CN104926946B - 具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物工程技术领域，公开了一种人血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTS₁₃‑MDTCS融合蛋白及其在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜(TTP)药物中的应用，本发明通过连接肽，将ADAMTS₁₃‑MDTCS与人血清白蛋白结合，形成融合蛋白，此融合蛋白保证了原有蛋白ADAMTS₁₃‑MDTCS的生物学活性，又显著增加了ADAMTS₁₃‑MDTCS蛋白的半衰期，克服了现有ADAMTS₁₃‑MDTCS降解的问题，具备长效生物学活性，其蛋白表达量高，可用于工业化生产。

Description

具有延长体内半衰期的ADAMTS13-MDTCS融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及医药生物工程技术领域，具体涉及一种血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTS13-MDTCS与人血清白蛋白HSA的融合蛋白、制备方法及其在制备治疗血栓性血小板减少性紫癜(TTP)药物中的应用。

背景技术

1.1血栓性血小板减少性紫癜

血栓性血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)是一种微血管血栓出血综合征，是因为血小板大量消耗而减少，在血液微循环中形成了血小板血栓，临床特征表现为在皮肤表面形成紫癜。微血管溶血性贫血和血小板减少是本疾病最核心的两大特征，另外或伴有神经系统损伤、肾脏损害及发热表现。临床上TTP分先天性TTP(基因突变)和获得性TTP(产生自身抗体)。TTP临床表现预后差，病程短，死亡率高，达80％～90％，TTP缓解后复发率较高，为30％～60％。在TTP临床治疗方面，目前尚无特效药，治疗通常采用血浆置换疗法或全血置换疗法，此类治疗方法费用高昂，过程复杂，且副作用较多，临床上存在交叉感染等诸多风险。因此，TTP的新型药物的研发成为治疗本病的关键。

1.2ADAMTS13与TTP

血管性血友病因子裂解酶(A Disintegrin And Metalloprotease withThrombospondin type Repeats 13,ADAMTS13)是ADAMTS家族的成员之一，属于金属蛋白酶。ADAMTS13基因位于9号染色体长臂(9q34)，cDNA全长4597kb，由29个外显子组成，开放阅读框为4284bp，编码1427个氨基酸。ADAMTS13蛋白由肝脏内皮细胞合成并分泌到血液中，其主要功能是剪切在新生的富血小板血栓内的血管性血友病因子(VWF因子)，以防止溶血、血小板减少和组织梗塞。该酶在正常机体内可以特异性地裂解VWF-A2区的Tyr1605-Met1606之间的肽键，从而使VWF裂解，保持正常的止血和血循环功能。当ADAMTS13缺乏或活性减低时，不能够有效的裂解VWF与血小板糖蛋白结合形成的超大分子量VWF(UL-VWF)分子时，便使之形成富含血小板和VWF的血栓，导致TTP的发生。由于发现TTP发病与ADAMTS13蛋白酶的功能缺失密切相关，因此ADAMTS13重组蛋白成为治疗TTP疾病的新的研究方向。目前，体外表达ADAMTS13基因，获得功能性的ADAMTS13重组蛋白，仍处于实验研究阶段。

1.3ADAMTS13全长蛋白(ADAMTS13-FL)与ADAMST13截断型突变体(ADAMTS13-MDTCS)

ADAMTS13作为ADAMTS家族一员，ADAMTS13-FL包含以下公共结构域，分别是信号肽(signal sequence,SP)，前导肽(propeptide,P)，金属蛋白酶结构域(metalloproteasedomain,M)，去整合素样结构域(disintegrin-like domain,D)，I型血小板反应蛋白重复序列(thrombospondin type1,TSP1)，富含半胱氨酸结构域(cysteine-rich domain,C)，空间结构域(spacer domain,S)，空间结构域后面是7个TSP1重复序列，和ADAMTS13特有的2个CUB结构域。

ADAMTS13-MDTCS则包含除了7个TSP1重复序列和ADAMTS13特有的2个CUB结构域，其他功能结构域，分别是信号肽，前导肽，金属蛋白酶结构域，去整合素样结构域，I型血小板反应蛋白重复序列，富含半胱氨酸结构域，空间结构域，取每个结构域的首字母，因此称作MDTCS突变体。

有研究报道ADAMTS13-MDTCS拥有与ADAMTS13-FL同等的生物学功能，但是ADAMTS13-MDTCS蛋白大小远远小于ADAMTS13-FL，因此体外表达生产蛋白的难度更小，预期的产量也较大，另外更重要的一点是：设计具有蛋白裂解活性但又不被ADAMTSl3抗体所抑制的ADAMTSl3重组体蛋白是解决获得性TTP的关键，可以有效降低ADAMTSl3抗体治疗失败的风险，也有效减少获得性TTP患者血浆置换治疗的频率。

但是，根据前期的实验结果，ADAMTS13-MDTCS蛋白在小鼠体内的半衰期实验表明，ADAMTS13-MDTCS蛋白半衰期较短，均在2小时之内，与正常血浆中ADAMTS13蛋白的半衰期1-2天，差距较大，半衰期较短减少了药物有效窗口期，降低了本实验室开发TTP治疗蛋白药物的可能性，因此，有效延长ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期将能使得ADAMTS13-MDTCS蛋白具有更好的临床应用前景。

1.4现有延长蛋白药物半衰期的方法

目前，延长蛋白药物半衰期主要根据加大蛋白药物的分子量，有效减少肾小球滤过率，相对分子质量小于69 000的分子都将通过肾小球滤过作用被排出体外；减少异源蛋白的免疫原性，防止被蛋白酶水解，从而减少其体内清除率；持续缓慢释放维持药物浓度，延长药物作用时间等三个方面考虑。常用技术包括：PEG化学修饰、制备缓释剂型、蛋白基因融合技术等。

1.4.1化学修饰法

化学修饰法是延长蛋白药物半衰期的一个重要方法之一，其延长蛋白药物半衰期的原理主要包含以下两部分内容：1)蛋白质药物经过化学法修饰以后，其化学分子量得到一定程度的增加，因此在代谢过程中降低了被肾小球过滤的机会；2)把蛋白药物的非必需基团与亲水惰性的化学高分子共价结合，进而将蛋白药物的抗原决定簇屏蔽，大大降低了作为异源性物质在体内被免疫系统识别的几率，也就不产生相应抗体，解除异体蛋白免疫原性，从而大大降低了蛋白药物被蛋白酶水解的机会。目前使用的蛋白药物修饰剂包含以下试剂：PEG、肝素、聚氯基酸、聚乙烯吡咯烷酮、右旋糖苷、多聚唾液酸等，其中以PEG修饰剂最为常用。已上市的PEG化的蛋白药物如PEG化的IFNα2a(商品名Pegasys，生产商Roche)，PEG化的IFNα2b(商品名PEGIntron，生产商Schering)，和PEG化的G-CSF(商品名Neulasta，生产商Amgen)等。

PEG修饰后的蛋白具有热稳定性好，体内半衰期显著延长，不易被体内蛋白酶水解，毒性减小，免疫原性与抗原性显著降低等优点，但本方法也存在许多缺点，例如,1)修饰反应工艺复杂，需要选择合适分子量的PEG修饰不同位点的游离氨基,控制修饰反应的条件,从而筛选最佳修饰方案；2)化学修饰后蛋白药物纯化困难,收率低；3)由于PEG为非单一化合物,分子量的概念是平均分子量，因此，反应终产品是一组异构体组成的混合物,对人健康的长效影响很难衡量；4)化学修饰后，封闭住了某些蛋白基团，降低了蛋白基团之间的相互联系，导致蛋白质的比活性明显下降。

1.4.2缓释剂法

缓释剂是指通过某种剂型延缓药物释放的速率，进而降低药物进入机体的吸收速率，最终取得长期的药物治疗效果。主要分为两大类：以微球为代表的聚合体给药系统，以脂质体为代表的脂类缓释系统。

微球是指将药物溶解或分散在高分子材料中形成微小球状实体，其粒径范围通常在1～250mm。把蛋白药物或多肽类药物包封于微球载体中，通过皮下给药或肌内给药，使药物缓慢释放，药物在体内的有效作用时间可长达1～3个月。用于制备缓释微球的材料主要是在进入机体后能逐渐被分解的高分子聚合物，大致可分为天然聚合物和人工合成聚合物两类。脂质体是将药物包裹于类脂质双分子层所形成的超微型球状囊泡，它作为多肽和蛋白质类药物的载体可起到保护药物活性，提高稳定性，延长半衰期和延缓释放的作用。脂质体根据其结构和所包含的双层磷脂膜层数，可分为单室脂质体和多室脂质体。两种缓释剂法已经被广泛使用，目前，已经有LHRH、hGH等多种蛋白质和多肽的缓释微球制剂上市销售。

蛋白质多肽类药物的缓释微剂法不仅大大减少了给药频率，也有效避免药物浓度的峰谷变化导致的不良作用，而且能够增加药物的稳定性和靶向性，减少药物对周围组织及非靶位组织细胞的毒副作用等。但是，该技术尚需进一步优化，不足之处包括：大量药物一次性植入体内，患者额外承担了药物突然释放的毒性风险；蛋白药物长期包裹植入体内，蛋白药物的生物活性一致性无法保障等。

1.4.3基因融合法

基因融合法是选取与人体相容性好，无毒副作用，不易引起免疫清除，分子量大且半衰期长的蛋白作为载体蛋白，将目的蛋白与其融合，利用载体蛋白分子量大的性状将目的蛋白的非活性区域折叠包裹，仅暴露出活性部位，从而保留目的蛋白的生物作用并在体内缓慢释放药物，达到延长药物半衰期的目的。

目前，关于如何在保证原有蛋白ADAMTS13-MDTCS的生物学活性的同时，有效延长ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期方面的技术，尚未见明确的报道。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种具有延长的半衰期的ADAMTS13-MDTCS融合蛋白、及其对应的核苷酸序列、载体及宿主细胞。

本发明的目的之二在于提供上述融合蛋白的制备方法。

本发明的目的之三在于提供一种治疗血栓性血小板减少性紫癜(TTP)的药物。

本发明的目的将通过以下技术方案得以实现：

发明提供了一种ADAMTS13-MDTCS融合蛋白，包含人血清白蛋白HSA和血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTS13-MDTCS，所述人血清白蛋白HSA位于所述血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTA13-MDTCS的C-端。

所述人血清白蛋白HSA与所述血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTA13-MDTCS通过连接肽连接。

连接肽是连接目标蛋白与人血清白蛋白HSA之前的部分，其保证蛋白两部分有必要的间隔，保持蛋白活性必需的空间构象,并且避免融合蛋白两部分产生相互作用。连接肽主要由甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸和苏氨酸组成，通用的连接链为甘氨酸和丝氨酸的重复序列。在构建融合蛋白时连接肽的长度对蛋白的折叠和稳定性都非常重要，一般从3～5个氨基酸到十几个氨基酸不等。

为减少蛋白作为治疗TTP药物的免疫性，并且进一步提高半衰期，优选地，所述连接肽为GGGGS。

作为一种实施方式，所述的融合蛋白包含SEQ ID NO:1所示氨基酸。

优选地，所述蛋白是在真核细胞中表达的。

发明同时提供并保护编码上述融合蛋白的多核苷酸。

作为一种可选的实施方式，所述的多核苷酸序列举例如下：SEQ ID NO:2。

发明同时提供并保护了包含上述多核苷酸的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。

发明和提供并保护了治疗血栓性血小板减少性紫癜TTP药物，其含有上述的融合蛋白。

制备该融合蛋白的方法包括，将上述多核苷酸转化宿主细胞，培养该宿主细胞并表达融合蛋白。

发明人的前期实验发现，将ADAMTS13-MDTCS进行了大肠杆菌BL21，巴斯德毕赤酵母和真核动物细胞HEK293-F的蛋白表达，研究表明只有在HEK293-F真核细胞的ADAMTS13-MDTCS表达蛋白具有生物学活性，可以进行体内和体外的VWF蛋白的剪切。但是ADAMTS13-MDTCS蛋白在小鼠体内的半衰期实验表明，ADAMTS13-MDTCS蛋白半衰期较短，均在2小时之内，与正常血浆中ADAMTS13蛋白的半衰期1-2天。

为了延长ADAMTS13-MDTCS蛋白半衰期，发明人最终选择了人血清白蛋白(humanserum albumin,HSA)作为修饰，使ADAMTS13-MDTCS的C末端与HSA的N端融合。

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是现有的常用天然载体蛋白之一。HSA是一种可溶性非糖基化的球型蛋白质，含有585个氨基酸和17对二硫键。它是血液中含量最高的单一蛋白，达40mg/mL，是人体血浆的主要成分。HSA本身就是许多内源因子和外源药物的载体，在体内有维持血液渗透压，运输营养物质和其它重要生物物质的作用。具有无免疫原性，人体相容性好。HSA理论分子量为66471.35D，是一种大分子蛋白，不易被肾小球滤过，并可抵御生物体内酶的作用，在血液中的半衰期约为14-20d左右。

大分子蛋白药物由HSA带入体内，除了保持原有治疗性蛋白质的优点以外，还使治疗性蛋白质在体内存活半衰期大大延长，使其具有长效和缓慢释放、疗效更佳、病人易于接受和注射次数减少等优点。目前HSA融合技术构建长效蛋白类药物已在多种药物研究中得到应用。加之与PEG修饰等技术相比，融合蛋白技术不需额外的化学修饰，生产工艺简单，底物均一，质量控制相对容易，在延长药物半衰期的效果及安全性上可能比PEG更为有效。

HSA融合技术具有以下优点：1)HSA与目的蛋白在胞内经蛋白翻译系统通过肽键连接，不需额外的体外处理；2)HSA是一个稳定的“惰性”蛋白，与其融合后可以提高目的蛋白的稳定性；3)HSA的表达水平高，与其融合后可以提高目的蛋白的表达水平；4)HSA融合蛋白具有比PEG修饰的蛋白药物更长的半衰期。

实际上，除了HSA融合技术之外，还有其他基因融合法用于延长蛋白药物半衰期，例如抗体Fc片段蛋白融合法。在人体血浆中，抗体IgG是半衰期最长的蛋白质，高达23d。与新生IgG转运受体FcRn的结合保证了抗体IgG在血浆中的高稳定性，这种结合可避免抗体进入溶酶体而被降解，因此，IgG Fc片段常被用于与药用蛋白连接构成融合蛋白，以提高药用蛋白在体内的半衰期，达到蛋白药物长期有效的目的。IgG Fc段融合蛋白的构建方式通常是将IgG Fc片段(铰链区-CH2-CH3)或CH片段(CH1-铰链区-CH2-CH3)的N端与药用蛋白的C端相连，以避免融合蛋白的结构对药用蛋白生物活性造成影响。Lee等(Lee TY,Tjin ThamSjin RM,Movahedi S,et al.Linking antibody Fc domain to endostatinsignificantly improves endostatin half-life and efficacy[J].Clin Cancer Res,2008,14(5):1487-1493.)将内皮抑制素与Fc片段连接后，使其在循环中的半衰期从几小时延长至几周。

然而，在研究过程中发明人采用了抗体Fc片段蛋白融合技术进行ADAMTS13-MDTCS半衰期延长的优化，但表达的融合蛋白无生物学活性。

与现有技术相比，本发明具有以下突出效果为：

本发明将ADAMTS13-MDTCS与人血清白蛋白结合，形成融合蛋白，此融合蛋白保证了原有蛋白ADAMTS13-MDTCS的生物学活性，又显著增加了ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期。先天性TTP的发病是由于ADAMTS13蛋白的缺失导致的，因此体外表达人重组ADAMTS13，输入人体作为治疗TTP的生物大分子蛋白药物意义重大。本研究组前期体外表达ADAMTS13全长蛋白，小鼠动物实验表明蛋白的半衰期较小，均在2小时以内，与其他研究数据一致，药物有效窗口期较窄，不能满足成为治疗性大分子药物的要求，因此增加ADAMTS13-MDTCS蛋白药物的动物体内半衰期，具有重要的现实意义。

本发明成功构建了ADAMTS13-MDTCS-HSA稳定表达HEK293-F细胞系；实验结果显示ADAMTS13-MDTCS-HSA融合蛋白有良好的VWF-73体外剪切活性；具有良好的VWF-多聚体体内剪切活性；且ADAMTS13-MDTCS-HSA显著提高了ADAMTS13-MDTCS蛋白的半衰期。

附图说明

图1是实施例1中重组ADAMTS13-Full-length-HSA和ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白结构示意图；

图2是实施例1中构建重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白PCR扩增示意图；

图3A是实施例2中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白HEK293-F细胞分泌表达上清SDS-PAGE检测结果图；

图3B是实施例2中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白HEK293-F细胞分泌表达上清Western Blotting分析结果图；

图3C是实施例2中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白HEK293-F细胞分泌表达上清活性检测；

图4是实施例5中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白的纯化；

图5是实施例6中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白体外(in vitro)剪切VWF多聚体活性检测；

图6是实施例7中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白半衰期的测定；

图7是实施例7中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白体内(in vivo)剪切VWF多聚体活性检测；

图8A是实施例8中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白体外(in vitro)剪切不含有抗ADAMTS13自身抗体的病人血浆VWF多聚体活性检测；

图8B是实施例8中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白体外(in vitro)剪切含有抗ADAMTS13自身抗体的病人血浆中VWF多聚体活性检测；

图9A是实施例9中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白体外(in vitro)剪切病人血浆VWF多聚体的时间效应检测；

图9B是实施例9中重组ADAMTS13-MDTCS-HSA(T-HSA)融合蛋白体外(in vitro)剪切病人血浆VWF多聚体的剂量效应检测。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

在本发明前期的工作：(1)本发明已经将ADAMTS13-MDTCS进行了大肠杆菌BL21，巴斯德毕赤酵母和真核动物细胞HEK293-F的蛋白表达，研究表明只有在HEK293-F真核细胞的ADAMTS13-MDTCS表达蛋白具有生物学活性，可以进行体内和体外的VWF蛋白的剪切；(2)为了避免动物本身ADAMTS13蛋白的背景影响，我们使用ADAMTS13基因敲除小鼠(ADAMTS13-/-)进行ADAMTS13-MDTCS-HAS融合蛋白的半衰期和体内活性实验。本发明用的小鼠为日本生物医学创新研究所疾病动物模型实验室馈赠。此类小鼠生理及生殖正常，需要进行后续的药物诱发，才能使ADAMTS13(-/-)纯合体小鼠产生TTP疾病模型。

实施例1ADAMTS13-MDTCS-HSA融合蛋白及其质粒的构建

1.1材料和方法

试剂：HEK293-Free style细胞系(Life tech)；

细胞培养试剂：高糖DMEM、Opti-MEM、293-F expression Medium、FBS、0.25％胰酶-EDTA溶液、细胞抗性筛选用抗生素G418(Life tech)；菌株：Top10(天根生化)；载体：pCEP4载体由自己保存；试剂盒：凝胶回收试剂盒；PCR纯化试剂盒，小量提取质粒试剂盒、大量无内毒素质粒提取试剂盒(天根生化)；

转染脂质体Lipofectamine 2000(Life tech)；PCR所用聚合酶(TAKARA)；限制性核酸内切酶(NEB)；所有测序由Life tech完成；Western-blot所用HSA抗体(Santa Cruz)；ADAMTS13抗体，HRP二抗(Abcam)；Ultra-15超滤管(Millipore)；Superdex纯化柱(GEhealth)。

1.2ADAMTS13-MDTCS融合表达质粒的构建

构建融合表达质粒引物序列如下：

备注：

AH-F CC为引入的保护碱基，划线部分或者aagctt为引入的Hind III酶切位点，灰色部分为Kozak序列，ATG为起始密码子；

AH-R CCG为引入的保护碱基，划线部分或者ctcgag为引入的Xho I酶切位点，TCA为终止密码子；

LK-F灰色部分为引入的linker序列，划线部分或者gcctgggtgtgg

gatgcacacaag为互补配对区域，为融合PCR做准备；

LK-R灰色部分为引入的linker序列，划线部分或者cttgtgtgcatc

ccacacccaggc为互补配对区域，为融合PCR做准备；

AH-F引物序列如序列表SEQ ID NO:3所示；

AH-R引物序列如序列表SEQ ID NO:4所示；

LK-F引物序列如序列表SEQ ID NO:5所示；

LK-R引物序列如序列表SEQ ID NO:6所示；

图1表示本发明所需ADAMTS13及其突变体的重组蛋白对应的示意图。

1.3PCR扩增融合片段

将HSA与基因的PCR产物，按照回收试剂盒推荐方法进行纯化，去除未掺入的dNTP、引物、模板DNA。取HSA纯化产物1μl(约100ng)与ADAMTS13-MDTCS纯化产物0.4μl(约30ng)混合作为模板，50μl反应体系进行PCR，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸4min；一个循环后加入引物LK-F与LK-R各1μmol/L，继续PCR，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min；50℃退火1min；72℃延伸4min；进行30个循环(见图2)。2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。

1.4PCR融合片段与pCEP4载体进行连接

分别用HindIII/XhoI进行酶切PCR融合片段与pCEP4载体，切胶纯化后，进行T4连接酶连接，TOP10转化，挑取单克隆，酶切鉴定，将酶切鉴定正确的克隆质粒，送测序进行进一步鉴定，将测序结果与SEQ ID:2序列进行Blast比对，确认克隆质粒中目的序列正确性，保存含正确质粒的菌株。

经过融合片段PCR扩增，载体连接，酶切鉴定与测序分析，获得正确的含目的序列的克隆质粒，目的序列的鉴定结果如SEQ ID:2序列所示。

实施例2ADAMTS13-MDTCS融合蛋白的瞬时表达及蛋白鉴定

a)接种细胞。转染前一天将细胞接种至10cm平皿内(尽量不要使用隔两天才长到90％的细胞，如果生长较慢，请多铺一些细胞)。转染时要求细胞汇合度为90～95％；

b)每平皿，700μl Opti-MEM Medium稀释LIP 2000 50μl(LIP体积不高于总体积1/10)，室温孵育5min；

c)每平皿，680μl Opti-MEM Medium稀释DNA 70μl(DNA体积不高于总体积1/10)；

d)将稀释好的DNA加入到稀释好的LIP2000中(1:1混合)，室温孵育20min；

e)将准备好的10cm平皿细胞，用3-5ml无菌PBS小心洗涤1次，巴斯吸管轻轻沿壁加入，以免冲起293F细胞，勿剧烈晃动(使用六孔板和PEI时要加上此步骤)；

f)将孵育好的DNA+LIP2000混合液，1.5ml/皿，直接加入有培养液的培养皿(吸出剩余培养液5ml)中(lip2000组)，轻轻混匀；作用4-5h后，吸出混有转染液的培养基，换10ml无血清293Expression Medium继续培养；培养2-3天后，收集培养基，12000rpm，30min离心去杂，30KD浓缩管浓缩10倍，PAGE分析表达蛋白，蛋白大小在200KD左右；

g)PAGE转膜条件：220mA,3h；

h)Western条件：5％脱脂奶粉封闭1h；anti-HSA单抗或anti-ADAMTS13多抗孵育1-2h；PBST洗3次，5min/次；二抗孵育1-2h；PBST洗3次，5min/次；显色ECL-HRP(Thermo,SuperSignal West Dura Chemiluminescent Substrate)。

在图3中，构建好的ADAMTS13-MDTCS HSA融合蛋白质粒转入293-F细胞后进行瞬时表达，收集浓缩后的细胞培养上清，采用SDS-PAGE(图3A),Western blot(图3B)和FRETS-VWF73荧光法(图3C)检测融合蛋白表达情况和活性，构建的融合蛋白能在细胞中正常表达并具有生物学活性。

实施例3ADAMTS13-MDTCS HSA融合蛋白稳定表达细胞株的筛选

a)接种细胞。转染前一天将细胞接种至10cm平皿内。转染时要求细胞汇合度为90～95％；

b)每平皿，700μl Opti-MEM Medium稀释LIP2000 50μl(LIP体积不高于总体积1/10)，室温孵育5min；

c)每平皿，680μl Opti-MEM Medium稀释DNA 70μl(DNA体积不高于总体积1/10)；

d)将稀释好的DNA加入到稀释好的LIP2000中(1:1混合)，室温孵育20min；

e)将准备好的10cm平皿细胞，用3-5ml无菌PBS小心洗涤1次，巴斯吸管轻轻沿壁加入，以免冲起293F细胞，勿剧烈晃动；

f)将孵育好的DNA+LIP2000混合液，1.5ml/皿，直接加入有培养液的培养皿(吸出剩余培养液5ml)中(LIP 2000组)，轻轻混匀；

g)作用4-5h后，吸出混有转染液的培养基，换10ml无血清293Expression Medium继续培养；

h)细胞转染24h后按1:10传代，并更换Hygromycin筛选培养基。针对HEK293细胞，选用浓度为200μg/mL的Hygromycin培养基来筛选细胞。筛选过程需持续l至2周，其中每天更新筛选培养基，将伴有大片的死亡细胞脱落；

i)挑取单克隆细胞：在用Hygromycin培养基筛选细胞的24孔板中，吸去培养基，用PBS缓冲液冲洗，之后用0.25％的胰酶消化。可以在倒置显微镜下直接挑取细胞单克隆。将单克隆转移至新24孔板中；

j)挑取后的细胞单克隆可以用低浓度的Hygromycin培养基(100μg/m1)维持生长。

实施例4ADAMTS13-MDTCS融合蛋白的表达

a)复苏ADAMTS13-MDTCS-HSA稳定表达细胞系，10cm平皿/管，PBS洗1次，8％FBS1640完全培养基10ml培养细胞；

b)第二天观察细胞，根据细胞生长情况，换液或传代；

c)5平皿(10cm)细胞收集，PBS洗1次，293无血清表达培养基100ml重悬，转移至250ml培养瓶中，120rpm，37度培养过夜；

d)约24h后，1000rpm,5min,收集上清，细胞100ml 293无血清表达培养基重悬，继续培养,根据细胞生长状况，可以连续收集5天；

e)将收集的血清转移至50mlEP管中，11000rpm,25min,离心去除细胞残片；

f)将上清转移至30KD的超滤管中，3000rpm,20min离心浓缩，并置为Tris-buffer(20mM)；

g)迅速转移至-80度保存，待稳定表达收集完毕后，进行第一步Q-HP纯化；

h)PAGE鉴定纯化峰，并超滤管浓缩置换Tris-buffer(20mM)进行下一步分子筛纯化；

i)分子筛纯化PAGE鉴定纯化峰；

j)超滤管浓缩并置换为PBS-buffer，-80度保存或冻干保存。

ADAMTS13-MDTCS HSA各取10μL上清应用Western blot检测蛋白表达情况。结果表明突变体的蛋白稳定表达，但每一次收集后需要马上-80度存放，否者蛋白在培养基中容易降解。

实施例5ADAMTS13-MDTCS融合蛋白的纯化

a)将收集到的无血清细胞表达培养上清，20000-30000g离心30-60min去除细胞碎片等颗粒杂质；

b)将细胞培养上清转移至15ml超滤管中(30kD)，4000g，20min/次，进行离心浓缩，并用20mM Tris-buffer进行置换；

c)打开AKTA-purifier-900系统，装好阴离子交换柱Q-HP；

d)将浓缩置换后的样品先稀释至50ml，通过Load模式上样，进行第一步的纯化；

e)采用80％A溶液(20mM Tris-bis,PH8.0)+20％B溶液(20mM Tris-bis,1M NaCl,PH8.0)洗涤杂蛋白，采用50％A溶液(20mM Tris-bis,PH8.0)+50％B溶液(20mM Tris-bis,1M NaCl,PH8.0)洗脱目的蛋白，收集并浓缩目的蛋白；

f)打开AKTA-purifier-900系统，装好凝胶过滤层析柱Surperdex 200 10/300GL；

g)将浓缩后的样品500ul注入上样环中(500ul或者1ml)，通过inject模式进行上样，进行第二步的纯化；

h)用20mM Tris-buffer进行洗脱，收集洗脱峰，并SDS-PAGE鉴定纯化峰；

i)纯化后的蛋白用20mM Tris-buffer进行置换，-80度保存或冻干保存。

图4中，无血清细胞培养表达上清经超滤管浓缩，Buffer置换后，采用AKTA系统，先在阴离子交换柱(Hitrap Q Hp)进行离子交换层析，目的蛋白的纯化条件是20％B液(20mMTris-base，1mM NaCl，PH8.0)洗涤杂蛋白，50％B液洗脱并收集目的蛋白；将前面的洗脱收集的目的蛋白进行浓缩脱盐处理后在凝胶过滤柱(Surperdex 200 10/300GL)进行凝胶过滤层析，最先出来的第一个样品峰含有本发明主要的目的蛋白。

实施例6ADAMTS13-MDTCS融合蛋白活性测定

6.1FRETS-VWF73荧光法

ADAMTS13活性测定依据VWF-73活性测定方案。将2μL加入23μL反应缓冲液(5mmol/L Bis-Tris,25mmol/L CaCl₂,0.005％Tween 20,pH 6.0)；然后与25μL 5μmol/L FRETS-VWF73反应液(25μL每孔)，一起加入不透明96孔板(Greiner,Germany)。立即在荧光动态酶标仪(Spectra Max M2microplate reader,Bio-Tek)上检测，485nm激发波，528nm发射波，检测条件30℃，每2min读数一次，测定60分钟；数据分析。

6.2琼脂糖电泳VWF抗体法

a)称取一定量的SeaKem HGT agarose(VWF分离专用琼脂糖)，配制1-2％的琼脂糖电泳胶，室温放置30分钟以上凝固；

b)将含有VWF多聚体的样品稀释到一定浓度。如正常人血浆样品稀释20-100倍，加入上样缓冲液后在60度水浴锅中温浴30分钟；

c)10000rpm高速离心样品5分钟，将上清留与后期电泳；

d)将凝固的琼脂糖胶拔开梳子后放入电泳缓冲液中，待缓冲液完全浸过胶面，在相应的孔里每孔加入5-20ul的样品，接好电源线，15mA电泳过夜；

e)电泳完后取出凝胶，凝胶用5％的醋酸和50％异丙醇固定1小时后，用水清洗3次；

f)洗净后的凝胶放入含有5％BSA的兔抗人VWF抗体反应液中，凝胶需完全浸在反应液中，待凝胶与抗体反应4小时后，用PBS浸洗4-5次，每次1小时；

g)凝胶放入含有5％BSA的带荧光标记的二抗反应液中，凝胶需完全浸在反应液中，待凝胶与抗体反应4小时后，用PBS浸洗4-5次，每次1小时；

h)将凝胶放置在LI-COROdyssey红外荧光扫描成像系统扫描，分析检测结果。

在图5结果中，ADAMTS13-MDTCS HSA能很好的剪切正常人血浆中VWF多聚体，并且随着体外作用时间的增长，超大VWF多聚体有明显的降低。

实施例7ADAMTS13-MDTCS融合蛋白的小鼠体内半衰期测定

约12周小鼠8只，称重；对每只小鼠采血，作为空白对照；计算重组蛋白活性单位，给药量标准是达到小鼠正常ADAMTS13量的10倍；按照7ml血液/100g计算剂量，眼底静脉血丛给药；从另外一只眼睛静脉血丛采集血样45ul，加入至预含有5ul的3.8％柠檬酸钠的EP管中；8000rpm，5min迅速离心；转移血浆至新的EP管中；-80度保存，测定剪切VWF73活性；体外剪切活性的测定：2μL样本+23μL Tris-Bis buffer+1μL VWF73+24μL Tris-Bis buffer。

在图6中，准备两组Adamts13-knockout小鼠，通过眼底静脉血丛给药方式分别向两组小鼠注射相同活性剂量的ADAMTS13-MDTCS和ADAMTS13-MDTCS HSA，之后在不同的时间点分别采集小鼠血液并制备血清，通过体外剪切FRETS-VWF73，测定不同时间点小鼠体内ADAMTS13-MDTCS和ADAMTS13-MDTCS HAS的活性。图中显示的AMTS13-MDTCS，半衰期是4h；显示的是ADAMTS13-MDTCS HSA，半衰期是15h，对比HSA融合前，提高了将近4倍。

在图7中，注射重组蛋白ADAMTS13-MDTCS的两只小鼠中，有1只小鼠在50分钟取样的血浆样品的超大VWF多聚体明显降低，而在注射重组ADAMTS13-MDTCS-HSA的两只小鼠中，在25分钟和50分钟取样的血浆样品中的超大VWF多聚体均有明显降低。

实施例8疑似TTP病人血浆样品ADMATS13活性测定及自身抗体的测定

a)将混合的正常人血浆样品作为对照(活性100％)，取不同浓度的对照样品与FRETS-VWF73反应，取得的结果作成标准曲线，将病人样品的检测荧光结果放入此标准曲线中获得病人血浆样品中ADAMTS13的酶切相对活性；

b)用ELISA试剂盒测定病人血浆样品ADAMTS13自身抗体的相对含量，具体操作参考试剂盒说明书。

图8A中，严重缺乏ADAMTS13活性(<5％)且不含有自身抗体的13个病人血浆样品中超大VWF多聚体全部可以不同程度地被融合ADAMTS13-MDTCS-HSA切割。其中(-)表示为未剪切样品，(+)表示为剪切样品。

图8B中，严重缺乏ADAMTS13活性(<5％)且含有自身抗体的15个病人血浆样品中超大VWF多聚体全部可以不同程度地被融合ADAMTS13-MDTCS-HSA切割。其中(-)表示为未剪切样品，(+)表示为剪切样品。

实施例9ADAMTS13-MDTCS融合蛋白剪切疑似TTP病人血浆样品的剂量与时间效应

1)采用FRETS-VWF73荧光法测定ADAMTS13-MDTCS融合蛋白和ADAMTS13-FL活性并进行活性定量。

2)将正常人血浆样品(20份)，实施例8中不含ADAMTS13自身抗体TTP疑似病人血浆样品，含ADAMTS13自身抗体疑似病人血浆样品分别进行混合。

3)取相同活性剂量的ADAMTS13-MDTCS融合蛋白和ADAMTS13-FL，分别与上面的三种混合的血浆样品进行孵育，设置几个不同的孵育时间(30min，60min，90min，120min)，通过琼脂糖电泳VWF抗体法检测蛋白的剪切活性。

4)取不同活性剂量的ADAMTS13-MDTCS融合蛋白和ADAMTS13-FL，分别与上面的三种混合的血浆样品孵育2h，通过琼脂糖电泳VWF抗体法检测蛋白的剪切活性。

图9A中，ADAMTS13-MDTCS融合蛋白能很好地剪切三种不同的混合血浆中的VWF多聚体，随着时间的延长，超大VWF多聚体有明显的降低，基本可达到ADAMTS13-FL相同的效果。正常人血浆中VWF多聚体孵育90min基本能降到最低，病人血浆孵育时间则要适当延长至120min。Nomal，代表正常人血浆，Patient1，不含ADAMTS13自身抗体的TTP病人血浆，Patient2，含ADAMTS13自身抗体的TTP病人血浆，(-)表示为未剪切样品，(+)表示为剪切样品。

图9B中，8U活性单位以上浓度ADAMTS13-MDTCS融合蛋白能很好地剪切三种不同的混合血浆中的VWF多聚体。Nomal，代表正常人血浆，Patient1，不含ADAMTS13自身抗体的TTP病人血浆，Patient2，含ADAMTS13自身抗体的TTP病人血浆，(-)表示为未剪切样品，(+)表示为剪切样品。

本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种ADAMTS13-MDTCS融合蛋白，其特征在于，包含人血清白蛋白HSA和血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTS13-MDTCS，所述人血清白蛋白HSA位于所述血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTA13-MDTCS的C-端；

所述人血清白蛋白HSA与所述血管性血友病因子裂解酶的突变体ADAMTA13-MDTCS通过连接肽连接；

所述连接肽为GGGGS；

所述融合蛋白的编码序列如多核苷酸SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，包含SEQ ID NO:1所示氨基酸。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白是在真核细胞中表达的。

4.编码权利要求1-3任一项所述的融合蛋白的多核苷酸SEQ ID NO:2。

5.一种载体，其特征在于，包含如权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，包含如权利要求5所述的载体。

7.一种治疗血栓性血小板减少性紫癜TTP药物，其特征在于，含有如权利要求1-3任一所述的蛋白。

8.一种制备融合蛋白的方法，其特征在于，用权利要求4所述的多核苷酸转化宿主细胞，培养该宿主细胞并表达融合蛋白。

Images