MX2008009893A

MX2008009893A - Factor de coagulacion modificado viia con vida media extendida.

Info

Publication number: MX2008009893A
Application number: MX2008009893A
Authority: MX
Inventors: Thomas Weimer; Stefan Schulte; Ulrich Kronthaler; Wiegand Lang; Uwe Liebing; Wilfried Wormsbaecher
Original assignee: Csl Behring Gmbh
Priority date: 2006-02-06
Filing date: 2007-02-03
Publication date: 2008-11-06
Also published as: CA2636671A1; EP1816201A1; PL1984503T3; JP2013188230A; EP1984503B2; WO2007090584A1; AU2007214011B9; KR20080109750A; DK1984503T3; EP2233576A1; ES2504517T5; KR20140066793A; ES2504517T3; US20140356346A1; KR101579083B1; KR101439817B1; EP2233576B1; BRPI0707513A2; EP1984503A1; CN101379189B

Abstract

La presente invención se refiere a los campos de polipéptidos de Factor VII (FVII) y Factor VIIa (FVIIa) unidos con albúmina. Más específicamente, la invención se refiere a secuencias de cDNA que codifican el Factor VII y el Factor VIIa de ser humano y derivados genéticamente fusionados con un cDNA que codifica albúmina sérica humana que puede estar unida por oligonucleótidos que codifican enlazadores peptídicos de intervención tales como derivados codificados que presentan una estabilidad mejorada así como una vida media plasmática funcional extendida, vectores de expresión recombinante que contienen tales secuencias de cDNA, células hospederas transformadas con tales vectores de expresión recombinantes, polipéptidos recombinantes y derivados que tienen actividades biológicas de la proteína de tipo silvestre no modificada pero que tiene una mejor estabilidad y una vida de anaquel prolongada así como procesos para la preparación de tales proteínas recombinantes y sus derivados. La invención abarca también un vector de transferencia para uso en terapia génica humana que compren tales secuencias de DNA modificadas.

Description

FACTOR DE COAGULACIÓN MODIFICADO VI la CON VIDA MEDIA EXTENDIDA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a los campos de polipéptidos Factor VII (FVII) y Factor Vlla (FVIIa) enlazados con albúmina. Más específicamente, la invención se refiere a secuencias de cDNA que codifican Factor VII y Factor Vlla humanos y derivados genéticamente fusionados con un cDNA que codifica albúmina sérica humana que puede estar unida por oligonucleótidos que codifican enlazadores peptídicos que intervienen tales como derivados codificados que presentan una estabilidad mejorada y una vida media plasmática funcional extendida, vectores de expresión recombinantes que contienen tales secuencias de cDNA, células hospederas transformadas con tales vectores de expresión recombinantes, polipéptidos recombinantes y derivados que tienen actividades biológicas de proteína de tipo silvestre sin modificación pero que tienen una estabilidad mejorada y una vida de anaquel prolongada, así como procesos para la preparación de tales proteínas recombinantes y -su derivados. La invención abarca también un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana, que comprende tales secuencias de DNA modificadas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Factor VII y Factor Vlla La hemofilia A es un trastorno de sangrado heredado. Resulta de una deficiencia relacionada con el cromosoma X del factor VIII de coagulación sanguínea y afecta casi exclusivamente a individuos de sexo masculino con una incidencia entre 1 y 2 individuos por 10,000. El defecto en el cromosoma X es transmitido por portadores mujeres que no son ellas hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es una tendencia al sangrado incrementado. Antes de la introducción de tratamiento con concentrado de Factor VIII, la esperanza media de vida de una persona con hemofilia severa era inferior a 20 años. El uso de concentrados de Factor VIII proveniente del plasma y después el uso de formas recombinantes de Factor VIII mejoró considerablemente la situación para los pacientes hemofílicos incrementando de manera importante la esperanza media de vida, proporcionando a la mayoría de ellos la posibilidad de llevar una vida más o menos normal. La hemofilia B es cinco veces menos prevaleciente que la hemofilia A y es causada por factor IX faltante o no funcional y se trata con concentrados de Factor IX provenientes de plasma o una forma recombinante de Factor IX. En la hemofilia A, así como en la hemofilia B, el problema médico más severo en el tratamiento de la enfermedad es la generación de aloanticuerpos contra los factores de reemplazo. Hasta el 30% de todos los pacientes con hemofilia A desarrollan anticuerpos para el Factor VIII. Anticuerpos para el Factor IX ocurren en menor medida pero con consecuencias más graves puesto que son menos susceptibles a una terapia de inducción de tolerancia inmune. El modelo actual de coagulación establece que el activador fisiológico de la coagulación es la formación de un complejo entre el Factor (TF) y Factor Vlla (Vlla) en la superficie de células que expresan TF, que se encuentra normalmente fuera de la vasculatura. Esto provoca la activación de Factor IX y Factor X generando finalmente una cierta cantidad de trombina. En un bucle de retroalimentación positiva, la trombina activa el Factor VIII y el Factor IX, los que se conocen brazo "intrínseco" de la cascada de la coagulación de la sangre, amplificando por consiguiente la generación de Factor Xa, que es necesario para la generación de una ráfaga completa de trombina para lograr una hemostasis completa. Se mostró que mediante la administración de concentraciones suprafisiológicas de factor Vlla, se logra la hemostasis evitando la necesidad de Factor Villa y Factor IXa. La clonación del cDNA para Factor VII (US 4,784,950) hizo posible desarrollar un factor VII activado como agente farmacéutico. El Factor Vlla fue exitosamente administrado por vez primera en 1988. Desde aquel entonces, el número de indicaciones de Factor Vlla ha crecido continuamente presentando un potencial para volverse un agente hemostático universal para detener el sangrado (Erhardtsen, 2002). Sin embargo, la vida media corta del Factor VIII de aproximadamente 2 horas está limitando su aplicación. FVII es una glicoproteina de una sola cadena con un peso molecular de aproximadamente 50 kDA, secretada por células hepáticas en el torrente sanguíneo en forma de un zymógeno inactivo de 406 aminoácidos. Contiene 10 residuos de ácido ?-carboxi-glutámico (posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35) que se encuentran en el dominio Gla N-terminal de la proteína. Los residuos Gla requieren de vitamina K para su biosíntesis. Dos dominios de factor de crecimiento epidérmico seguidos por un dominio de serina proteasa tipo tripsina se encuentran C-terminal con relación al dominio Gla. Modificaciones post-traducción adicionales de FVII abarcan la hidroxilación (Asp 63), N-(Asnl45 y Asn322) así como la glicosilación de tipo O (Ser52 y Ser60) . FVII es convertido en su forma activa Factor Vlla por proteólisis del único enlace péptido en Argl52-Ilel53 llevando a la formación de dos cadenas de polipéptidos , una cadena ligera N-terminal (24 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa) que están unidas por un puente disulfuro. En contraste con otros factores de coagulación dependientes de vitamina K, no se ha descrito en el caso de FVII péptido de activación, disociado durante la activación de estos otros factores de coagulación dependientes de vitamina K. El sitio de disociación Argl52-Ilel53 y ciertos aminoácidos corriente abajo muestran homología con el sitio de disociación de activación de otros polipéptidos dependientes de vitamina K. Para lograr la conformación activa de Factor Vlla la formación de un puente de sal después de disociación de activación entre Ilel53 y Asp343 es esencial. La disociación de activación del Factor VII puede lograrse in vitro por Factor Xa, Factor Xlla, Factor IXa, Factor Vlla, proteasa activadora del Factor Siete (FSAP) y trombina. Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48:501-505) reportaron que cierta disociación ocurre también en la cadena pesada en Arg290 y/o Arg315. El Factor VII está presente en el plasma en una concentración de 500 ng/ml. 1%, por ejemplo, 5 ng/ml de Factor VII está presente como Factor Vlla. La vida media plasmática de Factor VII es de aproximadamente 4 horas y la vida media plasmática de Factor Vlla es de aproximadamente 2 horas. Aún cuando la vida media de Factor Vlla de 2 horas es comparativamente larga para un factor de coagulación activado (es decir, en el caso de otros factores de coagulación activados es del orden de minutos debido a la inhibición irreversible por antitrombina III tipo serpinas), esto constituye sin embargo un inconveniente importante para el uso terapéutico del Factor Vlla puesto que conlleva la necesidad de múltiples inyecciones i.v. o infusión continua para lograr la hemostatis. Esto resulta en un costo muy elevado del tratamiento e incomodidad para el paciente. Hasta ahora ninguna preparación farmacéutica de un Factor Vlla con vida media plasmática mejorada ha estado comercialmente disponible ni se han publicado datos sobre variantes de FVII/FVIIa con vida in vivo prolongada. Puesto que el Factor VII/VIIa tiene el potencial de utilizarse como agente hemostático universal, sigue existiendo la necesidad médica importante de desarrollar formas de Factor VIla con una vida media funcional más larga in vivo. Ballance et al. (WO 01/79271) describen polipéptidos de fusión de múltiples proteínas terapéuticas diferentes o variantes y/o fragmentos de dichas proteínas terapéuticas que, cuando se fusionan con albúmina sérica humana, o variantes y/o fragmentos de dicha albúmina tendrán probablemente una vida media funcional incrementada in vivo y una vida de anaquel extendida. Largas listas de socios de fusión potenciales se describen sin mostrar a través de datos experimentales para casi todas estas proteínas que los polipéptidos de fusión de albúmina respectivos conservan de hecho la actividad biológica del socio de fusión de proteína terapéutica y tienen propiedades mejoradas. De conformidad con WO 01/79271 además cada miembro de la lista de proteínas terapéuticas puede estar fusionado en muchas orientaciones diferentes con albúmina, por ejemplo, dos moléculas de la proteína de fusión fusionadas una sobre el N-extremo y la otra en el C-extremo de albúmina, o bien una molécula de la proteina terapéutica fusionada en cualquiera de N-terminal o C-terminal con la albúmina o también múltiples regiones de cada proteina fusionadas en múltiples regiones de la otra. Entre las múltiples proteínas terapéuticas listadas en el documento O 01/79271 como socios de fusión de albúmina potenciales se pueden mencionar Factores IX y FVII/FVIIa si bien no sé proporcionan evidencias experimentales de principio para ninguna de estas proteínas. Sheffield expresó un polipéptido de fusión Factor IX (un factor de protrombina que consiste de 415 aminoácidos) con albúmina y mostró en experimentos farmacocinéticos que el comportamiento de depuración del polipéptido de fusión de Factor IX con albúmina el en conejos se parecía más estrechamente al del Factor IX que al de la albúmina mostrando solamente un incremento leve de la vida media terminal (inferior a la duplicación (Sheffield WP et al. (2004) Br. J. Haematol. 126:565-573). Tomando en cuenta los resultados de Sheffield y debido a la alta homología entre los Factores IX y VII (ambos son factores de protrombina dependientes de vitamina K) y su tamaño comparable, una persona con conocimientos en la materia podría considerar que tampoco el Factor VII se aprovecha de la fusión con albúmina en términos de vida media funcional in vivo.

El problema técnico subyacente de la presente invención fue entonces desarrollar proteina de fusión FVII/albúmina funcionales que conservan su actividad biológica y muestran una vida media funcional incrementada in vivo. Con relación a este aspecto, la actividad biológica, de un polipéptido Factor VII /VIla se refiere a su capacidad de activar los factores de coagulación IX y X en presencia de factor tisular después de haber sido activo el mismo. La vida media plasmática funcional in vivo se refiere a la vida media de la actividad biológica del polipéptido de fusión de Factor VII/VIIa una vez inyectado en el plasma. El plasma preferentemente es plasma humano. Encontramos que polipéptidos enlazados a albúmina que comprenden por lo menos un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla o un fragmento o variante del mismo, fusionados con albúmina, o un fragmento o variante de la misma, en donde por lo menos una molécula de Factor VII o Factor Vlla se localiza en el extremo N de la proteina de fusión, resultan en polipéptidos de fusión con una porción de Factor Vil/Factor FVIIa biológicamente activo. Un aspecto de la presente invención es por consiguiente proteínas de fusión biológicamente activas en donde los polipéptidos de Factor VII/VIIa están fusionados en el •extremo N de la albúmina sérica humana. Las proteínas de fusión presentan por lo menos el 25%, con mayor preferencia más del 40%, con preferencia aún mayor más del 70%, y muy especialmente más del 90% de la actividad especifica molar de Factor VlI/VIIa de tipo silvestre. Se encontró además de manera sorprendente que en contraste con fusiones de Factor IX en el extremo N de la albúmina sérica humana como lo publicó Sheffield, fusiones de Factor VlI/VIIa con albúmina en el extremo N de la albúmina sérica humana conllevaron a proteínas de fusión de Factor VII/FVIIa que no solamente conservaron la actividad biológica de Factor VlI/VIIa sino también presentaban una extensión significativa de la vida media plasmática funcional de Factor VlI/VIIa in vivo . La expresión de constructos de fusión con albúmina con una porción FVII/FVIIa deseada en el extremo C de albúmina no fue exitosa debido a que las proteínas de fusión de albúmina expresadas no fueron secretadas como moléculas intactas. En la transición a través de la membrana celular se observó una disociación en una molécula madura FVII/FVIIa que debido a una gamma-carboxilación afectada presentaba una actividad específica molar reducida y una porción albúmina con el propéptido FVII fijado en su extremo C. Por consiguiente se encontró en contraste con la divulgación de Ballance et al que solamente una fusión de la porción FVII/FVIIa de la albúmina sérica humana resulta en una proteína de fusión con las propiedades biológicas deseadas, respectivamente la retención de la actividad biológica de FVII/FVIIa y una vida media plasmática incrementada. Un aspecto adicional de la presente invención es por consiguiente proteínas de fusión biológicamente activas en las cuales polipéptidos de Factor VII/VIIa están fusionados en el extremo N de albúmina que muestran una extensión significativa de la vida media plasmática funcional en comparación con Factor VII/VIIa no fusionado. En modalidades preferidas, los polipéptidos de fusión de albúmina FVII/FVIIa de la invención que comprenden un polipéptido FVII/FVIIa tienen una vida media funcional in vivo extendida o una actividad terapéutica de mayor duración o incrementada en comparación con la vida media in vivo o con la actividad terapéutica in vivo de FVII/FVIIa no fusionado. Un aspecto de la invención se refiere por consiguiente a FVII/FVIIa fusionado con el extremo N de la albúmina que extiende la vida media plasmática en comparación con la vida media plasmática de FVII/FVIIa no fusionado en por lo menos 100%, preferentemente más del 200%, con preferencia aún mayor más de 500%, y muy especialmente más de 1000%. En un aspecto sorprendente adicional de la presente invención encontramos que polipéptidos de fusión FVII/FVIIa con albúmina sin un enlazador muestran una actividad biológica significativamente reducida, mientras que polipéptidos de fusión FVII/FVIIa con albúmina en donde las porciones FVII/FVIIa están separadas de la albúmina por un enlazador presentan un incremente de 'la actividad biológica de Factor VII/VIIa dependiente de la longitud del enlazador. El Factor VII o la porción de péptido de Factor Vlla está conectado a la porción de albúmina por un enlazador peptídico permitiendo por consiguiente que la molécula de fusión tome una conformación que permita una actividad específica molar más elevada en comparación con una molécula de fusión sin una secuencia de enlazador de este tipo. Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención son polipéptidos de fusión de Factor VII/VIIa con albúmina que comprenden un péptido de enlazador entre la porción Factor VII/VIIa y el extremo N de la albúmina que tienen una actividad de Factor VII/VIIa biológica incrementada, por ejemplo, según lo medido como actividad específica molar en comparación con proteínas de fusión de Factor VII/VIIa sin tales enlazadores. El incremento de la actividad específica molar de proteínas de fusión en donde la porción de Factor VII/VIIa está fusionada en el extremo N de la albúmina a través de un enlazador peptídico en comparación con proteínas de fusión correspondientes sin un enlazador de este tipo es de por lo menos 25%, preferentemente por lo menos 50%, y muy preferentemente por lo menos 100%. Estos polipéptidos de fusión de Factor VII/VIIa con albúmina que llevan enlazador presentan también una vida media funcional incrementada in vivo en comparación con FVIIa de tipo silvestre. Sin embargo, enlazadores químicos o sistemas de enlazadores tales como, sin limitación, avidina-biotina funcionarán de manera similar en la medida en que distancias comparables son introducidas entre la porción de Factor VII/FVIIa y la porción albúmina. A continuación, el término "péptido enlazador" o similar incluirá tales otros enlazadores funcionales, en caso,, adecuado . La invención abarca polipéptidos de Factor VII/VIIa terapéuticos unidos al extremo N de albúmina, composiciones, composiciones farmacéuticas, formulaciones y kits. La invención abarca también el uso de tales polipéptidos enlazados con albúmina terapéuticos en ciertas indicaciones médicas . La invención abarca también moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos enlazados a albúmina de la presente invención, así como vectores que contienen éstos ácidos nucleicos, células hospederas transformadas con estos ácidos nucleicos y vectores, y métodos para elaborar los polipéptidos enlazados con albúmina de la presente invención utilizando estos ácidos nucleicos, vectores y/o células hospederas. La invención ofrece también una composición que comprende un polipéptidos de Factor VII/VIIa unido a albúmina que comprende un péptido de Factor VII o Factor Vlla, o un fragmento o variante del mismo, opcionalmente un enlazador peptidico, y albúmina, o un fragmento o variante de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para tratar pacientes con trastornos de sangrado. El método comprende el paso de administrar una cantidad efectiva del polipéptido de FVII/FVIIa unido a albúmina. Otro objeto de la presente invención es ofrecer una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de Factor VlI/VIIa unido a albúmina que comprenden un péptido de Factor VII o Factor VI la, o un fragmento o variante del mismo, opcionalmente un enlazador peptidico, y albúmina, o un fragmento o variante de la misma, así como un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico. Dicha secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se encuentra en el extremo 3' de una secuencia de ácido nucleico que codificas un propéptido que media la carboxilacion gamma de la parte de fusión de Factor VlI/VIIa. La invención ofrece también un método para preparar un polipéptido de Factor VII/FVIIa unido a albúmina que comprende un peptidico Factor VlI/VIIa o un fragmento o variante del mismo, un enlazador peptidico, y una albúmina o un fragmento o variante de la misma, en donde el método comprende : (a) proporcionar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Factor VII/VIIa unido a albúmina que puede expresarse en una célula de mamífero; (b) expresar el ácido nucleico en el organismo para formar un polipéptido de Factor VII/VIIa unido a albúmina; y (c) purificar el polipéptido de Factor VII/VIIa unido a albúmina . En un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos . de fusión de albúmina y a métodos para el tratamiento, la prevención o la mejora de enfermedades o trastornos. Como se utiliza aquí, la expresión "polipéptido" de fusión de Factor VII/VIIa con albúmina se refiere a un polipéptido formado por la fusión de por lo menos una molécula de Factor VII/VIIa (o fragmento o variante del mismo) en el extremo N de por lo menos una molécula de albúmina (o fragmento o variante de la misma) , ambas porciones estando opcionalmente separadas a través de un enlazador peptídico. Un polipéptido de Factor VII/FVIIa unido a albúmina de la presente invención comprende por lo menos un fragmento o variante de Factor VII/FVIIa y por lo menos un fragmento o variante de albúmina sérica humana que están asociados entre ellos, como por ejemplo mediante fusión genética (es decir, el polipéptido de fusión de albúmina es generado por la traducción de un ácido nucleico en donde un polinucleótido que codifica la totalidad o una parte de un Factor VII/FVIIa está unido en cuadro al extremo 5' de un polinucleótico que codifica la totalidad o una porción de albúmina opcionalmente unido por un polinucleótico que codifica una secuencia de enlazador introduciendo un péptido enlazador entre la porción Factor VlI/VIIa y la porción albúmina) . En una modalidad, la invención ofrece un polipéptido de fusión de Factor VlI/VIIa con albúmina que comprende, o alternativamente que consiste de Factor VII /VI la biológicamente activo y/o terapéuticamente activo fusionado en el extremo N de un polipéptido de albúmina sérica . En otras modalidades la invención ofrece un polipéptido de fusión de albúmina que comprende, o bien alternativamente que consiste de un fragmento de Factor VlI/VIIa biológicamente activo y/o terapéuticamente activo y un enlazador peptidico fusionado en el extremo N de una proteina de albúmina sérica. En otras modalidades, la invención ofrece un polipéptido de fusión de Factor VlI/VIIa con albúmina que comprende, o alternativamente que consiste de una variante de un Factor VlI/VIIa biológicamente activa y/o terapéuticamente activa fusionada en el extremo N de un polipéptido de albúmina sérica y opcionalmente un enlazador peptxdico. En modalidades adicionales, la invención ofrece un polipéptido de Factor VII/FVIIa unido a albúmina que comprende, o alternativamente que consiste de una fragmento o una variante biológicamente activo y/o terapéuticamente activo de un FVII/FVIIa fusionado en el extremo N de un fragmento o una variante de albúmina sérica y opcionalmente un enlazador peptidico. En ciertas modalidades, la invención ofrece un polipéptido de fusión de albúmina que comprende, o alternativamente que consiste de la porción madura de un FVII/FVIIa fusionada sobre el extremo N de la porción madura de albúmina sérica y opcionalmente un enlazador peptidico. De conformidad con el documento WO 01/79271, un polipéptido de fusión de albúmina que comprende FVII/FVIIa puede ser utilizado como un agente terapéutico en las indicaciones "trastornos del sangrado", "hemofilia A y B", "trastornos hepáticos" y "episodios hemorrágicos relacionados con cirugía". En otro aspecto de la invención, un polipéptido de fusión de albúmina que comprende FVII/FVIIa puede también utilizase terapéuticamente en otras indicaciones. Indicaciones más preferidas son "episodios de sangrado y cirugía en pacientes con hemofilia heredada o adquirida con inhibidores de factores de coagulación (FVII o FIX)", "reversión de déficits de hemostasis desarrollados como consecuencia de tratamientos farmacéuticos tales como fármacos antiplaquetarios o fármacos anticoagulación", "mejora de hemostasis secundaria", "déficits de hemostasis desarrollados durante infecciones o durante enfermedades como, por ejemplo, deficiencia en Vitamina K o enfermedad hepática severa", "resección hepática", "déficits de hemostasis desarrollados como consecuencias de mordeduras de serpientes", "sangrados gastrointestinales", "traumas", "consecuencias de transfusión masiva (coagulopatia dilucional") , "deficiencias de factor de coagulación otros que FVII y FIX", "VWD", "deficiencia de FI", "deficiencia de FV", "deficiencia de FVII" "deficiencia de FX", "deficiencia de FXIII", "deficiencia de HUS", "enfermedades y trastornos plaquetarios heredados o adquiridos tales como trombocitopenia, ITP, TTP, síndrome de HELLP, síndrome de Bernard-Soulier, trombastenia de Glanzman, HIT", "síndrome de Chediak-Higahi" , "síndrome de Hermansky-Pudlak", "síndrome de Rendu-Osler", "síndrome de Henoch-Schonlein" , "curación de heridas". DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Es un objeto de la presente invención ofrecer Factor VII humano y Factor Vlla humano o fragmentos o variantes de los mimos fusionados sobre el extremo N de albúmina humana o fragmentos o variantes de la misma con una vida media funcional más larga in vivo en comparación con Factor VII humano y Factor Vlla humano o fragmentos o variantes de los mismos. Es otro objeto de la presente invención ofrecer Factor VII humano y Factor Vlla humano o fragmentos o variantes de los mismos fusionados con el extremo N de albúmina humana o fragmentos o variantes de lá misma con actividad especifica molar incrementada. Para lograr esta meta se proporcionan fusiones de Factor VII o Factor Vlla en el extremo N de albúmina sérica, opcionalmente con un enlazador peptidico entre FVII/FVIIa y la albúmina. Los términos "albúmina sérica humana" (HSA) y "albúmina humana" (HA) se utilizan de manera intercambiable aquí. Los términos "albúmina" "albúmina sérica" son más amplios y abarcan albúmina sérica humana (y fragmentos y variantes de la misma) asi como albúmina de otras especies (y fragmentos y variantes de la misma) . En lugar de albúmina se pueden utilizar también otras proteínas de tipo albúminas, como por ejemplo, sin limitación, alfa-fetoproteína humana (según lo descrito en el documento WO 2005/024044) así como sus fragmentos o variantes funcionales . Como se utiliza aquí, el término "albúmina" se refiere colectivamente a polipéptido de albúmina o secuencia de aminoácidos, o a un fragmento o variante de albúmina, que tiene una o varias actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas de albúmina) . En particular, la "albúmina" se refiere a albúmina humana o fragmentos de la misma especialmente la forma madura de albúmina humana como se muestra SEQ ID No: 22 aqui o albúmina de otros vertebrados o fragmentos de la misma, o análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de ellas. La porción albúmina de los polipéptidos enlazados con albúmina puede comprender la longitud completa de la secuencia de HA de conformidad con lo descrito arriba, o bien puede incluir uno de varios fragmentos de la misma capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Tales fragmentos pueden tener 10 o más aminoácidos en cuanto a su longitud o pueden incluir aproximadamente, 15, 20, 25, 30, 50, o más aminoácidos contiguos provenientes de la 'secuencia de HA o bien pueden incluir una parte o la totalidad de los dominios de HA. La porción albúmina de los polipéptidos enlazados a albúmina de la presente invención puede ser una variante de HA normal. La porción de proteina de Factor VII de los polipéptidos unidos a albúmina de la presente invención puede ser variantes de los polipéptidos de Factor VII de conformidad con lo descrito aqui. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sea conservadoras o no conservadoras, de tal manera que tales cambios no alteren sustancialmente el sitio activo, o dominio activo, que proporciona las actividades terapéuticas de los polipéptidos de Factor VII. En particular los polipéptidos unidos a albúmina de la presente invención pueden incluir variantes polimórficas que ocurren naturalmente de la albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. La albúmina puede ser derivada de cualquier vertebrado, especialmente cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, vaca, oveja, o cerdo. Albúminas no de mamífero incluyen, pero sin limitarse a estos ejemplos, albúmina de gallina y de salmón. La porción albúmina del polipéptido unido a albúmina puede ser de un animal diferente en comparación con la porción FVII/FVIIa. En términos generales un fragmento de albúmina o variante puede tener por lo menos 20 aminoácidos, preferentemente por lo menos 40 aminoácidos, con mayor preferencia más de 70 aminoácidos de largo. La variante de albúmina puede consistir preferentemente o puede comprender alternativamente por lo menos un dominio entero de albúmina o fragmento de dichos dominios, por ejemplo los dominios 1 (aminoácido 1-194 de SEQ ID NO:22), 2 (aminoácidos 195-387 de SEQ ID NO:22), 3 (aminoácidos de 388-585 SEQ ID NO:22), 1 + 2 (1-387 de SEQ ID NO:22), 2 + 3 (195-585 de SEQ ID NO:22) o 1 + 3 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO:22 + aminoácidos 388-585 SEQ ID NO:22). Cada dominio está formado por dos subdominios homólogos, específicamente 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con regiones flexibles de enlazador entre subdominios que comprenden los residuos Lysl06 hasta Glull9, Glu292 hasta Val315 y Glu492 hasta Ala511. La porción de albúmina de polipéptido de fusión de albúmina de la presente invención puede comprender por lo menos un subdominio o dominio de HA o modificaciones conservadoras del mismo. La invención se refiere a un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla modificado, que comprende el enlace de polipéptido de Factor VII o Factor Vlla o fragmento o variante del mismo con el extremo N de un polipéptido de albúmina o fragmento o variante de la misma opcionalmente de tal manera que un enlazador peptídico esté introducido entre el Factor VII o Factor Vlla modificado y la albúmina de tal manera que el polipéptido de Factor VII o Factor Vlla modificado tenga una vida media funcional in vivo incrementada en comparación con el polipéptido de Factor VII o Factor Vlla que no ha sido unido a albúmina o de tal manera que la actividad específica molar de FVII/FVIIa fusionado a albúmina con un enlazador peptídico sea mayor que la actividad específica molar de FVII/FVIIa fusionado a albúmina sin enlazador peptídico.

El término "Factor VII/VIIa" como se utiliza en esta solicitud se refiere a un polipéptido terapéutico que consiste ya sea de la forma no activada "Factor VII" o de la forma activada "Factor Vlla" o mezcla de ellas. La expresión "Factor VII/VIIa" en la definición arriba incluye polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de Factor VII/VIIa humano nativo. Incluye también polipéptidos con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N modificado o extremo C modificado que incluye deleciones o adiciones de aminoácidos terminales en la medida que estos polipéptidos conservan sustancialmente la actividad biológica de Factor Vlla. "Factor VII" en la definición arriba incluye también variaciones alélicas naturales que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. La expresión "Factor VII" en la definición arriba incluye además variantes de FVII/FVIIa. Tales variantes difieren en uno o varios residuos de aminoácidos en comparación con la secuencia de tipo silvestre. Ejemplo de tales diferencias pueden incluir la truncación del extremo N y/o extremo C por uno o varios residuos de aminoácidos (por ejemplo de 1 a 10 residuos de aminoácidos) , o la adición de 1 o varios residuos adicionales en el extremo N y/o en el extremo C, asi como sustituciones conservadoras de aminoácidos, es decir, sustituciones efectuadas dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrofóbicos, (6) aminoácidos aromáticos. Ejemplos de tales sustituciones conservadoras se muestran en la tabla siguiente. Tabla 1 (1) Alanina Glicina (2) Ácido Aspártico Ácido Glutámico (3a) Asparagina Glutamina (3b) Serina Treonina (4) Arginina Histidina Lisina (5) Isoleucina leucina Metionina Valina (6) Feninalanina Tirosina Triptófano Las proteínas de fusión presentan una actividad específica molar que es por lo menos 25%, preferentemente más que 40%, con preferencia aún mayor más que 70%, y de manera muy especialmente preferida más que el 90% de la actividad específica molar de Factor VII/VIIa de tipo silvestre no fusionado o del fragmento o variante FVII/FVIIa respectivo del mismo. El polipéptido FVII/FVIIa de la presente invención unido a través de un enlazador peptídico de intervención al extremo N de albúmina tiene una actividad especifica molar incrementada en comparación con la actividad especifica molar de una fusión de Factor VII/VIIa con albúmina sin un enlazador peptidico de intervención. El incremento de la actividad especifica molar del polipéptido de Factor VII/VIIa unido a albúmina de la presente invención en comparación con las actividad especifica de una fusión de Factor VII/VIIa con albúmina sin un enlazador peptidico de intervención es por lo menos 25% preferentemente por lo menos 50%, con mayor preferencia, 100%, y de manera muy especialmente preferible por lo menos 200%. La actividad de Factor VII/VIIa es la capacidad de convertir el Factor X de substrato en el Factor Xa activo. La actividad de FVIIa de un polipéptido de Factor VII/VIIa unido a albúmina puede medirse preferentemente utilizando STACLOT®. La actividad especifica molar de conformidad con lo utilizado en esta invención significa: la actividad medida en el ensayo STACLOT® después de activación de la proteina de fusión de FVII con albúminas en Unidades Internacionales (UI) por 100 UI de antigeno de Factor VII/VIIa según lo medido por ELISA. Los polipéptidos FVII/FVIIa unidos a albúmina de la presente invención tienen una actividad especifica molar por lo menos 25% mayor en comparación con la fusión de Factor VII/FVIIa con albúmina sin el enlazador peptidico de intervención y presentan una vida media funcional incrementada in vivo en comparación con la forma no enlazada del polipéptido de Factor VII o Factor Vlla. La vida media funcional in vivo puede ser determinada como se muestra en Lindley et al. (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VII, clin. Pharmacol Ther. (1994) 55:638-648). Los polipéptidos FVII/FVIIa enlazados a albúmina de la presente invención tienen una actividad especifica molar por lo menos 25% mayor en comparación con proteínas de fusión de Factor VII/FVIIa- con albúmina sin enlazador peptídico de intervención y su vida media funcional in vivo es habitualmente incrementa en por lo menos 100%, preferentemente por lo menos 200%, con preferencia aún mayor en por lo menos 500% en comparación con la forma no enlazada de polipéptido Factor VII o Factor Vlla. Una modalidad de la presente invención se refiere por consiguiente a polipéptidos de FVII/FVIIa unidos a albúmina que tienen un enlazador peptídico que consisten de por lo menos un aminoácido, preferentemente por lo menos 3 aminoácidos, con mayor preferencia por lo menos 7 aminoácidos, y con preferencia especial por lo menos 25 aminoácidos . La vida media funcional in vivo de la forma de tipo silvestre del Factor VII humano es de aproximadamente 4 horas en seres humanos. La vida media funcional de polipéptidos de Factor VII unidos a albúmina de la presente invención es habitualmente de por lo menos aproximadamente 8 horas, con preferencia por lo menos aproximadamente 12 horas y con preferencia muy especial por lo menos aproximadamente 24 horas . La vida media funcional in vivo de la forma de tipo silvestre de Factor VIla humano es de aproximadamente 2 horas en seres humanos. La vida media funcional de los polipéptidos de Factor Vlla unidos a albúmina de la presente invención es habitualmente de por lo menos 4 horas, preferentemente por lo menos aproximadamente 6 horas, con preferencia aún mayor por lo menos 12 horas. De conformidad con la presente invención, la porción de Factor VlI/VIIa está conectada a la porción albúmina a través de un enlazador peptidico. El enlazador es preferentemente flexible y no inmunogénico y genera una distancia entre una albúmina humana y FVII/FVIIa que minimiza la interferencia potencial de los dos socios de fusión, lo que resulta en una actividad FVII/FVIIa incrementada de la proteina de fusión. Enlazadores de ejemplo incluyen (GGGGS)N o (GGGS)N o (GGS)N, en donde N es un número entero superior o igual a 1 y en donde G representa glicina y S representa serina. Estos aminoácidos pertenecen al grupo de los aminoácidos naturales y fueron seleccionados como ejemplos para todos los aminoácidos naturales posibles. En otra modalidad de la presente invención, el enlazador peptidico entre la porción de Factor VII/VIIa y la porción albúmina contiene sitios de consenso para la adición de modificaciones postraducción. Preferentemente, tales modificaciones consisten de sitios de glicosilación . Con mayor preferencia, tales modificaciones consisten de por lo menos un sitio de N-glicosilación de la estructura Asn - X -Ser/Thr, en donde X se refiere a cualquier aminoácido excepto prolina. Con preferencia aún mayor, tales sitios de N-glicosilación están insertados cerca del extremo amino y/o carboxi del enlazador peptidico de tal manera que puedan proteger los neoepitopos potenciales que pueden desarrollarse en las secuencias en donde la porción Factor VII/VIIa está efectuando transición en el enlazador peptidico y en donde el enlazador peptidico está efectuando transición en la secuencia de porción de albúmina, respectivamente. En otra modalidad de la invención, el enlazador peptidico entre la porción Factor VII/VIIa y la porción albúmina consiste de secuencias de péptido que sirven como enlazadores entre dominios naturales en proteínas humanas. Preferentemente, tales secuencias de péptidos en su entorno natural están localizadas cerca de la superficie de las proteínas y son accesibles al sistema inmune de tal manera que se pueda asumir una tolerancia natural contra esta secuencia. En la tabla 2 se proporcionan ejemplos. Tabla 2 Secuencia Proteina Número de Posición del Acceso Enlazador EPQ GGGGSGGGGSG E Protocaderina- Q9P2E7 cerca de la membrana, 10 extracelular GGVGGGGGGAGI Receptor de ANP P17342 extremo N-terminal, extracelular PAR GGGGGG KAR Rizado-8 Q9H461 ínter-dominio, secretada GGPGGGGGGGPGG Rizado-8 Q9H461 C-terminal , secretada TSR GGGGSGGG EPP LRRFN2 Q9ULH4 inter-dominio, extracelular En otra modalidad de la invención, el enlazador peptidico entre la porción de Factor VII/VIIa y la porción albúmina consiste de secuencias de péptidos que son enlazadores entre dominios de proteínas plasmáticas conocidas. Ejemplos se ofrecen en la Tabla 3. Tabla 3 Secuencia Proteina Número de Posición del Enlazador Acceso MYGAKKPLNTEGVMKSRS FXIIIa P00488 entre dominio catalítico y dominio de tipo ig RGEVKYPLCTRKESK FXIIIb P05160 entre dos dominios Sushi ESGGPLSLS FVIII P00451 dentro del dominio B APEAPPPTLPP vWF P04275 entre dos vWAs En otra modalidad de la invención, la porción Factor VlI/VIIa está conectada a la porción albúmina a través de un enlazador peptidico que libera el polipéptido Factor VlI/VIIa en el sitio de coagulación en donde el enlazador contiene un sitio de disociación de proteasa. Preferentemente, tales sitios de disociación de proteasas plasmáticas son los de serina proteasas. Más preferentemente, el sitio de disociación es de un sitio de disociación de proteasa de coagulación. Con mayor preferencia, la proteasa de coagulación se selecciona dentro del grupo que consiste de Factor lia, Factor IXa, Factor Xa, Factor Xla, Factor Xlla, proteina C activada, elastasa o kallikreina . Las secuencias de aminoácidos que son reconocidas y disociadas por estas serina proteasas son conocidas por parte de ü'na persona con conocimientos ordinarios en la técnica, por ejemplo de conformidad con lo descrito en "Hemostasis' and Thrombosis, Basic Principies and Clinical Practice", Cuarta Edición, Colman et al. 2001. Factor Ha: p34-35, pl76, Factor IXa: p40-41, Factor Xa: p34-35, Factor Xla pl28-129, Factor Xlla: pl94, aPC: p34-35, pl59, kallikreina: pl03-104 o elastasa (O'Reilly et al; 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin : Science 285:1926-1928). La invención se refiere además a polipéptidos de fusión de Factor VII/VIIa con albúmina modificada de conformidad con la presente invención que comprenden modificaciones adicionales dentro de la porción Factor VII/VIIa. En particular, modificaciones de Factor VII/VIIa se encuentran dentro del marco de la presente invención en donde el Factor VII/VIIa ha sido modificado entre los polipéptidos Argl44 y Argl52 mediante la adición de por lo menos una parte de un péptido de activación de un polipéptido dependiente de vitamina K diferente o mediante el reemplazo de por lo menos una parte del péptido de activación putativo de un polipéptido de Factor VII/FVIIa con por lo menos una parte de un péptido de activación de un polipéptido dependiente de vitamina K diferente ,de conformidad con lo descrito en la solicitud de Patente Europea 04019485.4 (que se incorpora en está solicitud por referencia) y que se describe en el párrafo siguiente. El FVII está relacionado de manera particularmente estrecha con otras proteínas de dominio Gla, por ejemplo FIX; FX y proteína C en donde el dominio Gla N-terminal está seguido por dos dominios de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) seguido por el dominio de serina proteasa de tipo tripsina. Lo notable es la gran diferencia en cuanto a la vida media plasmática de estás proteínas plasmáticas estrechamente relacionadas : FVII 2-4 horas Proteina C: 6-8 horas FIX: 18-30 horas FX: 20-42 horas Las moléculas son altamente conservadas, la diferencia más notable se encuentra dentro del dominio de activación. Para FVII, no se ha descrito ningún péptido de activación. Sin embargo, durante la activación, FVII puede estar disociado en Argl44, además de la disociación en Argl52, lo que resulta en la liberación de un péptido de activación putativo de 8 aminoácidos que contiene un sitio de N-glicosilación conservado. La secuencia entre Argl44 y Argl52 se conoce en la solicitud de Patente Europea 04019485.4 como "péptido de activación putativo". Sorprendentemente, la longitud de los péptidos de activación y modificaciones postraducción de los péptidos de activación se correlacionan con una vida media incrementada. Tabla 4.

Vida media Longitud de péptido Sitios de N- Plasmática de activación dentro glicosilación de las proteínas dentro de péptido humanas respectivas de activación respectivo FVII 2-4 horas Ningún péptido de 1 en péptido de activación (o bien activación de 8 péptido de activaaminoácidos ción de 8 aminoáciputativo dos putativo) Proteína 6-8 horas 16 aminoácidos 0 C FIX 18-30 horas 34 aminoácidos 2 FX 20-42 horas 51 aminoácidos 2 La invención se refiere por consiguiente a un método para preparar un polipéptido de Factor VlI/VIIa modificado enlazado a albúmina, que comprende la modificación del polipéptido de Factor VlI/VIIa en la región entre Argl44 y Argl52 de tal manera que el polipéptido de Factor VlI/VIIa modificado tenga una vida media incrementada en comparación con el polipéptido de Factor VII /VI la en el cual está región no ha sido modificada. La invención se refiere además a un método para preparar dicho polipéptido de Factor VlI/VIIa unido a albúmina modificado, que comprende la modificación del polipéptido de Factor VlI/VIIa en la región entre Argl44 y Argl52 de dicho polipéptido de Factor VlI/VIIa unido a albúmina mediante la adición de por lo menos una parte de un péptido de activación de un segundo polipéptido dependiente de vitamina K o mediante el reemplazo de por lo menos parte del péptido de activación putativa de un polipéptido de Factor VlI/VIIa con por lo menos parte de un péptido de activación de un polipéptido dependiente de vitamina K diferente. La invención abarca además mutaciones adicionales dentro de la secuencia de polipéptidos de Factor VlI/VIIa, que incrementan la actividad catalítica, extienden la vida media plasmática o modifican la interacción con Factor Tisular. Mutaciones de Factor VII particularmente útiles se describen en Shah et al. (1198) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 95:4229-4234, en donde se reportaron mejoras de la función de proteína. Otras mutaciones útiles de Factor VII/VIla se presentan en la descripción de la técnica anterior de la solicitud de Patente Europea 04019485.4. La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión de Factor VlI/VIIa con albúmina de conformidad con lo descrito en está solicitud. El termino "polinucleótido (s) " se refiere generalmente a cualquier poli-ribonucleótido o poli-desoxirribonucleótido que puede ser RNA o DNA no modificado o bien RNA o DNA modificado. El polinucleótido puede ser DNA de una sola cadena o bien DNA de doble cadena, RNA de una sola cadena o bien RNA de doble cadena. Como se utiliza aquí, el término "polinucleótido (s) " incluye también DNAs o RNAs que comprenden una o varias bases modificadas y/o bases no usuales, como por ejemplo inosina. Se observará que varias modificaciones pueden efectuarse al DNA y al RNA que sirven muchos propósitos útiles conocidos por parte de una persona con conocimientos en la materia. El término "polinucleótido (s) " como se emplea aquí abarca tales formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos así como las formas químicas de DNA o RNA característico de virus y células, incluyendo, por ejemplo, células simples y complejas. La persona con conocimientos en la materia entenderá que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado puede ser codificado por diferentes polinucleótidos. Estas "variantes" están abarcadas dentro del marco de la presente invención. Preferentemente, el polinucleótido de la presente invención es un polinucleótido aislado. El término polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido sustancialmente libre de otras secuencias de ácido nucleico, como por ejemplo, pero sin limitarse a estos ejemplos, otro DNA y RNA cromosómico y extra-cromosómico . Polinucleótidos aislados pueden ser purificados a partir de una célula hospedera. Métodos convencionales de purificación de ácido nucleico conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia pueden utilizarse para obtener polinucleótidos aislados. El término incluye también polinucleótidos recombinantes así como polinucleótidos químicamente sintetizados . Otro aspecto de la invención es un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de conformidad con la presente invención. Preferentemente, el plásmido o vector es un vector de expresión. En una modalidad particular, el vector es un vector de transferencia para uso en terapia génica humana. Otro aspecto de la presente invención es una célula hospedera que comprende un polinucleótido de la invención o un plásmido o vector de la invención. Las células hospederas de la presente invención pueden emplearse en un método para la producción de un polipéptido de fusión FVII/VIIa-albúmina que es parte de está invención. El método comprende: cultivar células hospederas de la invención bajo condiciones tales que el polipéptido de fusión FVII/VIIa-albúmina sea expresado; y - recuperar opcionalmente el polipéptido de fusión FVII/VIIa-albúmina a partir del medio de cultivo. EXPRESIÓN DE LAS VARIANTES PROPUESTAS: La producción de proteínas recombinantes a altos niveles en células hospederas adecuadas requiere del ensamblaje de los cDNAs modificados mencionados arriba en unidades transcripcionales eficientes conjuntamente con elementos reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante, que puede propagarse en varios sistemas de expresión de conformidad con métodos conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia. Elementos reguladores de transcripción eficientes podrían derivarse de virus que tienen células animales como sus hospederos naturales o bien a partir de DNA cromosómico de células de animales. Preferentemente, combinaciones promotor-realzador derivadas del Virus del Simio 40, adenovirus, virus de polioma BK, citomegalovirus humano, o la repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous, o bien combinaciones promotor-realzador que incluyen genes fuertemente constitutivamente transcritos en células de animales tales como beta-actina o GRP78 puede utilizarse. Con el objeto de lograr niveles altos estables de mRNA transcripto a partir de cDNAs, la unidad transcripcional debe contener en su parte próxima al extremo 3' una región de DNA que codifica una secuencia de poliadenilación de terminación transcripcional.

Preferentemente, está secuencia es derivada de la región transcripcional temprana del Virus del Simio 40, el gen de beta-globina del conejo, o el gen de activador de plasminógeno tisular humano. Los cDNAs son entonces integrados en el genoma de una línea adecuada de células hospederas para expresión de los polipéptidos de fusión de Factor VlI/VIIa-albúmina . Preferentemente, está línea celular debe ser una línea de células de animales de origen vertebrado con el objeto de asegurar un doblado correcto, gamma-carboxilación de residuos de ácido glutámico dentro del dominio Gla, formación de enlaces disulfuro, glicosilación enlazada con asparagina, glicosilación enlazada con 0, y otras modificaciones postraducción asi como secreción en medio de cultivo. Ejemplos de otras modificaciones postraducción son 0-sulfatación de tirosina, hidroxilación, procesamiento proteolitico de la cadena de polipéptido naciente y disociación de la región pro-péptido. Ejemplos de lineas de células que pueden utilizarse son células COS de mono, células de L de ratón, células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster, células 293 de riñon embriónico humano, y preferentemente células CHO de hámster. El vector de expresión recombinante que codifica los cDNAs correspondientes puede ser introducido en una linea de células de animal en varias formas diferentes. Por ejemplo, vectores de expresión recombinantes pueden ser creados a partir de vectores basados en diferentes virus de animal. Ejemplos de estos son vectores basados en baculoviros, virus de vaccinia, adenovirus, y preferentemente virus de papiloma bovino . Las unidades de transcripción que codifican los DNA' s correspondientes pueden también ser introducidos en células de animales conjuntamente con otro gen recombinante que puede funcionar como un marcador seleccionable dominante en estás células con el objeto de facilitar el aislamiento de clones celulares específicos que tienen integrados el DNA recombinante en sü genoma. Ejemplos de este tipo de genes de marcadores seleccionables dominantes son Tn5 aminoglicósido fosfotransferasa, que proporciona resistencia a la geneticina (G418) higromicina fosfotransferasa, que proporciona resistencia a la higromicina, y puromicina acetil transferasa que proporciona resistencia a la puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica dicho marcador seleccionable puede encontrarse ya sea en el mismo vector que el que codifica el cDNA de la proteína deseada o bien puede ser codificado en un vector separado que es introducido simultáneamente e . integrado en el genoma de la célula hospedera, resultando frecuentemente en un enlace físico estrecho entre las diferentes unidades de transcripción. Otros tipos de genes marcadores seleccionables, que pueden utilizarse conjuntamente con el gen cDNA de la proteína deseada, están basados en varias unidades de transcripción que codifican dihidrofolato reductasa (dhfr) . Después de la introducción de este tipo de gen en células que no tienen actividad de dhfr endógena, preferentemente células CHO (DUKX-Bll, DG-44), permitirá a estás crecer en medios a los cuales les faltan nucleósidos. Un ejemplo de un medio de este tipo es Ham' s F12 sin hipoxantina, timidina, y glicina. Estos genes dhfr pueden ser introducidos conjuntamente con las unidades transcripcionales de cDNA de Factor de coagulación en células CHO del tipo mencionado arriba, ya sea enlazadas en el mismo vector o bien en vectores diferentes, creando por consiguiente lineas de células dhfr positivas que producen proteina recombinante. Si las lineas de células mencionadas arriba son cultivadas en presencia de metotrexato inhibidor de dhfr citotóxico, nuevas lineas celulares resistentes al metotrexato surgirán. Estás lineas celulares pueden producir proteina recombinante a una velocidad incrementada debido al número amplificado de dhfr enlazada y las unidades transcripcionales de proteina deseada. Cuando se propagan estás lineas celulares en concentraciones crecientes de metotrexato (1-10000 nM) , se pueden obtener nuevas lineas celulares que producen la proteina deseada a una velocidad muy elevada. Las lineas de células mencionadas arriba que producen la proteina deseada pueden ser cultivadas a gran escala, ya sea en cultivo en suspensión o bien en varios soportes sólidos. Ejemplos de estos soportes son microportadores basados en matrices de dextrano o colágeno, o bien soporte sólidos en forma de fibras huecas en varios materiales de cerámica. Cuando se cultiva en cultivo en suspensión celular o en microportadores, el cultivo de las lineas celulares antes mencionadas puede efectuarse ya sea como cultivo en lote o bien como cultivo en perfusión con producción continua de medio acondicionado durante periodos prolongados de tiempo. Por consiguiente, de conformidad con la presente invención, las líneas celulares mencionadas arriba son muy adecuadas para el desarrollo de un proceso industrial para la producción de las proteínas recombinantes deseadas. La proteína recombinante, que se acumula en el medio de células secretorias de los tipos mencionados arriba, puede concentrarse y purificarse a través de varios métodos bioquímicos y cromatográficos, incluyendo métodos que utilizan diferencias de tamaño, carga hidrofobicidad, solubilidad, afinidad específica, etc., entre la proteína deseada y otras sustancias en el medio de cultivo celular. Un ejemplo de una purificación de este tipo es la adsorción de la proteína recombinante a un anticuerpo monoclonal que es inmovilizado en un soporte sólido. Después de la desorción, la proteína puede ser purificada adicionalmente a través de varias técnicas cromatográficas basadas en las propiedades mencionadas arriba. Es preferible purificar el polipéptido de Factor VII/VIIa unido a albúmina de la presente invención a una pureza =80%, de preferencia a una pureza =95%, y de manera particularmente preferible es un estado farmacéuticamente puro que es más que 99.9% puro con relación a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirogénicos. Preferentemente, un polipéptido FVII/VIIa unido a albúmina aislado o purificado de la presente invención está substancialmente libre de otros polipéptidos . Los polipéptidos de Factor VII/VIIa unidos a albúmina descritos en está misma invención pueden formularse en preparaciones farmacéuticas para uso terapéuticos. Las proteínas purificadas pueden estar disueltas en soluciones amortiguadoras acuosas fisiológicamente compatibles convencionales a las cuales s eles puede agregar excipientes farmacéuticos, opcionalmente, con el objeto de proporcionar preparaciones farmacéuticas. Tales vehículos farmacéuticos y excipientes así como formulaciones farmacéuticas adecuadas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer et al; Taylor & Francis (2000) o "Handbook of Pharmaceutical Excipients", tercera edición, Kibbe et al; Pharmaceutical Press (2000) ) . En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido de la presente invención puede formularse en forma liofilizada o soluble estable. La variante de polipéptido puede estar liofilizada a través de varios procedimientos conocidos en la técnica. Formulaciones liofilizadas son reconstituidas antes de uso mediante la adición de uno o varios diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica estéril. Formulaciones de la composición se suministran al individuo a través de cualquier medio de administración farmacéuticamente adecuado. Varios sistemas de administración son conocidos y pueden utilizarse para administrar la composición por cualquier vía conveniente. Preferentemente, las composiciones de la presente invención se administran sistémicamente . Para uso sistémico, las variantes de Factor VII/VIIa unidos a albúmina de la presente invención se formulan para administración parenteral (por ejemplo, administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral , intrapulmonar, intranasal o transdérmica) o bien para administración enteral (por ejemplo, oral, vaginal o rectal) de conformidad con métodos convencionales. La vía preferible de administración es la administración intravenosa. Las formulaciones pueden ser administradas continuamente por infusión o bien por inyección de bolos. Ciertas formulaciones incluyen sistemas de liberación lenta. Los polipéptidos de Factor VII/VIIa unidos a albúmina biológicamente activos modificados de la presente invención se administran a pacientes en la dosis terapéuticamente efectiva, lo que significa una dosis suficiente para producir los efectos deseados, evitar o reducir la seguridad o difusión de la condición o indicación tratada sin alcanzar una dosis que produzca efectos colaterales intolerables. La dosis exacta depende de muchos factores como por ejemplo, la indicación, formulación y modo de administración y debe determinarse en ensayos preclinicos y clínicos para cada indicación respectiva. La composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada sola o en combinación con otros agentes terapéuticos. Estos agentes pueden estar incorporados como parte del mismo fármaco. Los varios productos de la invención son útiles como fármacos. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de FVII/VIIa unido a albúmina de conformidad con lo descrito aquí, un polinucleotido de la invención o un plásmido o vector de la invención. Los DNA' s modificados de esta invención pueden también estar integrados en un vector de transferencia para uso en la terapia génica humana. Otro aspecto de la invención es el uso de un polipéptido de FVII/VIIa unido a albúmina de conformidad con lo descrito aquí, de un polinucleotido de la invención, de un plásmido o vector de la invención, o de una célula hospedera de la invención para la fabricación de un fármaco para el tratamiento o la prevención de trastornos del sangrado. Los trastornos del sangrado incluyen, sin limitarse a este ejemplo, hemofilia A. En otra modalidad de la invención, el tratamiento comprende terapia génica humana. La invención se refiere también a un método para el tratamiento de un individuo en una o varias de las indicaciones siguiente: "episodios de sangrado y cirugía en pacientes con hemofilia heredada o adquirida con inhibidores de factores de la coagulación (FVII o FIX)", "reversión de déficits de hemostasis desarrollados como consecuencia de tratamientos farmacéuticos tales como fármacos antiplaquetarios o fármacos anticoagulación", "mejora de la hemostasis secundaria", "déficits de hemostasis desarrollados durante infecciones o durante enfermedades como por ejemplo deficiencia en Vitamina K o enfermedad hepática severa", "resección hepática", "déficits de hemostasis desarrollados como consecuencias de mordeduras de serpientes", "sangrados gastrointestinales". Indicaciones preferidas son también "traumas", "consecuencias de transfusión masiva (coagulopatía dilucional" ) , "deficiencias de factor de coagulación diferentes de FVII y FIX", "VWD", "deficiencia de FI", "deficiencia de FV", "deficiencia de FVII" "deficiencia de FX", "deficiencia de FXIII", "deficiencia de HUS", "enfermedades y trastornos plaquetarios heredados o adquiridos tales como trombocitopenia, ITP, TTP, síndrome HELLP, síndrome de Bernard-Soulier, trombastenia de Glanzman, HIT", "síndrome de Chediak-Higahi", "síndrome de Hermansky-Pudlak", "síndrome de Rendu-Osler" , "síndrome de Henoch-Schonlein", "curación de heridas". El método comprende la administración a dicho individuo de una" cantidad eficiente del polipéptido FVII/VIla unido a albúmina de conformidad con lo descrito aquí. En otra modalidad, el método comprende la administración al individuo de una cantidad eficiente del polinucléotido de la invención o de un plásmido o vector de la invención. Alternativamente, el método puede comprender la administración al individuo de una cantidad eficiente de las células hospederas de la invención descrita aqui . DESCRIPCIÓN DE TABLAS Y DIBUJOS: FIGURA 1: El sitio de restricción Xhol . introducido en el sitio del codón de terminación de FVII natural por reemplazo de TAG por TCG está subrayado. El sitio Notl utilizado para construcción adicional está subrayado dos veces. La secuencia de aminoácidos del extremo C de Factor VII se proporciona en el código de tres letras (en cuadros) . FIGURA 2: Presentación de las secuencias de enlazador insertadas entre el extremo C del Factor VII y el extremo N de albúmina en los varios constructos de pFVII. Se subraya el sitio de disociación de trombina en pFVII-834. Se subrayan dos veces las asparaginas de los sitios de N-glicosilación . FIGURA 3: Las proteínas de fusión FVII-albúmina fueron activadas por FXa y se midió la actividad FVIIa en un ensayo STACLOT®. La gráfica muestra la actividad -de proteínas con longitud creciente de enlazador con relación a la proteína sin enlazador (derivada de plásmido pFVII-974). FIGURA 4: Resultados de los experimentos PK con factor VII de tipo silvestre (pFVII-659) , proteínas de fusión FVII-albúmina, FVII derivado de plasma (pdFVII) y rFVIIa (NovoSeven®) de conformidad con lo medido por ELISA. EJEMPLOS: Ejemplo 1 : Generación de cDNAs que codifican polipeptidos de fusión FVII-albúmina La secuencia de codificación de Factor VII fue amplificada por reacción en cadena de polimerasa (PCR) a partir de una biblioteca de cDNA hepático humano (PrpQuest, Invitrogen) utilizando cebadores Wel303 y Wel304 (SEQ ID No 1 y 2) . Después de una segunda ronda de reacción en cadena de polimerasa utilizando cebadores Wel286 y Wel287 (SEQ ID Número 3 y 4), el fragmento resultante fue clonado en pCR4TOPO (Invitrogen) . A partir de ahí el cDNA FVII fue transferido como fragmento EcoRI en el sitio EcoRI de pIRESpuro3 (BD Biosciences) en donde un sitio Xhol interno había sido previamente removido. El plásmido resultante fue designado pFVII-659. Subsiguientemente, un sitio de restricción Xhol fue introducido en pFVII-659 en el sitio del codón de terminación FVII natural (FIGURA 1) por mutagénesis dirigida a sitio de conformidad con los protocolos estándares (QuickChange XL Site Directed Mutagénesis Kit, Stratagene) utilizando los oligonucléotidos el643 y Wel644 (SEQ ID Número 5 y 6) . El plásmido resultante fue designado pFVII-700. Oligonucléotidos el731 y Wel732 (SEQ ID No 7 y 8) fueron hibridados en concentraciones equimolares (10 pmol) bajo condiciones estándares de reacción en cadena de polimerasa llenados y amplificados utilizando un protocolo de reacción en cadena de polimerasa de una desnaturalización inicial de 2 minutos a una temperatura de 94 °C seguido por 7 ciclos de 15 segundos de desnaturalización a 94°C , 15 segundos de hibridación a 55°C y 15 segundos de elongación a 72°C, y se finalizó con un paso de extensión de 5 minutos a una temperatura de 72°C. El fragmento resultante fue digerido con endonucleasas de restricción Xhol y Notl y ligado en pFVII-700 digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante fue designado pFVII-733, que contiene la secuencia codificadora para FVII y una extensión C-terminal de un enlazador de glicina/serina disociable con trombina. Con base en pFVII-733, otros enlazadores sin sitio de disociación de trombina y con sitios adicionales de N-glicosilación fueron insertados. Para este propósito, pares de cebadores e2148 y We2149 (SEQ ID No 9 y 10), We2148 y e2150 (SEQ ID No 9 y 11), We2148 y We2151 (SEQ ID No 9 y 12), e2152 y e2153 (SEQ ID No 13 y 14), We2152 y We2154 (SEQ ID No 13 y 15), We2152 y We2155 (SEQ ID No 13 y 16) y We2156 y We2157 (SEQ ID No 17 y 18), respectivamente fueron hibridados y amplificados de conformidad con lo descrito aquí. Los fragmentos respectivos de reacción en cadena de polimerasa fueron digeridos con endonucleasas de restricción Xhol y BamHl e insertados en pFVII-733 digerido con las mismas enzimas. En el sitio BamHl de los plásmidos resultantes, asi como en el sitio de pFVII-733, se insertó un fragmento BamHl que., contiene el cDNA de albúmina human madura. Este fragmento habia sido generado en reacción en cadena de polimerasa en una secuencia de cDNA de albúmina utilizando los cebadores Wel862 y Wel902 (SEQ ID No 19 y 20) bajo condiciones estándares. Los plásmidos finales fueron designados pFVII-935, pFVII-936, pVII-937, pVII-938, pVII-939, pFVII-940, pFVII-941 y pFVII-834, respectivamente. Sus secuencias de enlazador y las secuencias de FVII C-terminal y albúmina N-terminal se presentan en la FIGURA 2. Con base en pFVII-938, se generaron secuencias de enlazador más cortas mediante mutagénesis de deleción. Para este propósito,' cebadores de mutagénesis We2247 y We2248 (SEQ ID No 23 y 24), We2249 y We2250 (SEQ ID No 25 y 26), We2251 y We2252 (SEQ ID No 27 y 28) y We2253 y We2254 (SEQ ID No 29 y 30) fueron utilizados en protocolos de mutagénesis estándares (QuickChange XL Site Directed MUtagenesis Kit, Stratagene) para generar los plásmidos pFVII-1014, pFVII-1015, pFVII-1016 y pFVII-1370, respectivamente. Con el objeto de generar una proteina de fusión FVII albúmina sin enlazador, se aplico mutagénesis de deleción como arriba en el plásmido pFVII-935 utilizando los cebadores We2181 y We2182 (SEQ ID No 31 y 32) . El plásmido resultante fue designado pFVII-974. Con base en el plásmido pFVII-974, se aplico mutagénesis de inserción para generar enlazadores de 1 a 3 aminoácidos. Para está mutagénesis, cebadores WE2432 y We2433 (SEQ ID No 33 y 34), We2434 y We2435 (SEQ ID No 35 y 36) y e2436 y We2437 (SEQ ID No 37 y 38) fueron utilizados en protocolos estándares de mutagénesis (QuickChange XL Site Directed Mutagénesis Kit, Stratagene) para generar los plásmidos pFVII-1158, pFVII-1159 y pFVII-1160, respectivamente. Constructos adicionales fueron generados en procedimientos análogos aplicando en protocolos de mutagénesis estándares los cebadores e2713 y We2714 (SEQ ID No 39 y 40) en el plásmido PFVII-1370, We2715 y We2716 (SEQ ID No 41 y 42) en el plásmido pFVII-1370, We2717 y We2718 (SEQ ID No 43 y 44) en el plásmido pFVII-1016 y We2756 y We2757 (SEQ ID No 45 y 46) en el plásmido pFVII-935 para generar los plásmidos pFVII-1361, pFVII-1362, pFVII-1363 y pFVII-1382, respectivamente.

Las secuencias de enlazador y las secuencias de FVII C-terminal y albúmina N-terminal de los plásmidos descritos arriba se presentan en la FIGURA 2. EJEMPLO 2 : Transfección y expresión de polipéptidos de usión Factor VII de albúmina Plásmidos fueron cultivados en E.coli TOP10 (Invitrogen) y purificados utilizando protocolos estándares (Qiagen) . Células HEK-293 fueron transfectadas utilizando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y cultivadas en medio libre de suero (Invitrogen 293 Express) en presencia de 50 ng/ml Vitamina K y 4µg/ml de puromicina. Poblaciones de células transfectadas fueron difundidas a través de frascos T en botellas de rodillos a partir de las cuales se cosechó el sobrenadante para purificación. Ejemplo 3: Purificación de polipéptidos FVII y polipéptidos de fusión FVII-albúmina Cosecha de cultivo celular que contenia FVII o proteina de fusión FVII-albúmina fue colocada en una columna de Q-Sepharose FF 2.06 mL previamente equilibrada con amortiguador HEPES 20 mM, pH 7.4. Subsiguientemente, la columna fue lavada con 10 volúmenes del amortiguador de HEPES nombrado. La elución de moléculas de FVII unidas se logro mediante la realización de un gradiente lineal de NaCL de 0 a 1.0 M en amortiguador HEPES 20mM dentro de 20 volúmenes de columna. El eluato contenia aproximadamente 85-90% del antigeno FVII aplicado en concentraciones de proteina entre 0.5 y 1 g/L. Alternativamente, FVII fue purificado por cromatografía utilizando factor tisular inmovilizado de conformidad con lo descrito en EP 0770625B1. El antígeno FVII y la actividad se determinaron de conformidad con lo descrito en el ejemplo 4. Ejemplo 4: Determinación de la actividad de FVII y antigeno.

La actividad de FVII fue determinada utilizando un kit de prueba cromogénica, comercialmente disponible (Chromogenix Coaset FVII utilizando plasma humano estándar [Data Behring] como estándar) con base en el método descrito por Seligsohn et al. Blood (1978) 52:978-988. La actividad de FVIIa fue determinada utilizando un kit de prueba comercialmente disponible (STACLOT® VIIa-rTF, Diagnostica Stago) con base en el método descrito por Morissey et al. (1993) Blood 81:734-744. Se determina el antígeno FVII mediante un ensayo ELISA cuyo desempeño es conocido por parte de las personas con conocimientos en la materia. En resumen, micro-placas fueron encubadas con 120 L por pozo del anticuerpo de captura (IgG anti FVII humano de oveja, Cerdalane CL20030AP, diluida 1:1000 en amortiguador A [Sigma C3041] ) durante la noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con amortiguador B (Sigma P3563) , cada pozo fue incubado con 200 µL de amortiguador C (Sigma P3688) durante una hora a temperatura ambiente. Después de otros tres pasos de lavado con amortiguador B, diluciones en serie de la muestra de prueba en amortiguador B asi como diluciones en serie de plasma humano estándar (Dade Behring; 50-0.5 mU/mL [lmU igual a 0.5ng]) en amortiguador B (volumen por pozo: 100 µ?,) fueron incubadas durante dos horas a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado con amortiguador B, 100 µ?. de una dilución 1:5000 en amortiguador B del anticuerpo de detección (IgG anti FVII humano de oveja, Cederlane CL20030K, marcada con peroxidasa) se agregaron a cada pozo y se incubaron durante dos horas adicionales a temperatura ambiente. Después de tres pasos de lavado con amortiguador B, se agregaron 100 pL de solución de sustrato (TMB, Dade Behring, OUVF) por pozo y se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente en oscuridad. La adición de 100 pL de solución de terminación no diluida (Dade Behring, OSFA) preparo las muestras "para lectura en un lector de micro-placas adecuado a una longitud de onda de 450 nm. Concentraciones de muestra de prueba fueron entonces calculadas utilizando la curva estándar con plasma humano estándar como referencia. Ejemplo 5: Activación de polipéptidos de FVII y polipéptidos de fusión FVII-albúmina por factor Xa Los polipéptidos FVII purificados de conformidad con lo descrito en el ejemplo 3 fueron dializados contra un amortiguador que consistía de HEPES 20mM, NaCL 150mM citrato de Na lmM, 1 g/L de caprilato de Na pH de 8.5. Dentro de este entorno de amortiguador, FVII fue activado a FVIIa por incubación con FXa (preparación disponible en el comercio, 100 UI/mL, ERL) , fosfolípido ( Phospholipon 25P, lg/L, Rhone Poulenc-Nattermann, Colonia) y Ca++ (solución de CaCl2 en agua destilada, 1 ) durante varios intervalos de tiempo a una temperatura de 37°C. Las concentraciones finales fueron ~30 a 65 UI/mL de FVII de conformidad con lo medido por el ensayo cromogénico; FXa al 0.5% relacionado con FVII es decir, 1UI de FXa 200UI de FVII, 0.02g/l de fosfolípido y CaCl2 5mM. La activación fue terminada por adición de 10% (v/v) de un amortiguador que consistía de HEPES 20mM, NaCL 150mM, Citrato de Na 200mM, lg/L de Caprilato de Na pH 5.0. Para monitorear la disociación de las moléculas en paralelo, se aplicaron una muestra de mezcla de activación y una muestra no activada correspondiente a SDS-PAGE, teñidas con azul Coomassie y escaneadas por densidad de banda. En resumen, muestras fueron reducidas, aplicadas a SDS-PAGE (Gradient 8-16% Polyacrilamid, Novex ® Tris-Glycin Gels, Invitrogen; según las instrucciones del fabricante) y teñidas con azul Coomassie G-250. Las bandas resultantes fueron escaneadas (Versa DOC®, Bio-Rad) y las concentraciones relativas de proteínas fueron calculadas utilizando el software Image Quant (versión 4.20, Amersham) . Ejemplo 6: La actividad de proteínas de fusión de FVII-albúmina depende de la longitud del enlazador Proteínas d efusión FVII-albúmina con longitud de enlazador entre 0 a 31 aminoácidos fueron activadas de conformidad con lo descrito arriba y se determino la actividad FVIIa en un ensayo STACLOT®. Aún cuando los polipéptidos de fusión independientemente de la longitud del enlazador mostraron un grado comparable de disociación de FXa, las actividades de FVIIa de las proteínas de fusión con albúmina medidas por el ensayo de la actividad mostraron un resultado sorprendente: entre más largo queda el enlazador entre FVII y la porción albúmina, mayor será la actividad FVIIa específica molar medida (FIGURA 3 y Tabla 5) y el constructo sin enlazador (974) presento menos que la mitad de la actividad FVIIa en comparación con los constructos con péptidos de enlazador de 19 o más aminoácidos de longitud. A un aminoácido como enlazador (pFVII-1158) incremento la actividad específica molar de la proteína de fusión en 31% en comparación con una proteína de fusión sin enlazador (pFVII-974). Esto sugiere fuertemente que la fusión directa de secuencias de FVII y albúmina puede llevar a una situación conformacional en la cual la porción albúmina interfiere ya sea con la conformación de su parte FVIIa o por su interacción con su sustrato. Está interferencia parece ser significativamente reducida por los constructos que tienen un enlazador peptídico de intervención entre el Factor VII/VIIa y la albúmina . La proteina de fusión de albúmina sin enlazador (974) presentó aproximadamente 25% de la actividad molar especifica en comparación con la NovoSeven® (Tabla 6) . Tabla 5 Proteina de Longitud de Número de % de incremento de fusión con enlazador sitios de actividad de Staclot albúmina derivada [aminoácidos] N- en comparación con de pFVII glicosila una proteina de ción fusión sin enlazador dentro del enlazador 974 0 0 0 1158 1 0 31, 3 1159 2 0 75, 6 1160 3 0 104, . 1370 4 0 81,6 1361 5 0 107,0 1362 6 0 98, 5 1363 7 0 178,1 1015 10 1 155,7 1014 13 2 201, 5 1382 16 0 149, 8 935 19 0 194, 5 936 25 0 255, 7 937 31 0 249, 8 Tabla 6: Comparación de la actividad especifica molar (expresada en unidades de FVIIa medidas mediante el ensayo Staclot por 100 unidades de antigeno de FVII según lo determinado por Elisa) entre proteina de fusión FVII-albúmina sin enlazador (974) y NovoSeven®. Tabla 6 Proteina Actividad Staclot específica % de actividad [UI/100 UI antígeno de FVII] específica 974 489 27.8 NovoSeven® 1759 100.0

Claims

REIVINDICACIONES Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende por lo menos un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla o un fragmento o variante del mismo, fusionado con albúmina, o un fragmento o variante de la misma, en donde por lo menos un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla de este tipo está localizado en el extremo N de la proteina de fusión y en donde la proteina de fusión tiene la actividad biológica de Factor VlI/VIIa. Un polipéptido fusionado con albúmina de conformidad con la reivindicación 1, en donde la proteina de fusión tiene por lo menos 25% de la actividad biológica de factor VlI/VIIa especifica molar en comparación con el Factor VII o Factor Vlla de tipo silvestre no fusionado respectivo o fragmento o variante del mismo. Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla de conformidad con la reivindicación 1 o 2, en donde la proteina de fusión tiene una vida media plasmática funcional incrementada in vivo en comparación con Factor FVII o Factor FVIIa no fusionado. Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende un polipéptido Factor VII o Factor Vlla de conformidad con la reivindicación 3, en donde la proteina de fusión tiene una vida media funcional in vivo que es incrementada en por lo menos 100% en comparación con Factor FVII o Factor FVIIa no fusionado. Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla de conformidad con las reivindicaciones 1 a 4, en donde un enlazador separa la porción de Factor VII o Factor Vlla de la porción albúmina. Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla de conformidad con las reivindicación 5, en donde un enlazador peptidico separa la porción de Factor VII o Factor Vlla de la porción albúmina y el polipéptido de fusión tiene una actividad especifica molar en comparación con proteínas de fusión de Factor VII o FVIIa sin un enlazador que es incrementada en por lo menos 25%. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 5 y 6, en donde el enlazador contiene un sitio de disociación de proteasa. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con la reivindicación 7, -en donde el sitio de disociación puede ser disociado a través de una proteasa de coagulación seleccionada dentro del grupo que consiste de Factor lia, Factor IXa, Factor Xa, Factor Xla, proteína C activada, elastasa o kallikreina. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 5 a 8, en donde el enlazador es modificado con la inserción de sitios para modificaciones postraducción. 10. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con la reivindicación 9, en donde la modificación postraducción comprende uno o varios sitios de N-glicosilación de la estructura Asn -X - Ser/Thr, en donde X se refiere a cualquier aminoácido excepto prolina . 11. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 5 y 6, en donde el enlazador peptidico comprende SEQ ID No.47 a 55. 12. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 5 a 10, en donde el enlazador peptidico comprende por lo menos 1 aminoácido. 13. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 5 a 10, en donde el enlazador peptidico comprende por lo menos 3 aminoácidos . 14. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 5 a 10, en donde el enlazador peptidico comprende por lo menos 7 aminoácidos . 15. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 5 a 10, en donde el enlazador peptídico comprende por lo menos 25 aminoácidos . 16. El polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho polipéptido de fusión con albúmina es modificado de tal manera que la modificación comprenda la adición por inserción de por lo menos parte del péptido de activación de un polipéptido dependiente de vitamina K diferente, o adición por inserción de análogo de dicho péptido de activación del polipéptido dependiente de vitamina K diferente. 17. Los polipéptidos fusionados con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 1 a 16, en donde la porción de polipéptido de Factor VII o Factor Vlla tiene una actividad procoagulante. 18. El polipéptido fusionado con albúmina de conformidad con las reivindicaciones 1 a 17, para su uso como fármaco. 19. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva del polipéptido de fusión con albúmina de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 conjuntamente con un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 20. Una molécula de ácido nucleico en donde dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido de fusión con albúmina de las reivindicaciones 1 a 17 en donde dicha secuencia de polinucleótidos está localizada en el extremo 3' de una secuencia codificadora de nucleótidos para un propéptido que media la carboxilación gamma de la parte de fusión de Factor VlI/VIIa. 1. Un plásmido o vector en donde dicho plásmido o vector comprende la molécula -de ácido nucleico de la reivindicación 20. 2. Un plásmido o vector de conformidad con la reivindicación 21, en donde dicho plásmido o vector es un vector de expresión. 3. Un vector de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho vector es un vector de transferencia para uso en terapia génica humana. 4. Una célula hospedera en donde dicha célula hospedera comprende la molécula de ácido nucleico de las reivindicaciones 19 a 23. 5. Un método para preparar un polipéptido de fusión con albúmina de la reivindicación 1 a la reivindicación 17, en donde dicho método comprende: a) proporcionar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de fusión con albúmina que puede expresarse en un organismo; b) expresar' el ácido nucleico en el organismo para formar un polipéptido de fusión con albúmina; y c) purificar el polipéptido de fusión con albúmina. 26. Una composición farmacéutica en donde dicha composición farmacéutica comprende un plásmido o vector de conformidad con las reivindicaciones 21 a 23. 27. El uso de un polipéptido de fusión con albúmina de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, de un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 20, de un plásmido o vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, o de una célula hospedera de conformidad con la reivindicación 24 para la preparación de un fármaco para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la coagulación sanguínea. 28. El uso de un polipéptido de fusión con albúmina que comprende un polipéptido de Factor VII o Factor Vlla o un fragmento o variante del mismo y albúmina, o un fragmento o variante de la misma para la preparación de un fármaco para el tratamiento de una o varias de las indicaciones siguientes: hemofilia A, hemofilias B, episodio hemorrágico relacionado con cirugía, trastornos hepáticos que provocan trastornos de la coagulación sanguínea, "episodios de sangrado y cirugía en pacientes con hemofilia heredada o adquirida con inhibidores para factores de coagulación (FVII o FIX) , reversión de déficit de hemostasis desarrollados como consecuencias de tratamientos farmacéuticos tales como fármacos antiplaquetarios o fármacos anticoagulación", "mejora de la homostasis secundaria", "déficit de hemostasis desarrollados durante infecciones o durante enfermedades tales como deficiencia de Vitamina K o enfermedad hepática severa", "resección hepática", "déficits de homostasis desarrollados como consecuencias de mordeduras de serpientes", "sangrados gastrointestinales", "trauma", "consecuencias de transfusión masiva (coagulopatia dilucional ) " , "deficiencias de factores de coagulación diferentes de FVII y FIX", "VWD", "deficiencia de FI", "deficiencia de FV", "deficiencia de FVII" "deficiencia de FX", "deficiencia de FXIII", "deficiencia de HUS", "enfermedades y trastornos plaquetarios heredados o adquiridos tales como trombocitopenia, ITP, TTP, síndrome HELLP, síndrome de Bernard-Soulier, trombastenia de Glanzman, "HIT", "síndrome de Chediak-Higahi" , "síndrome de Hermansky-Pudlak", "síndrome de Rendu-Osler", "púrpura de Henoch-Schonlein", "Curación de Heridas". 29. El uso de conformidad con las reivindicaciones 27 a 28 en donde el tratamiento comprende terapia génica humana.