert werden mit 10 Einheiten XmaI für 3 Stunden bei 37°C linearisiert, und seine Enden werden durch Inkubation für eine Stunde bei 37°C in Gegenwart von 150 Einheiten alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Der so hergestellte Vektor pNUT wird unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kits nach Trennung auf 1 % Agarosegel isoliert.
Der Vektor pNUT-GDX wird durch Ligation des Fragments, das aus der "Mega-Primer"-PCR stammt, in den Vektor pNUT in Gegenwart von T₄-DNA-Ligase, wie es oben beschrieben wurde, stammt, und Selektion auf der Basis der BamHI-, XmaI-, PstI- oder EcoRI-Restriktionsprofile oder der Konstrukte, die das Insert in der richtigen Orientierung enthalten, erhalten.
Ortsspezifische Mutagenese des Vektors pNUT-GDX
Im nativen Faktor X (und auch im GDX-FX-Derivat) ist die Sequenz der Reste P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃', die die Spaltungsstelle umrahmen (die Spaltung erfolgt zwischen P₁ und P₁'), LTR-IVG.
Die sechs Faktor X-Analoga, die hergestellt wurden: GDX-IVG, GDX-IFG, GDX-AVG, GDX-IFR, GDX-SVG, GDX-SFR, haben entsprechend die Sequenz P₃-P₂-P₁-P₁'-P₂'-P₃': VPR-IVG, VPR-IFG, VPR-IFR, VPR-AVG, VPR-SVG und VPR-SFR.
Die Vektoren, die diese Faktor X-Analoga exprimieren, wurden durch Mutagenese des Vektors pNUT-GDX durch ein Verfahren hergestellt, das von dem von JONES et al. (Nature, 344, 793-794, 1990) abgeleitet ist.
Die Sequenzen der verwendeten Primer für die Mutagenese des Vektors pNUT-GDX sind in Tabelle IV angegeben (SEQ ID NO:19 bis SEQ ID NO:30).
Der "Sense"-Primer (s) hybridisiert am nicht-codierenden Strang, und der "Antisense"-Primer (a) hybridisiert am codierenden Strang.
TABELLE IV
Die Mutagenese wird durch PCR in einem Volumen von 50 μl durchgeführt, das 50 ng (0,2 nM) pNUT-GDX als Matrix, 125 ng (70 nM) jedes Primers (Sense und Antisense, siehe Tabelle 4), ein äquimolares Gemisch (0,5 mM) von jedem dNTP und 2,5 Einheiten kbE-Polymerase in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer enthält, und zwar unter Verwendung eines DNA-Thermal Cycler 480 (PERKIN ELMER). Die PCR umfasst einen Anfangsschritt der Denaturierung bei 95°C für 5 Minuten, gefolgt von 16 identischen Zyklen, die jeweils aus 45 Sekunden Denaturierung bei 95°C, 60 Sekunden Hybridisierung bei 55°C und 26 Minuten Elongation bei 68°C bestehen. Am Ende dieser 16 Zyklen wird der Vektor, der als Matrix diente, bei 37°C für 60 Minuten mit 10 Einheiten DpnI zersetzt.
DH5α-Bakterien, die durch Waschen bei 4°C in 100 mM CaCl₂ kompetent gemacht worden waren, werden mit 5 bis 10 μl des mit DpnI verdauten PCR-Produktes transformiert; die Kolonien, die ein lebensfähiges Plasmid eingebaut haben, werden selektiert, und die Orientierung und die Sequenz des Inserts werden verifiziert.
BEISPIEL 2: PRODUKTION DER FAKTOR X-DERIVATE IN EUKARYOTISCHEN ZELLEN
Transfektion von BHK-21-Zellen:
Die rekombinanten Proteine wurden in Nierenzellen von neugeborenen Hamstern (BHK-21), die von der European Collection of Cell Cultures (Sofia-Antipolis, Frankreich) zur Verfügung gestellt wurden, exprimiert.
Die BHK-21-Zellen werden in Petrischalen (80 mm Durchmesser) in einem Inkubator bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% CO₂ in vollständigem DMEM-Medium (Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium): (GIBCO BRL), supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum (GIBCO BRL), 2 mM L-Glutamin (GIBCO BRL), 100 Einheiten/ml Penicillin (GIBCO BRL) und 100 μg/m1 Streptomycin (GIBCO BRL), kultiviert. Wenn die Zellen etwa 80% Konfluenz erreichen, werden sie zweimal in PBS-Puffer (Phosphat-gepufferte Salzlösung, GIBCO BRL) gespült und dann bei 37°C für 1 Stunde in 4 ml OPTI-MEM (GIBCO BRL) inkubiert.
Die Transfektion wird durchgeführt, indem 40 nM des Expressionsvektors für das gewünschte Faktor X-Derivat (40 μg in einem Volumen von 220 μl, eingestellt mit destilliertem Wasser) zu 250 μl einer Lösung mit einem pH von genau 7,05, die aus 50 mM Hepes, 1,5 mM Na₂HPO₄, 280 mM NaCl, 10 mM KCl und 12 mM Dextrose hergestellt ist, gegeben werden. Eine Copräzipitation der DNA wird erreicht, indem 31 μl 2,5 M CaCl₂ tropfenweise und unter konstanter Bewegung zugesetzt werden. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur, wird das Präzipitat zu dem Medium, das die Zellen bedeckt, gegeben, und es wird für 3 Stunden bei 37°C sedimentieren gelassen. Die Zellen werden mit PBS gewaschen (um das meiste des Präzipitats zu entfernen) und zur Kultur in vollständigem DMEM-Medium für 24 Stunden bei 37°C zurückgegeben.
Die Zellen werden mit 2 ml einer Lösung von 54 mM EDTA, pH 8,0, die 0,5 mg/ml Trypsin enthält, losgelöst im Selektionsmedium (vollständiges DMEM, enthaltend 50 mg/l Methotrexat (TEVA, Courbevoie, Frankreich)) suspendiert und erneut in zwei neuen Petrischalen ausgesät. Das Kulturmedium wird alle zwei Tage für 2 bis drei Wochen erneuert, bis Kolonien erhalten werden. Diese Kolonien werden isoliert und in die Vertiefungen (2 cm²) einer Kulturplatte mit 24 Vertiefungen transferiert, wo sie bis zur Konfluenz im Selektionsmedium vermehrt werden.
Identifizierung der Klone, die ein Faktor X-Derivat produzieren:
Detektion der Klone, die in stabiler Weise ein Faktor X-Derivat exprimieren, wird durch Immunblotting durchgeführt.
Ein Aliquot (30 μl) an BHK-21-Zellkulturüberstand, der für wenigstens 48 Stunden im Kontakt mit den transfizierten Zellen war, wird zu 10 μl 100 mM Tris-HCl, pH 6,8, der 40% (V/V) Glycerin, 8% (G/V) SDS, 0,04% (G/V) Bromphenolblau und 20% (V/V) (3-Mercaptoethanol enthält, gegeben. Die Proteine in der Probe werden bei 95°C für 5 Minuten denaturiert und werden an einem 12% Polyacrylamid-Gel (Vernetzung 29/1) in 25 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 0,1 M Glycin und 0,1 % (G/V) SDS enthält, getrennt.
Auf die Elektrophorese folgt ein Transfer auf Nitrocellulosemembran (TRANS-BLOT, BIO-RAD, Ivry sur Seine, Frankreich) in 25 mM Tris-HCl-Puffer, 0,1 M Glycin, pH 7,5, der 20% Methanol enthält. Die Membran wird durch Inkubation für 1 Stunde bei Umgebungstemperatur in einer Lösung von 5% (G/V) Magermilch in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20 (TTBS) enthält, gesättigt und dann dreimal für 10 Minuten in demselben Puffer gewaschen. Die Membran wird dann für 1 bis 12 Stunden in Gegenwart von 50 ng/ml monoklonalem Antikörper 9E10 in TTBS inkubiert. Nach drei Waschgängen (wie vorher) wird die Membran für eine Stunde bei Umgebungstemperatur in Gegenwart eines mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-Maus-IgG-Ziege-polyklonalen Antikörpers (BIO-RAD), 1/3000 verdünnt in TTBS, inkubiert. Das Vorliegen von rekombinantem Protein wird durch Inkubation der Membran in Gegenwart eines chromogenen Substrats (Gemisch in gleichen Mengen aus 5-Brom-4-chlor-3-indolylphoshat, p-Toluidinsalz (BCIPT) und Nitrotetrazoliumchlorid (NTC), verdünnt in 0,1 M Tris-Puffer, pH 9,5, enthaltend 0,5 M MgCl₂) gezeigt.
Zellkultur und Produktion:
Die Klone, die das gewünschte Faktor X-Derivat am stärksten exprimieren, werden amplifiziert und durch Gefrieren in flüssigem Stickstoff konserviert (etwa 10⁶ Zellen in 1 ml fötalem Kälberserum, dem 10% (V/V) DMSO zugesetzt worden war).
Eine Produktion der Faktor X-Derivate wird in Selektionsmedium, das 50 μM Zink (zur Induktion des Metallothionein-Promotors) und für die Klone, die das FX-rekombinante Derivat, das eine Gla-Domäne besitzt, exprimieren, 5 mg/ml Vitamin K₁ (Roche, Neuilly sur Seine, Frankreich), um die posttranslationale γ-Carboxylierung zu erlauben, enthält. Die Zellen werden durch sukzessive Passagen in 150 cm²-Kolben vermehrt, die verwendet werden, um 850 cm²-Flaschen zu inokulieren. Die Kulturüberstände werden alle 2 bis 6 Tage (in Abhängigkeit von der Zelldichte) geerntet, durch Zentrifugation für 10 Minuten bei 5000 g geklärt und bei –20°C nach Zusatz von 5 mM EDTA und 10 mM Benzamidin konserviert.
BEISPIEL 3: REINIGUNG DER FAKTOR X-DERIVATE
Die Reinigung der Derivate wurde in zwei oder drei Schritten, abhängig vom betreffenden Derivat, durchgeführt.
Der erste Schritt ist allen Reinigungen gemeinsam: er involviert eine Adsorption an Anionenaustauschharz, um die im Kulturüberstand enthaltenen Proteine zu konzentrieren.
Die Kulturüberstände werden 1/3 in 50 mM Tris, pH 7,5, der 10 mM Benzamidin und 5 mM EDTA enthält, verdünnt. Typischerweise werden zwei Liter Überstand in vier Liter Puffer verdünnt, 4,5 Gramm QAE SEPHADEX A50 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) werden zugesetzt, und das Gemisch wird langsam für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur (unter Verwendung eines rotierenden Schaufelrührers) gerührt. Die SEPHADEX-Perlen werden für eine Stunde sedimentieren gelassen, und der Überstand wird verworfen.
Das beladene Harz wird in eine Säule transferiert, und die adsorbierten Proteine werden mit 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 0,5 M NaCl enthält, eluiert.
Der zweite Schritt ist eine Affinitätschromatographie, die es möglich macht, das Faktor X-Derivat von den anderen Proteinen, die im QAE-SEPHADEX-Eluat enthalten sind, zu trennen.
Das "FX-rekombinant"-Derivat wird durch Affinitätschromatographie an einem AFFI-PREP HZ-Gel (BIO-RAD), das mit 3 mg monoklonalem Antikörper 9E10 pro ml Gel gepfropft ist, gereinigt. Nach Beladen der Säule mit dem QAE-SEPHADEX-Eluat und Waschen in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 0,5 M NaCl enthält, wird das "FX-rekombinant"-Derivat in 0,1 M Glycin-HCl-Puffer, pH 2,7, eluiert. Der pH des Eluats wird durch Zugabe von 30 μl/ml 2 M Tris auf 7,5 eingestellt, und die Säule wird im Waschpuffer erneut äquilibriert.
Die mit dem Antikörper 9E10 gepfropfte Affinitätssäule hat den Nachteil, dass sie eine geringe Kapazität hat und dass sie eine Elution in denaturierendem Medium erfordert. Ein dritter Reinigungsschritt durch Hochauflösungs-Anionenaustauschchromatographie wird in diesem Fall notwendig, um das denaturierende Agens zu entfernen und das aus der Säule eluierte Derivat zu konzentrieren.
Mehrere Eluate aus der Affinitätssäule, die insgesamt 2 bis 10 mg "FX-rekombinant"-Derivat liefern, werden gesammelt, 1/4 in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 5 mM EDTA enthält, verdünnt und auf eine Q-SEPHAROSE FAST FLOW-Säule (0,8 × 10 cm) (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) aufgeladen. Nach Waschen in Verdünnungspuffer wird die Säule in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,4, der 0,5 M NaCl enthält, eluiert.
Faktor X-Derivate, denen die Gla-Domäne fehlt, die an ihrem N-terminalen Ende das Epitop tragen, das durch den Antikörper HPC-4 erkannt wird, wurden an einer Affinitätssäule, die mit diesem Antikörper gepfropft war, gereinigt. Da der Antikörper HPC-4 Calcium-abhängig ist, kann die Säule durch Waschen in Gegenwart eines Calcium-Chelatbildners, der das Protein nicht denaturiert, eluiert werden. Das Faktor X-Derivat, das auf diese Weise gereinigt wurde, kann direkt eingesetzt werden.
In diesem Fall wird das QAI-SEPHADEX-Eluat zuvor mit 5 mM recalcifiziert, indem CaCl₂ zugesetzt wird. Die Säule wird in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 0,5 M NaCl und 1 mM CaCl₂ enthält, gewaschen, und das Faktor X-Derivat wird in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 100 mM NaCl und 5 mM EDTA enthält, eluiert.
Insgesamt werden mindestens 10 mg jedes der Faktor X-Derivate hergestellt.
Welches Protokoll auch verwendet wird, die Reinheit der Präparation wird nach Denaturierung und Reduktion einer Probe durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese (12%, Vernetzung 29/1) und Färbung mit Coomassie-Blau kontrolliert.
Alle erhaltenen Präparationen scheinen an einem SDS-Polyacrylamidgel rein zu sein, aber zwei Formen sind systematisch vorhanden: eine Haupt-Doppelkettenform (80 bis 90%) mit scheinbaren Molekülmassen, die mit denen, die für die schwere und leichte Kette erwartet werden (50 und 23 kDa für FX-rekombinant; 50 und 18 kDa für die Derivate, denen die Gla-Domäne fehlt), kompatibel sind; eine kleinere Einzelkettenform (in Abhängigkeit von den Präparationen 10 bis 20%) mit einer Molekülmasse von 66 kDa für FX-rekombinant und 60 kDa für die Derivate, denen die Gla-Domäne fehlt).
Der prozentuale Gehalt an Einzel-Kettenform scheint eher von dem Pool an Überständen, aus dem die Präparation stammt, als von der eingeführten Mutation abzuhängen: für eine gegebene Mutation variiert der prozentuale Anteil der Einzelkttenform von einer Reinigung zu der anderen.
Die gereinigten Derivate werden in Aliquots aufgeteilt und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Die Konzentration des Aliquots wird durch seine Extinktion bei 280 nm be stimmt, wobei 1,25 g^–1 × 1 cm^–1 als der molare Absorptionskoeffizient (ε%₂₈₀) angenommen wird.
BEISPIEL 4: THROMBIN-AKTIVIERUNG DER FAKTOR X-DERIVATE
Nativer Faktor X kann nur durch seine physiologischen Aktivatoren (Tenase- oder Gewebefaktor-Komplexe) und durch bestimmte Schlangengifte, von denen das am häufigsten eingesetzte Russell's-Schlangengiftextrakt (RVV-X) ist, aktiviert werden. Die Gla-Domäne von Faktor X spielt bei dieser Aktivierung eine sehr wichtige Rolle: die Aktivierungsgeschwindigkeit für normalen Faktor X, dem die Gla-Domäne fehlt, ist durchschnittlich etwa einhundert Mal langsamer als die des kompletten Faktor X.
Der FX-rekombinant verhält sich im Wesentlichen ähnlich wie der Plasmafaktor X, außer dass ein Teil (der durch die BHK-21-Zellen unkorrekt γ-carboxyliert wird) schwierig zu aktivieren ist und innerhalb des Prothrombinase-Komplexes nur schwach aktiv ist. Die Faktor X-Derivate, denen die Gla-Domäne fehlt, bleiben durch den isolierten Schlangengift-Aktivator spaltbar (langsam) und (zu einem gewissen Ausmaß) durch die physiologischen Komplexe spaltbar.
Die Fähigkeit der Derivate, denen die Gla-Domäne fehlt, durch Thrombin gespalten zu werden, wurde untersucht.
Es wurden zwei Verfahren verwendet, um die Spaltungsgeschwindigkeit bzw. Spaltungsrate der Faktor X-Derivate durch Thrombin zu beurteilen, und zwar in Abhängigkeit davon, ob diese Spaltung eine detektierbare amidolytische Aktivität erzeugt oder nicht. Im ersten Fall wird die durch den aktivierten Faktor erzeugte amidolytische Aktivität gemessen, und im zweiten Fall wird die gespaltene Form quantitativ durch Elektrophorese bestimmt.
Messung der amidolytischen Aktivität:
Die Geschwindigkeitskonstanten für die Aktivierung der Faktor X-Derivate durch Thrombin werden unter Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen bestimmt, d.h., die Konzentration des Zymogens entspricht fast dem 0,1-Fachen der Konzentration zur Halbsättigung des Aktivators (sein K_m-Wert). Unter diesen Bedingungen ist die gemessene Geschwindigkeitskonstante proportional zu der Spezifitätskonstante (k_cat/K_m) des Aktivators (Thrombin) für sein Substrat (das Zymogen, das von Faktor X abgeleitet ist). Ohne den Wert der K_m zu kennen, ist es möglich, zu verifizieren, dass die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung erfüllt ist, indem die Aktivierungsgeschwindigkeit bei zwei Substratkonzentrationen gemessen wird: die Geschwindigkeitskonstante, die gemessen wurde, sollte für die zwei Zymogen-Konzentrationen dieselbe sein (unter Berücksichtigung experimenteller Fehler).
Jedes Faktor X-Derivat (zwischen 1 und 10 μM) wird in Gegenwart von Thrombin (100 nM) in Kinetikpuffer (50 mM Tris, pH 7,8, enthaltend 150 mM NaCl, 0,2% PEG 8000 (G/V) und 5 mM CaCl₂) bei 37°C inkubiert. Nach Variation der Inkubationszeiten wird ein 10 μl-Aliquot gesammelt, dem 1 μM (100 Einheiten pro ml) Hirudin (REFLUDAN, HOECHST, Frankfurt, Deutschland) zugesetzt wird (um die Reaktion durch Neutralisierung von Thrombin zu stoppen). Die Menge der aktiven Form, die erzeugt wird, wird durch die amidolytische Aktivität des aktivierten Derivats bestimmt. Nachdem 100 μM N-α-Z-Arg-Gly-Arg-pNA (S2765, BIOGENIC, Maurin, Frankreich) zugesetzt worden war, wird die amidolytische Aktivität durch Aufzeichnung der Variation bei der Extinktion bei 400 nM als Funktion der Zeit (die Anfangsgeschwindigkeit bzw. Anfangsrate der Hydrolyse von S2765) unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts (DYNEX, Guyanocourt, Frankreich) gemessen. Vor der Zugabe von Thrombin ist die Hydrolysegeschwindigkeit bzw. Hydrolyserate von S2765 null, da das Faktor X-Derivat vollständig in der Zymogen-Form ist. Durch Auftragen der Anfangsgeschwindigkeit der Hydrolyse von S2765 als Funktion der Inkubationszeit des Zymogen mit Thrombin wird eine Kurve erhalten, die es durch nicht-lineare Regression möglich macht, die Geschwindigkeitskonstante für eine Aktivierung des Zymogen (k) zu bestimmen, wobei Gleichung 1 verwendet wird, die eine exponentielle Zunahme erster Ordnung darstellt: Vt = V0 + Vmax(1 – exp(–kt)) (Gleichung 1)worin V_t die Hydrolysegeschwindigkeit bzw. Hydrolyserate des chromogenen Substrats zur Zeit t darstellt, V₀ die Hydrolysegeschwindigkeit des chromogenen Substrats zur Zeit null (normalerweise null) darstellt, und V_max die Hydrolysegeschwindigkeit bzw. Hydrolyserate des chromogenen Substrats zu unendlicher Zeit darstellt (wenn das gesamte Zymogen aktiviert ist). Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung befolgt wird, ist der Wert für k gleich der Konzentration des Aktivators (Thrombin) multipliziert mit k_cat/K_m für die Zymogen-Aktivierungsreaktion. Dieses Verfahren macht es daher möglich, die Fähigkeit von Thrombin, die Faktor X-Derivate, die amidolytische Aktivität nach Aktivierung erzeugen, zu vergleichen. Dieses Verfahren ist anwendbar, wann immer die amidolytische Aktivität erzeugt wird, wobei die einzige Bedingung ist, dass eine katalytische Aktivität gemessen werden kann: es ist in der Tat dasselbe wie die Messung der prozentualen Aktivierung als Funktion der Zeit.
Quantitative Bestimmung durch Elektrophorese
Wenn keine katalytische Aktivität detektierbar ist, wird alternativ die Fähigkeit von Thrombin, das Faktor x-Derivat zu spalten, auf SDS-Polyacrylamid-Gel detektiert. Eine Inkubation des Substrats Zymogen mit seinem Aktivator wird unter denselben Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen wie oben durchgeführt. Nach variierenden Inkubationszeiten wird ein 20 μl-Aliquot entnommen und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12%, Vernetzung 29/1) nach Denaturierung und Reduktion der Probe analysiert.
Nach Färbung mit Coomassie-Blau wird das Gel gescannt und die Intensität jeder Migrationsbande wird durch Bildgebungs-Software abgeschätzt (SCION-IMAGE, erhältlich unter der Adresse http://www.scioncorp.com).
Dieses Verfahren macht es möglich, für jede Probe den prozentualen Anteil jeder Form des Faktor X-Derivats (inaktive Einzelkette, inaktive Doppelkette, aktiviert in α-Form, aktiviert in β-Form) zu beurteilen. Indem die Intensität der Banden, die den aktivierten Formen entsprechen, als Funktion der Inkubationszeit des Zymogens mit Thrombin aufgetragen wird, wird eine Kurve erhalten, die es durch nicht-lineare Regression möglich macht, die Geschwindigkeitskonstante für eine Aktivierung des Zymogens zu bestimmen (k), wobei Gleichung 1 verwendet wird, in der V_t, V₀ und V_max jeweils ersetzt sind durch: die Intensität der Bande zur Zeit t, zur Zeit null (normalerweise null) und zu unendlicher Zeit (wenn 100% des Zymogens aktiviert sind). Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung erfüllt ist, ist der Wert für k gleich der Konzentration des Aktivators (Thrombin), multipliziert mit k_cat/K_m für die Zymogen-Aktivierungsreaktion. In der Praxis ist es zuverlässiger, das Verschwinden des Zymogens mit der Zeit zu beurteilen. Durch Auftragen der Intensität der Banden, die den Zymogen-Formen entsprechen, als Funktion der Inkubationszeit mit Thrombin, wird eine Kurve erhalten, die es unter Verwendung der Gleichung 2 unten (die eine exponentielle Abnahme erster Ordnung darstellt) durch nicht-lineare Regression möglich macht, die Geschwindigkeitskonstante für die Aktivierung des Zymogens zu bestimmen: dt = d0 + dminexp(–kt) (Gleichung 2)
In dieser Gleichung stellt d_t die Dichte zur Zeit t dar, d₀ die Dichte zur Zeit null dar (die maximal ist) und stellt d_min die Dichte bei unendlicher Zeit dar (die null ist, wenn das gesamte Zymogen aktiviert ist). Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung erfüllt ist, ist der Wert für k gleich der Konzentration des Aktivators (Thrombin) multipliziert mit k_cat/K_m die Zymogen-Aktivierungsreaktion. Dieses Verfahren ist anwendbar, wann immer das Faktor X-Derivat betrachtet wird, ist aber weniger genau als das chromogene Verfahren.
Die Resultate sind in Tabelle V angegeben.
Der Wert für k_cat/K_m die Aktivierung jedes Faktors X-Derivats durch Thrombin ist angegeben, ebenso wie der Standardfehler (ausgedrückt als Prozentwert des erhaltenen Werts).
TABELLE V
Wie sein normales Plasma-Homologes, ist das FX-rekombinant durch Thrombin nicht nachweisbar spaltbar (ND), wie es auch bei dem GD-FX-Derivat der Fall ist. Andererseits wird das GDX-FX-Derivat durch Thrombin sehr schnell gespalten: der Wert für k_cat/K_m ist 4 × 10³ M^–1 s^–1; dem gespaltenen Derivat fehlt allerdings amidolytische Aktivität. Das GDX-SVG-Derivat wird ebenfalls durch Thrombin gespalten, erzeugt aber keine detektierbare amidolytische Aktivität. Der Wert für k_cat/K_m für die Spaltung des GDX-AVG-Derivats durch Thrombin ist 10² × M^–1 s^–1, und das aktivierte Derivat hat leicht detektierbare amidolytische Aktivität. Die anderen Faktor X-Derivate (GDX-IVG, GDX-IFG und GDX-IFR) scheinen Thrombin-spaltbar zu sein, allerdings ist die Reaktion zu langsam, um den Wert für k_cat/K_m zuverlässig bestimmen zu können.
BEISPIEL 5: HERSTELLUNG UND CHARAKTERISIERUNG DER AKTIVIERTEN FORM DER FAKTOR X-DERIVATE
Um die katalytische Aktivität (nach Spaltung) jedes der Faktor X-Derivate gründlich zu charakterisieren, wurden mehrere Milligramm jedes Derivats aktiviert und gereinigt.
Die Faktor X-Derivate, die in Position P₃, P₂ und P₁ ihrer Aktivierungsstelle die Sequenz LTR (FX-rekombinant und GD-FX-Derivat) tragen, sind nicht Thrombin-spaltbar. Sie wurden aktiviert, indem sie über eine HITRAP NHS-aktivierte Säule (5 ml) (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH), die mit 5 mg/ml Gel mit isoliertem Russell-Schlangengift (RVV-X)-Aktivator (KORDIA, Leiden, Niederlande) gepfropft worden war, geleitet wurden. Vier Milligramm Faktor X-Derivat in 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ und 0,2% (G/V) PEG 800 enthält, werden in die mit RVV-X gepfropfte Säule eingeleitet. Die Säule wird an beiden Enden verschlossen, und die Inkubation wird für 16 Stunden bei Umgebungstemperatur aufrechterhalten. Das aktivierte Derivat wird mit 50 mM Tris, pH 7,5, der 0,5 M NaCl und 5 mM CaCl₂ enthält, eluiert. Das Eluat enthält hauptsächlich die aktivierte Form, allerdings ist die Aktivierung nicht immer vollständig. Um das Eluat mit aktivierter Form anzureichern, wird es 1/3 in 50 mM Tris, pH 7,5, der 5 mM CaCl₂ (zur Verringerung der Ionenstärke) enthält, verdünnt, auf eine 1 ml HITRAP Heparin-SEPHAROSE-Säule (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) geladen und mit 50 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 0,5 M NaCl und 5 mM CaCl₂ enthält, eluiert.
Die anderen Faktor X-Derivate, die durch Thrombin aktiviert werden können (wenn auch langsam), wurden alle aktiviert, indem sie über eine HITRAP NHS-aktivierte Säule (1 ml) (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH) geleitet wurden, welche mit 1 mg/ml Gel mit Thrombin gepfropft war. Die Inkubationsbedingungen (Konzentration, Puffer, Temperatur und Dauer) sind dieselben wie für die Aktivierung durch Durchleiten durch die Säule, die mit RVV-X gepfropft war, wie auch für die Elution aus der Säule und die Reinigung der aktivierten Form des Derivats an Heparin-SEPHAROSE.
Die N-terminale Sequenz der schweren Kette, die durch Aktivierung der verschiedenen Faktor X-Derivate produziert wurde, wurde durch Mikrosequenzierung bestimmt. Jede erhaltene Sequenz entspricht eindeutig dem N-terminalen Ende, das für die schwere Kette der aktivierten Form des betrachteten Derivats (IVG, IFG, IFR, AVG, SVG oder SFR) nach Spaltung zwischen den Resten P₁ und P₁' der Aktivierungsstelle erwartet wird.
Wechselwirkung mit Chlormethylketon-Peptiden:
Chlormethylketon-Peptide sind irreversible Serinprotease-Inhibitoren, die einen äquimolekularen und kovalenten Komplex mit ihrem Ziel bilden. Die Wechselwirkungsrate eines Chlormethylketon-Peptids mit einer Protease hängt von der Sequenz ab, die der Chlormethylke tongruppe vorausgeht. Diese Inhibitoren machen es in der Tat möglich, die Integrität der aktiven Stelle des Targets zu beurteilen: die Geschwindigkeitskonstante für die Reaktion (die k_on) ist in der Tat eine Signatur, die für jedes Inhibitor/Protease-Paar spezifisch ist. Eines der reaktivsten Chlormethylketon-Peptide mit der aktivierten Form von Faktor X ist D-Phe-Phe-Arg-CH₃Cl (D-FFR-CK, auf dem Markt von CALBIOCHEM, Meudon, Frankreich). Wenn die Reaktion unter Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen durchgeführt wird, kann die k_on geschätzt werden, selbst wenn die genaue Konzentration des Targets nicht bekannt ist. Sobald die k_on bekannt ist, ist es möglich, die experimentellen Bedingungen vorauszusagen, die es ermöglichen werden, die Konzentration der aktiven Stelle für die Protease genau zu bestimmen (siehe unten). Diese Bestimmung ist eine Vorbedingung für eine echte funktionelle Charakterisierung.
Eine Menge der aktivierten Form des Faktor X-Derivats, die ausreicht, um eine einfach detektierbare amidolytische Aktivität zu erhalten, wird in einem Reaktionsvolumen von 10 μl für einen gegebenen Zeitraum in Gegenwart einer fixierten Konzentration an D-FFR-CK in Kinetikpuffer bei 25°C inkubiert. Die Konzentration der Reagentien ist in der Tat sehr variabel: 30 nM bis 1,8 μM an aktivierter Form (entsprechend der Extinktion bei 280 nm), abhängig vom Faktor X-Derivat, um eine einfach detektierbare amidolytische Aktivität zu haben (10% Hydrolyse des chromogenen Substrats in 30 Minuten). Die Konzentration an zugesetztem D-FFR-CK sollte viel größer sein als die seines Targets, so dass die Reaktion unter Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen abläuft. Die Konzentration an D-FFR-CK sollte allerdings nicht zu hoch sein, ansonsten ist die Reaktion zu schnell. Typischerweise werden drei Konzentrationen an D-FFR-CK verwendet, die den 10-, 20- und 40-fachen derjenigen des Targets (bestimmt durch seine Extinktion bei 280 nm) entsprechen. Dasselbe Experiment wird zwö1fmal wiederholt, wobei die Inkubationszeit von einem Experiment zum anderen variiert wird (von 10 Sekunden für das erste bis 5 Stunden für das letzte, so dass die Inkubationszeit für ein gegebenes Experiment die doppelte derjenigen des vorangehenden ist). Am Ende jeder Inkubation werden 190 μl 100 μM S2765 in Kinetikpuffer zugesetzt, und die restliche amidolytische Aktivität wird durch Aufzeichnung der Variation in der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit (d.h., die Anfangs-Hydrolysegeschwindigkeit des S2765) unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Durch Auftragung der Hydrolysegeschwindigkeit des S2765 als Funktion der Inkubationszeit des Inhibitors mit seinem Target wird eine Kurve erhalten, die es möglich macht, durch nicht-lineare Regression unter Verwendung von Gleichung 2 die Geschwindigkeitskonstante für die Inaktivierung der aktivierten Form des Faktors X-Derivats abzuschätzen. Die Parameter d_t, d₀ und d_min von Gleichung 2 stellen in diesem Fall die restliche Aktivität zur Zeit t, die Anfangs-Aktivität (die ein Maximum ist) und die Aktivität zur unendlichen Zeit (die normalerweise 0 ist) dar. Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung erfüllt ist, ist der für k erhaltene Wert gleich der Inhibitorkonzentration multipliziert mit seinem k_on für das Enzym.
Die Werte für k_on von D-FFR-CK für die aktivierten Formen der Faktor X-Derivate, die erhalten wurden, sind in Tabelle VI, ebenso wie der Standardfehler (ausgedrückt als Prozent wert des erhaltenen Wertes), zusammengefasst. Die k_on für die Derivate, denen katalytische Aktivität fehlt, kann durch das angewendete Verfahren nicht bestimmt werden (NB).
TABELLE VI
Die Werte für k_on der aktivierten Form des FX-rekombinant-Derivats, der aktivierten Form des GD-FX-Derivats und der aktivierten Form des GDX-IVG-Derivats sind alle ähnlich dem Wert, der mit der aktivierten Form des Faktor X aus Plasma erhalten wird. Dieses Resultat war erwartet worden: die Zymogene dieser Faktor X-Derivate unterscheiden sich durch das Vorliegen oder das Fehlen einer Gla-Domäne und auch durch die Reste P₃ und P₂ stromaufwärts der Aktivierungsstelle, allerdings ist die katalytische Domäne des Produktes ihrer Aktivierung identisch.
Der Wert für k_on für die aktivierte Form des GDX-IFG-Derivats ist 20mal niedriger; dies legt nahe, dass die katalytische Furche dieses Faktor X-Derivats durch die Mutation nicht strikt konserviert wird. Der Wert für k_on für die aktivierte Form des GDX-AVG-Derivats ist 1000mal geringer. Die Faktor X-Derivate, denen nach Spaltung detektierbare amidolytische Aktivität fehlt (GDX-IFR, GDX-SVG und GDX-SFR), können durch dieses Verfahren nicht analysiert werden.
Titration der aktivierten Form von Faktor X-Derivaten:
Die aktive Stellen-Konzentration für die aktivierte Form der Faktor X-Derivate ist ein Wert, der essentiell ist, um zu bestimmen, ob es möglich ist, die effektive katalytische Aktivität jeder Mutante zu beurteilen. Die Extinktion bei 280 nm macht es in der Tat möglich, die Konzentration der gereinigten Protease zu errechnen, aber sie liefert nicht den Verhältnisanteil der Probe, der in der aktiven Form ist. Andererseits macht eine Titration es möglich, die Konzentration an aktiver Form, wie auch immer der Prozentgehalt an restlicher Zymogen-Form ist, oder die intrinsische Aktivität der Mutante im Vergleich zu der normalen Protease abzuschätzen.
Ein sehr genaues Verfahren zum Titrieren der Serinproteasen basiert auf der Verwendung eines Chlormethylketon-Peptids, unter der Bedingung, dass das Enzym messbare katalytische Aktivität hat und dass die Halbwertszeit der Reaktion der titrierenden Substanz mit ihrem Target vorausgesagt werden kann. Drei der aktivierten Formen von Faktor X-Derivaten genügen diesen Kriterien und wurden durch dieses Verfahren titriert: durch Messung der restlichen amidolytischen Aktivität nach Inkubation mit steigenden Konzentrationen an Inhibitor. Das verwendete Chlormethylketon-Peptid ist D-FFR-CK, für das der k_on-Wert für jedes Target oben bestimmt wurde.
Steigende Konzentrationen an D-FFR-CK, zwischen 20 nM und 12 μM, werden mit einer festgelegten Menge (0,5 bis 1 μM) der aktiven Form des Faktor X-Derivats, das zu titrieren ist, in Kinetikpuffer bei 25°C inkubiert. Die Inkubation wird aufrechterhalten, bis die Reaktion vollständig ist: d.h., ein Minimum von 10 Halbwertszeiten wird abgedeckt (die Halbwertszeit der Reaktion entspricht dem natürlichen Logarithmus von 2 geteilt durch das Produkt aus der k_on und der Konzentration des Inhibitors). Am Ende dieser Inkubation werden 190 μl 100 μM S2765 in Kinetikpuffer zugesetzt, und die restliche amidolytische Aktivität wird durch Aufzeichnung der Variation in der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit (d.h., die Anfangs-Hydrolysegeschwindigkeit des S2765) unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts gemessen. Durch Auftragen der Hydrolyserate des S2765 als Funktion der Konzentration von D-FFR-CK wird eine gerade Linie erhalten, für die die Abszisse am Ursprung der Anfangskonzentration des aktiven Enzyms entspricht (LE BONNIEC et al., Biochemistry, 33, 3959-3966, 1994).
Die aktivierte Form des GDX-AVG-Derivats konnte durch dieses Verfahren nicht bestimmt werden, da der Wert für k_on von D-FFR-CK (2 M^–1 s^–1) zu niedrig ist, um fähig zu sein, die Reaktion in einem vernünftigen Zeitraum zu beenden: in Gegenwart von 1 μM D-FFR-CK wäre es notwendig, die Reaktion für 15 Tage aufrecht zu erhalten, um etwa zehn Halbwertszeiten abzudecken, wohingegen die Stabilität von D-FFR-CK bei pH 7,5 48 Stunden nicht übersteigt. Die "aktivierten" Formen der Faktor X-Derivate, denen detektierbare amidolytische Aktivität fehlt (GDX-IFR, GDX-SVG und GDX-SFR), konnten unter Verwendung von D-FFR-CK nicht titriert werden. Für diese Derivate wurde der prozentuale Anteil der aktiven Form in einfacher Weise durch Densitometrie nach Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12%, Vernetzung 29/1), nach Denaturierung und Reduktion der Probe (wie oben zur Identifizierung der BHK-21-Klone, die ein Faktor X-Derivat produzieren, beschrieben) bestimmt. Nach Färbung mit Coomassie-Blau wird das Gel gescannt und die Intensität der Banden, die den aktivierten α- und β-schweren Ketten entsprechen, wird verglichen mit denen der restlichen ungespaltenen Formen, wobei die Analysen-Software SCION-IMAGE verwendet wird. Dieses Verfahren macht es möglich, den prozentualen Anteil an aktivierter Form für jedes Aliquot an Faktor X-Derivat zu beurteilen. Indem dieser prozentuale Anteil von aktivierten Formen mit der Gesamtkonzentration, die über die Extinktion bei 280 nm bestimmt wurde, verglichen wird, wird die effektive Konzentration an aktivierter α- und β-Form daraus abgeleitet.
Dieses Verfahren ist arbeitsintensiver als das vorstehende, aber genügend zuverlässig, um geeignet zu sein, eine funktionelle Charakterisierung der betroffenen Mutanten durchzuführen.
Amidolytische Aktivität:
Die amidolytische Aktivität von Serinproteasen involviert nur ihre katalytische Furche und ihr Ladungsübertragungssystem. Sie wird unter Verwendung synthetischer Substrate gemessen, welche aus einem kleinen Peptid bestehen, das am C-Terminus eine para-Nitroanilidgruppe trägt; während der Hydrolyse dieser Substrate wird para-Nitroanilin auf (pNA), das bei 405 nm leicht detektierbar ist, freigesetzt. Diese Peptide ermöglichen eine sehr feine Charakterisierung der katalytischen Maschinerie einer Protease: k_cat und K_m für die Hydrolyse für eines dieser Substrate bilden hier wiederum eine Signatur, die für jedes Enzym/Substrat-Paar einzigartig ist. Die Messung der amidolytischen Aktivität der aktivierten Formen der Faktor X-Derivate macht es demnach möglich, zu detektieren, ob ihre katalytische Maschinerie verändert worden ist oder nicht. Für diese Analyse wurden zwei chromogene Substrate eingesetzt: S2765 und Benzyl-CO-Ile-Glu-(γ-OR)-Gly-Arg-pNA (S2222), von BIOGENIC auf dem Markt.
Die Werte für k_cat und K_m der aktivierten Formen der Faktor X-Derivate werden bei 25°C in Kinetikpuffer bestimmt. Variierende Substratkonzentrationen (zwischen 6 und 800 μM) werden mit einer fixierten Menge der aktivierten Form des Faktor Xa-Derivats (10 nM bis 0,5 μM, abhängig von der aktivierten Form des Faktor X-Derivats, so dass wenigstens 10% des chromogenen Substrats in 30 Minuten hydrolysiert werden) inkubiert. Die Variation bei der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit wird unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts aufgezeichnet, und die Anfangs-Hydrolyserate wird durch lineare Regression (nur die Extinktionen, die höchstens 15% Hydrolyse des Substrats entsprechen, werden für die Analyse berücksichtigt) bestimmt. Die Werte für k_cat und für K_m werden durch nicht-lineare Regression der Variation bei der Anfangshydrolyserate als Funktion der Anfangskonzentration des Substrats unter Verwendung der Michaelis-Menten-Gleichung bestimmt.
Die Werte für k_cat und K_m und das k_cat/K_m-Verhältnis von S2222 und S2765, und auch der Standardfehler (ausgedrückt als Prozentwert des erhaltenen Werts) für die aktivierten Formen der Faktor X-Derivate sind in Tabelle VII angegeben.
Diese Konstanten können für die Derivate, denen detektierbare amidolytische Aktivität fehlt (NB) nicht bestimmt werden.
TABELLE VII
Die Werte von k_cat und K_m für die aktivierte Form des FX-rekombinant-Derivats, die der aktivierten Form des FX-rekombinant, dem die Gla-Domäne fehlt, und die des GDX-IVG-Derivats sind ähnlich denen, die für die aktivierte Form des Faktors X aus dem Plasma erhalten wurden (sie unterscheiden sich höchstens um einen Faktor von zwei). Außer dem C-terminalen Epitop ist die katalytische Domäne, die während der Aktivierung dieser Faktor X-Derivate gebildet wird, identisch; wie für k_on von D-FFR-CK wurde erwartet, dass ihre amidolytischen Aktivitäten wenigstens vergleichbar sind. Es ist interessant, zu bemerken, dass das Fehlen der Gla-Domäne keine bedeutenden Effekte auf die amidolytische Aktivität der aktivierten Form des Derivats hat; dies legt nahe, dass sie keinen Einfluss auf die Struktur der katalytischen Furche der aktivieren Form des Faktors X hat. Im Vergleich ist der Wert für k_cat der aktivierten Form des GDX-IFG-Derivats verringert (10-fach für S2222 und 3-fach für S2765); der Wert für K_m ist in ähnlicher Weise erhöht (5- bis 10-fach). Insgesamt ist das Verhältnis k_cat/K_m für diese chromogenen Substrate 30- bis 50-mal kleiner als für die aktivierte Form von normalem Faktor X, eine Abnahme, die demnach in derselben Größenordnung ist wie die, die für k_on von D-FRR-CK beobachtet wurde (2-fach). Die Abnahme beim Wert für k_cat der aktivierten Form des GDX-AVG-Derivats ist in einem viel größeren Verhältnisanteil (etwa 100-fach für S2222, etwa 10-fach für S2765) wie der Anstieg der K_m (5 mal höher für S2222, 40 mal höher für S2765). Insgesamt ist das Verhältnis k_cat/K_m für diese chromogenen Substrate 400- bis 600 mal kleiner als für die aktivierte Form des normalen Faktors X, diese Werte stehen in Übereinstimmung mit der für k_on für D-FFR-CK beobachteten Abnahme (1000-fach). Diese Resultate bestätigen, dass die Mutationen, die von den GDX-IFG- und GDX-AVG-Derivaten getragen werden, klar strukturelle Modifikationen in der katalytischen Furche induzieren und/oder die Aktivität des Ladungsübertragungssystems stören.
Aktivität innerhalb des Prothrombinase-Komplexes:
Nativer Faktor Xa ist im Vergleich zu Trypsin oder Prothrombin kein sehr aktives Enzym. Nur wenn das Enzym in Gegenwart von Phospholipiden und Calcium an seinem Cofaktor (Gerinnungsfaktor Va) bindet, wird die Prothrombin-Aktivierungsreaktion physiologisch sehr schnell (die Reaktion ist in Gegenwart der Cofaktoren 1000mal schneller als in ihrer Abwesenheit). Die Aktivität innerhalb des Prothrombinase-Komplexes ist jedoch vom Vorliegen einer Gla-Domäne stark abhängig: ohne sie wird die Geschwindigkeit nur höchstens 50-fach erhöht. Der Unterschied ist jedoch größtenteils ausreichend, um detektieren zu können, ob die aktivierte Form der Faktor X-Derivate mit Faktor Va wechselwirkt oder nicht, und speziell, ob der Cofaktor eine effektive Aktivierung von Prothrombin ermöglicht oder nicht. Die Erfinder haben daher die Aktivierungsrate von Prothrombin durch jede der aktivierten Formen der Faktor X-Derivate in Gegenwart wie auch in Abwesenheit von Faktor Va, Phospholipiden und Calcium verglichen.
Der Cofaktoreffekt von Faktor Va (KORDIA) wird in einem streng kontrollierten, gereinigten System untersucht: das Prothrombin wird insbesondere immungereinigt (LE BONNIEC et al., J. Biol. Chem., 266, 13796-803, 1991; LE BONNIEC et al., 1992, oben erwähnt), um frei von einer Spurenmenge der aktivierten Form (Faktor X oder von Thrombin) zu sein. Die Aktivierung dieses Prothrombins wird durch die Bildung von Thrombin, das daraus resultiert, detektiert. Die Reaktion wird durch das Vorliegen eines chromogenen Substrats, H-D-Phe-Pip-Arg-pNA (S2238, BIOGENIC), das für Thrombin viel empfindlicher ist als für die aktivierte Form von Faktor X, im Reaktionsmedium kontinuierlich verfolgt. Zur Zeit null gibt es kein Thrombin, und es gibt nur eine unbedeutende Hydrolyse von S2238 durch die aktivierte Form des Faktors X-Derivats. Während der Reaktion nimmt die Thrombinkonzentration in linearer Art mit der Zeit zu (wenn die Reaktion zur Aktivierung von Prothrombin durch die aktivierte Form des Faktor X-Derivats im stabilen Zustand ist). Die Hydrolyserate von S2238 ist direkt proportional zu der Thrombinkonzentration, allerdings nimmt diese mit der Zeit zu. Die Spaltungsrate ist daher nicht konstant; sie steigt rasch an: die Reaktion beschleunigt sich. Es ist möglich, zu zeigen (KOSOW, Thromb. Res. Suppl., 4, 219-227, 1974), dass die Menge an pNA, die durch hydrolysiertes S2238 freigesetzt wird (daher die Extinktion bei 405 nm des Gemisches), proportional zum Beschleunigungs-Koeffizienten der Reaktion multipliziert mit der Zeit im Quadrat ist; der Beschleunigungs-Koeffizient selbst ist direkt proportional zu der Anfangsrate der Thrombinbildung. In der Praxis werden 195 μl Kinetikpuffer, der 100 μM S2238, 0,5 μM Prothrombin und 35 μM Phospholipidvesikel (Gemisch aus Phosphatidylserin und Phosphatidylcholin im Verhältnis 20%-80% G/G) in Gegenwart oder Abwesenheit von 20 nM Faktor Va enthält, bei 37°C in einer Mikrotiterplatte vorinkubiert. Die Reaktion wird durch Zusatz von 2,5 nM der aktivierten Form des Faktors X-Derivats (5 μl mit 50 nM) ausgelöst, und die Veränderung bei der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit wird unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts aufgezeichnet. Durch Auftragen der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Inkubationszeit wird eine Kurve erhalten, die es durch nichtlineare Regression möglich macht, c, den Beschleunigungs-Koeffizienten für die Reaktion, unter Verwendung von Gleichung 3 zu bestimmen: A405 = Ao+ bt + ct2 (Gleichung 3)worin A_o die Anfangsextinktion des Gemisches bei 400 nm (vor Zusatz des Enzyms) darstellt, und b die Hydrolyserate von S2238 durch die aktivierte Form des Faktor X-Derivats (die in der Praxis vernachlässigbar ist) darstellt. Wenn die Reaktion zur Aktivierung von Prothrombin durch die aktivierte Form des Faktor X-Derivats im stabilen Zustand ist, und wenn die Restkonzentration an nicht-hydrolysiertem S2238 viel größer als seine K_m für Thrombin (3,6 μM) bleibt, ist der Parameter c effektiv proportional zur Anfangsrate der Aktivierung von Prothrombin durch die aktivierte Form des Faktor X-Derivats. Um diese Bedingungen zu erfüllen, werden nur die experimentellen Punkte, die weniger als 15% Hydrolyse jedes Substrats (Prothrombin und S2238) entsprechen, zur Analyse durch nicht-lineare Regression berücksichtigt. Dieser Ansatz macht es nicht möglich, die katalytischen Konstanten für die Aktivierung von Prothrombin durch die aktivierte Form der Faktor X-Derivate zu bestimmen; er macht es nur möglich, wenn die Reaktion unter identischen Bedingungen durchgeführt wird, um die Aktivität der zwei Enzyme zu vergleichen (hier wird die Aktivität jeder aktivierten Form von Faktor X-Derivaten mit der der aktivierten Form, der die Gla-Domäne fehlt, die als Referenz dient, verglichen).
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle VIII zusammengefasst.
Die Beschleunigungs-Koeffizienten der pNA-Freisetzung durch das durch den Prothrombinase-Komplex (+ Faktor Va) oder durch das aktivierte Faktor X-Derivat allein (– Faktor Va) erzeugte Thrombin sind zusammen mit dem Standardfehler (ausgedrückt als Prozentwert des erhaltenen Werts) angegeben.
TABELLE VIII
In Gegenwart von Phospholipiden und Calcium (aber in Abwesenheit von Faktor Va) ist die Aktivierung des Prothrombins sehr langsam und schwierig zu detektieren, einschließlich für die aktivierte Form von Faktor X, dem die Gla-Domäne fehlt, oder die seines GDX-IVG-Derivats; der Zusatz von Faktor Va erhöht die Aktivierungsrate des Thrombins 50-fach bzw. 10-fach. In Abwesenheit von Faktor Va ist eine Aktivierung des Prothrombins für keine der anderen aktivierten Formen von Faktor X-Derivaten (GDX-AVG, GDX-IFG, GDX-IFR, GDX-SVG und GDX-SFR) detektierbar. Der Zusatz von Faktor Va macht es möglich, die Aktivierungsrate des Prothrombins durch die aktivierte Form des GDX-AVG-Derivats beträchtlich zu erhöhen: diese ist nur 13-fach geringer als die, die für die aktivierte Form seines nicht-mutierten Homologen (GDX-IVG) erhalten wird. Es scheint daher, dass Faktor Va zum großen Teil die katalytische Aktivität der aktivierten Form des GDX-AVG-Derivats wieder herstellt, da die katalytischen Furchen-Proben (D-FFR-CK, S2765 und S2222) im Vergleich zu seinem nicht-mutierten Homologen eine Katalyseeffizienz widerspiegeln, die wenigstens 400-fach verringert ist. Bei den anderen aktivierten Formen der Faktor X-Derivate (GDX-IFG, GDX-IFR, GDX-SVG und GDX-SFR) ist der Zusatz von Faktor Va weit davon entfernt, einen solchen Effekt zu haben: er macht es nicht möglich, eine Aktivierung von Prothrombin zu detektieren (NB).
Inhibierung durch Antithrombin:
Der wirksamste Plasma-Inhibitor der aktivierten Form von Faktor X ist der Gewebefaktor-Inhibitor (tissue factor pathway inhibitor = TFPI); der Wert für seine k_on für die Wechselwirkung mit der aktivierten Form von Faktor X ist größer als 10⁵ M^–1 s^–1. Allerdings bedeutet die Plasmakonzentration an TFPI (2,5 nM), dass dieser Inhibitor eine relativ geringe Rolle bei der Inhibierung der aktivierten Form von Faktor X spielt (sein physiologisches Target ist eher Gerinnungsfaktor VIIa).
Antithrombin (allein) ist ein relativ wenig kräftiger Inhibitor, da der Wert für seine k_on für die Wechselwirkung mit der aktivierten Form von Faktor X nur in der Größenordnung von 10⁴ M^–1 s^–1 liegt. Die Plasmakonzentration von Antithrombin (2,3 μM) macht es allerdings zum physiologischen Haupt-Inhibitor von Faktor Xa: bei dieser Konzentration wäre die Plasma- Halbwertszeit der aktivierten Form von Faktor X nur 30 Sekunden (wir haben experimentell eine Minute gemessen, siehe unten). Insbesondere in Gegenwart von Heparin übersteigt der Wert für k_on von Antithrombin für die Wechselwirkung mit der aktivierten Form von Faktor X 10⁶ M^–1 s^–1, d.h., für eine Antithrombin-Plasmakonzentration von 2,3 μM erfolgt eine Neutralisierung der Protease in wenigen Sekunden (die Halbwertszeit wäre jetzt nur 0,3 Sekunden). Es war daher essentiell, die k_on der Wechselwirkung von Antithrombin mit den aktivierten Formen der Faktor X-Derivate zu bestimmen, da ein Anstieg in der Plasma-Halbwertszeit die Prokoagulanswirkung des Faktor X-Derivats verlängern würde, und daher seine anti-hämophile Wirkung verstärken würde.
Die Erfinder bestimmten die Fähigkeit jeder aktivierten Form der Faktor X-Derivate, einen stabilen kovalenten Komplex mit Antithrombin zu bilden. Sie bestimmten auch den Wert der k_on von Antithrombin (in Gegenwart oder Abwesenheit von Heparin) für die aktivierten Formen von Faktor X-Derivaten mit detektierbarer amidolytischer Aktivität (Derivat, dem die Gla-Domäne fehlt, und GDX-IVG-, GDX-IFG- und GDX-AVG-Derivate).
Der Beweis von kovalenten Komplexen zwischen der aktivierten Form der Faktor X-Derivate (1 μM) und Antithrombin (2 μM; gereinigt aus humanem Plasma nach der Technik, die von MCKAY beschrieben wurde (Thromb. Res., 21, 375-382; 1981)) wird in Gegenwart von 2 Einheiten/ml Heparin (KORDIA) durchgeführt. Die Inkubation wird für eine Stunde bei 25°C aufrecht erhalten, und das Reaktionsgemisch wird durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese (10%, Vernetzung 29/1) nach Denaturierung und Reduktion der Probe analysiert. Nach Färbung mit Coomassie-Blau resultiert das Vorliegen von kovalenten Komplexen zwischen der (inaktivierten) Form des Faktor X-Derivats und dem Antithrombin in einer Verringerung der Intensität der Bande, die Antithrombin entspricht (60 kDa), in einer Verringerung der Intensität der Bande, die der aktivierten Form des Faktor X-Derivats entspricht (31 kDa), und dem Auftreten einer neuen Bande mit höherem Molekulargewicht (etwa 100 kDa), die dem kovalenten Komplex entspricht.
Die Resultate sind in 3 angegeben.
Bahnen 1 und 8: Antithrombin allein; Bahnen 2 und 3: GDX-IVG-Derivat ohne und mit Antithrombin; Bahnen 4 und 5: GDX-IFG-Derivat ohne und mit Antithrombin; Bahnen 6 und 7: GDX-IFR-Derivat ohne und mit Antithrombin; Bahnen 9 und 10: GDX-SVG-Derivat ohne und mit Antithrombin; Bahnen 11 und 12: GDX-SFR-Derivat ohne und mit Antithrombin; Bahnen 13 und 14: GDX-AVG-Derivat ohne und mit Antithrombin.
Die Bildung eines Komplexes resultiert im Auftreten einer Bande mit hohem Molekulargewicht (Bahnen 3, 5, 7, 10 und 14), die fehlt, wenn Antithrombin (Bahnen 1 und 8) oder eine der aktivierten Formen der Faktor X-Analoga (Bahnen 2, 4, 6, 9, 11, 13) allein verwendet werden. Ein einzelnes Faktor X-Analogon (GDX-SFR, Bahn 12) erlaubt keine Bildung eines detektierbaren kovalenten Komplexes.
Alle aktivierten Formen der Faktor X-Derivate (ausgenommen das GDX-SFR-Derivat) sind daher fähig, in Gegenwart von Heparin einen stabilen kovalenten Komplex mit Antithrombin zu bilden, einschließlich des GDX-SVG-Derivats, das jedoch frei von einer detektierbaren katalytischen Aktivität ist.
Das zur Bestimmung der k_on von Antithrombin für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats ausgewählte Verfahren hängt von der Halbwertszeit der Reagentien ab. Das Verfahren ist abhängig davon, ob die Halbwertszeit größer als 3 Minuten ist, zwischen 15 Sekunden und 3 Minuten liegt oder kleiner als 15 Sekunden ist, nicht dasselbe. Die Reaktion muss (außer dies ist unmöglich, siehe unten) unter Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen durchgeführt werden: d.h., die Konzentration des Inhibitors (Antithrombin) muss mindestens das 10-Fache derjenigen seines Targets (die aktivierte Form des Faktor X-Derivats) sein. Darüber hinaus sollte die Konzentration des Targets ausreichend sein, um fähig zu sein, seine restliche amidolytische Aktivität zu detektieren (10 nM bis 1 μM in Abhängigkeit von der aktivierten Form des Faktor X-Derivats, z.B. idealerweise werden 10% des chromogenen Substrats in 30 Minuten hydrolysiert). Diese zwei Beschränkungen limitieren die Wahl der Konzentration der Reagentien beträchtlich: die Konzentration an Antithrombin sollte wenigstens 0,1 bis 10 μM (in Abhängigkeit vom Target) sein. Die Halbwertszeit des Targets (gleich dem natürlichen Logarithmus von 2 dividiert durch das Produkt der Konzentration des Inhibitors und seiner k_on für das Target) bestimmt das zu verwendende Verfahren. Für Halbwertszeiten von über drei Minuten ist das eingesetzte Verfahren dasselbe wie das, das zur Bestimmung der k_on von D-FFR-CK beschrieben wurde: es besteht in der Bestimmung der restlichen Aktivität, die in Aliquots enthalten ist, welche bei verschiedenen Zeiten entnommen werden, um so etwa zehn Halbwertszeiten abzudecken. Für Antithrombin-Konzentrationen zwischen 0,1 und 10 μM macht dieser Ansatz es möglich, nur k_on Werte zu bestimmen, die fast gleich 2 × 10⁴ M^–1 s^–1 sind. Wenn die Halbwertszeit der Reaktion weniger als drei Minuten ist, wird die chargenweise Messung der Restaktivität (durch Probenahme von Aliquots) schwierig in die Praxis umzusetzen. In diesem Fall wird die Reaktion noch mit Antithrombin-Konzentrationen zwischen 0,1 und 10 μM (daher k_on-Werte größer als 2 × 10⁴ M^–1 s^–1) kontinuierlich durch das Vorliegen von S2765 im Reaktionsmedium verfolgt. Die Hydrolyserate von S2765 ist direkt proportional zur Restkonzentration der aktivierten Form von Faktor X. Zur Zeit null hat die amidolytische Aktivität ein Maximum, da noch keine Inhibierung erfolgt ist. Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen erfüllt sind, nimmt die Konzentration der aktivierten Form des Faktor X-Derivats entsprechend einer abnehmenden Exponentialgröße erster Ordnung mit der Zeit ab. Die Spaltungsrate ist nicht konstant: sie verlangsamt sich, bis sie null wird (wenn das gesamte Target neutralisiert worden ist). Es ist möglich, zu zeigen (CHA, Biochem. Pharmacol., 24, 2177-2185, 1975; STONE & HOFSTEENGE, Biochemistry, 25, 4622-4628, 1986), dass die Menge an pNA, die durch die Hydrolyse des S2765 freigesetzt wird (daher die Extinktion bei 405 nm des Reaktionsgemi sches), entsprechend einer exponentiellen Zunahme erster Ordnung ansteigt, was durch nichtlineare Regression unter Verwendung von Gleichung 4 analysiert werden kann: A405 = A0 + Vi (1 – exp(–Ikt))/k (Gleichung 4)worin A₀ die Anfangsextinktion bei 405 nm darstellt, V_i die Hydrolyserate von S2765 in Abwesenheit von Antithrombin darstellt, I die Konzentration von Antithrombin darstellt und k die Pseudo-erster Ordnung-Geschwindigkeitskonstante für die Inhibierungsreaktion darstellt. Während der Reaktion steht der Inhibitor im Wettbewerb mit dem Substrat um die Wechselwirkung mit dem Enzym; somit steht der Wert für k_on von Antithrombin für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats mit k durch die folgende Gleichung in Beziehung: kon = k (1 + S/Km) (Gleichung 5)worin S die Anfangskonzentration des chromogenen Substrats (S2765) darstellt und K_m seine Michaelis-Konstante für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats darstellt (bestimmt während der Charakterisierung der amidolytischen Aktivität). Dieses Verfahren macht es möglich, Halbwertszeiten in der Größenordnung von 15 Sekunden zu messen, d.h., k_on-Werte von höchstens 2 × 10⁵ M^–1 s^–1 (für Antithrombin-Konzentrationen zwischen 0,1 und 10 μM) zu bestimmen. Für Konzentrationen von aktivierten Formen der Faktor X-Derivate zwischen 10 nM und 1 μM ist, wenn die Halbwertszeit der Reaktion weniger als 15 Sekunden ist, die Amplitude des Signals (die Extinktion bei 405 nm) zu klein, um eine zuverlässige kontinuierliche Messung der Restaktivität zuzulassen (eine Erhöhung der Konzentration des Enzyms würde es notwendig machen, dass Antithrombin erhöht wird, um die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung zu erfüllen, und daher die Halbwertszeit weiter zu verringern). Wenn demnach die k_on größer als 2 × 10⁵ M^–1 s^–1 ist, wird die Reaktion nicht länger unter Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen, sondern unter Zweiter Ordnung-Bedingungen durchgeführt. Die Pseudo-erster-Ordnung-Bedingung bedeutet, dass die Konzentration des Antithrombins (offensichtlich) während der Reaktion konstant bleibt; dies ist der Fall, wenn es im Vergleich zum Target im großen Überschuss vorliegt. Wenn die Konzentration des Inhibitors weniger als 10 mal größer als die seines Targets ist, kann die Abnahme bei der Konzentration des Inhibitors (durch Bildung eines Komplexes mit seinem Target) nicht länger ignoriert werden. Während der Reaktion variieren die Konzentrationen des Inhibitors und seines Targets beide mit der Zeit, was die Analyse stark verkompliziert. Es bleibt allerdings möglich, eine ausreichende Signalamplitude zu erhalten und die Kinetik der Inhibierung bei Vorliegen eines chromogenen Substrats unter Bedingungen zweiter Ordnung zu verfolgen. Es ist möglich zu zeigen, dass in diesem Fall die Extinktion des Reaktionsgemisches bei 405 nm entsprechend einer Kurve zunimmt, die durch nicht-lineare Regression unter Verwendung von Gleichung 6 analysiert werden kann, die als "slow tight-binding inhibition" bezeichnet wird (CHA, 1975, oben erwähnt; Biochem. Pharmacol, 25, 2695-2702, 1976; WILLIAMS und MORRISON, Methods Enzymol, 63, 437-467, 1979): P = Vst + (V0 – Vs)(1 – d)/(dk')ln{(1 – d exp(–k't))/(1 – d)} (Gleichung 6) worin P die Konzentration von pNA darstellt, das zur Zeit t freigesetzt wird (direkt proportional zur Extinktion bei 405 nm), V₀ die Hydrolyserate von S2765 in Abwesenheit des Inhibitors darstellt und V_s die End-Hydrolyserate von S2765 darstellt (wenn die Reaktion beendet wurde). Die Parameter d und k' selbst hängen von zwei Parametern (F₁ und F₂) ab, so dass: d = (F1 – F2)/(F1 + F2); k' = k·F2; F1 = KI' + I + E; F2 = (FI 2 – 4 E·I)1/2.
In diesen Gleichungen stellt I die Anfangskonzentration an Antithrombin dar, E diejenige des Targets dar und stellt K_I' die scheinbare Inhibierungskonstante für die Wechselwirkung dar. Die k_on des Antithrombins für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats steht durch die in Gleichung 5 angegebene Beziehung zu k (das dieselbe Bedeutung wie in Gleichung 4 hat) in Beziehung.
Das Verfahren der chargenweisen Entnahme von Aliquots wird eingesetzt, um die k_on des Antithrombins für die aktivierte Form des GDX-AVG-Derivats (in Gegenwart oder Abwesenheit von Heparin) zu bestimmen.
Die Reaktion wird in Kinetikpuffer durchgeführt, der 1 mg/ml Protease-freies Rinderalbumin (SIGMA, St. Quentin-Fallavier, Frankreich) und, wenn passend, 2 Einheiten pro ml Heparin (KORDIA) enthält. In einem Reaktionsvolumen von 10 μl wird eine ausreichende Menge der aktivierten Form des GDX-AVG-Derivats (0,5 μM in Anwesenheit von Heparin, 1 μM in seiner Abwesenheit) in Gegenwart eines großen Überschusses an Antithrombin (5 μM in Gegenwart von Heparin, 10 μM in seiner Abwesenheit) über eine variierende Zeitspanne bei 25°C inkubiert. Dasselbe Experiment wird zwölfmal wiederholt, wobei die Inkubationszeit von einem Experiment zum anderen verändert wird (von 10 Sekunden für das erste bis 5 Stunden für das letzte, so dass die Inkubationszeit für ein gegebenes Experiment der zweifachen derjenigen des Vorangehenden entspricht). Am Ende jeder Inkubation werden 190 μl S2765 (200 μM in Kinetikpuffer) zugegeben, und die restliche amidolytische Aktivität wird gemessen, indem die Variation in der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit (d.h., die Anfangs-Hydrolyserate von S2765) unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts gemessen wird. Durch Auftragen der Hydrolyserate von S2765 als Funktion der Inkubationszeit des Inhibitors mit seinem Target wird eine Kurve erhalten, die es durch nicht-lineare Regression unter Verwendung von Gleichung 2 möglich macht, die Geschwindigkeitskonstante zur Inaktivierung der aktivierten Form des Faktor X-Derivats zu bestimmen. Die Parameter d_t, d₀ und d_min von Gleichung 2 stellen: die Restaktivität zur Zeit t, die Anfangsaktivität (die bei einem Maximum ist) bzw. die Aktivität bei unendlicher Zeit (die üblicherweise null ist) dar. Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung erfüllt ist, ist der für k erhaltene Wert gleich der Konzentration des Inhibitors multipliziert mit k_on der Reaktion zur Inaktivierung der aktivierten Form des Faktor X-Derivats.
Das Verfahren durch kontinuierliche Aufzeichnung der Extinktion bei 405 nm unter Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen wird verwendet, um die k_on des Antithrombin für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats, dem die Gla-Domäne fehlt, und diejenigen der aktivierten Formen der GDX-IVG- und GDX-IFG-Derivate zu bestimmen (in Abwesenheit von Heparin).
Die Kinetik wird bei 25°C in Kinetikpuffer, der 1 mg/ml Protease-freies Rinderalbumin enthält, untersucht und kontinuierlich durch das Vorliegen von 100 μM S2765 im Reaktionsmedium verfolgt. Die Reaktion wird in einer Mikroplatte in einem Volumen von 200 μl durchgeführt, wenn die Amplitude des Signals es möglich macht, die Kinetik mit einem Plattenlesegerät zu verfolgen. Wenn dies nicht der Fall ist, wird die Reaktion in einer 600 μl-Mikroküvette durchgeführt und die Kinetik unter Verwendung eines Spektralphotometers verfolgt (LAMBDA 14, PERKIN-ELMER (Courtaboeuf Frankreich)). Die Reaktion wird durch Zugabe von 10 bis 25 nM der aktivierten Form des Faktor X-Derivats ausgelöst (idealerweise so, dass in Abwesenheit von Inhibitor 10% des chromogenen Substrats in 60 Minuten hydrolysiert ist). Für jede aktivierte Form des Faktor X-Derivats wird die Reaktion in Gegenwart von drei Konzentrationen an Antithrombin, entsprechend dem 10-, 20- und 40-Fachen der Konzentration des Targets, durchgeführt. Durch Auftragen der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit wird eine Kurve erhalten, die es durch nicht-lineare Regression unter Verwendung von Gleichung 4 (die ein exponentielles Wachstum erster Ordnung darstellt) möglich macht, die Geschwindigkeitskonstante für die Inaktivierung der aktivierten Form des Faktor X-Derivats abzuschätzen. Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung erfüllt ist, wird die k_on des Antithrombins für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats durch Gleichung 5 angegeben, die den Wettbewerb während der Kinetik, der durch das Substrat eingeführt wird, berücksichtigt.
Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingungen erfüllt sind, ist die Halbwertszeit der aktivierten Form des Faktor X-Derivats, dem die Gla-Domäne fehlt, und auch die der aktivierten Formen der GDX-IVG- und GDX-IFG-Derivate in Gegenwart von Heparin kleiner als 15 Sekunden. Eine Senkung der Konzentrationen an Antithrombin und seines Targets könnte es möglich machen, die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung zu erfüllen, während gleichzeitig die Halbwertszeit erhöht wird, allerdings würde die Amplitude des Signals reduziert werden; nun wird die Empfindlichkeit des Spektralphotometers unzureichend, um eine kontinuierliche Kinetik zu verfolgen, wenn die Amplitude nur wenige Milli-Einheiten Extinktion aufweist. Folglich wird die Kinetik der Inhibierung der aktivierten Form des Faktor X-Derivats, dem die Gla-Domäne fehlt, durch Antithrombin in Gegenwart von Heparin und auch die der aktivierten Formen der GDX-IVG- und GDX-IFG-Derivate unter Bedingungen zweiter Ordnung verfolgt.
Die Kinetik wird bei 25°C in Kinetikpuffer, der 1 mg/ml Protease-freies Rinderalbumin und 2 Einheiten pro ml Heparin enthält, studiert; sie wird durch das Vorliegen von 400 μM S2765 im Reaktionsmedium kontinuierlich verfolgt. Die Reaktion wird in einer Mikroküvette in einem Volumen von 600 μl durchgeführt, wobei die Kinetik unter Verwendung eines Lambda 14-Spektralphotometers verfolgt wird. Die Reaktion wird durch Zugabe der Mindestmenge an aktivierter Form des Faktor X-Derivats ausgelöst, wobei dieses mit einem zuverlässigen Signal kompatibel ist (1 bis 2,5 nM in Abhängigkeit vom Derivat, so dass in Abwesenheit von Inhibitor etwa 10% des chromogenen Substrats in 60 Minuten hydrolysiert werden). Für jede aktivierte Form von Faktor X-Derivat wird die Reaktion in Gegenwart von zwei Konzentrationen an Antithrombin durchgeführt, die dem 2- und 3-Fachen der Konzentration des Targets entsprechen. Durch Auftragen der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit wird eine Kurve erhalten, die es durch nicht-lineare Regression unter Verwendung von Gleichung 6 möglich macht, die Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung für die Reaktion abzuschätzen. Die k_on des Antithrombins für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats wird durch Gleichung 5 gegeben, die die durch das Substrat während der Kinetik eingeführte Kompetition berücksichtigt.
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle IX zusammengefasst. Die Werte für k_on (in M^–1 s^–1) für Antithrombin in Gegenwart von Heparin (+ Heparin) oder in seiner Abwesenheit (– Heparin) sind zusammen mit dem Standardfehler (ausgedrückt als Prozentwert des erhaltenen Werts) angegeben.
TABELLE IX
In Abwesenheit von Heparin sind die Werte für k_on des Antithrombins für die aktivierte Form des Faktor X-Derivats, dem die Gla-Domäne fehlt, und der aktivierten Form des GDX-IVG-Derivats ähnlich (sie unterscheiden sich höchstens um einen Faktor zwei). Im Vergleich dazu ist der Wert für k_on des Antithrombins für die aktivierte Form des GDX-IFG-Derivats 66 mal kleiner. Insbesondere der Wert für k_on für die aktivierte Form des GDX-AVG-Derivats ist mehr als 1000 mal geringer als der seines nicht-mutierten Homologen (die Inhibierung ist in der Tat schwer zu detektieren). In Gegenwart von Heparin nimmt der Wert für k_on des Antithrombin für die aktivierten Derivate von Faktor X 1000- bis 4000-fach zu, während k_on für das Antithrombin auch in Gegenwart von Heparin für die aktivierte Form des GDX-AVG-Derivats 3 × 10² M^–1 s^–1 nicht übersteigt. Diese wichtige Beobachtung legt nahe, dass das GDX-AVG-Derivat nach Aktivierung für längere Zeit aktiv bleiben könnte als sein nicht-mutiertes Homo loges (seine Plasma-Halbwertszeit könnte in Abwesenheit von Heparin mehrere Stunden sein, in seiner Gegenwart 17 Minuten).
Plasma-Halbwertszeit der aktivierten Form der Faktor X-Derivate:
Die k_on des Antithrombin für die aktivierte Form der Faktor X-Derivate legt nahe, dass die Plasma-Halbwertszeit der aktivierten Form des GDX-AVG-Derivats beträchtlich verlängert sein könnte, was sein anti-hämophiles Potential verstärken würde. Um diese Hypothese zu verifizieren, bestimmten die Erfinder die Plasma-Halbwertszeit der aktivierten Form jedes der Faktor X-Derivate.
Die Plasma-Halbwertszeit der aktivierten Formen der Faktor X-Derivate wird bestimmt, indem ihre restliche Aktivität nach der Inkubation für variierende Zeiträume in einem Pool von normalem humanem Plasma gemessen wurde. Um die Bildung eines Gerinnsels zu verhindern, wird der Plasmapool durch Zusatz von 0,8 μM Hirudin (80 Einheiten pro ml) ungerinnbar gemacht, bevor eine Recalcifizierung folgt (durch Zusatz von 8 mM CaCl₂). Das Reaktionsgemisch wird auf 80% (V/V) Plasma und 20% (V/V) Kinetikpuffer, der Hirudin, Calcium und die aktivierte Form eines der Faktor X-Derivate in einer Konzentration, die zu seiner Detektion ausreicht (20-300 nM Endkonzentration) enthält, eingestellt. Nach variierenden Inkubationszeiten wird ein Aliquot (40 μl) entfernt, und die restliche amidolytische Aktivität wird gemessen, nachdem 160 μl S2765 (1 mM für die aktivierte Form des GDX-AVG-Derivats, 100 μM für die anderen aktivierten Formen der Faktor X-Derivate) zugesetzt worden waren, und zwar durch Aufzeichnung der Variation bei der Absorption bei 405 nm als Funktion der Zeit (Anfangs-Hydrolyserate des S2765), wobei ein MR5000-Mikroplatten-Lesegerät verwendet wurde. Die Geschwindigkeitskonstante für die Abnahme der Aktivität wird durch nicht-lineare Regression der Variation bei der Restaktivität als Funktion der Zeit unter Verwendung von Gleichung 2 bestimmt, in der d_t, d₀ und d_min die Restaktivität zur Zeit t, die Anfangsaktivität (die bei einem Maximum ist) und die Aktivität bei unendlicher Zeit (die bei einem Minimum ist) darstellen. Obgleich Hirudin jede Thrombinspur neutralisiert, ist die Mindestaktivität nicht null, selbst wenn die gesamte aktivierte Form von Faktor X neutralisiert ist; dieses Hintergrundrauschen kommt von anderen Proteasen, die im Plasma enthalten sind, und die fähig sind, das S2765 langsam zu hydrolysieren. Wenn die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung erfüllt ist, ist die Plasma-Halbwertszeit gleich dem Verhältnis des natürlichen Logarithmus von 2 über k (die Geschwindigkeitskonstante zur Abnahme). Die betrachtete Plasma-Halbwertszeit hängt weder von der Konzentration des Targets noch von der Amplitude der amidolytischen Aktivität, die gemessen wurde, ab; sie hängt nur von der Anfangskonzentration des im Plasma enthaltenden Inhibitors (und natürlich von seiner Reaktivität bezüglich des Targets) ab: wenn Antithrombin tatsächlich der Haupt-Plasma-Inhibitor ist, der involviert ist, wird die Pseudo-erster Ordnung-Bedingung respektiert, da es während der gesamten Inkubation im Vergleich zu seinem Target in großem Überschuss (1,8 μM) bleibt.
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle X zusammengefasst. Die Werte für die Halbwertszeit (in Minuten) der aktivierten Form der Faktor X-Derivate in Gegenwart von Heparin (+ Heparin) oder in seiner Abwesenheit (– Heparin) sind angegeben, ebenso wie der Standardfehler (ausgedrückt als Prozentwert des erhaltenen Werts). Die Halbwertszeit der aktivierten Formen von Derivaten, denen detektierbare amidolytische Aktivität fehlt, wurde nicht bestimmt (NB).
TABELLE X
In Abwesenheit von Heparin sind die Plasma-Halbwertszeit der aktivierten Form von Faktor X, der die Gla-Domäne fehlt, und der aktivierten Form des GDX-IVG-Derivats vergleichbar (eine Minute); in Gegenwart von Heparin ist die Plasma-Halbwertszeit dieser aktivierten Formen zu kurz, um zuverlässig gemessen zu werden. In Abwesenheit von Heparin ist die Halbwertszeit der aktivierten Form des GDX-AVG-Derivats beträchtlich ausgedehnt: sie ist 55mal länger als die der aktivierten Form von Faktor X, dem die Gla-Domäne fehlt. Der Anstieg in der Plasma-Halbwertszeit in Gegenwart von Heparin ist auch beachtlich, da er leicht gemessen werden kann (5 Minuten und 30 Sekunden), anders als die seines nicht-mutierten Homologen. Die Plasma-Halbwertszeit der aktivierten Form des GDX-IFG-Derivats ist auch verlängert (12-fach im Vergleich zu der der aktivierten Form von Faktor X, dem die Gla-Domäne fehlt). Die Plasma-Halbwertszeit von anderen aktivierten Formen von Faktor X-Derivaten (denen amidolytische Aktivität fehlt) kann durch das eingesetzte Verfahren nicht bestimmt werden.
BEISPIEL 6: ANTI-HÄMOPHILE AKTIVITÄT DER FAKTOR X-DERIVATE
Die Prokoagulanz-Aktivität der aktivierten Formen der Faktor X-Derivate wurde in Plasma getestet, die schwere Hämophilie A oder B simulieren. Diese Plasmen werden durch Verarmung eines normalen Plasmas an Faktor VIII oder IX erhalten, und verhalten sich in vitro wie authentisches Plasma von Hämophilen. Die getesteten Faktor X-Analoga (GDX-IVG, GDX-IFG, GDX-AVG, GDX-IFR, GDX-SFR, GDX-SVG) haben alle keine Gla-Domäne. In normalem Plasma ist die Prokoagulanzwirkung des Faktors X, dem die Gla-Domäne fehlt, viel geringer als die von normalem Faktor X, da die Gla-Domäne zur Aktivität des Prothrombinase-Komplexes beiträgt.
Die Prokoagulanz-Aktivität dieser Faktor X-Derivate kann nicht vergleichbar mit der von normalem Faktor X sein. In der Tat ist ein beliebiges Faktor X-Derivat, dem die Gla-Domäne fehlt, ein Inhibitor des Prothrombinase-Komplexes; spezifischer ausgedrückt, er steht im Wettbewerb mit der aktivierten Form von Plasma-Faktor X, der mit seiner Gla-Domäne viel aktiver ist. Mit anderen Worten, in normalem Plasma verzögert der Zusatz eines beliebigen Faktor X-Derivats, dem die Gla-Domäne fehlt, die Bildung eines Gerinnsels, anstatt sie zu begünstigen.
Die Tatsache, dass die Prokoagulanz-Aktivität der Derivate, denen die Gla-Domäne fehlt, viel geringer ist als die eines normalen Faktor X, verhindert allerdings keine Vergleiche, die zwischen diesen Derivaten gemacht werden. Spezifischer ausgedrückt, der Beitrag der Gla-Domäne zur Prokoagulanz-Aktivität ist einheitlich, welches Derivat es auch ist: sie ist von seiner katalytischen Aktivität unabhängig. Ein Faktor X-Derivat, das im Vergleich zu den normalen Derivaten die "Gerinnungszeit" (Zeit, die erforderlich ist, damit das Plasma seine Fluidität verliert) senkt, spiegelt daher eine bessere Prokoagulanz-Aktivität wider; eine Zunahme bei der Gerinnungszeit gibt andererseits an, dass das Derivat weniger aktiv ist als sein normales Homologes. Die Prokoagulanz-Aktivität der Faktor X-Derivate (aktiviert oder nicht) wurde daher mit der des normalen Homologen verglichen, dem die Gla-Domäne fehlt (GD-FX).
Prokoagulanz-Wirkung der aktivierten Formen der Faktor X-Derivate:
Der Zusatz der aktivierten Form eines Faktor X-Derivats zu Plasma von einem Hämophilen testet nicht die Zyklisierung der Aktivierung von Prothrombin: sie spiegelt nur die Fähigkeit des aktivierten Derivats wider, unter Bedingungen, die denen in vivo nahe kommen, zu wirken. In Abwesenheit von Gewebefaktor und von Faktor VIII oder IX erfolgt keine Amplifikation der Gerinnungskaskade, lediglich die aktivierte Form des Faktor X-Derivats ermöglicht die Bildung von Thrombin und anschließend die Bildung eines Gerinnsels bzw. eines Thrombus. Die Studie der Aktivität innerhalb des Prothrombinase-Komplexes (siehe Beispiel 5) zeigt, dass der Zusatz von aktiviertem Faktor V teilweise die katalytische Aktivität der aktivierten Form des GDX-AVG-Analogon wieder herstellt: sie war jetzt nur 13 mal weniger als die seines nicht-mutierten Homologen (GDX-IVG). Dieser Effekt ist weitaus geringer als er mit anderen aktivierten Formen von Faktor X-Analoga (GDX-IFG, GDX-IFR, GDX-SVG und GDX-SFR) wahrgenommen wird. Die Verwendung von an Faktor VIII oder Faktor IX verarmtem Plasma macht es möglich, die mögliche Interferenz mit anderen Gerinnungsfaktoren, insbesondere den Effekt der regulatorischen Mechanismen (Antithrombin usw.), zu untersuchen.
Der Prokoagulanzeffekt der aktivierten Form der Faktor X-Derivate wird durch die Fähigkeit detektiert, die Bildung eines Thrombus bzw. Gerinnsels in einem an Faktor VIII oder Faktor IX verarmten Plasma (DIAGNOSTICA STAGO, Asnières, Frankreich) zu induzieren. Durch Zugabe von Gewebefaktor zu einem dieser Plasmen ist es möglich, die Bildung von aus reichend Thrombin, um die Bildung eines Gerinnsels zu induzieren, auszulösen, allerdings ist die Gerinnungszeit extrem lang und kann mit herkömmlichen Verfahren nicht gemessen werden. So wird die Reaktion in einer Mikroplatte ausgeführt, und die Gerinnselbildung wird durch Turbidimetrie verfolgt, wobei die optische Dichte bei 405 nm als Funktion der Zeit aufgezeichnet wird (wie immer die Wellenlänge ist, die Extinktion steigt mit der Turbidimetrie). Der Gerinnselbildung, die relativ abrupt ist, geht eine mehr oder weniger lange Latenzperiode voraus: typischerweise folgt die Turbidimetrie einer sigmoiden Kurve als Funktion der Zeit. Die Zeit, die erforderlich ist, um 50% der maximalen Trübung zu erreichen, ist für die "Gerinnungszeit" herkömmlicher Gerinnungsassays repräsentativ.
In der Praxis werden 100 μl an Faktor VIII oder Faktor IX verarmtem Plasma in einer Mikroplatte bei 25°C vorinkubiert, und die Reaktion wird durch Zusatz von 100 μl Kinetikpuffer, der 20 mM CaCl₂ und 200 nM aktiviertes Faktor X-Derivat enthält, ausgelöst. Die Veränderung bei der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit wird unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts aufgezeichnet. Durch Auftragen der Variation bei der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit wird eine Kurve erhalten, die es möglich macht, durch nicht-lineare Regression die Gerinnungszeit (V₅₀) unter Verwendung der "Boltzmann"-Gleichung 7 zu bestimmen:
worin A₄₀₅ die Extinktion bei 405 nm zur Zeit t darstellt, A_min die Anfangsextinktion bei 405 nm darstellt und A_max die Endextinktion bei 405 nm (nach Bildung eines Gerinnsels) darstellt. Die Steigung ist ein Parameter, der die relativ kurze Natur der ansteigenden Phase bei der Bildung des Gerinnsels berücksichtigt (die Steigung nimmt zu, wenn die Latenzperiode abnimmt).
Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle XI zusammengefasst.
Die Gerinnungszeit (in Minuten) eines an Faktor VIII verarmten (– Faktor VIII) oder an Faktor IX verarmeten (– Faktor IX) Plasmas nach Zusatz der aktivierten Form eines der Faktor X-Derivate ist angezeigt, ebenso wie der Standardfehler (ausgedrückt als Prozentwert des erhaltenen Wertes). Über 50 Minuten ist der Wert für die Gerinnungszeit nicht länger zuverlässig (>50).
TABELLE XI
Die aktivierte Form des GD-FX-Derivats und die des GDX-IVG-Derivats haben einen deutlichen Prokoagulanzeffekt.
Außerdem wird das Potenzial der aktivierten Form des GDX-AVG-Derivats bestätigt: in an Faktor VIII oder Faktor IX verarmtem Plasma verkürzt dieses Derivat die Gerinnungszeit so weit wie die aktivierte Form des GD-FX-Derivats. Dasselbe gilt für die aktivierte Form des GDX-IFG-Derivats: seine Prokoagulanz-Aktivität in an Faktor IX verarmetem Plasma ist detektierbar, allerdings bleibt dieses Derivat unfähig, die Bildung eines Gerinnsels in weniger als 50 Minuten in einem an Faktor VIII verarmten Plasma zu induzieren. Die aktivierten Formen der Faktor X-Derivate, denen detektierbare katalytische Aktivität fehlt (GDX-SFR, GDX-SVG und GDX-IFR), haben keine detektierbare Prokoagulanz-Aktivität.
Prokoagulanzeffekt des GDX-AVG-Derivats (nicht-aktiviert):
Ohne Gewebefaktor gibt es keine Gerinnselbildung bzw. Thrombusbildung, ob das Plasma das eines Hämophilen ist oder nicht: die Gerinnungskaskade wird nicht initiiert. Ein normales Plasma gerinnt andererseits sehr schnell nach Zusatz von Gewebefaktor; das eines Hämophilen gerinnt eventuell auch, da der extrinsische Koagulationskomplex (gebildet zwischen dem Gewebefaktor und Faktor VIIa) Faktor X aktiviert, welcher innerhalb des Prothrombinase-Komplexes (gebildet mit aktiviertem Faktor V) Prothrombin zu Thrombin aktiviert, das gegebenenfalls ausreichend Fibrinogen spaltet, um ein Gerinnsel zu bilden. Die Reaktion ist viel langsamer, da es keine Amplifikation gibt, die den Tenase-Komplex involviert. Das Vorliegen eines Thrombin-aktivierbaren Faktor X sollte eine Amplifikation der Thrombinerzeugung wieder herstellen: zwei Aktivatoren wären verfügbar: der Komplex aus Gewebefaktor mit Faktor VIIa wie vorher, aber auch Thrombin. Da die Thrombin-Konzentration ansteigt, werden mehr und mehr Faktor X-Derivate aktiviert, die mehr Thrombin erzeugen, daher die Amplifikation.
Ein Faktor X-Derivat, dem die Gla-Domäne fehlt, macht es nicht wirklich möglich, sein anti-hämophiles Potential zu testen, da seine Prokoagulanzwirkung in jedem Fall begrenzt ist.
Es ist allerdings möglich, zu verifizieren, ob in Gegenwart eines solchen Derivats eine Amplifikation der Thrombinbildung nach Zusatz von Gewebefaktor erfolgt.
Das Verfahren, das eingesetzt wird, um die Prokoagulanzwirkung der Faktor X-Derivate (nicht-aktiviert) zu detektieren, ist sehr ähnlich dem, das zum Detektieren der Aktivität ihrer aktivierten Formen beschrieben wurde. Der Hauptunterschied ist der, dass die Reaktion durch Zugabe eines Gemisches aus Gewebefaktor und Phospholipiden initiiert wird (neben der Tatsache, dass diese Derivate nicht voraktiviert sind). Was die Untersuchung der aktivierten Formen angeht, so wird die Reaktion in einer Mikroplatte bei 25°C durchgeführt, und die Gerinnselbildung wird durch Turbidimetrie verfolgt, wobei eine Aufzeichnung der optischen Dichte bei 405 nm als Funktion der Zeit erfolgt. Untersucht wird die Fähigkeit der Faktor X-Derivate, die Gerinnungszeit eines an Faktor VIII oder Faktor IX verarmten Plasmas zu verkürzen.
In der Praxis wird das Faktor X-Derivat (0,5 μM) zu 100 μl an Faktor VIII oder IX verarmtem Plasma gegeben, und die Reaktion wird durch Zusatz von 100 μl Kinetikpuffer, der 20 mM CaCl₂ und 2 pM rekombinanten Gewebefaktor, vermischt mit Phospholipiden (INNOVIN, DADE BEHRING, La Défense, Frankreich) enthält, ausgelöst. Die Veränderung der Extinktion bei 405 nm als Funktion der Zeit wird unter Verwendung eines MR5000-Mikroplatten-Lesegeräts aufgezeichnet, und die Zeit, die erforderlich ist, um die Hälfte des Maximums der Trübung zu erreichen, wird durch nicht-lineare Regression unter Verwendung von Gleichung 7, wie sie oben zur Untersuchung der Prokoagulanz-Aktivität der aktivierten Formen der Faktor X-Derivate beschrieben wurde, bestimmt.
Die Resultate, die mit dem GDX-AVG-Derivat (Zymogen) erhalten werden, sind in 4 angegeben, welche den Prokoagulanzeffekt dieses Derivats (Ο) (nicht-aktiviert) mit dem GD-FX-Derivat (⎕) (nicht-aktiviert) in an Faktor VIII verarmtem (4A) oder Faktor IX verarmtem (4B) Plasma vergleicht. In Gegenwart des GDX-AVG-Derivats ist die Gerinnungszeit kürzer als in Gegenwart des GD-FX-Derivats (beide in an Faktor VIII verarmtem Plasma und in an Faktor IX verarmtem Plasma). Die Zymogen-Form des GDX-AVG-Derivats hat daher klar Prokoagulanzwirkung, trotz des Fehlens der Gla-Domäne und seiner verringerten katalytischen Wirkung im Vergleich zu seinem nicht-mutierten Homologon. Die Tatsache, dass das GDX-AVG-Derivat aktiver ist als das GD-FX-Derivat, legt nahe, dass eine Amplifikation der Thrombinerzeugung in Gegenwart von GDX-AVG tatsächlich stattgefunden hat. Im Vergleich zum GD-FX-Derivat ist das GDX-AVG-Derivat tatsächlich 13 mal weniger aktiv innerhalb des Prothrombinase-Komplexes, wo es wenigstens zweimal so aktiv ist wie im Plasma von einem Hämophilen: während der Gerinnselbildung gibt es daher eine Produktion von wenigstens 26 mal aktiverer Form des GDX-AVG-Derivats.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Faktor X-Analogon, in dem die Sequenz Thr-Arg-Ile der Aktivierungsstelle von nativem Faktor X durch eine Thrombinspaltbare Sequenz ersetzt ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Thrombin-spaltbare Sequenz die Sequenz Pro-Arg-Ala ist.
Faktor X-Analogon nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz Leu-Thr-Arg-Ile-Val-Gly der Aktivierungsstelle von nativem Faktor X durch die Sequenz P₃-Pro-Arg-Ala-P₂'-P₃' (SEQ ID NO: 31), in der P₃ eine beliebige Aminosäure mit Ausnahme von Pro, Asp oder Glu darstellt, P₂' Val, Ile, Leu oder Phe darstellt und P₃' Gly, Asn oder His darstellt, ersetzt ist.
Faktor X-Analogon nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenz Leu-Thr-Arg-Ile-Val-Gly der Aktivierungsstelle von nativem Faktor X durch die Sequenz Val-Pro-Arg-Ala-Val-Gly ersetzt ist.
Faktor Xa-Analogon, das durch Spaltung eines Faktor X-Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 3 durch Thrombin erhalten wird.
Nucleinsäuremolekül, das für ein Faktor X-Analogon nach einem der Ansprüche 1 bis 3 codiert oder für ein Faktor Xa-Analogon nach Anspruch 4 codiert.
Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5 umfasst.
Wirtszelle, die genetisch mit einem Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 5 transformiert ist.
Verwendung eines Faktor X-Analogons nach einem der Ansprüche 1 bis 3, eines Faktor Xa-Analogons nach Anspruch 4 oder eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 5 zum Erhalt eines medizinischen Prokoagulanzproduktes.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das medizinische Produkt zur Behandlung einer Koagulopathie bestimmt ist, die aus einem Mangel an Faktor VIII, an Faktor IX oder an Faktor XI resultiert.
Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Koagulopathie Typ A-Hämophilie oder Typ B-Hämophilie ist.