JP5833448B2 - セリンプロテアーゼ誘導体および血液凝固疾患の予防または処置における使用 - Google Patents
セリンプロテアーゼ誘導体および血液凝固疾患の予防または処置における使用 Download PDFInfo
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- C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
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- C12N9/6464—Protein C (3.4.21.69)
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- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
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- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
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Description
本発明は、第X因子の活性化ペプチド、並びにセリンプロテアーゼ誘導体、特にプロテインC、第IX因子および第X因子の誘導体の半減期および回収率を向上させるためのその使用、並びにプロテインC、第IX因子および第X因子に関連した疾患、特に血液凝固疾患の予防または処置におけるこれらの誘導体の使用に関する。
血液凝固は、血管の損傷に応答して起こる、主要で複雑な過程である。それは出血を止めそして傷害を受けた血管の修復を開始する血塊の形成からなり、その壁は血小板およびフィブリンを含む血塊によって覆われている。その過程は、損傷のほぼ直後に始まる。
本発明は、配列番号2の33〜52位の範囲のアミノ酸配列(39位または49位におけるアスパラギンはN−グリコシル化されている)を含むポリペプチドPP(第X因子の活性化ペプチド)に関する。
−第1のポリペプチドPP、および
−配列番号4の7〜16位の範囲のアミノ酸配列を含む第2のポリペプチド
を含む、融合タンパク質FPに関する。
本発明者らは、第X因子の種々の構築物を研究することで、第X因子の活性化ペプチドが、第X因子のクリアランス過程およびその回収率において始原的な役割を果たしていることを示した。
「機能保存的変異体」は、類似の特性(例えば、極性、水素結合能、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性など)を有するアミノ酸を用いてのアミノ酸の置換を含むがそれらに限定されない、タンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変化させることなく改変されたものである。保存されていると指摘された以外のアミノ酸はタンパク質中において異なり得、よって、類似の機能の任意の2つのタンパク質間のタンパク質またはアミノ酸の配列の類似率は変化し得、そしてCluster法(類似性はMEGALIGNアルゴリズムに基づく)などのアラインメントスキームに従って決定したところ70%から99%であり得る。「機能保存的変異体」はまた、比較されるネイティブタンパク質または親タンパク質に対して、BLASTまたはFASTAアルゴリズムによって決定したところ少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、最も好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%のアミノ酸同一性を有し、そして同じまたは実質的に類似した特性または機能を有する、ポリペプチドを含む。
・第X因子のcDNAから推定した配列を参照したナンバリングシステム。
・軽鎖、活性化ペプチドおよび重鎖を含む、分泌タンパク質から推定した配列を参照したナンバリングシステム:1番のアミノ酸残基は、軽鎖のアミノ末端の最初のアミノ酸残基である。このナンバリングシステムを使用する。上流のアミノ酸位置はマイナスとして識別される:プロペプチドのC末端アミノ酸は−1番であり、そして翻訳されたタンパク質のN末端アミノ酸残基(これはプレペプチドのアミノ末端アミノ酸残基である)は−40番である。
・−40位から−28位のプレペプチド(またはシグナルペプチド)
・−27位から−1位のプロペプチド、
・1位から142位の軽鎖、
・143位から194位の活性化ペプチド、
・195位から448位の重鎖。
本発明の第1の目的は、配列番号2の33〜52位の範囲のアミノ酸配列を含むポリペプチドPPに関し、ここで39位または49位におけるアスパラギンはN−グリコシル化されている。
本発明のさらなる目的は、
−前記したポリペプチドPPからなる第1ポリペプチド、および
−配列番号4の7〜16位の範囲のアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド
を含む、融合タンパク質FPに関する。
−前記したポリペプチドPPからなる第1ポリペプチド、および
−配列番号4の7〜16位の範囲のアミノ酸配列を含む第2ポリペプチド
を含む、融合タンパク質FPに関し、
ここで、
−配列番号4の14位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換されている、そして/または
−配列番号4の15位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されている。
前記した本発明のポリペプチドおよび融合タンパク質を、セリンプロテアーゼチモーゲンまたは活性型またはそのフラグメントに融合させて、前記セリンプロテアーゼチモーゲンの半減期および回収率を向上させることができる。
−配列番号1の235位の残基に対応するイソロイシンは、アラニン、セリンまたはロイシンによって置換されていてもよく;
−配列番号1の236位の残基に対応するバリンは、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよい。
−配列番号4の14位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号4の15位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
−ポリペプチドPP、および
−配列番号5または配列番号6のアミノ酸配列によって定義されるフィブリノペプチドAのトロンビンによって開裂され得る誘導体
を含む融合タンパク質によって置換されている。
−前記ポリペプチドは、第X因子のネイティブな活性化ペプチド(配列番号2)であり、そして
−前記フィブリノペプチドAのトロンビンによって開裂され得る誘導体は、アミノ酸配列DFLAEGGGVRIVG(配列番号7)によって定義される。
−配列番号3の212位の残基に対応するロイシンは、アラニンまたはセリンによって置換されていてもよく:
−配列番号3の213位の残基に対応するイソロイシンは、フェニルアラニンによって置換されていてもよく;
−配列番号3の214位の残基に対応するアスパルテートは、グリシンによって置換されていてもよい。
−配列番号4の14位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号4の15位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
−ポリペプチドPP、および
−配列番号13または配列番号14のアミノ酸配列によって定義されるフィブリノペプチドAのトロンビンによって開裂され得る誘導体
を含む融合タンパク質によって置換されている。
−前記ポリペプチドは、第X因子のネイティブな活性化ペプチド(配列番号2)であり、そして
−前記のフィブリノペプチドAのトロンビンによって開裂され得る誘導体は、アミノ酸配列DFLAEGGGVRLID(配列番号15)によって定義される。
−配列番号1の235位の残基に対応するイソロイシンは、アラニン、セリンまたはロイシンによって置換されていてもよく、
−配列番号1の236位の残基に対応するバリンは、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号4の14位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく、
−配列番号4の15位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
−配列番号3の212位の残基に対応するロイシンは、アラニンまたはセリンによって置換されていてもよく;
−配列番号3の213位の残基に対応するイソロイシンは、フェニルアラニンによって置換されていてもよく;
−配列番号3の214位の残基に対応するアスパルテートは、グリシンによって置換されていてもよく;
−配列番号4の14位の残基に対応するグリシンは、バリン、フェニルアラニンまたはアラニンによって置換されていてもよく;
−配列番号4の15位の残基に対応するバリンはプロリンによって置換されていてもよい。
本発明のさらなる目的は、本発明に記載のポリペプチドおよびキメラ誘導体をコードする核酸分子に関する。
本発明の第3の目的は、プロテインCおよび第X因子に関連した疾患、特に血液凝固疾患の予防または処置において使用するための本発明によるキメラ誘導体に関する。
本発明のさらなる目的は、プロテインCおよび第X因子に関連した疾患、特に血液凝固疾患の予防または処置のための本発明のキメラ誘導体を含む薬学的組成物に関する。
材料および方法
材料
ベビーハムスター腎臓(BHK)は、ATCC(Rockville, USA)からであった。ウシ胎児血清(FCS)およびウシ血清アルブミン(BSAプロテアーゼ非含有)をPAA Laboratories (Les Mureaux, France)から購入した。ダルベッコ改変イーグル/F12培地、ペニシリン/ストレプトマイシン、ファンギゾン(アムホテリシンBデオキシコール酸塩)をInvitrogen (Cergy Pontoise, France)から入手した。ベンズアミジンおよびフッ化フェニルスルホニル(PMSF)はCalbiochem (Meudon, France)からであった。メトトレキセート、ビタミンK1、ポリエチレングリコール8000(PEG)をSigma (Saint Quentin Fallavier, France)から購入した。N−a−ベンジルオキシカルボニル−D−アルギニル−L−アルギニン−p−ニトロアニリド−ジヒドロクロライド(N−a−Z−D−Arg−Gly−Arg−p−NA)製品名S−2765はChromogenix (Molndal, Sweden)からであった。L−α−ホスファチジル−L−セリン(ウシ脳から)、およびL−α−ホスファチジルコリン(卵黄から)はAvanti Polarlipids (Albaster, USA)からであった。QAEセファデックスA−50、HiTrapTM Qカラム、ヘパリンHiTrapカラムをGE Healthcare (Orsay, France)から入手した。抗プロテインCアフィニティマトリックスをRoche Diagnostics (Meylan, France)から購入した。
ヒト第X因子cDNAを含む哺乳動物発現プラスミドpKG5(Christophe, et al., 2001)、ヒトインシュリンcDNAを含むプラスミド、およびヒトプロテインC cDNAを含むプラスミドを、標準的なPCR突然変異誘発のための鋳型として使用して、それぞれ全長ヒト第X因子、全長ヒトインシュリン、およびC末端HPC−4タグ(残基EDQVDPRLIDGK、配列番号27)を有する全長ヒトタンパク質をコードするcDNAを生成した。発現ベクターpNUTにクローニングされた突然変異した全長cDNAを、ABI PRISM310DNAシークエンサーで製造業者の説明書に従ってABI PRISMダイターミネーターサイクルシークエンシング反応キットv3.1(Applied Biosystems Applera, Courtaboeuf, France)を使用してDNA配列解析によって確認した。FX構築物を標準的なPCR突然変異誘発(プライマーについては表I参照)のための鋳型として使用し、FX/AP176−194、FX/delPA−FpA、FX/AP−FpA、FX/AP176−194−N181A、FX/AP176−194−N191A、およびFX/AP176−194−N181A−N191Aと命名された活性化ペプチドにおいて部分的な欠失および特定の突然変異を有する第X因子変異体をコードするcDNAを生成した(図4)。インシュリン構築物を標準的なPCR突然変異誘発のための鋳型として使用して、配列番号2の33〜52位の範囲のアミノ酸配列(第X因子の活性化ペプチド)を含むポリペプチドPPを含むインシュリン変異体をコードするcDNAを生成した。同様に、プロテインC構築物を鋳型として使用して、プロテインC変異体をコードするcDNAを生成した(図5)。pNUT発現ベクターにクローニングされた構築物の全体をシークエンスした。
pNUT構築物を、業者によって明記されたようにjetPEI試薬(Qbiogen, Ozyme, France)を使用してベビーハムスター腎臓細胞(BHK)にトランスフェクションした。100μMの濃度のメトトレキセート(Sigma)を含む培地を用いてトランスフェクションした細胞を選択した後、単一のクローンを採取し、そして選択培地中で増殖させて、安定な細胞株を得た。第X因子抗原の産生を、Dako (Dakopatts, Glostrup, Denmark)から入手したセイヨウワサビペルオキシダーゼでコンジュゲーションしたおよびしていない第X因子に対するポリクローナル抗体を使用して酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)によってアッセイした。Kordia (Leiden, The Netherlands)からの精製ヒト血漿由来の第X因子(pd−FX)を参照として使用した。インシュリンの産生を、DakoからのヒトインシュリンELISAキットによってアッセイした。プロテインCの産生を、コーティングのためのアフィニティ精製されたマウスモノクローナル抗体(Roche, Meylan, France)およびDakoから入手したセイヨウワサビペルオキシダーゼでコンジュゲーションしたタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いてtwo-site ELISAによってアッセイした。第X因子、インシュリンおよびプロテインCを産生する細胞株を選択した。
組換えの第X因子、インシュリンおよびプロテインC誘導体並びに野生型の第X因子、インシュリンおよびプロテインCを産生する安定な細胞株を、タンパク質産生のために、300cm2フラスコ中の、10%FCS、50μMメトトレキセート、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、および5μg/mlビタミンK1(インシュリンについては含まない)の補充されたDMEM/F−12中で維持した。対象のタンパク質を含む培地を48時間毎に収集した。ベンズアミジンおよびPMSFをそれぞれ10mMおよび2mMの最終濃度となるまで加え、そして培地を遠心分離にかけ(6000g)、セルロースアセテート膜(0.45μm)上を通過させて、細胞片を排除し、そして使用するまで−20℃で保存した。馴化培地を37℃で解凍した。EDTAを5mMの最終濃度となるまで加えた。培地を希釈水およびトリス(pH7.4)中で希釈し、最終のトリスおよびNaCl濃度をそれぞれ25mMおよび60mMとした。その後、混合物を30分間室温でQAEセファデックスA−50ビーズと共に撹拌して、0.25%(wt/v)の最終濃度を達成した。ビーズを洗浄し、その後、50mMトリス(pH7.4)、500mM NaClおよび10mMベンズアミジンを用いて溶出した。溶出画分(ELISA)に含まれる組換えタンパク質を直ちに10mMベンズアミジンを含む25mMトリス(pH7.4)および100mM NaClに対して透析し、そして使用するまで−20℃で保存した。濃縮したタンパク質を37℃で解凍した。カルシウムを5mMの最終濃度となるまで加えた。組換えタンパク質の精製を、業者の説明に従って、HPC−4アガロース(Roche, Meylan, France)を使用してアフィニティクロマトグラフィーによって実施した。チモーゲンとして使用する1時間前に、第X因子誘導体を、1mMのPMSFと共にインキュベーションして、組換えタンパク質の産生または精製中に生じ得る全ての微量の活性化第X因子を中和した。同じ処理をプロテインC誘導体にも適用した。対照実験は、トリス−HCl緩衝液中で30分後に、PMSFが完全に加水分解され、そして他の反応に干渉しないであろうことを示した。タンパク質の純度を、還元(100mMジチオトレイトール、最終濃度)および非還元条件下における組換えタンパク質の10%SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析、その後の、クーマシーブリリアントブルーR−250を用いての染色により評価した。第X因子、インシュリンおよびプロテインCの同定は、精製組換えタンパク質を還元し、そして10%SDS−ポリアクリルアミドゲル上にロードした後に行なわれた。分離したタンパク質を、イモビロン膜に転写し、そしてセイヨウワサビペルオキシダーゼでコンジュゲートした第X因子、インシュリンおよびプロテインCに対するポリクローナル抗体(Dakopatts, Glostrup, Denmark)を使用してブロッティングした。精製した誘導体をアリコート化し、そして使用するまで−80℃で保存した。アリコートの濃度は、280nmにおけるその吸光度によって推定され、第X因子、インシュリンおよびプロテインCの吸光係数(E280nm、0.1%)は1.16、1.05および1.45であると考える。
C57BL/6バックグラウンドの野生型の雄マウス(Janvier, Le Genest-St-Isle, France)を、本研究全体を通じて使用し、そしてこれは8〜9週令であった。飼育および実験は、フランスの規則および欧州共同体の実験ガイドラインによって推奨された通りに行なわれた。24匹のマウスを各々のクリアランスの調査のために使用した。
麻酔をかけていないマウスを拘束装置に入れ、そしてその尾を40℃の水浴に3分間浸した。その後、リン酸緩衝食塩水(PBS)中で50μg/mlに希釈した第X因子誘導体200μlをマウスの尾静脈に注入した。種々の時点において(注入から2、6、10、および30分後、並びに1、2、4および8時間後)、マウスにペントバルビタールナトリウム(60mg/kg;Ceva Sante Animale, Libourne, France)の腹腔内注入によって麻酔をかけ、そして血液を後眼窩静脈叢から、クエン酸三ナトリウムを含むプラスチックチューブに回収した(9容量の血液に対して1容量の0.138Mのクエン酸三ナトリウム)。3匹のマウスを各時点において使用し、そして各マウスを1回だけ出血させた。血小板の少ない血漿を得るために、血液試料を1000gで20分間室温で遠心分離にかけた。血漿中の第X因子誘導体の濃度を、炭酸緩衝液(pH9.6)中でコーティングしたHPC−4(Roche)と呼ばれるマウスモノクローナル抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼにコンジュゲーションしたポリクローナル抗体の抗ヒト第X因子(Dako)を使用するイムノソルベントアッセイを用いて測定した。HPC4のタグの付いた組換え精製および定量した野生型第X因子(前記参照)を参照として使用した。結果を、注入した組換えヒト第X因子の比率として表した。体内分布実験および回収率の決定のために、高度に精製された組換えFX変異体を、記載の通りに(Fracker and Speck, BBRC 1978)、Iodo Gen(Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA)を使用してNa125I(Perkin-Elmer, Courtaboeuf, France)を用いて標識した。比放射能は、FX変異体の2〜10×104cpm/μgまで変動した。最終調製物中における遊離ヨウ素は、20%トリクロロ酢酸を用いての沈降によって決定したところ5%未満であった。回収率は、注入された量に対する注入から5分後の血漿中に存在するFXの比率を示す。
各々のプロテインCおよびインシュリンの変異体について、8周令の24匹の雄のWTマウスを使用する。1匹のマウスあたり、PBS中に希釈した10μgの精製組換えタンパク質を尾静脈を介して注入する。注入後の種々の時点において、マウスをトリブロモエタノール(60mg/kg(体重))を用いて麻酔し、そして後眼窩静脈からヒルジン(Diagnostica Stago, Asnieres, France)(100UI、最終濃度)にサンプリングによって血液を回収する。1時点につき3匹のマウスを使用し、そして各マウスは1回だけ出血させる。血漿を調製し、そしてELISAによってまたは残留活性によって注入された残留抗原濃度について分析する。
クリアランス曲線は、時間の関数としての注入された量に対する、マウス血漿中の残留第X因子、プロテインCおよびインシュリン誘導体抗原の量(注入された濃度の%)を指す。データを、以下のいずれかにあてはめた。
・単一指数関数式:
Cp=Ae−αt 式1
・または、双指数関数式:
Cp=Ae−αt+Be−βt 式2
・二相性クリアランス過程において:
MRT=(A/α2+B/β2)/(A/α+B/β) 式3
・単相性クリアランス機序において:
MRT=(A/α2)/(A/α) 式4
トロンビン生成を、分注機の具備されたFluoroscan Ascent蛍光光度計(Thermolabsystems OY, Helsink, Finland)でHemker 等(Hemker HC, Giesen P, Al Dieri R, et al. Pathophysiol Haemost Thromb 2003; 33:4-15)によって記載された方法に従って測定した。簡潔に言うと、食塩水(対照)または指定した濃度の抗凝固剤のフォンダパリニクス(Arixtra(登録商標), GlaxoSmithKline, Brentford, UK)および種々の濃度の組換え第X因子誘導体の補充された80μlの血漿を、丸底96ウェルマイクロタイタープレート中に分注した。TF(組換えの脂質化されたヒト組織因子、Innovin(登録商標)、Dade Behringから入手)およびリン脂質(PL)小胞を含む20μlの混合物を血漿試料に加えて、最終濃度1pMのTFおよび4μMのPL小胞を得た。L−α−ホスファチジル−L−セリン(PS)およびL−α−ホスファチジルコリン(PC)(Avanti Polarlipids, Albaster, Alabama, USA)から調製し、100nmの公称直径(PC:PS、3:1)のPL小胞を、膜押出法(Olson, F., Hunt, C. A., Szoka, F. C., Vail, W. J., and Papahadjopoulos, D. (1979) Biochim Biophys Acta 557(1), 9-23)によって合成した。リン脂質の濃度をホスフェート分析によって決定した。最後に、蛍光発生基質およびCaCl2を含む20μlの出発試薬の添加によって、トロンビンの生成をトリガーした。蛍光発生基質I−1140(Z−Gly−Gly−Arg−AMC)はBachem AG (Bubendorf, Switzerland)からであった。凝固血漿中におけるトロンビン生成の動態を、60分間37℃で較正自動化トロンボグラムを使用してモニタリングし、そしてThrombinoscope(登録商標)ソフトウェア(Thrombinoscope B.V., Maastricht, the Netherlands)を使用して分析した。3つのウェルが各実験のために必要とされ、2つのウェルは血漿試料のトロンビン生成を測定するためのものであり、1つのウェルは検量のためであった。全ての実験は三重に行なわれ、そして平均値が報告された。内因性トロンビン生成能(ETP)、すなわち曲線下面積、トロンビン生成ピークおよびトロンビン検出のためのラグタイムを決定した。
組換え野生型第X因子の二相性クリアランス
血漿からの第X因子のクリアランスを調査するために、マウスに、組換え野生型第X因子を静脈内注入した。注入後の指定した時点において、マウスを出血させ、そして血漿を第X因子抗原について分析した。注入後の時間の関数としての抗原値のグラフ表示は、野生型第X因子が、それぞれ43分および305分という急速な半減期および遅い半減期によって特徴付けられる二相性クリアランスで血液から消失したことを示した(図6)。さらに、MRTは、380分間であると計算された(表II)。
第X因子のクリアランスの動態における活性化ペプチドの役割を決定するために、活性化ペプチドを欠失した第X因子変異体を設計し、産生しそして精製した。FX/delAP−FpAと呼ばれるこの変異体は、第X因子活性化ペプチドをもはや有さず、しかしその代わりにフィブリノペプチドAのカルボキシ末端に対応する10残基を有する。フィブリノペプチドA残基の配列は、FX活性化ペプチドに存在する対応する残基とは異なる。野生型第X因子とは対照的に、マウスへの注入後に、FX/delAP−FpAは、見掛け上40分間の半減期を有する単相性のクリアランスパターンを示した(図7)。さらに、MRTは、野生型第X因子と比較して、切断短縮された分子では6倍減少した(表II)。結論として、これらのデータは、第X因子の活性化ペプチドが、血漿中における第X因子のクリアランス速度に重大な役割を有することを示唆する。
FX/delAP−FpAのクリアランスパターンおよび薬物動態パラメーターに対して観察される効果は、フィブリノペプチドA残基の存在に起因するのではなく、第X因子活性化ペプチドの欠失に起因することを実証するために、FX/AP−FpAを設計し、産生し、精製し、そして特徴付けた。この第X因子変異体は、カルボキシ末端においてフィブリノペプチドAの10残基に結合された、第X因子活性化ペプチドの52残基を含む。精製された変異体を、尾静脈への注入によってマウスに投与した。野生型第X因子に類似したクリアランスパターンが観察された(図8)。表IIにおいて要約したように、この変異体および野生型FXについて類似した薬物動態パラメーターが得られた。従って、以前に観察された急速なFX/delAP−FpAクリアランス速度(前記参照)は、FIX配列の存在から独立していたが、FX活性化ペプチドの52残基の非存在に起因していた。
第X因子のクリアランスに寄与する活性化ペプチドの残基を同定することに関心があった。この目的を達成するために、第X因子活性化ペプチドのカルボキシ末端の僅か19残基を有するFX/AP176−194と呼ばれる第X因子変異体を構築した。精製した変異体を、尾静脈への注入によってマウスに投与した。マウスを種々の時点で出血させ、そして血漿を第X因子抗原について分析した。これらの実験は、FX/AP176−194が、野生型第X因子と類似した様式で血漿から消失したことを明らかとした(図9)。実際に、類似の薬物動態パラメーターを実験データから計算することができた(表II)。これらのデータは、第X因子活性化ペプチドのカルボキシ末端内の残基が、第X因子のクリアランス速度において重大な役割を果たしていることを実証する。
第X因子のカルボキシ末端は、2つのN−グリコシル化部位(Asn181および191)を含んでいるので、第X因子の循環寿命におけるこれらの翻訳後修飾の可能性ある役割を、一方または両方のN−グリコシル化部位において突然変異したFX/AP176−194を使用して研究した。FX/AP176−194−N181A、FX/AP176−194−N191AおよびFX/AP176−194−N181A−N191Aと呼ばれる2つの単一突然変異体および1つの二重突然変異体を産生し、精製し、そしてそのクリアランスを研究した。二重突然変異体のFX/AP176−194−N181A−N191Aは、野生型第X因子よりも急速に循環からクリアランスされ、そして興味深いことに、第X因子の活性化ペプチドを全く含まない第X因子変異体であるFX/delAP−FpAと類似したクリアランスパターンでクリアランスされた(図10)。表IIに示したように、FX/AP176−194−N181A−N191AおよびFX/delAP−FpAについて類似した薬物動態パラメーターが得られた。これらのデータは、活性化ペプチド中の181位および191位におけるN−グリコシル化が、第X因子の生存において重大な役割を果たしていることを実証する。変異体FX/AP176−194−N181Aについて、野生型第X因子と同じような二相性クリアランスが観察された(図11)。しかしながら、循環からのその消失は、表IIに示したように野生型FXよりも速かった。変異体FX/AP176−194−N191Aについては、FX/delAP−FpAと同じような単相性クリアランスが観察された(図12)。これに対し、その消失はFX/delAP−FAよりも長かったが、FX/AP176−194−N181Aと比較して類似したMRTであった。これらのデータは、181位におけるN−グリコシル化が、第X因子のクリアランスの単相性パターンに関与し、一方、191位におけるN−グリコシル化は、二相性パターンに関与していることを示す。さらに、両方のN−グリコシル化が、第X因子の薬物動態パラメーターにおいて重要な役割を果たしている。
本願の全体を通じて、種々の参考文献が、本発明が属する当技術分野の最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (12)
- 第X因子のネイティブな活性化ペプチドが、配列番号2の33〜52位の範囲のアミノ酸配列、ここで39位および/または49位におけるアスパラギンはN−グリコシル化されている、からなる第1ポリペプチドと、配列番号4又は配列番号4の14位の残基に対応するグリシンが、バリン、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換され、そして/または配列番号4の15位の残基に対応するバリンが、プロリンによって置換されている配列番号4の変異体の7〜16位の範囲のアミノ酸配列からなる第2ポリペプチドとを含む融合タンパク質によって置換されている、第X因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。
- −第X因子が、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を有し、
−配列番号1の235位の残基に対応するイソロイシンが、アラニン、セリンもしくはロイシンによって置換され、そして/または
−配列番号1の236位の残基に対応するバリンが、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換されている、
請求項1記載の第X因子のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。 - 配列番号1の419位の残基に対応する第X因子のキメラ誘導体のセリンが、アラニンによって置換されている、請求項1〜2のいずれかに記載の第X因子のキメラ誘導体。
- 配列番号1のそれぞれ387位および391位の残基に対応する第X因子のキメラ誘導体のアルギニンおよびリジンが、アラニンによって置換されている、請求項1〜3のいずれかに記載の第X因子のキメラ誘導体。
- 出血型の凝血病態の予防または処置において使用するための請求項1〜4のいずれか1項記載の第X因子のキメラ誘導体。
- 血友病AまたはBの予防または処置において使用するための請求項5記載の第X因子のキメラ誘導体。
- 低分子量ヘパリン(LMWH)によってまたは第Xa因子にターゲティングする抗凝固剤によって誘発された出血の予防または処置のための方法において使用するための、請求項1〜4のいずれか1項記載の第X因子のキメラ誘導体。
- プロテインCのネイティブな活性化ペプチドが、配列番号2の33〜52位の範囲のアミノ酸配列、ここで39位および/または49位におけるアスパラギンはN−グリコシル化されている、からなる第1ポリペプチドと、配列番号4又は配列番号4の14位の残基に対応するグリシンが、バリン、フェニルアラニンもしくはアラニンによって置換され、そして/または配列番号4の15位の残基に対応するバリンが、プロリンによって置換されている配列番号4の変異体の7〜16位の範囲のアミノ酸配列からなる第2ポリペプチドとを含む融合タンパク質によって置換されている、プロテインCのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。
- −プロテインCが、配列番号3に記載されるアミノ酸配列を有し、
−配列番号3の212位の残基に対応するロイシンが、アラニンもしくはセリンによって置換され、そして/または
−配列番号3の213位の残基に対応するイソロイシンが、フェニルアラニンによって置換され、そして/または
−配列番号3の214位の残基に対応するアスパルテートが、グリシンによって置換されている、
請求項8記載のプロテインCのキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体。 - 凝固亢進の関与する病態の予防または処置において使用するための請求項8〜9のいずれか1項記載のプロテインCのキメラ誘導体。
- 血栓症の予防または処置において使用するための請求項10記載のプロテインCのキメラ誘導体。
- 請求項1〜4、8〜9のいずれか1項記載のキメラでトロンビンによって開裂され得る誘導体をコードする核酸分子。
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