BRPI0707513A2 - fator de coagulaÇço viia modificado com meia-vida prolongada - Google Patents

Abstract

FATOR DE COAGULAÇçO VIIa MODIFICADO COM MEIA-VIDA PROLONGADA. A presente invenção refere-se aos campos de polipeptídios ligados à albumina de Fator VII (FVII) e Fator Vila (FVIIa). Mais especificamente, a invenção refere-se a seqúências de cDNA que codificam Fator VII e Fator Vila humanos e derivados geneticamente fundidos a um cDNA que codifica albumina sérica humana que pode ser ligada por oligonucleotídeos que codificam ligantes peptídicos intermediários, em que tais derivados codificados exibem estabilidade aperfeiçoada e meia-vida plasmática funcional prolongada, vetores de expressão recombinantes contendo tais seqüências de cDNA, células hospedeiras transformadas com tais vetores de expressão recombinantes, polipeptídios recombinantes e derivados que têm realmente atividades biológicas da proteína do tipo selvagem não modificada, mas tendo estabilidade aperfeiçoada e vida de prateleira prolongada e processos para a fabricação de tais proteínas recombinantes e seus derivados. A invenção também engloba um vetor de transferência para uso em terapia gênica humana, que compreende tais seqúências de DNA modificadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FATOR DECOAGULAÇÃO Vlla MODIFICADO COM MEIA-VIDA PROLONGADA".

Campo de Invenção

A presente invenção refere-se aos campos de polipeptídios Iiga-dos à albumina de Fator Vll (FVII) e Fator Vlla (FVIIa). Mais especificamen-te, a invenção refere-se a seqüências de cDNA que codificam Fator Vll eFator Vlla humanos e derivados geneticamente fundidos a um cDNA quecodifica albumina sérica humana que pode ser ligada por oligonucleotídeosque codificam Iigantes peptídicos intermediários, em que tais derivados codi-ficados exibem estabilidade aperfeiçoada e meia-vida plasmática funcionalprolongada, vetores de expressão recombinantes contendo tais seqüênciasde cDNA, células hospedeiras transformadas com tais vetores de expressãorecombinantes, polipeptídios recombinantes e derivados que têm realmenteatividades biológicas da proteína do tipo selvagem não modificada, mas ten-do estabilidade aperfeiçoada e vida de prateleira prolongada e processospara a fabricação de tais proteínas recombinantes e seus derivados. A in-venção também engloba um vetor de transferência para uso em terapia gê-nica humana, que compreende tais seqüências de DNA modificadas.

Antecedentes da Invenção

Fator Vll e Fator Vlla

Hemofilia A é um distúrbio de sangramento hereditário. Resultade uma deficiência ligada ao cromossomo X do fator Vlll de coagulação san-güínea, e afeta quase exclusivamente os homens com uma incidência entreum e dois indivíduos por 10.000. O defeito no cromossomo X é transmitidopor veículos femininos que não são eles próprios hemofílicos. A manifesta-ção clínica da hemofilia A é uma tendência aumentada a sangramento. An-tes do tratamento com concentrados de Fator Vlll ter sido introduzido, a du-ração de vida média de uma pessoa com hemofilia grave era de menos que20 anos. O uso de concentrados de Fator Vlll do plasma e mais tarde deformas recombinantes do Fator Vlll melhorou consideravelmente a situaçãodos pacientes com hemofilia, aumento a duração de vida média extensiva-mente, dando à maioria deles a possibilidade de viver uma vida mais ou me-nos normal. A hemofilia B, que é 5 vezes menos prevalente que a hemofiliaA, é causada por Fator IX não funcional ou ausente e é tratada com concen-trados do Fator IX do plasma ou de uma forma recombinante do Fator IX.Em ambas a hemofilia Aea hemofilia Β, o mais sério problema médico notratamento da doença é a geração de aloanticorpos contra os fatores de re-posição. Até 30% de todos os pacientes com hemofilia A desenvolvem anti-corpos para o Fator VIII. Anticorpos para Fator IX ocorrem em uma menorextensão, mas com conseqüências mais graves, na medida em que eles sãomenos suscetíveis à terapia de indução à imunotolerância.

O modelo corrente de coagulação estabelece que o desencade-ador fisiológico de coagulação é a formação de um complexo entre o Fatortecidual (TF) e o Fator Flla (FVIIa) sobre a superfície de células que expres-sam TF, que estão normalmente localizadas fora da vasculatura.

Isso leva à ativação de o Fator IX e o Fator X levando, por fim, àgeração de alguma trombina. Em um circuito de retroalimentação positiva, atrombina ativa o Fator Vlll e o Fator IX, o assim chamado braço "intrínseco"da cascata de coagulação sangüínea, ampliando, assim, a geração de FatorXa, que é necessário para a geração da explosão de trombina inteira paraobter a hemóstase completa. Foi mostrado que por administração de con-centrações suprafisiológicas de Fator Vila, hemóstase é obtida por desvio danecessidade de Fator Vllla e Fator IXa. A clonagem do cDNA para Fator Vll(Patente US 4.784.950) tornou possível o desenvolvimento do Fator Vll ati-vado como um produto farmacêutico. O Fator Vlla foi administrado, com êxi-to, pela primeira vez em 1988. Desde então, o número de indicações do Fa-tor Vlla tem crescido constantemente mostrando um potencial para se tornarum agente hemostático universal para interromper sangramento (Erhardtsen,2002). Contudo, a meia-vida curta do Fator Vlla de aproximadamente 2 ho-ras está limitando a sua aplicação.

FVII é uma glicoproteína de cadeia simples com um peso mole-cular de cerca de 50 kDa, que é secretado pelas células do fígado para acorrente sangüínea como um zimógeno inativo de 406 aminoácidos. Ele con-tém 10 resíduos de ácido 10 γ-carbóxi-glutâmico (posições 6, 7, 14, 16, 19,20, 25, 26, 29, e 35) localizados no domínio Gla N-terminal da proteína. Osresíduos Gla requerem vitamina K para sua biossíntese. C-terminal localiza-do para o domínio Gla são dois domínios de fator de crescimento epidérmicoseguidos por um domínio de serina protease tipo tripsina. Ainda, modifica-ções pós-traducionais de FVII englobam hidroxilação (Asp 63), N- (Asn145 eAsn322), bem como glicosilação do tipo O (Ser52 e Ser60).

FVII é convertido em seu Fator Vlla de forma ativa por proteóliseda ligação peptídica simples em Arg152-lle153 levando à formação de duascadeias de polipeptídios, uma cadeia leve N-terminal (24 kDa) e uma cadeiapesada C-terminal (28 kDa), que são mantidas juntas por uma ponte de dis-sulfeto. Em contraste com outros fatores de coagulação dependentes de vi-tamina K, nenhum peptídeo de ativação, que é clivado durante a ativaçãodestes outros fatores de coagulação dependentes de vitamina K, foi descritopara FVII. O sítio de clivagem de Arg152-lle153 e alguns aminoácidos a ju-sante mostram homologia ao sítio de clivagem de ativação de outros poli-peptídios dependentes de vitamina K.

Essencial para a obtenção da conformação ativa do Fator Vlla éa formação de uma ponte de sal depois da clivagem de ativação entreIle153 e Asp343. A clivagem de ativação do Fator Vll pode ser obtida, in vi-tro, pelo Fator Xa, Fator XlIa, Fator IXa, Fator Vila, Protease de Ativação deFator Sete (FSAP) e trombina. Mollerup et al. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48:501-505) reportaram que alguma clivagem também ocorre na cadeia pesadaem Arg290 e/ou Arg315.

O Fator Vll está presente no plasma em uma concentração de500 ng/mL. 1 %, por exemplo, 5 ng/mL do Fator Vll está presente como FatorVila. Verificou-se que a meia-vida no plasma do Fator Vll era de cerca de 4horas e que a do Fator Vlla era de cerca de 2 horas. Embora a meia-vida doFator Vlla de 2 horas seja comparativamente longa para um fator de coagu-lação ativado (que é, para outros fatores de coagulação ativados da ordemde minutos devido à inibição irreversível de serpinas como antitrombina III),isto, contudo, constitui uma forte desvantagem para o uso terapêutico doFator Vila, por ele levar à necessidade de múltiplas injeções i.v. ou infusãocontínua para obter hemóstase. Isso resulta em custo muito alto do trata-mento e inconveniência para o paciente. Até agora, nenhuma preparaçãofarmacêutica de um Fator Vlla com meia-vida plasmática aperfeiçoada écomercializada, nem existem quaisquer dados publicados que mostrem vari-antes de FVII/FVIIa com meia-vida, in vivo, prolongada. Como o Fator Vl-l/Vlla tem potencial para ser usado como um agente hemostático universal,há uma grande necessidade médica pelo desenvolvimento de formas do Fa-tor Vlla que tenham uma meia-vida funcional mais longa in vivo.

Ballance et al. (WO 01/79271) descreve polipeptídios de fusãode uma multiplicidade de proteínas terapêuticas diferentes ou variantes e/oufragmentos das ditas proteínas terapêuticas que, quando fundidos à albumi-na sérica humana, ou às variantes e/ou aos fragmentos da dita albumina sãoprognosticados como tendo meia-vida funcional aumentada in vivo e vida deprateleira prolongada. Longas listas de parceiros de fusão potenciais sãodescritos, sem mostrar por dados experimentais para quase todas essasproteínas, que os polipeptídios de fusão de albumina respectivos retêm, re-almente, atividade biológica do parceiro de fusão de proteína terapêutica.Além disso, de acordo com o WO 01/79271, cada membro da lista de proteí-nas terapêuticas pode ser fundida em muitas orientações diferentes à albu-mina, por exemplo, duas moléculas da proteína terapêutica fundida uma àterminação N e uma à terminação C da albumina, ou uma molécula da prote-ína terapêutica fundida ou N-terminal ou C-terminal à albumina, ou tambémregiões múltiplas de cada proteína fundida às regiões múltiplas da outra.Dentre a multiplicidade de proteínas terapêuticas listada no WO 01/79271como parceiras de fusão de albumina potenciais estão o Fator IX e FVI-I/FVIIa, ao passo que nenhuma prova de princípio experimental é proporcio-nada para ambas as proteínas.

Sheffield expressou um polipeptídio de fusão de Fator IX (umfator de protrombina que consiste em 415 aminoácidos) e albumina e mos-trou em experimentos farmacocinéticos que o comportamento de depuraçãodo polipeptídio de fusão de Fator IX e de albumina em coelhos se asseme-lhou de modo mais próximo àquele do Fator IX que àquele da albumina,mostrando somente um aumento modesto da meia-vida terminal (menos queduas vezes) (Sheffield WP et al. (2004) Br. J. Haematol. 126:565-573).

Em vista dos resultados de Sheffield e devido à alta homologiaentre os Fatores IX e Vll (ambos são fatores de protrombina dependentes devitamina K) e seu tamanho comparável, aquele versado na técnica teria as-sumido que também o Fator Vll não se beneficiaria de ser fundido à albumi-na em termos de meia-vida in vivo funcional.

O problema técnico envolvendo a presente invenção foi, portan-to, desenvolver proteínas de fusão de albumina com funcionalidade de FVII-a, que retêm a atividade biológica e mostram meia-vida funcional aumentadain vivo.

A esse respeito, a atividade biológica de um polipeptídio de Fa-tor Vll/Vlla refere-se a sua capacidade de ativar Fatores IX e X de coagula-ção em presença de um fator tecidual depois de ter sido ele mesmo ativado.

Meia-vida plasmática funcional in vivo refere-se à meia-vida daatividade biológica do polipeptídio de fusão de Fator Vll/Vlla uma vez injeta-do no plasma. Preferivelmente, plasma é plasma humano.

Verificou-se que polipeptídios ligados à albumina compreenden-do pelo menos um polipeptídio de Fator Vll ou de Fator Vlla ou um fragmen-to ou variante deste, fundido à albumina, ou um fragmento ou variante desteem que pelo menos uma molécula de Fator Vll ou de Fator Vlla está locali-zada na terminação N da proteína de fusão, são resultantes de polipeptídiosem fusão com uma porção biologicamente ativa de Fator Vil/Fator Vila.

Portanto, um aspecto da invenção refere-se a proteínas de fusãobiologicamente ativas, nas quais os polipeptídios de Fator Vll/Vlla são fundi-dos à terminação N de albumina sérica humana. As proteínas de fusão mos-tram pelo menos 25%, preferivelmente mais que 40%, ainda mais preferi-velmente mais que 70% e, mais preferivelmente, mais que 90% da atividadeespecífico molar do Fator Vll/Vlla do tipo selvagem.

Foi ainda surpreendentemente constatado que em contrastecom as fusões do Fator IX à terminação N da albumina sérica humana con-forme publicação por Sheffield, fusões de albumina de Fator Vll/Vlla à termi-nação N da albumina sérica humana levaram às proteínas de fusão de FatorVII/FVIIa, que não somente retiveram a atividade biológica do Fator Vl-l/FVIIa, mas também mostraram uma extensão significante da meia-vidaplasmática funcional do Fator Vll/Vlla in vivo.

Expressão de construções de fusão de albumina com uma por-ção de FVII/FVIIa desejada na terminação C da albumina não foi bem-sucedida, porque as proteínas de fusão de albumina expressas não foramsecretadas como moléculas intactas. Mediante transição através da mem-brana celular, foi observada uma clivagem em uma molécula de FVII/FVIIamadura, que, devido à gama-carboxilação comprometida, teve uma atividadeespecífica molar reduzida, e uma porção de albumina com o propeptídeo deFVII ligado a sua terminação C. Assim, foi verificado, em contraste com adescrição de Ballance et al., que somente uma fusão da porção de FVI-I/FVIIa à terminação N da albumina sérica humana resulta em uma proteínade fusão com as propriedades biológicas desejadas, respectivamente a re-tenção da atividade biológica de FVII/FVIIa e uma meia-vida plasmática au-mentada.

Um outro aspecto da invenção refere-se, portanto, às proteínasde fusão biologicamente ativas, nas quais os polipeptídios de Fator Vll/Vllasão fundidas à terminação N da albumina, que mostram uma extensão signi-ficante da meia-vida plasmática funcional em comparação com o Fator Vl-l/Vlla não fundido. Em modalidades preferidas, polipeptídios de albumina deFVII/FVIIa da invenção compreendendo um polipeptídio de FVII/FVIIa têmmeia-vida funcional in vivo prolongada ou de duração mais longa ou ativida-de terapêutica aumentada em comparação com a meia-vida in vivo ou ativi-dade terapêutica de FVII/FVIIa não fundido.

Portanto, um aspecto da invenção refere-se ao FVII/FVIIa fundi-do à terminação N da albumina que prolonga a meia-vida plasmática emcomparação àquela do FVII/FVIIa não fundido de pelo menos 100%, preferi-velmente mais que 200%, ainda mais preferivelmente mais que 500%, maispreferivelmente mais que 1.000%.

Em um outro aspecto surpreendente da presente invenção, veri-ficou-se que os polipeptídios de fusão de albumina de FVII/FVIIa sem umIigante mostram atividade biológica significantemente reduzida, ao passoque os polipeptídios de fusão de albumina de FVII/FVIIa, nos quais as por-ções de FVII/FVIIa são separadas da albumina por um Iigante exibem umaumento dependente do comprimento do Iigante em atividade biológica doFator Vll/Vlla. A porção peptídica do Fator Vll ou do Fator Vlla é acoplada àporção de albumina por um Iigante peptídico, permitindo, assim, que a molé-cula de fusão assuma uma conformação que permite uma maior atividadeespecífica molar em comparação com uma molécula de fusão sem tal se-qüência de ligantes.

Portanto, um outro aspecto da invenção refere-se aos polipeptí-dios de fusão de Fator Vll/Vlla e de albumina compreendendo um peptídeode Iigante entre a porção de Fator Vll/Vlla e a terminação C da albumina,que têm atividade de Fator VII/FVIIa biológica aumentada, por exemplo, me-dida como atividade específica molar em comparação com as proteínas defusão de Fator Vll/Vlla sem tais ligantes. O aumento da atividade específicamolar das proteínas de fusão nas quais a porção de Fator Vll/Vlla é fundidaà terminação N da albumina via um Iigante peptídico em comparação com asproteínas de fusão correspondentes sem tal Iigante é de pelo menos 25%,preferivelmente pelo menos 50% e mais preferivelmente de pelo menos100%. Esses polipeptídios de fusão de albumina de Fator Vll/Vlla contendoIigante exibem também meia-vida funcional in vivo aumentada em compara-ção com o FVIIa do tipo selvagem. Contudo, os ligantes químicos ou siste-mas de Iigante semelhantes sem avidina-biotina de limitação funcionarão demodo similar desde que as distâncias comparáveis sejam introduzidas entrea porção de Fator VII/FVIIa e a porção de albumina. Abaixo, o termo "peptí-deo ligante" ou similar deve compreender outros de tais meios de ligantesfuncionais, sempre que adequados.

A invenção engloba polipeptídios de Fator Vll/Vlla terapêuticosligados à terminação N da albumina, composições, composições farmacêuti-cas, formulações e kits. A invenção engloba também o uso dos ditos polipep-tídios ligados à albumina terapêuticos em certas indicações médicas. A in-venção engloba também moléculas de ácido nucléico que codificam os poli-peptídios ligados à albumina da invenção, bem como vetores que contêmestes ácidos nucléicos, células hospedeiras transformadas com estes ácidosnucléicos e vetores, e métodos para preparar polipeptídios ligados à albumi-na da invenção usando estes ácidos nucléicos, vetores, e/ou células hospe-deiras.

A invenção também proporciona uma composição que compre-ende um polipeptídio albumina ligado ao Fator VII/FVIIa compreendendo umpeptídeo de Fator Vll ou de Fator Vila, ou um fragmento ou variante destes,opcionalmente um Iigante peptídico, e albumina, ou um fragmento ou varian-te destes, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Um outro objetivo dainvenção é proporcionar um método para tratar pacientes com distúrbios desangramento. O método compreende a etapa de administrar uma quantida-de eficaz do polipeptídio de albumina ligado ao FVII/FVIIa.

Um outro objetivo da invenção é proporcionar uma molécula deácido nucléico que compreende uma seqüência de polinucleotídeos que co-difica um polipeptídio de albumina ligado ao Fator Vll/Vlla compreendendoum peptídeo de Fator Vll ou de Fator Vila, ou um fragmento ou uma variantedestes, opcionalmente um Iigante peptídico, e albumina, ou fragmento ou20 variante desta, bem como um vetor que compreende tal molécula de ácidonucléico. A dita seqüência de ácidos nucléicos que codifica a proteína defusão está localizada na extremidade 3' de uma seqüência de ácidos nucléi-cos que codifica um propeptídeo que medeia a gama-carboxilação da partede fusão do Fator Vll/Vlla.

A invenção também proporciona um método para fabricar umpolipeptídio de albumina ligada ao Fator VII/FVIIa compreendendo um peptí-deo de Fator Vll ou de Fator Vila, ou um fragmento ou variante destes, umIigante peptídico, e albumina, ou um fragmento ou variante desta, em que ométodo compreende:

(a) proporcionar um ácido nucléico que compreende uma se-qüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídio de albumina ligado aoFator Vll/Vlla expressável em uma célula mamífera;(b) expressar o ácido nucléico no organismo para formar um po-lipeptídio de albumina ligado ao Fator Vll/Vlla; e

(c) purificar o polipeptídio de albumina ligado ao Fator Vll/Vlla.

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídios defusão de albumina e métodos para tratar, prevenir, ou atenuar doenças oudistúrbios. Como usado aqui, "polipeptídio de fusão de albumina de FatorVll/Vlla " refere-se a um polipeptídio formado pela fusão de pelo menos umamolécula de Fator Vll/Vlla (ou fragmento ou variante deste) à Terminação Nde pelo menos uma molécula de albumina (ou um fragmento ou variantedesta), em que ambas as porções são opcionalmente separadas via um Ii-gante peptídico.

Um polipeptídio de fusão de albumina de Fator VII/FVIIa da in-venção compreende pelo menos um fragmento ou variante de um Fator VI-I/FVIIa e pelo menos um fragmento ou variante de albumina sérica humana,que são associados um ao outro, tal como por fusão genética (isto é, a poli-peptídio de fusão de albumina é gerado pela tradução de um ácido nucléicono qual um polinucleotídeo codificando todo ou uma porção de um Fator VI-I/FVIIa é ligado em alinhamento à extremidade 5' de um polinucleotídeo quecodifica toda ou uma porção de albumina opcionalmente ligada por um poli-nucleotídeo que codifica uma seqüência de ligantes, introduzindo um peptí-deo de Iigante entre a porção de Fator Vll/Vlla e a porção de albumina).

Em uma modalidade, a invenção proporciona um polipeptídio defusão de albumina de Fator Vll/Vlla compreendendo, ou consistindo alterna-tivamente em, Fator Vll/Vlla biologicamente ativo ou terapeuticamente ativofundido à terminação N de um polipeptídio de albumina sérica.

Em outras modalidades, a invenção proporciona um polipeptídiode fusão de albumina compreendendo, ou alternativamente consistindo em,um fragmento biologicamente ativo e/ou terapeuticamente ativo de Fator Vl-l/Vlla e um Iigante peptídico fundido à terminação N de uma proteína de al-bumina sérica.

Em outras modalidades, a invenção proporciona um polipeptídiode fusão de albumina de Fator Vll/Vlla compreendendo, ou alternativamenteconsistindo em, uma variante biologicamente ativa e/ou terapeuticamenteativa de um Fator Vll/Vlla fundido à terminação N de um polipeptídio de al-bumina sérica e opcionalmente um Iigante peptídico.

Em outras modalidades, a invenção proporciona um polipeptídiode fusão de Fator Vll/Vlla e de albumina compreendendo, ou alternativa-mente consistindo em, um fragmento ou variante biologicamente ativo e/outerapeuticamente ativo de um FVII/FVIIa fundido à terminação N de umfragmento ou variante de albumina sérica e opcionalmente um Iigante peptí-dico.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona um polipeptí-dio de fusão de albumina compreendendo, ou alternativamente consistindoem, porção madura de um FVII/FVIIa fundido à terminação N da porção ma-dura da albumina sérica e opcionalmente um Iigante peptídico.

De acordo com o WO 01/79271, um polipeptídio de fusão de al-bumina que compreende FVII/FVIIa pode ser usado como um produto tera-pêutico nas indicações de "distúrbios de sangramento", "hemofilia A e B","distúrbios dò fígado" e episódios hemorrágicos relacionados a cirurgias",

Em um outro aspecto da invenção, um polipeptídio de fusão dealbumina compreendendo FVII/FVIIa pode ser também usado terapeutica-mente em outras indicações. As indicações mais preferidas são para "episó-dios de sangramento e cirurgia em pacientes com hemofilia hereditária ouadquirida com inibidores para Fatores de coagulação (FVIII ou FIX)", "rever-são de déficits de hemóstase desenvolvidos em conseqüência de tratamen-tos com fármacos tais como fármacos antiplaquetários ou fármacos anticoa-gulantes", "aperfeiçoamento de hemóstase secundária", "déficits de hemós-tase desenvolvidos durante infecções e durante doenças tal como deficiên-cia de Vitamina K ou doença do fígado aguda", "ressecção do fígado", "défi-cits de hemóstase desenvolvidos em conseqüência de mordidas de cobra","sangramentos gastrointestinais", "trauma", "conseqüências de transfusãomassiva (coagulopatia dilucional)", "deficiências de fatores de coagulaçãodiferentes de FVII e FIX", "VWD", "deficiência de Fl", "deficiência de FV","deficiência de FX", "deficiência de FXII", "HUS", doenças e distúrbios pia-quetários hereditárioss ou adquiridos como trombocitopenia, ITP, TTP1 sín-drome de HELLP, síndrome de Bemard-Soulier1 Trombostenia de Glanz-mann, HIT111 "Síndrome de Chediak-Higahi", "Síndrome de Hermansky-Pudlak", "Síndrome de Rendu-Osler", "púrpura de Henoch-Schonlein" e "Ci-catrização de Ferimentos".

Descrição Detalhada da Invenção

Um objetivo da presente invenção é proporcionar Fator Vll hu-mano e Fator Vlla humano ou fragmentos ou variantes destes fundidos àterminação N de albumina humana ou fragmentos ou variantes destes comuma meia-vida funcional mais longa in vivo em comparação com Fator Vllhumano e Fator Vlla humano ou fragmentos ou variantes destes. Um outroobjetivo da presente invenção é proporcionar Fator Vll humano e Fator Vllahumano ou fragmentos ou variantes destes fundidos à terminação N de al-bumina humana ou fragmentos ou variantes desta com atividade específicamolar aumentada. Para atingir essa meta, fusões de Fator Vll ou de FatorVlla à terminação N da albumina sérica são proporcionadas opcionalmentecom um Iigante peptídico intermediário entre FVII/FVIIa e albumina.

Os termos albumina sérica humana (HSA) e albumina humana(HA) são usados intercambiavelmente aqui. Os termos "albumina" e "albu-mina sérica" são mais amplos, e englobam albumina sérica humana (e frag-mentos e variantes desta) bem como albumina de outras espécies (e frag-mentos e variantes destas). Em vez de albumina, também outras proteínassimilares à albumina, como, sem limitação, alfa-fetoproteína humana (con-forme descrita no WO 2005/024044), bem como seus fragmentos ou varian-tes funcionais podem ser usados.

Como usada aqui, "albumina" refere-se coletivamente a polipep-tídio de albumina ou seqüência de aminoácidos, ou um fragmento ou varian-te de albumina, tendo uma ou mais atividades funcionais (por exemplo, ativi-dades biológicas) de albumina. Em particular, "albumina" refere-se à albumi-na humana ou aos fragmentos desta especialmente a forma madura da al-bumina humana conforme mostrada na SEQ ID NO:22 aqui ou albumina deoutros vertebrados ou fragmentos desta, ou análogos ou variantes destasmoléculas ou fragmentos destes.

A porção de albumina dos polipeptídios ligados à albumina podecompreender o comprimento inteiro da seqüência de HA conforme descriçãoacima, ou podem incluir um ou mais fragmentos desta que são capazes deestabilizar e prolongar a atividade terapêutica. Tais fragmentos podem serde comprimento de 10 ou mais aminoácidos ou podem incluir cerca de 15,20, 25, 30, 50, ou mais aminoácidos contíguos da seqüência de HA ou po-dem incluir parte ou todos os domínios de HA.

A porção de albumina dos polipeptídios ligados à albumina dainvenção pode ser uma variante de HA normal. A porção de proteína de Fa-tor Vll dos polipeptídios ligados à albumina da invenção pode compreendertambém variantes dos polipeptídios do Fator Vll conforme descrição aqui. Otermo "variantes" inclui inserções, deleções e substituições, tanto conserva-tivas como não conservativas, onde tais mudanças não alteram substanci-almente o sítio ativo, ou o domínio ativo, que confere as atividades terapêuti-cas dos polipeptídios de Fator VII.

Em particular, os polipeptídios ligados à albumina da invençãopodem incluir variantes polimórficas de ocorrência natural de albumina hu-mana e fragmentos de albumina humana. A albumina pode ser derivada dequalquer vertebrado, especialmente qualquer mamífero, por exemplo, serhumano, vaca, carneiro, ou porco. Albuminas não-mamíferas incluem, massem limitação, galinha e salmão. A porção de albumina do polipeptídio ligadoà albumina pode ser de um animal diferente daquele da porção de FVI-l/FVIIa.

Geralmente falando, um fragmento ou variante de albumina terácomprimento de pelo menos 20, preferivelmente 40, mais preferivelmentemais que 70 aminoácidos. A variante de albumina pode consistir preferenci-almente em, ou compreender alternativamente, pelo menos um domínio in-teiro de albumina ou fragmentos dos ditos domínios, por exemplo, domínios1 (aminoácidos 1-194 da SEQ ID NO:22), 2 (aminoácidos 195-387 da SEQID NO:22), 3 (aminoácidos 388-585 da SEQ ID NO:22), 1 + 2 (1-387 da SEQID NO:22), 2 + 3 (195-585 da SEQ ID NO:22) ou 1 + 3 (aminoácidos 1-194da SEQ ID NO:22 + aminoácidos 388-585 da SEQ ID NO:22). Cada domínioé ele mesmo constituído de dois subdomínios homólogos, a saber: 1-105,120-194, 195-291, 316-387, 388-491 e 512-585, com regiões de Iigante in-ter-subdomínio flexíveis compreendendo os resíduos Lys106 a Glu119,Glu292 a Val315 e Glu492 a Ala 511.

A porção de albumina de um polipeptídio de fusão de albuminada invenção pode compreender pelo menos um subdomínio ou domínio deHA ou modificações conservativas destes.

A invenção refere-se a um polipeptídio de Fator Vll ou de FatorVlla modificado, compreendendo ligar o polipeptídio de Fator Vll ou de FatorVlla ou fragmento ou variante deste à terminação N de um polipeptídio dealbumina ou fragmento ou variante deste opcionalmente de modo que umIigante peptídico intermediário é introduzido entre o Fator Vll ou Fator Vllamodificado e albumina de modo que o polipeptídio de Fator Vll ou de FatorVlla modificado tem uma meia-vida funcional aumentada in vivo em compa-ração com o polipeptídio de Fator Vll ou de Fator Vila, que não tenha se li-gado à albumina ou tal que a atividade específica molar de FVII/FVIIa fundi-do à albumina com um Iigante peptídico intermediário é maior que a ativida-de específica molar de FVII/FVIIa fundido à albumina sem um Iigante peptí-dico intermediário.

"Fator Vll/Vlla", como usado neste pedido de patente, significaum polipeptídio terapêutico que consiste em ou na forma não ativada (FatorVII) ou na forma ativada (Fator Vila) ou misturas destes. "Fator Vll/Vlla" den-tro da definição inclui polipeptídios que têm a seqüência de aminoácidos deFator Vll/Vlla humano nativo. Ele inclui também polipeptídios com uma se-qüência de aminoácidos ligeiramente modificados, por exemplo, uma extre-midade N-terminal ou C-terminal modificada incluindo deleções ou adiçõesde aminoácidos terminais desde que esses polipeptídios retenham substan-cialmente a atividade biológica do Fator Vila. "Fator VII" dentro da definiçãoacima inclui também variações alélicas naturais que podem existir e ocorrerde um indivíduo para o outro. "Fator VII", dentro da definição acima, incluiainda variantes de FVII/FVIIa. Tais variantes diferem em um ou mais resí-duos de aminoácidos da seqüência do tipo selvagem. Exemplos de tais dife-renças podem incluir truncamento da terminação N e/ou a terminação C porum ou mais resíduos de aminoácidos (por exemplo, 1 a 10 resíduos de ami-noácidos), ou adição de um ou mais resíduos extras na terminação N e/ouna terminação C, bem como substituições de aminoácidos conservativas,isto é, substituições realizadas dentro de grupos de aminoácidos com carac-terísticas similares, por exemplo, (1) aminoácidos pequenos, (2) aminoáci-dos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoáci-dos hidrofóbicos, e (6) aminoácidos aromáticos.

Tabela 1

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As proteínas de fusão exibem pelo menos 25%, preferivelmentemais que 40%, ainda mais preferivelmente mais que 70%, e de maior prefe-rência mais que 90% da atividade específica molar do Fator Vll/Vlla do tiposelvagem não fundido ou o respectivo fragmento FVII/FVIIa ou variante des-te.

O polipeptídio de FVII/Vlla da invenção ligado via Iigante peptídi-co intermediário à terminação N de albumina tem uma atividade específicamolar aumentada em comparação com a atividade específica molar de umfusão de albumina de Fator Vll/Vlla homóloga sem um Iigante peptídico in-termediário. O aumento da atividade específica molar do polipeptídio de Fa-tor Vll/Vlla ligado à albumina da invenção em comparação com a atividadeespecífica molar de uma fusão de Fator Vll/Vlla e de albumina sem um Ii-gante peptídico intermediário é pelo menos 25%, preferivelmente pelo me-nos 50%, mais preferivelmente, pelo menos 100% e de maior preferênciapelo menos 200%. A atividade do Fator Vll/Vlla é a capacidade de convertero Fator X de substrato no Fator Xa ativo. A atividade de FVIIa de um polipep-tídio de albumina ligado ao Fator Vll/Vlla pode ser preferivelmente medidausando STACLOT®. A atividade específica molar conforme usada nesta in-venção significa: atividade conforme medida em ensaio de STACLOT® de-pois da ativação de proteína de fusão de albumina ligada ao FVII em Unida-des Internacionais (IU) por 100 IU de antígeno de Fator Vll/Vlla conformemedida por ELISA.

Os polipeptídios ligados à albumina de FVII/FVIIa da invençãotêm pelo menos 25% de atividade específica molar mais alta em compara-ção com a fusão de Fator Vll/Vlla e albumina sem Iigante peptídico interme-diário e exibem uma meia-vida funcional aumentada in vivo em comparaçãocom a forma não ligada do peptídeo de Fator Vll ou do Fator Vila. A meiavida funcional in vivo pode ser determinada conforme mostrado por Lindleyet al. (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor Vila,Clin. Pharmacol. Ther. (1994) 55:638-648).

Os polipeptídios ligados à albumina de FVII/FVIIa da invençãotêm pelo menos 25% de atividade específica molar mais alta em compara-ção com as proteínas de fusão de Fator Vll/Vlla e albumina em Iigante pep-tídico intermediário, e sua meia-vida funcional in vivo é, usualmente, aumen-tada de pelo menos 100%, preferivelmente pelo menos 200%, ainda maispreferivelmente pelo menos 500% em comparação com a forma não ligadado polipeptídio de o Fator Vll ou o Fator Vila.

Uma modalidade da invenção compreende, portanto, polipeptí-dios ligados à albumina de FVII/FVIIa que têm um Iigante peptídico que con-siste em pelo menos um aminoácido, preferivelmente pelo menos 3 aminoá-cidos, mais preferivelmente pelo menos 7 aminoácidos e mais preferivelmen-te pelo menos 25 aminoácidos.

A meia-vida funcional in vivo da forma do tipo selvagem do FatorVll humano é aproximadamente de 4 horas em seres humanos. A meia-vidafuncional dos polipeptídios ligados à albumina de Fator Vll da invenção éusualmente pelo menos cerca de 8 horas, preferivelmente pelo menos cercade 12 horas, mais preferivelmente pelo menos cerca de 24 horas.

A meia-vida funcional in vivo da forma do tipo selvagem do FatorVlla humano é de aproximadamente 2 horas em sere humanos. A meia-vidafuncional dos polipeptídios de albumina ligados ao Fator Vll da invenção éusualmente de pelo menos cerca de 4 horas, preferivelmente pelo menoscerca de 6 horas, de maior preferência pelo menos cerca de 12 horas.

De acordo com a invenção, a porção de Fator Vll/Vlla é acopla-da à porção de albumina por um Iigante peptídico. O Iigante é preferivelmen-te flexível e não imunogênico e gera uma distância entre a albumina humanae FVII / FVIIa, que minimiza a interferência potencial dos dois parceiros defusão, resultando em uma aumentada atividade de FVII / FVIIa da proteínade fusão. Exemplos de Iigantes incluem (GGGGS)n ou (GGGS)n ou (GGS)n,em que N é um número inteiro maior ou igual a 1, e em que G representaglicina e S representa serina. Esses aminoácidos pertencem ao grupo deaminoácidos naturais e foram escolhidos como exemplos para todos os ami-noácidos naturais possíveis.

Em uma outra modalidade da invenção, o Iigante peptídico entrea porção de Fator Vll/Vlla e a porção de albumina contém sítios de consen-so para a adição de modificações pós-traducionais. Preferivelmente, taismodificações consistem em sítios de glicosilação. Mais preferivelmente, taismodificações consistem em pelo menos um sítio de N-glicosilação da estru-tura Asn -X- Ser/THR, em que X representa qualquer aminoácido, excetoa prolina. Ainda mais preferivelmente, tais sítios de N-glicosilação são inseri-dos próximos à terminação amino e/ou carbóxi do Iigante peptídico tal queeles são capazes de proteger neoepítopos que podem se desenvolver nasseqüências onde a porção de Fator Vll/Vlla está transitando no Iigante pep-tídico e onde o Iigante peptídico está transitando na seqüência de porçõesde albumina, respectivamente.

Em uma outra modalidade da invenção, o Iigante peptídico entrea porção de Fator Vll/Vlla e a porção de albumina consiste em seqüênciasde polipeptídios, que servem como Iigantes inter-domínios naturais em prote-ínas humanas. Preferivelmente, tais seqüências de peptídeos em seu ambi-ente natural estão localizadas próximas à superfície de proteína e são aces-síveis ao sistema imunológico de modo que se pode assumir uma tolerâncianatural contra esta seqüência. Exemplos são dados na tabela 2.

Tabela 2

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Em ainda uma outra modalidade da invenção, o Iigante peptídicoentre a porção de Fator Vll/Vlla e a porção de albumina consiste em se-qüências de peptídeos, que são Iigantes inter-domínios de proteínas plasmá-ticas conhecidas. Exemplos são dados na tabela 3.

Tabela 3

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Em ainda uma outra modalidade da invenção, a porção de FatorVll/Vlla é acoplada à porção de albumina por um Iigante peptídico Iiberadordo polipeptídio de Fator Vll/Vlla no sítio de coagulação em que o Iigante con-tém um sítio de clivagem de protease plasmática. Preferivelmente, tais sítiosde clivagem de protease plasmática são aquelas de serina proteases. Maispreferivelmente, o sítio de clivagem é de um sítio de clivagem de proteasede coagulação. Mais preferivelmente, a protease de coagulação é selecio-nada do grupo que consiste em Fator lia, Fator IXa, Fator Xla, Fator XlIa,proteína C ativada, elastase ou calicreína. As seqüências de aminoácidosque são organizadas e clivadas por essas serina proteases são conhecidasdaquele com conhecimento ordinário, por exemplo, conforme descrição em" Homeostasis and Thrombosis, Basic Principies and Clinicai Practice", 4-Edição, Colman et al. 2001 Fator //a: p34-35, p176. Fator IXa: p40-41, FatorXa: p34-35, Fator XIA p128-129, Fator Xlla: p194, aPC: p34-35, p159, cali-creína: p103-104 ou elastase (O1ReiIIy et al., 1999; Antiangiogenic activity ofthe cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science 285:1926-1928).

A invenção refere-se ainda a polipeptídios de fusão de albuminade Fator Vll/Vlla modificados de acordo com a presente invenção, compre-endendo modificações adicionais dentro da porção de fator Vll/Vlla.

Em particular, modificações do Fator VII/FVIIa estão englobadaspela invenção onde o Fator Vll/Vlla foi modificado entre o polipeptídio de Arg144 e Arg152 por adição de pelo menos parte de um peptídeo de ativaçãode um polipeptídio dependente de vitamina K diferente ou por reposição depelo menos parte do peptídeo de ativação putativo de um polipeptídio deFator Vll/Vlla com pelo menos parte de um peptídeo de ativação de um poli-peptídio dependente de vitamina K diferente, conforme descrito no Pedidode Patente EP 04019485.4 (que é aqui incorporado a título de referência) eque é descrito no seguinte parágrafo.

FVII é em particular proximamente relacionado às proteínas dedomínio de Gla como FIX, FX e proteína C onde o domínio de Gla N-terminalé seguido por dois domínios de Fator de crescimento epidérmico (EGF) se-guidos pelo domínio de serina protease tipo tripsina.

Surpreendente é a grande diferença na meia-vida plasmáticadessas proteínas plasmáticas proximamente relacionadas:

FVII 2-4 horas

Proteína C: 6-8 horas

FIX: 18-30 horas

FX: 20-42 horasAs moléculas são altamente conservadas, a mais surpreendentediferença estando dentro do domínio de ativação. Para FVII1 nenhum peptí-deo de ativação foi descrito. Contudo, durante a ativação de FVII pode, alémda clivagem em Arg152, ser também clivado em Arg144, resultando, então,na liberação de um peptídeo de ativação putativo de 8 aminoácidos conten-do um sítio de N-glicosilação conservado. A seqüência entre Arg144 eArg 152 é chamada no Pedido de Patente EP 04019485.4 de "peptídeo deativação putativo".

De modo surpreendente, o comprimento dos peptídeos de ativa-ção e modificações pós-traducionais dos peptídeos de ativação se correla-cionam com a meia-vida aumentada:

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Portanto, a invenção refere-se a um método para preparar umpolipeptídio de Fator Vll/Vlla modificado ligado à albumina, que compreendemodificar o polipeptídio de Fator Vll/Vlla na região entre Arg144 e Arg152 demodo que o polipeptídio de Fator Vll/Vlla modificado tem uma meia-vidaaumentada em comparação com o polipeptídio de Fator Vll/Vlla no qual estaregião não foi modificada.

A invenção refere-se ainda a um método para preparar tal poli-peptídio de albumina ligado ao Fator Vll/Vlla modificado, que compreendemodificar o polipeptídio de Fator Vll/Vlla na região entre Arg144 e Arg152 dodito polipeptídio de albumina ligado ao Fator Vll/Vlla por adição de pelo me-nos parte de um peptídeo de ativação de um segundo polipeptídio depen-dente de vitamina K ou por reposição de pelo menos parte do peptídeo deativação putativo de um polipeptídio de Fator Vll/Vlla com pelo menos partede um peptídeo de ativação de um polipeptídio dependente de vitamina Kdiferente.

A invenção engloba ainda mutações adicionais dentro da se-qüência de polipeptídios, que intensificam a atividade catalítica, prolongam ameia-vida plasmática ou modificam a interação de Fator Tecidual. Particu-larmente, mutações do Fator Vll úteis são descritas por Shah et al. (1998)em Proc. Nati Acad. Sei. USA 95:4229-4234, que reportaram aumentos nafunção de proteína. Outras mutações de Fator de Vll/Vlla úteis são citadasno relatório descritivo do Pedido de Patente EP 04019485.4.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo que codifica umpolipeptídio de fusão de Fator Vll/Vlla e de albumina conforme descriçãoneste relatório descritivo. O termo "polinucleotídeo(s)" refere-se, em geral, aqualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo que pode serRNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado. O polinucleotídeopode ser DNA de fita simples ou de fita dupla, RNA de fita simples ou de fitadupla, Como usado aqui, o termo "polinucleotídeo(s)" inclui, também, DNAsou RNAs que compreendem uma ou mais bases modificadas e/ou base in-comuns, tal como inosina. Será apreciado que uma variedade de modifica-ções pode ser efetuada ao DNA ou ao RNA que servem a muitos propósitosúteis conhecidos daqueles versados na técnica. O termo "polinucleotí-deo(s)", conforme ele é empregado aqui, engloba formas de polinucleotídeosquímica, enzimática ou metabolicamente modificados, bem como as formasquímicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo, porexemplo, células simples e complexas.

Aquele versado na técnica entenderá que, devido à degeneres-cência do código genético, um dado polipeptídio pode ser codificado por di-ferentes polinucleotídeos. Essas "variantes" são englobadas por esta inven-ção.

Preferivelmente, o polinucleotídeo da invenção é um polinucleo-tídeo isolado. O termo polinucleotídeo "isolado" refere-se a um polinucleotí-deo que é substancialmente isento de outras seqüências de ácidos nucléi-cos, tais como, sem limitação, DNA e RNA cromossômicos ou extracromos-sômicos. Polinucleotídeos isolados podem ser purificados de uma célulahospedeira. Métodos de purificação de ácido nucléicos, convencionais, co-nhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados para obtenção depolinucleotídeos isolados. O termo inclui também polinucleotídeos recombi-nantes e polinucleotídeos quimicamente sintetizados.

Ainda um outro aspecto da invenção é um plasmídeo ou vetorque compreende um polinucleotídeo de acordo com a invenção. Preferivel-mente, o plasmídeo ou vetor é um vetor de expressão. Em uma modalidadeparticular, o vetor é um vetor de transferência para uso em terapia genéticahumana.

Ainda um outro aspecto da invenção é uma célula hospedeiraque compreende um polinucleotídeo da invenção ou um plasmídeo ou vetorda invenção.

As células hospedeiras da invenção podem ser empregadas emum método para produzir um polipeptídio de fusão de FVII/Vlla e de albumi-na, que é parte desta invenção. O método compreende:

- cultivar células hospedeiras da invenção sob condições taisque o polipeptídio de fusão de FVII/Vlla e de albumina é expresso; e

- opcionalmente recuperar o polipeptídio de fusão de FVII/Vlla ede albumina do meio de cultura.

Expressão das variantes propostas:

A produção de proteínas recombinantes, em altos níveis, emcélulas hospedeiras adequadas, requer a montagem dos cDNAs modifica-dos, mencionados acima, em unidades transcricionais eficientes juntamentecom elementos reguladores adequados em um vetor de expressão recombi-nante, que pode ser propagado em vários sistemas de expressão de acordocom métodos conhecidos daqueles versados na técnica. Elementos regula-dores transcricionais eficientes poderiam ser derivados de vírus tendo célu-las animais como seus hospedeiros naturais ou do DNA cromossômico decélulas animais. Preferivelmente, podem ser usadas combinações de promo-tores-intensificadores derivados do Vírus Símio 40, adenovírus, vírus polionaBK, citomegalovírus humano, ou a repetição terminal longa do vírus do sar-coma de Rous, ou combinações de promotores-intensificadores incluindogenes transcritos fortes constitutivamente transcritos em células animaiscomo beta-actina ou GRP78. De modo a atingir altos níveis estáveis de mR-NA transcrito dos cDNAs, a unidade transcricional deve conter em sua parteproximal 3'- uma região de DNA que codifica uma seqüência de poliadenila-ção de terminação transcricional. Preferivelmente, essa seqüência é deriva-da da região transcricional precoce do Vírus Símio 40, o gene beta-globinade coelho, ou o gene ativador de plasminogênio de tecido humano.

Os cDNAs são então integrados no genoma de uma linhagem decélula hospedeira adequada para expressão dos polipeptídios de fusão deFator Vll/Vlla e de albumina. Preferivelmente, essa linhagem de célula deveser uma linhagem de célula animal de origem vertebral de modo a assegurardobramento correto, γ-carboxilaçao de resíduos de ácido glutâmico dentrodo domínio de Gal, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação ligada àasparagina, glicosilação ligada a O, e outras modificações pós-traducionais,bem como secreção no meio de cultura. Exemplos de outras modificaçõespós-traducionais são O-sulfatação de tirosina, hidroxilação, processamentoproteolítico da cadeia de polipeptídio nascente e clivagem da região de pro-peptídeo. Exemplos de linhagens de células que podem ser usadas são cé-lulas COS de macaco, células L de camundongo, células C-127 de camun-dongo, células BHK-21 de hamster, células 293 de rim de embrião humano,e preferivelmente células CHO de hamster.

O vetor de expressão recombinante que codifica os cDNAs cor-respondentes pode ser introduzido em uma linhagem de célula animal emvários modos diferentes. Por exemplo, os vetores de expressão recombinan-tes podem ser criados a partir de vetores com base em diferentes vírus ani-mais. Exemplos desses são vetores com base em baculovírus, vírus da va-cínia, adenovírus, e preferivelmente papilomavírus bovino.

As unidades de transcrição que codificam os DNA correspon-dentes podem ser também introduzidas em células animais juntamente comum outro gene recombinante que pode funcionar como um marcador sele-cionável dominante nestas células de modo a facilitar o isolamento de clonesde células específicas que têm o DNA recombinante integrado em seu ge-noma. Exemplos desse tipo de genes marcadores selecionáveis dominantessão Tn5 aminoglicosídeo fosfotransferase, conferindo resistência à genetici-na (G418), higromicina fosfotransferase, conferindo resistência à higromici-na, e puromicina acetil transferase, conferindo resistência à puromicina. Ovetor de expressão recombinante que codifica tal marcador selecionável po-de residir tanto no mesmo vetor como naquele que codifica o cDNA da prote-ína desejada, ou ele pode ser codificado em um vetor separado, que é simul-taneamente introduzido ou integrado ao genoma de célula hospedeira, resul-tando, freqüentemente, em um ligação física firme entre as diferentes unida-des de transcrição.

Outros tipos de genes marcadores selecionáveis, que podem serusados juntos com o cDNA da proteína desejada, são baseados em váriasunidades de transcrição que codificam diidrofolato redutase (dhfr). Depois daintrodução desse tipo de gene nas células que carecem de atividade de dhfrendógena, preferivelmente células CHO (DUKX-B11, DG-44), ele possibilita-rá a esses genes crescerem em meios que carecem de nucleosídeos. Umexemplo de tal meio é o F12 de Ham sem hipoxantina, timidina, e glicina.Esses genes de dhfr podem ser introduzidos juntos com as unidades trans-cricionais de cDNA de Fator de coagulação em células CHO do tipo acima,tanto ligada no mesmo vetor como em vetores diferentes, criando assim li-nhagens de células positivas para dhfr, produzindo proteína recombinante.

Se as linhagens de células acima são crescidas na presença dometotrexato inibidor de dhfr citotóxico, novas linhagens de células resisten-tes ao metotrexato emergirão. Essas linhagens de células podem produzirproteína recombinante em uma taxa adequada devido ao número ampliadode dhfr ligado e as unidades transcricionais da proteína desejada. Quandoessas linhagens de células estão se propagando em concentrações crescen-tes de metotrexato (1-10.000nM), novas linhagens de células podem ser ob-tidas, que produzem a proteína desejada em taxa muito alta.

As linhagens de células acima produtoras da proteína desejadapodem ser crescidas em larga escala, tanto em cultura em suspensão ousobre vários suportes sólidos. Exemplos desses suportes são microveículoscom base em dextrano ou matrizes de colágeno, ou suportes sólidos na for-ma de fibras ocas ou de vários materiais cerâmicos. Quando crescida emcultura de suspensão de células ou sobre microveículos, a cultura das linha-gens de células acima pode ser realizada tanto como uma cultura em bate-Iada como uma cultura de perfusão com produção contínua do meio condi-cionado em períodos prolongados de tempo. Assim, de acordo com a pre-sente invenção, as linhagens de células acima são bem-adequadas para odesenvolvimento de um processo industrial para a produção das proteínasrecombinantes desejadas.

A proteína recombinante, que se acumula no meio de célulassecretoras dos tipos acima, pode ser concentrada e purificada por uma vari-edade de métodos bioquímicos e cromatográficos, inclusive métodos Litili-zando diferenças de tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade, afinidadeespecífica, etc. entre a proteína desejada e outras substâncias no meio decultivo de células.

Um exemplo de tal purificação é a absorção da proteína recom-binante para um anticorpo monoclonal que é imobilizado sobre um suportesólido. Depois da dessorção, a proteína pode ser ainda purificada por umavariedade de técnicas cromatográficas com base nas propriedades acima.

É preferido purificar o polipeptídio de albumina ligado ao FatorVll/Vlla da presente invenção para pureza >80%, mais preferivelmente parapureza >95%, e particularmente preferido é um estado farmaceuticamentepuro que é maior que 99,9% puro com respeito às macromoléculas contami-nantes, particularmente outras proteínas e ácidos nucléicos, e isento de a-gentes infecciosos e pirogênicos. Preferivelmente, um polipeptídio de albu-mina ligado ao FVII/Vlla isolado ou purificado da invenção é substancialmen-te isento de outros polipeptídios.

Os polipeptídios de albumina ligados ao Fator Vll/Vlla descritosnesta invenção podem ser formulados em preparações farmacêuticas parauso terapêutico. As proteínas purificadas podem ser dissolvidas em soluçõesde tampão aquosas, fisiologicamente compatíveis, convencionais, às quaispodem ser adicionados, opcionalmente, excipientes farmacêuticos para pro-porcionar preparações farmacêuticas.

Tais veículos e excipientes farmacêuticos, bem como formula-ções farmacêuticas adequadas são bem-conhecidos da técnica (vide, porexemplo, "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Prote-ins", Frokjaer et al., Taylor & Francis (2000) ou "Handbook of PharmaceuticaiExcipientst', 3ê Edição, Kibbe et al., Pramaceutical Press (2000)). Em particu-lar, a composição farmacêutica que compreende a variante de polipeptídioda invenção pode ser formulada na forma Iiofilizada ou solúvel, estável. Avariante de polipeptídio pode ser Iiofilizada por uma variedade de procedi-mentos conhecidos da técnica. Formulações Iiofilizadas são reconstituídasantes do uso pela adição de um ou mais diluentes farmaceuticamente acei-táveis tais como água estéril para injeção ou solução salina fisiológica estéril.

As formulações da composição são distribuídas ao indivíduo porquaisquer meios de administração farmaceuticamente adequados. Váriossistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para adminis-tração da composição por qualquer via conveniente. Preferencialmente, ascomposições da invenção são administradas sistemicamente. Para uso sis-têmico, as variantes de Fator Vll/Vlla ligadas à albumina da invenção sãoformuladas para distribuição parenteral (por exemplo, intravenosa, subcutâ-nea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal outransdérmica) ou enteral (por exemplo, oral, vaginal ou retal) de acordo commétodos convencionais. A via mais preferencial de administração é a admi-nistração intravenosa. As formulações podem ser administradas continua-mente por infusão ou por injeção de bolus. Algumas formulações englobamos sistemas de liberação lenta.

Os polipeptídios de Fator Vll/Vlla ligados à albumina ativa, bio-logicamente modificados, da presente invenção são administrados aos paci-entes em uma dose terapeuticamente eficaz, que significa uma dose que ésuficiente para produzir os efeitos desejados, prevenindo ou diminuindo agravidade da condição ou da indicação que está sendo tratada sem atingiruma dose que produz efeitos colaterais adversos intoleráveis. A dose exatadepende de muitos fatores, como, por exemplo, a indicação, a formulação, eo modo de administração e tem que ser determinada em experimentos pré-clínicos e clínicos para cada indicação respectiva.

A composição farmacêutica da invenção pode ser administradasozinha ou em conjunto com outros agentes terapêuticos. Esses agentespodem ser incorporados como parte do mesmo produto farmacêutico.

Os vários produtos da invenção são úteis como medicamentos.Por conseguinte, a invenção refere-se a uma composição farmacêutica quecompreende polipeptídio de albumina ligado a FVII/Vlla conforme descritoaqui, um polinucleotídeo da invenção, ou um plasmídeo ou vetor da inven-ção.

O DNA modificado desta invenção pode ser também integrado aum vetor de transferência para uso na terapia genética humana.

Um outro aspecto da invenção é o uso de polipeptídio de albu-mina ligado a FVII/Vlla conforme descrito aqui, de um polinucleotídeo dainvenção, de um plasmídeo ou vetor da invenção, ou de uma célula hospe-deira da invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamentoou prevenção de distúrbios de sangramento. Os distúrbios de sangramentoincluem, mas sem limitação, hemofilia A. Em uma outra modalidade da in-venção, o tratamento compreende uma terapia genética humana.

A invenção também se refere a um método para tratar um indiví-duo em uma ou mais das seguintes indicações: "episódios de sangramentoe cirurgia em pacientes com hemofilia hereditária ou adquirida com inibido-res para Fatores de coagulação (FVIII ou FIX)", "reversão de déficits de he-móstase desenvolvidos em conseqüência de tratamentos de fármacos taiscomo fármacos antiplaquetários ou fármacos anticoagulantes", "aperfeiçoa-mento de hemóstase secundária", "déficits de hemóstase desenvolvidos du-rante infecções ou durante doenças tal como deficiência de Vitamina K oudoença de fígado aguda", "ressecção de fígado", "déficits por hemóstasedesenvolvidos como conseqüências de mordidas de cobra", "sangramentosgastrointestinais". Também indicações preferidas são "trauma", "conseqüên-cias de transfusão massiva (coagulopatia dilucional)", "deficiências de fatorde coagulação diferentes de FVIII e FIXu1 "VWD", "deficiência de Fl", "defici-ência de FV", "deficiência de FVII", "deficiência de FX", "deficiência de FXIM","HUS", "doenças e distúrbios plaquetários herdados ou adquiridos comotrombocitopenia, ITP, TTP, síndrome HELLP, síndrome de Bernard-Soulier,Trombastenia de Glanzamann, HIT", "Síndrome de Chediaki-Higahi", "Sín-drome de Hermansky-Pudlak", "Síndrome de Rendu-Osler", "púrpura de He-noch-Schonlein" e "Cicatrização de Ferimento". O método compreende ad-ministrar ao dito indivíduo uma quantidade eficaz do polipeptídio de albuminaligado a FVII/Vlla conforme descrito aqui. Em uma outra modalidade, o mé-todo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do polinu-cleotídeo da invenção ou de um plasmídeo ou vetor da invenção. Alternati-vamente, o método pode compreender administrar ao indivíduo uma quanti-dade eficaz das células hospedeiras da invenção descrita aqui.

Descrição da tabelas e dos desenhos:

Figura 1:

O sítio de restrição Xhol introduzido no sítio do códon de inter-rupção de FVII natural por reposição de TAG por TCG é TCG está sublinha-do. O sítio Notl usado para posterior construção está duplamente sublinha-do. A seqüência de aminoácidos da terminação C do Fator Vll é dada em umcódigo de três letras (dentro de um retângulo).

Figura 2:

Esquema das seqüências de Iigantes inseridas entre a termina-ção C do Fator Vll e a terminação N da albumina nas várias construções depFVII. O sítio de clivagem de trombina em pFVII-834 está sublinhado. Asasparaginas dos sítios de N-glicosilação estão duplamente sublinhadas.

Figura 3:

Proteínas de fusão de albumina de FVII foram ativadas por FXae a atividade de FVIIa foi medida em um ensaio de STACLOT®. A plotagemmostra a atividade das proteínas com comprimento de Iigante crescente comrespeito à proteína sem Iigante (derivado por plasmídeo pFVII-974).

Figura 4:Resultados dos experimentos de PK com Fator Vll do tipo selva-gem (pFVII-659), proteínas de fusão de albumina de FrVII, FVII derivado deplasma (pdFVII) e rFVIIa (NovoSeven®) conforme medição por ELISA.Exemplos:

Exemplo 1: Geração de cDNAs que codificam polipeptídios de fusão de al-bumina de FVII

A seqüência de codificação de Fator Vll foi ampliada por PCR apartir de uma biblioteca de cDNA de fígado humano (ProQuest, Invitrogen)usando iniciadores We1303 e We1304 (SEQ ID NO: 1 e 2). Depois de umsegundo ciclo de PCR usando iniciadores We1286 e We1287 (SEQ ID NO: 3e 4), o fragmento foi clonado em pCR4TOPO (Invitrogen). Daí, o cDNA deFVII foi transferido como um Fragmento EcoRI para o sítio EcoRI de pIRES-puro3 (BD Biosciences), em que um sítio XHoI havia sido deletado previa-mente. O plasmídeo resultante foi designado pFVII-659.

Subseqüentemente, um sítio de restrição XHoI foi introduzido nopFVII-659 no sítio do códon de interrupção de FVII natural (figura 1) por mu-tagênese direcionada por sítio de acordo com os protocolos-padrão (Sítio demutagênese direcionada por sítio QuickChange XL, Stratagene) usando oli-gonucleotídeos We1643 e We1644 (SEQ ID NO: 5 e 6). O plasmídeo resul-tante foi designado pFVII-700.

Os oligonucleotídeos We1731 e We1732 (SEQ ID NO: 7 e 8)foram anelados em concentrações eqüimolares (10 pmols) sob condições-padrão de PCR, preenchidos e ampliados usando um protocolo de PCR deuma desnaturação inicial de 2 minutos, a 94°C, seguida por 7 ciclos de 15segundos de desnaturação a 94°C, 15 segundos de anelamento a 55°C e 15segundos de alongamento a 72°C, e finalizados por uma etapa de extensãode 5 minutos a 72°C. O fragmento resultante foi digerido com endonucleasesde restrição Xhol e Notl e ligados em pFVII-700 digerido com as mesmasenzimas. O plasmídeo resultante foi designado pFVII-733, contendo seqüên-cia de codificação para FVII e uma extensão C-terminal de um Iigante deglicina/serina clivável por trombina.

Com base em pFVII-733, outros Iigantes sem sítio de clivagemde trombina e adicionais sítios de N-glicosilação foram inseridos. Para isso,os pares de iniciadores We2148 e We2149 (SEQ ID NO: 9 e 10), We 2148 eWe2150 (SEQ ID NO: 9 e 11), We2148 e We2151 (SEQ ID N0:9 e 12),We2152 e We2153 (SEQ ID N0:13 e 14), We2152 e We2154 (SEQ IDNO:13 e 15), We2152 e We2155 (SEQ ID NO: 13 e 16), e We2156 e We2157(SEQ ID NO:17 e 18), respectivamente, foram anelados e ampliados con-forme descrição acima. Os fragmentos de PCR1 respectivos, foram digeridoscom endonucleases de restrição Xhol e BamHI e inseridos no pFVII-733digeridos com as mesmas enzimas. No sítio BamHI dos plasmídeos resul-tantes, bem como naquele de pFVII-733, foi inserido um fragmento de Ba-mH1 contendo o cDNA de albumina humana. Esse fragmento foi gerado porPCR sobre uma seqüência de cDNA de albumina usando os iniciadoresWe 1862 e We 1902 (SEQ ID NO: 19 e 20) sob condições-padrão. Os plasmí-deos finais foram designados pFVII-935, pFVII-936, pFVII-937, pFVII-938,pFVII-939, pFVII-940, pFVII-941 e pFVII-834, respectivamente. Suas se-qüências de Iigantes e as seqüências de FVII C-terminal e as seqüências dealbumina N-terminal são mostradas na figura 2.

Com base em pFVI-938, seqüências de Iigantes mais curtas fo-ram geradas por mutagênese de deleção. Para isso, iniciadores de mutagê-nese We2247 e We2248 (SEQ ID NO:23 e 24), We2249 e We2250 (SEQ IDNO:25 e 26), We 2251 e We2252 (SEQ ID NO:27 e 28) e We2253 e We2254(SEQ ID NO:29 e 30) foram usados em protocolos de mutagênese-padrão(Kit de Mutagênese Sitio-Direcionada QuickChange XL, Stratagene) paragerar os plasmídeos pFVII-1014, pFVII-1015, pFVII-1016 e pFVII-1370, res-pectivamente.

Para gerar uma proteína de fusão de FVII e de albumina, muta-gênese de deleção foi aplicada, como acima, no plasmídeo pFVII-935 usan-do os iniciadores We2181 e WE2182 (SEQ ID NO:31 e 32). O plasmídeoresultante foi designado pFVII-974.

Com base no plasmídeo pFVII-974, mutagênese de inserção foiaplicada para gerar de 1 a 3 Iigantes de aminoácidos. Para essa mutagêne-se, os iniciadores We2432 e We2433 (SEQ ID NO:33 e 34), We2434 eWe2435 (SEQ ID NO:35 e 36) e We2436 e We2437 (SEQ ID NO:37 e 38)foram usados em protocolos da mutagênese padrão (Kit de Mutagênese Di-recionada por Sítio QuickChange XL1 Stratagene) para gerar os plasmídeospFVII-1158, pFVII-1159 e pFVII-1160, respectivamente.

Outras construções foram geradas em procedimentos análogos,aplicando em protocolos de mutagênese-padrão os iniciadores We2713 eWe2714 (SEQ ID NO:39 e 40) no plasmídeo pFVII-1370, We2725 e We2726(SEQ ID NO:41 e 42) no plasmídeo FVII-1370, We2717 e We2718 (SEQ IDNO:43 e 44) no plasmídeo pFVII-1016 e We2756 e We2757 (SEQ ID NO:45e 46) no plasmídeo pFVII-935 para gerar os plasmídeos pFVII-1361, pFVII-1362, pFVII-1363 e pFVII-1382, respectivamente.

As seqüências de Iigantes e as seqüências de albumina de FVIIC-terminal e N-terminal dos plasmídeos descritos acima estão mostrados nafigura 2.

Exemplo 2: Transfecção e expressão de polipeptídios de fusão de albuminae FatorVII

Os plasmídeos forma crescidos em E. coli TOPIO (Invitrogen) epurificados usando protocolos-padrão (Qiagen). Células HEK-293 foramtransfectadas usando o reagente Lipofectamina 2000 (Invitrogen) e cresci-das em meio isento de soro (Invitrogen 293 Express) em presença de 50ng/ml_ de Vitamina K e 4 μg/mL de Puromicina. As populações de célulastransfectadas foram espalhadas através de frasco T em garrafas cilíndricas,de onde o sobrenadante foi colhido para purificação.

Exemplo 3: Purificação de FVII e e polipeptídios de fusão de albumina deFVII

Colheita de cultura de células contendo FVII ou proteína de fu-são de FVII e de albumina foi aplicada em uma coluna de 2,06 ml_ Q-Sepharose FF previamente equilibrada com tampão HEPES 20mM, pH 7,4.Subseqüentemente, a coluna foi lavada com 10 volumes do tampão denomi-nado HEPES. Eluição das moléculas de FVII ligadas foi obtida por correr umgradiente linear de NaCI a 0 a 1,0 M em HEPES 20mM em 20 volumes dacoluna. O eluato continha cerca de 85 a 90% do antígeno de FVII aplicadoem concentrações de proteína entre 0,5 e 1 g/L.

Alternativamente, FVII foi purificado por cromatografia usandoum fator tecidual imobilizado conforme descrição em EP 0770625B1.

Antígeno e atividade de FVII foram determinados conforme des-crição no Exemplo 4.

Exemplo 4: Determinação de atividade e antígeno de FVII.

A atividade de FVII foi determinada usando um kit de teste cro-mogênico comercialmente disponível (Chromogenix Coaset FVII usandoplasma humano padrão [Dade Behring] como padrão) com base no métododescrito por Seligsohn et al. Blood (1978) 52:978-988.

A atividade de FVIIa foi determinada usando um kit de teste co-mercialmente disponível (STACLOT®)Vlla-rTF, Diagnostica Stago) com baseno método descrito por Morissey et al. (1993) Blood 81:734-744.

O antígeno de FVII foi determinado por ELISA cujo desempenhoé conhecido daquele versado na técnica. Em resumo, microplacas foramincubadas com 120 μΙ_ por cavidade do anticorpo de captura (IgG de FVIIanti-humano de carneiro, Cedarlan CL20030AP, em diluição de 1:1.000 emTampão A [Sigma C3041] durante a noite, à temperatura ambiente. Depoisde lavar as placas três vezes com tampão B (Sigma P3563), cada cavidadefoi incubado com 200 μΙ_ de tampão C (Sigma P3688), por uma hora, emtemperatura ambiente. Depois de mais três etapas de lavagem com tampãoB, diluições em série da amostra de teste em tampão B , bem como di-luições em série de plasma humano padrão (Dade Behring; 50 - 0,5 mU/mL[1 mU igual a 0,5 ng]) em tampão B (volumes por cavidade: 100 μΙ_) foramincubadas, por duas horas, em temperatura ambiente. Depois de três etapasde lavagem com o tampão B, 100 μΙ_ de uma diluição de 1:5.000 em tampãoB do anticorpo de detecção (IgG de FVII anti-humano de carneiro, CedarlaneCL20030K, peroxidase marcada) foram adicionados a cada cavidade pormais duas horas, em temperatura ambiente. Depois de três etapas de Iava-gem com tampão B, 100 μΙ_ da solução de substrato (TMB, Dade Behring,OUVF) foram adicionados por cavidade e incubados por 30 minutos, emtemperatura ambiente, no escuro. Adição de 100 μΙ_ de solução de interrup-ção não diluída (Dade Behring, OSFA) preparou as amostras para leitura emuma leitora de microplatas adequada, em comprimento de onda de 450 nm.As concentrações da amostras de teste foram então calculadas usando acurva padrão com plasma humano padrão como referência.

Exemplo 5: Ativação de FVII e polipeptídios de fusão de FVII e de albuminapor fator Xa

Os polipeptídios de FVII purificados conforme descrição no e-xemplo 3 foram dialisados contra um tampão consistindo em 20mM de HE-PES1 150mM de NaCI1 1mM de Citrato de Na1 1 g/L de Caprilato de Na, pH8,5. Dentro deste ambiente de tampão, FVII foi ativado para FVIIa por incu-bação com FXa (preparação comercialmente disponível, 100 Ul/mL, ERL).Fosfolipídio (Fosfolipon 25P, 1 g/L, Rhone Poulenc-Nattermann, Kõln) e Ca4+(solução de CaCI2 em água destilada, 1M) por vários intervalos de tempo, a37°C. As concentrações finais eram de -30 a 65 UI/mL de FVII, medidaspelo ensaio cromogênico; 0,5% de FXa relacionado a FVII, isto é, 1 Ul deFXa e 200 Ul de FVII, 0,02 g/L de Fosfolipídio e 5mM de CaCl2.

A ativação foi finalizada por adição de 10% (p/p) de um tampãoconsistindo em 20mM de HEPES, 150mM de NaCI, 200mM de Citrato deNa, 1 g/L de Caprilato de Na, pH 5,0.

Paralelamente, para monitorar a clivagem das moléculas, umaamostra da mistura de ativação e uma amostra não ativada correspondenteforam aplicadas à SDS-PAGE, coloridas com azul de Coomassie e varridaspara densidade de banda.

Em resumo, as amostras foram reduzidas, aplicadas à SDS-PAGE (Gradiente de 8-16% de Poliacrilamida, Géis de triglicina Novex®, Invi-trogen; de acordo com as instruções do fabricante), e coloridas com azul deCoomassie G-250. As bandas resultantes foram varridas (Versa DOC®, Bio-Rad) e as concentrações relativas de proteína foram calculadas usando osoftware Image Qaunt (V 4.20, Amersham).

Exemplo 6: Atividade de proteínas de fusão de albumina de FVII é depen-dente do comprimento do ligante

As proteínas de fusão de albumina de FVII com comprimento deligante entre O e 31 aminoácidos foram ativadas conforme descrição acima ea atividade de FVIIa foi determinada em ensaio de STACLOT®. Embora ospolipeptídios de fusão, independentemente do comprimento de ligante, ti-vessem mostrado um grau comparável de clivagem de FXa1 as atividades deFVIIa das proteínas de fusão de albumina medidas pelo ensaio de atividademostraram um resultado surpreendente: quanto mais longo o ligante entreFVII e a porção de albumina se tornava, maior era a atividade de FVIIa es-pecífica molar medida (figura 3 e tabela 5) e a construção sem ligante (974)exibiu menos da metade da atividade de FVIIa em comparação com asconstruções com peptídeos Iigantes de 19 ou mais aminoácidos de compri-mento. Mesmo um aminoácido como ligante (pFVII-1158) aumentou a ativi-dade específica molar da proteína de fusão de 31% em comparação a umaproteína de fusão sem ligante (pFVII-974). Isso sugere fortemente que a fu-são direta de seqüências de FVII e albumina pode levar a uma situação con-formacional onde a porção de albumina interfere tanto na conformação desua parte de FVIIa como em sua interação com seu substrato. Essa interfe-rência parece ser significantemente reduzida nas construções tendo um li-gante peptídico intermediário entre o Fator Vll/Vlla e a albumina.

A proteína de fusão de albumina sem ligante (974) mostrou 25%de atividade molar específica em comparação com NovoSeven® (tabela 6).

Tabela 5:

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Tabela 6:

Comparação da atividade específica molar (expressa em unida-des de FVIIa medidas pelo ensaio de Staclot por 100 unidades de antígenodeterminado por Elisa) entre a proteína de fusão de FVII e de albumina, semligante (974) e NovoSeven®.

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Claims (29)

1. Polipeptídio fundido de albumina, que compreende pelo me-nos um polipeptídio de Fator Vll ou de Fator Vlla ou um fragmento ou varian-te do mesmo, fundido à albumina, ou um fragmento ou variante da mesma,em que pelo menos um de tal polipeptídio de Fator Vll ou de Fator Vlla estálocalizado na terminação N da proteína de fusão e em que a proteína de fu-são tem atividade biológica de Fator Vll/Vlla.

2. Polipeptídio fundido de albumina, de acordo com a reivindica-ção 1, em que a proteína de fusão tem pelo menos 25% de atividade biológi-ca de Fator Vll/Vlla específico molar em comparação com o respectivo FatorVll ou Fator Vlla do tipo selvagem não fundido ou fragmento ou variante domesmo.

3. Polipeptídio fundido de albumina, que compreende um poli-peptídio de Fator Vll ou de Fator Vila, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,em que a proteína de fusão tem meia-vida plasmática funcional in vivo au-mentada em comparação com o Fator FVII ou Fator Vlla não fundido.

4. Polipeptídio fundido de albumina, que compreende um poli-peptídio de Fator Vll ou de Fator Vila, de acordo com a reivindicação 3, emque a proteína de fusão tem uma meia-vida funcional in vivo, que é aumen-tada de pelo menos 100% em comparação com o Fator FVII ou Fator FVIIanão fundido.

5. Polipeptídio fundido de albumina, que compreende um poli-peptídio de Fator Vll ou de Fator Vila, de acordo com as reivindicações 1 a4, em que um Iigante separa a porção de Fator Vll ou da Porção Vlla da por-ção de albumina.

6. Polipeptídio fundido de albumina, que compreende um poli-peptídio de Fator Vll ou de Fator Vila, de acordo com a reivindicação 5, emque o Iigante peptídico separa a porção de Fator Vll ou do Fator Vlla da por-ção de albumina e o polipeptídio de fusão tem uma atividade específica mo-lar, em comparação com proteínas de fusão do Fator Vll ou FVIIa sem umligante, que é aumentada de pelo menos 25%.

7. Polipeptídio de fusão de albumina, de acordo com as reivindi-cações 5 e 6, em que o Iigante contém um sítio de clivagem de protease.

8. Polipeptídio de fusão de albumina, de acordo com a reivindi-cação 7, em que o sítio de clivagem pode ser clivado por uma protease decoagulação do mesmo grupo que consiste em Fator lia, Fator IXa, Fator Xa,Fator Xla, Fator Xllaj proteína C ativada, elastase ou calicreína.

9. Polipeptídio de fusão de proteína, de acordo com as reivindi-cações 5 a 8, em que o Iigante é modificado por inserção de sítios para mo-dificações pós-traducionais.

10. Polipeptídio de fusão de albumina, de acordo com a reivindi-cação 9, em que a modificação pós-traducional compreende um ou maissítios de N-glicosilação da estrutura Asn -X- Ser/Thr, em que X representaqualquer aminoácido, exceto prolina.

11. Polipeptídio de fusão de albumina, de acordo com as reivindi-cações 5 e 6, em que o Iigante peptídico compreende a SEQ ID NO:47 a 55.

12. Polipeptídio, de acordo com as reivindicações 5 a 10, emque o Iigante peptídico compreende pelo menos 1 aminoácido.

13. Polipeptídio de fusão de albumina, de acordo com as reivin-dicações 5 a 10, em que o Iigante peptídico compreende pelo menos 3 ami-noácidos.

14. Polipeptídio de albumina de fusão, de acordo com a reivindi-cações 5 a 10, em que o Iigante peptídico compreende pelo menos 7 amino-ácidos.

15. Polipeptídio de fusão de albumina, de acordo com as reivin-dicações 5 a 10, em que o Iigante polipeptídico compreende pelo menos 25aminoácidos.

16. Polipeptídio de fusão de albumina, de acordo com as reivin-dicações 1 a 15, em que o dito polipeptídio de fusão de albumina é modifica-do de modo que a modificação compreende adicionar por inserção de pelomenos parte do peptídeo de ativação de um polipeptídio dependente de vi-tamina K diferente, ou adicionar, por inserção, um análogo do dito peptídeode ativação do polipeptídio dependente de vitamina K diferente.

17. Polipeptídios fundidos de albumina, de acordo com a reivin-dicações 1 a 16, em que a porção de polipeptídio de Fator Vll ou de FatorVlla tem atividade pró-coagulante.

18. Polipeptídio fundido à albumina, de acordo com as reivindi-cações 1 a 17, para uso como um medicamento.

19. Composição farmacêutica, que compreende uma quantidadeeficaz do polipeptídio de fusão de albumina como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 17, juntamente com um veículo ou excipiente farma-ceuticamente aceitável.

20. Moléculas de ácido nucléico, em que a dita molécula de áci-do nucléico compreende uma seqüência de polinucleotídeos que codifica opolipeptídio de fusão de albumina como definido nas reivindicações 1 a 17,em que a dita seqüência de polinucleotídeos está localizada na extremidade-3' de uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídio, que me-deia a gama-carboxilação da parte de fusão do Fator Vll/Vlla.

21. Plasmídeo ou vetor, em que o dito plasmídeo ou vetor com-preende a molécula de ácido nucléico, como definida na reivindicação 20.

22. Plasmídeo ou vetor de acordo com a reivindicação 21, emque o dito plasmídeo ou vetor é um vetor de expressão.

23. Vetor de acordo com a reivindicação 22, em que o dito vetoré um vetor de transferência para uso em uma terapia genética humana.

24. Célula hospedeira, em que a dita célula hospedeira compre-ende a molécula de ácido nucléico como definida na reivindicação 20.

25. Método para fabricar um polipeptídio de fusão de albuminacomo definido nas reivindicações 1 a 17, em que o dito método compreende:a. proporcionar um ácido nucléico que compreende uma se-qüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídio de fusão de albuminaexpressável em um organismo;b. expressar o ácido nucléico no organismo para formar um poli-peptídio de fusão de albumina; ec. purificar o polipeptídio de fusão de albumina.

26. Composição farmacêutica, em que a dita composição farma-cêutica compreende um plasmídeo ou vetor como definido nas reivindica-ções 21 a 23.

27. Uso de um polipeptídio de fusão de albumina como definidoem qualquer uma das reivindicações 1 a 17, de um polinucleotídeo comodefinido na reivindicação 20, de um plasmídeo ou vetor como definido emqualquer uma das reivindicações 21 a 23, ou de uma célula hospedeira co-mo definida na reivindicação 24, na fabricação de um medicamento para otratamento ou prevenção de um distúrbio de coagulação do sangue.

28. Uso de um polipeptídio de fusão de albumina que compre-ende um polipeptídio de Fator Vll ou de Fator Vlla ou um fragmento ou vari-ante do mesmo, e albumina, ou um fragmento ou variante da mesma, nafabricação de um medicamento para tratar uma ou mais das seguintes indi-cações: hemofilia A, hemofilia B, episódio hemorrágico relacionado a cirurgi-as, distúrbios do fígado que levam a distúrbios de coagulação sangüínea,"episódios de sangramento e cirurgia em pacientes com hemofilia hereditáriaou adquirida com inibidores para Fatores de coagulação (FVIII ou FIX)", "re-versão de déficits de hemóstase desenvolvidos em conseqüência de trata-mentos com fármacos tais como fármacos antiplaquetários ou fármacos an-ticoagulantes", "aperfeiçoamento de hemóstase secundária", "déficits dehemóstase desenvolvidos durante infecções ou durante doenças tal comodeficiência de Vitamina K ou doença do fígado grave", "ressecção do fíga-do", "déficits de hemóstase desenvolvidos em conseqüência de mordidas decobra", "sangramentos gastrointestinais", "trauma", "conseqüências de trans-fusão massiva (coagulopatia dilucional)", "deficiências de fator de coagula-ção diferente de FVIII e FIX", "VWD", "deficiência de Fl", "deficiência de FV","deficiência de FVII", "deficiência de FX", "deficiência de FXIII", "HUS", "do-enças plaquetárias hereditárias ou adquiridas e distúrbios como trombocito-penia, ITP1 TTP, síndrome de HELLP, síndrome de Bernard-Soulier, Trom-bastenia de Glanzmann, "HIT", "Síndrome de Chediak-Higahi", "Síndrome deHermansky-Pudlak", "Síndrome de Rendu-Osler", "púrpura de Henoch-Schonlei" e "Cicactrização de Ferimentos".

29. Uso, de acordo com a reivindicação 27 e 28, em que o tra-tamento compreende terapia genética humana.