ES2793325T3 - Factor de coagulación VIIa modificado con semivida prolongada - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende al menos un polipéptido de Factor VII o Factor VIIa o un fragmento o variante del mismo, fusionado con albúmina, en el que al menos uno de tales polipéptidos de Factor VII o Factor VIIa está localizado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y en el que la proteína de fusión tiene actividad biológica de Factor VII/IIa y en el que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina.

Description

DESCRIPCIÓN
Factor de coagulación VIIa modificado con semivida prolongada
Campo de la invención:
La presente invención se refiere al campo de polipéptidos de Factor VII (FVII) y Factor VlIa (FVIIa) enlazados con albúmina. Más específicamente, la invención se refiere a secuencias de ADNc que codifican el Factor VII y el Factor VlIa humanos y derivados, fusionados genéticamente con un ADNc que codifica seroalbúmina humana, en los que al menos uno de tales polipéptidos de Factor VII o Factor VlIa está localizado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y en los que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o del Factor VlIa, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina, y a procedimientos para la preparación de tales proteínas recombinantes y sus derivados. La invención también incluye un vector de transferencia para uso en terapia génica humana que comprende tales secuencias de ADN modificadas.
Antecedentes de la invención:
Factor VII y Factor VlIa
La hemofilia A es un trastorno hemorrágico hereditario. Es el resultado de una carencia del Factor VIII de la coagulación sanguínea, ligada al cromosoma X y afecta casi exclusivamente a varones con una incidencia de entre uno y dos individuos por cada 10.000. El defecto del cromosoma X es transmitido por mujeres portadoras no siendo ellas mismas hemofílicas. La manifestación clínica de la hemofilia A es un aumento de la tendencia a la hemorragia. Antes de la introducción del tratamiento con concentrados de Factor VIII, la esperanza media de vida de una persona con hemofilia grave era menos de 20 años. El uso de concentrados de Factor VIII procedentes del plasma y posteriormente de formas recombinantes del Factor VIII, ha mejorado considerablemente la situación de los pacientes con hemofilia, incrementando en gran medida la esperanza media de vida, proporcionando a la mayoría de ellos la posibilidad de tener una vida más o menos normal. La hemofilia B que es 5 veces menos prevalente que la hemofilia A está causada por un Factor IX no funcional o ausente y se trata con concentrados de Factor IX procedentes del plasma o una forma recombinante de Factor IX. Tanto en la hemofilia A como en la hemofilia B, el problema médico más grave en el tratamiento de la enfermedad es la generación de aloanticuerpos contra los factores de sustitución. Hasta un 30 % de todos los pacientes con hemofilia A desarrollan anticuerpos contra el Factor VIII. Los anticuerpos contra el Factor IX se producen en menor medida pero con consecuencias más graves, ya que son menos susceptibles a una terapia de inducción de tolerancia inmune.
El modelo actual de coagulación establece que el agente fisiológico desencadenante de la coagulación es la formación de un complejo entre el Factor tisular (FT) y el Factor VIIa (FVIIa) en la superficie de células que expresan FT, que se encuentran normalmente fuera del sistema vascular. Esto conduce a la activación del Factor IX y el Factor X que generan a la larga cierta cantidad de trombina. En un bucle de retroalimentación positiva, la trombina activa el Factor VIII y el Factor IX, la denominada vía "intrínseca" de la cascada de coagulación de la sangre, amplificando de este modo la generación de Factor Xa, que es necesario para la generación de una ráfaga de trombina completa para lograr la hemostasia completa. Se mostró que mediante la administración de concentraciones suprafisiológicas de Factor VlIa, se consigue una hemostasia evitando la necesidad de Factor VlIIa y Factor IXa. La clonación del ADNc del Factor VII (documento US 4.784.950) hizo posible el desarrollo de Factor VII activado como agente farmacéutico. El Factor VIIa se administró con éxito por primera vez en 1988. Desde entonces el número de indicaciones de Factor VlIa ha crecido de manera constante mostrando que tiene potencial para convertirse en un agente hemostático universal para detener el sangrado (Erhardtsen, 2002). Sin embargo, la corta semivida del Factor VlIa de aproximadamente 2 horas, está limitando su aplicación.
FVII es una glicoproteína de cadena única con un peso molecular de aproximadamente 50 kDa, que es secretada por las células hepáticas en el torrente sanguíneo como un zimógeno inactivo de 406 aminoácidos. Contiene 10 residuos de ácido Y-carboxi-glutámico (posiciones 6, 7, 14, 16, 19, 20, 25, 26, 29 y 35) localizados en el dominio Gla N-terminal de la proteína. Los residuos Gla requieren vitamina K para su biosíntesis. Dos dominios de factor de crecimiento epidérmico seguidos por un dominio de proteasa de serina de tipo tripsina, se encuentran en posición C-terminal con respecto al dominio Gla. Otras modificaciones postraduccionales de FVII incluyen la hidroxilación (Asp 63), glicosilación de tipo N (Asn145 y Asn322) así como de tipo O (Ser52 y Ser60).
FVII se convierte en su forma activa Factor VlIa mediante proteólisis del enlace peptídico único en Arg152-Ile153 que conduce a la formación de dos cadenas polipeptídicas, una cadena ligera N-terminal (24 kDa) y una cadena pesada C-terminal (28 kDa), que se mantienen unidas por un puente disulfuro. En contraste con otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K, no se ha descrito para FVII un péptido de activación, que se escinde durante la activación de estos otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K. El sitio de escisión Arg152-Ile153 y algunos aminoácidos aguas abajo muestran homología con el sitio de escisión para la activación de otros polipéptidos dependientes de vitamina K.
Para la consecución de la conformación activa del Factor VlIa, es esencial la formación de un puente salino después de la escisión para activación entre Ile153 y Asp343. La escisión para activación del Factor VII se puede conseguir in vitro con el Factor Xa, Factor XIIa, Factor IXa, Factor VIIa, proteasa activadora del factor siete (FSAP) y trombina.
Mollerup y col. (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505) informaron que también tiene lugar alguna escisión en la cadena pesada en Arg290 y/o Arg315.
El Factor VII está presente en el plasma en una concentración de 500 ng/ml. Un 1 %, por ejemplo 5 ng/ml de Factor VII está presente como Factor VlIa. La semivida plasmática del Factor VII se encontró que era de aproximadamente 4 horas y la del Factor VlIa de aproximadamente 2 horas. Aunque la semivida del Factor VIIa de 2 horas es comparativamente larga para un factor de coagulación activado (que para otros factores de coagulación activados es más del orden de minutos, debido a una inhibición irreversible con serpinas como antitrombina III), sin embargo, esto constituye un grave inconveniente para el uso terapéutico del Factor VlIa, puesto que conlleva la necesidad de múltiples inyecciones i.v. o una infusión continua para conseguir la hemostasia. Esto da lugar a un tratamiento muy costoso e incomodidad para el paciente. Hasta ahora no está disponible comercialmente ninguna preparación farmacéutica de un Factor VlIa con una semivida plasmática mejorada, ni se ha publicado ningún dato que muestre variantes de FVII/FVIIa con una semivida prolongada in vivo. Como el Factor VII/IIa tiene el potencial de poder ser utilizado como un agente hemostático universal, todavía existe una gran necesidad médica de desarrollar formas del Factor VIIa que tengan una semivida funcional in vivo más larga.
Ballance y col. (documento WO 01/79271) describe polipéptidos de fusión de múltiples proteínas terapéuticas diferentes o variantes y/o fragmentos de dichas proteínas terapéuticas que, cuando se fusionan con seroalbúmina humana o variantes y/o fragmentos de dicha albúmina, tendrán probablemente una semivida funcional incrementada in vivo y una vida útil prolongada. Se describen largas listas de potenciales parejas de fusión sin mostrar con datos experimentales para casi la totalidad de estas proteínas que los respectivos polipéptidos fusionados con albúmina, realmente conservan la actividad biológica de la pareja de fusión proteica terapéutica y tienen propiedades mejoradas. Según el documento WO 01/79271, además, cada miembro de la lista de proteínas terapéuticas se puede fusionar con orientaciones muy diferentes con la albúmina, por ejemplo, dos moléculas de la proteína terapéutica fusionada una con el extremo N-terminal y la otra con el extremo C-terminal de la albúmina, o una molécula de la proteína terapéutica fusionada con el extremo N-terminal o C-terminal de la albúmina, o también múltiples regiones de cada proteína fusionadas con múltiples regiones de la otra. Entre las múltiples proteínas terapéuticas enumeradas en el documento WO 01/79271 como potenciales parejas fusionadas con albúmina, están el Factor IX y FVII/FVIIa aunque no se proporcionan evidencias experimentales de principio para ninguna de ambas proteínas. Ballance y col. tampoco desvelan ni hacen alusión al uso de un enlazador que comprende al menos 7 aminoácidos de longitud y unidades de repetición que comprenden glicina y serina.
Pipe (Pipe SW (2005) J. Thromb. Haemost 3:1692-1701) analizan el uso de estrategias de bioingeniería para mejorar las propiedades de los factores de coagulación recombinantes. Pipe, sin embargo, no desvela la posibilidad de utilizar proteínas de fusión de albúmina, o algún otro polipéptido, para mejorar la semivida in vivo de los factores de coagulación. El documento US 2005/147618 se refiere a una proteína quimérica que comprende al menos un factor de coagulación y al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina. El documento US 2005/147618 no desvela una proteína quimérica que comprende un factor de coagulación y un resto de albúmina.
Sheffield expresó un polipéptido fusionado de albúmina y Factor IX (un factor de protrombina que consistía en 415 aminoácidos) y mostró en experimentos farmacocinéticos que el comportamiento de aclaramiento del polipéptido fusionado de albúmina y Factor IX en conejos se parecía más al del Factor IX que al de la albúmina, mostrando solo un ligero aumento de la semivida terminal (menos de dos veces) (Sheffield WP y col. (2004) Br. J. Haematol. 126:565-573).
En vista de los resultados de Sheffield y debido a la alta homología entre los Factores IX y VII (ambos son factores de protrombina dependientes de vitamina K) y su tamaño comparable, un experto en la técnica asumiría que tampoco el Factor VII se beneficiaría de una fusión con albúmina en términos de semivida funcional in vivo.
El problema técnico subyacente de la presente invención era por tanto desarrollar proteínas de fusión funcionales FVIIa-albúmina, que conservaran la actividad biológica y mostraran un aumento de la semivida funcional in vivo.
En este sentido, la actividad biológica de un polipéptido de Factor VII/VIIa se refiere a su capacidad para activar los Factores de coagulación IX y X en presencia de factor tisular después de que el mismo haya sido activado.
La semivida plasmática funcional in vivo se refiere a la semivida de la actividad biológica del polipéptido de fusión Factor VII/IIa una vez que se inyecta en el plasma. El plasma es preferentemente plasma humano.
Los inventores han descubierto que los polipéptidos enlazados con albúmina que comprenden al menos un polipéptido de Factor VII o de Factor VIIa o un fragmento o una variante de los mismos, fusionado con albúmina, o un fragmento o una variante de la misma, en los que al menos una molécula de Factor VII o de Factor VIIa se encuentra en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, están dando lugar a polipéptidos de fusión con un resto de Factor VII/Factor VIIa biológicamente activo.
Un aspecto de la invención es, por lo tanto, proteínas de fusión biológicamente activas en las que polipéptidos del Factor VII/IIa están fusionados con el extremo N-terminal de seroalbúmina humana, en los que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o del Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de la albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina. Las proteínas de fusión muestran al menos 25 %, preferentemente más de 40 %, incluso más preferentemente más de 70 % y lo más preferentemente más de 90 % de la actividad específica y molar del Factor VII/VIIa de tipo silvestre.
Además, sorprendentemente se ha encontrado que en contraste con fusiones del Factor IX con el extremo N-terminal de seroalbúmina humana, según lo publicado por Sheffield, las fusiones de albúmina y Factor VII/IIa con el extremo N-terminal de la seroalbúmina humana, condujeron a proteínas de fusión de Factor VII/FVIIa, que no solo conservaban la actividad biológica de Factor VII/FVIIa, sino que también presentaban una prolongación significativa de la semivida plasmática funcional del Factor VII/IIa in vivo.
La expresión de estructuras artificiales fusionadas con albúmina con un resto deseado de FVII/FVIIa en el extremo C-terminal de la albúmina, no dio resultado porque las proteínas fusionadas con albúmina expresadas no se secretaban como moléculas intactas. Después de la transición a través de la membrana celular, se observó una escisión en una molécula madura de FVII/FVIIa, la cual debido a una gama-carboxilación defectuosa, tenía una actividad específica y molar reducida, y un resto de albúmina con el polipéptido FVII fijado a su extremo C-terminal. Por tanto, se observó que, en contraste con la descripción de Ballance y col., solo una fusión del resto FVII/FVIIa con el extremo N-terminal de la seroalbúmina humana da como resultado una proteína de fusión con las propiedades biológicas deseadas, respectivamente la conservación de la actividad biológica de FVII/FVIIa y una semivida plasmática incrementada.
Un aspecto adicional de la invención es por lo tanto proteínas de fusión biológicamente activas en las que los polipéptidos del Factor VII/IIa están fusionados con el extremo N-terminal de la albúmina, lo que muestra una prolongación significativa de la semivida plasmática funcional, en comparación con el Factor VII/VIIa no fusionado. En realizaciones preferidas, los polipéptidos de fusión FVII/FVIIa y albúmina de la invención que comprenden un polipéptido de FVII/FVIIa, tienen una semivida funcional in vivo prolongada o de mayor duración o un aumento de la actividad terapéutica, en comparación con la semivida in vivo o la actividad terapéutica de FVII/FVIIa no fusionado.
Un aspecto de la invención es por lo tanto FVII/FVIIa fusionados con el extremo N-terminal de la albúmina lo que prolonga la semivida plasmática en comparación con FVII/FVIIa no fusionados, en al menos un 100%, preferentemente más de 200 %, incluso más preferentemente más de 500 %, más preferentemente más de 1000 %.
En un aspecto adicional sorprendente de la presente invención, los inventores descubren que polipéptidos de fusión FVII/FVIIa y albúmina sin un enlazador, mostraban una actividad biológica significativamente reducida, mientras que polipéptidos de fusión FVII/FVIIa y albúmina en el que los restos de FVII/FVIIa están separados de la albúmina por un enlazador, muestran un aumento de la actividad biológica de FVII/IIa que depende de la longitud del enlazador. La porción peptídica del Factor VII o Factor VIIa se acopla con la porción de albúmina a través de un enlazador peptídico, permitiendo de este modo que la molécula de fusión adopte una conformación que permite una actividad específica y molar más alta en comparación con una molécula de fusión sin tal secuencia enlazadora.
Por lo tanto un aspecto adicional de la invención son polipéptidos de fusión Factor VII/IIa y albúmina que comprenden un péptido enlazador entre el resto de Factor VII/IIa y el extremo N-terminal de la albúmina, los cuales tienen una actividad biológica incrementada de Factor VII/IIa, por ejemplo, medida como actividad específica y molar, en comparación con proteínas de fusión Factor VII/IIa sin tales enlazadores, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina. El aumento de la actividad específica y molar de las proteínas de fusión en las que el resto del Factor VII/IIa está fusionado con el extremo N-terminal de la albúmina a través de un enlazador peptídico, en comparación con proteínas de fusión correspondientes sin un enlazador de este tipo, es de al menos 25 %, preferentemente al menos 50 % y más preferentemente al menos el 100 %. Estos polipéptidos de fusión Factor VII/IIa y albúmina que son portadores de enlazador también presentan una semivida funcional incrementada in vivo, en comparación con FVIIa de tipo silvestre. Sin embargo, enlazadores químicos o sistemas de enlazador tales como, sin limitación, avidina-biotina funcionarán de forma similar, siempre y cuando se introduzcan distancias comparables entre el resto del Factor VII/FVIIa y el resto de albúmina. A continuación, la expresión "péptido enlazador" o similares incluirán otros medios enlazadores funcionales de este tipo, en caso adecuado.
La invención incluye polipéptidos terapéuticos de Factor VII/IIa enlazados con el extremo N-terminal de la albúmina y en los que la proteína de fusión tiene una actividad biológica de Factor VII/IIa y en los que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina, composiciones, composiciones farmacéuticas, formulaciones y kits. La invención también incluye el uso de dichos polipéptidos terapéuticos enlazados con albúmina en ciertas indicaciones médicas. La invención también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos enlazados con albúmina de la invención, así como vectores que contienen estos ácidos nucleicos, células hospedadoras transformadas con estos ácidos nucleicos y vectores, y procedimientos para preparar los polipéptidos enlazados con albúmina de la invención empleando estos ácidos nucleicos, vectores y/o las células hospedadoras.
Otro objeto de la invención es proporcionar un procedimiento para tratar pacientes con trastornos de la coagulación. El procedimiento comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz del polipéptido de FVII/FVIIa enlazado con albúmina fusionado con albúmina, en el que al menos uno de tales polipéptidos del Factor VII o Factor VIIa está localizado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y en la que la proteína de fusión tiene actividad biológica de Factor VN/IIa y en la que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina.
Otro objeto de la invención es proporcionar una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido de Factor VN/IIa enlazado con albúmina que comprende un péptido de Factor VII o Factor VIIa en los que al menos uno de tales polipéptidos del Factor VII o Factor VIIa está localizado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y en la que la proteína de fusión tiene una actividad biológica de Factor VII/IIa y en los que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina, así como un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de este tipo. Dicha secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión se encuentra en el extremo 3' de una secuencia de ácido nucleico que codifica un propéptido que media en la carboxilación gamma de la parte fusionada del Factor VII/IIa.
La invención también proporciona un procedimiento para la preparación de un polipéptido de Factor VII/FVIIa enlazado con albúmina que comprende un Factor VII o Factor VlIa y albúmina, en los que al menos uno de tales polipéptidos de Factor VII o Factor VlIa está localizado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y en la que la proteína de fusión tiene actividad biológica de Factor VII/IIa y en la que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina, en el que el procedimiento comprende:
(a) proporcionar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de Factor VII/IIa enlazado con albúmina que se puede expresar en una célula de mamífero;
(b) expresar el ácido nucleico en el organismo para formar un polipéptido de Factor VII/IIa enlazado con albúmina; y
(c) purificar el polipéptido de Factor VII/IIa enlazado con albúmina.
En un aspecto, la presente invención se refiere a polipéptidos fusionados con albúmina y a procedimientos para tratar, prevenir o mejorar enfermedades o trastornos. Tal y como se usa en este documento, "polipéptido de fusión Factor VII/IIa y albúmina" se refiere a un polipéptido formado por la fusión de al menos una molécula de Factor VII/IIa (o un fragmento o variante del mismo) con el extremo N-terminal de al menos una molécula de albúmina (o un fragmento o variante de la misma), estando opcionalmente separados ambos restos a través de un enlazador peptídico, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina.
Según el documento WO 01/79271 un polipéptido fusionado con albúmina que comprende FVII/FVIIa se puede utilizar como un agente terapéutico en las indicaciones de "trastornos de sangrado", "hemofilia A y B", "trastornos hepáticos" y "episodios hemorrágicos relacionados con cirugía".
Otro aspecto de la invención es que un polipéptido fusionado con albúmina que comprende FVII/FVIIa se puede emplear también terapéuticamente en otras indicaciones. Las indicaciones más preferidas son "episodios hemorrágicos y cirugía en pacientes con hemofilia heredada o adquirida con inhibidores de Factores de la coagulación (FVIII o FIX)", "reversión de déficits de la hemostasia desarrollados como consecuencia de tratamientos con fármacos tales como fármacos antiplaquetarios o fármacos anticoagulantes", "mejora de la hemostasia secundaria", "déficits de la hemostasia desarrollados durante infecciones o durante enfermedades tales como la carencia de vitamina K o enfermedad hepática grave", "resección hepática", "déficits de la hemostasia desarrollados como consecuencia de mordeduras de serpientes", "hemorragias gastrointestinales", "trauma", "consecuencias de una transfusión masiva (coagulopatía dilucional)", "carencias de factores de coagulación distintos de FVIII y FIX", "VWD", "carencia de FI", "carencia de FV", "carencia de FVII", "carencia de FX", "carencia de FXIII", "SUH", "enfermedades plaquetarias heredadas o adquiridas y trastornos como trombocitopenia, ITP, TTP, síndrome de HELLP, síndrome de Bernard-Soulier, trombastenia de Glanzmann, “HIT”, "síndrome de Chediak-Higahi", "síndrome de Hermansky-Pudlak", "síndrome de Rendu-Osler", "púrpura de Henoch-Schonlein" y "curación de heridas".
Descripción detallada de la invención:
Es un objeto de la presente invención proporcionar Factor VII humano y Factor VIIa humano fusionados con el extremo N-terminal de albúmina humana, en los que la proteína de fusión tiene actividad biológica de Factor VII/IIa y en los que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa, en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de la albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina con una semivida funcional in vivo prolongada, en comparación con el Factor VII humano y el Factor VIIa humano. Otro objeto de la invención es proporcionar Factor VII humano y Factor VlIa humano fusionados con el extremo N-terminal de albúmina humana, en los que la proteína de fusión tiene actividad biológica de Factor VII/IIa y en los que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina con actividad específica y molar incrementada.
Las expresiones, seroalbúmina humana (SAH) y albúmina humana (AH) se utilizan indistintamente en este documento. Los términos "albúmina" y "seroalbúmina" son más amplios, e incluyen seroalbúmina humana (y fragmentos y variantes de la misma), así como albúmina de otras especies (y fragmentos y variantes de las mismas). En lugar de la albúmina también se pueden utilizar otras proteínas similares a la albúmina, tales como, sin limitación, alfafetoproteína humana (como se describe en el documento WO 2005/024044), así como sus fragmentos funcionales o variantes.
Tal como se usa en el presente documento, "albúmina" se refiere en conjunto a un polipéptido o a una secuencia de aminoácidos de albúmina, o a un fragmento o una variante de albúmina, que tiene una o varias actividades funcionales (por ejemplo, actividades biológicas) de la albúmina. En particular, "albúmina" se refiere a albúmina humana o a fragmentos de la misma, especialmente la forma madura de la albúmina humana, como se muestra en SEQ ID NO: 22 en el presente documento, o a albúmina de otros vertebrados o a fragmentos de la misma, o a análogos o variantes de estas moléculas o fragmentos de las mismas.
La porción de albúmina de los polipéptidos enlazados con albúmina puede comprender la secuencia de longitud completa de la AH, tal y como se ha descrito anteriormente, o puede incluir uno o varios fragmentos de la misma que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Tales fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o más aminoácidos contiguos procedentes de la secuencia de AH o pueden incluir parte o la totalidad de los dominios de AH.
La porción de albúmina de los polipéptidos enlazados con albúmina de la invención puede ser una variante de AH normal. La porción proteica del Factor VII de los polipéptidos enlazados con albúmina de la invención también pueden ser variantes de los polipéptidos del Factor VII, tal y como se describe en el presente documento. El término "variantes" incluye inserciones, deleciones y sustituciones, ya sean conservadoras o no conservadoras, en las que tales cambios no alteran sustancialmente el sitio activo o el dominio activo que proporciona las actividades terapéuticas de los polipéptidos del Factor VII.
En particular, los polipéptidos enlazados con albúmina de la invención pueden incluir variantes polimórficas de origen natural de albúmina humana y fragmentos de albúmina humana. La albúmina se puede obtener a partir de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, por ejemplo, ser humano, vaca, oveja o cerdo. Las albúminas de animales no mamíferos incluyen, pero sin limitación, gallina y salmón. La porción de albúmina del polipéptido enlazado con albúmina puede ser de un animal diferente que la porción de FVII/FVIIa.
En términos generales, un fragmento de albúmina o una variante tendrá una longitud de al menos 20, preferentemente al menos 40, más preferentemente más de 70 aminoácidos. La variante de albúmina puede consistir preferentemente en, o puede comprender alternativamente, al menos un dominio completo de la albúmina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo, los dominios 1 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO: 22), 2 (aminoácidos 195-387 de SEQ ID NO: 22), 3 (aminoácidos 388-585 de SEQ ID NO: 22), 1 2 (1-387 de SEQ ID NO: 22), 2 3 (195-585 de SEQ ID NO: 22) o 1 3 (aminoácidos 1-194 de SEQ ID NO: 22 aminoácidos 388-585 de Se Q ID n O: 22). Cada dominio se compone de dos subdominios homólogos, a saber, 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con regiones enlazadoras flexibles entre los subdominios que comprende los residuos Lys106 a Glu119, Glu292 a Val315 y Glu492 a Ala511.
La porción de albúmina de un polipéptido fusionado con albúmina de la invención puede comprender al menos un subdominio o un dominio de AH o modificaciones conservadoras del mismo.
La invención se refiere a un polipéptido de Factor VII o Factor VIIa modificado, que comprende unir el polipéptido del Factor VII o del Factor VIIa con el extremo N-terminal de un polipéptido de albúmina, en la que la proteína de fusión tiene actividad biológica de Factor VII/IIa y en la que un enlazador peptídico separa el resto de Factor VII o de Factor VlIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina, de tal manera que el polipéptido modificado de Factor VII o de Factor VlIa tiene una semivida funcional incrementada in vivo, en comparación con el polipéptido de Factor VII o de Factor VlIa que no está enlazado con albúmina, o de modo que la actividad específica y molar de Factor VII/VIIa fusionado con albúmina con un enlazador peptídico intercalado, es superior que la actividad específica y molar de FVII/FVIIa fusionado con albúmina sin un enlazador peptídico intercalado.
El “Factor VII/VIIa” tal como se utiliza en esta solicitud significa un polipéptido terapéutico que consiste ya sea en la forma no activada (Factor VII) o la forma activada (Factor VIIa) o en mezclas de las mismas. "Factor VII/VIIa" bajo la definición anterior, incluye polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos del Factor VII/VIIa humano natural. También incluye polipéptidos con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N-terminal o C-terminal modificado que incluye deleciones o adiciones de aminoácidos terminales, siempre que esos polipéptidos conserven sustancialmente la actividad biológica de Factor VIIa. "Factor VII" bajo la definición anterior también incluye variaciones alélicas naturales que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. "Factor VII" bajo la definición anterior incluye además variantes de FVII/FVIIa. Dichas variantes difieren en uno o varios residuos de aminoácidos de la secuencia de tipo silvestre. Ejemplos de tales diferencias pueden incluir el truncamiento del extremo N-terminal y/o C-terminal mediante uno o varios residuos de aminoácido (por ejemplo, de 1 a 10 residuos de aminoácidos), o la adición de uno o varios residuos extra en el extremo N-terminal y/o C-terminal, así como sustituciones conservadoras de aminoácidos, es decir, sustituciones realizadas dentro de grupos de aminoácidos con características similares, por ejemplo (1) aminoácidos pequeños, (2) aminoácidos ácidos, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos básicos, (5) aminoácidos hidrófobos y (6) aminoácidos aromáticos. Ejemplos de tales sustituciones conservadoras se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 1
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Las proteínas de fusión muestran al menos 25 %, preferentemente más de 40 %, incluso más preferentemente más de 70 % y lo más preferentemente más de 90 % de la actividad específica y molar del Factor VII/IIa de tipo silvestre no fusionado o del fragmento FVII/FVIIa respectivo o una variante del mismo.
El polipéptido FVII/VIIa de la invención unido a través de un enlazador peptídico intercalado, con el extremo N-terminal de la albúmina, tiene una actividad específica y molar incrementada en comparación con la actividad específica y molar de una fusión homóloga de Factor VII/IIa y albúmina sin un enlazador peptídico intercalado. El aumento de la actividad específica y molar del polipéptido Factor VII/IIa enlazado con albúmina de la invención, en comparación con la actividad específica y molar de una fusión de Factor VII/IIa y albúmina sin un enlazador peptídico intercalado, es de al menos 25 %, preferentemente al menos 50 %, más preferentemente al menos 100 % y más preferentemente al menos 200 %. La actividad del Factor VII/IIa es la capacidad para convertir el sustrato Factor X en Factor Xa activo. La actividad de FVIIa de un polipéptido Factor VII/IIa enlazado con albúmina, se puede medir preferentemente utilizando STACLOT®. La actividad específica y molar, tal y como se usa en esta invención significa: Actividad tal y como se mide en un ensayo STACLOT® después de la activación de la proteína de fusión FVII enlazado con albúmina en Unidades Internacionales (UI) por 100 UI de antígeno de Factor VII/IIa, medido con ELISA.
Los polipéptidos de FVII/FVIIa enlazados con albúmina de la invención tienen una actividad específica y molar al menos 25 % superior en comparación con la fusión Factor VII/VIIa y albúmina sin enlazador peptídico intercalado y muestran una semivida funcional in vivo incrementada en comparación con la forma no ligada del polipéptido Factor VII o Factor VIIa. La semivida funcional in vivo se puede determinar tal y como se muestra en Lindley y col. (Pharmacokinetics and pharmacodynamics of recombinant Factor VlIa, Clin. Pharmacol Ther. (1994) 55:638-648)
Los polipéptidos FVII/FVIIa enlazados con albúmina de la invención tienen una actividad específica y molar al menos 25 % superior en comparación con las proteínas de fusión Factor VII/VIIa y albúmina sin enlazador peptídico intercalado y su semivida funcional in vivo generalmente se incrementa al menos 100 %, preferentemente al menos 200 %, aún más preferentemente al menos 500 %, en comparación con la forma no ligada del polipéptido de Factor VII o Factor VIIa.
La semivida funcional in vivo de la forma de tipo silvestre del Factor VII humano es de aproximadamente 4 horas. La semivida funcional de los polipéptidos de Factor VII enlazados con albúmina de la invención es por lo general de al menos aproximadamente 8 horas, preferentemente al menos aproximadamente 12 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 24 horas.
La semivida funcional in vivo de la forma de tipo silvestre del Factor VIIa humano es de aproximadamente 2 horas en los seres humanos. La semivida funcional de los polipéptidos de Factor VIIa enlazados con albúmina de la invención es por lo general de al menos aproximadamente 4 horas, preferentemente al menos aproximadamente 6 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 12 horas.
De acuerdo con la invención, el resto del Factor VII/IIa se acopla con el resto de albúmina a través de un enlazador peptídico. El enlazador es preferentemente flexible y no inmunógeno y genera una distancia entre la albúmina humana y FVII/FVIIa que minimiza la potencial interferencia entre los dos miembros de la fusión, dando como resultado una actividad FVII/FVIIa incrementada de la proteína de fusión. Enlazadores ejemplares incluyen (GGGGS)n o (GGGS)n o (GGS)n, en los que N es un número entero mayor que o igual que 1 y en los que G representa glicina y S representa serina. Estos aminoácidos pertenecen al grupo de los aminoácidos naturales y se escogieron como ejemplos para todos los posibles aminoácidos naturales.
En otra realización de la invención, el enlazador peptídico entre el resto del Factor VII/IIa y el resto de albúmina contiene sitios consenso para la adición de modificaciones postraduccionales. Preferentemente, tales modificaciones consisten en sitios de glicosilación. Más preferentemente, tales modificaciones consisten en al menos un sitio de N-glicosilación de estructura Asn - X - Ser/Thr, en la que X indica cualquier aminoácido excepto prolina. Incluso más preferentemente, tales sitios de N-glicosilación se insertan cerca del extremo amino y/o carboxilo del enlazador peptídico, de modo que sean capaces de proteger potenciales neoepítopos que pudieran aparecer respectivamente en las secuencias donde el resto del Factor VII/Na está en transición hacia el péptido enlazador y donde el enlazador peptídico está en transición a la secuencia del resto de albúmina. En otra realización más de la invención, el resto de Factor VII/Na está acoplado al resto de albúmina mediante un enlazador peptídico que libera el polipéptido de Factor VII/IIa en el sitio de coagulación, en el que el enlazador contiene un sitio de escisión para proteasa plasmática. Preferentemente, tales sitios de escisión para proteasa plasmática son los de proteasas de serina. Más preferentemente, el sitio de escisión es de un sitio de escisión para proteasa de la coagulación. Muy preferentemente, la proteasa de la coagulación se selecciona del grupo que consiste en Factor IIa, Factor IXa, Factor Xa, Factor XIa, Factor XIIa, proteína C activada, elastasa o calicreína. Las secuencias de aminoácidos que son reconocidas y escindidas por estas proteasas de serina son conocidas por un experto en la técnica, por ejemplo, como se describe en " Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Clinical Practice", cuarta edición, Colman y col. 2001. Factor IIa: pág. 34-35, pág. 176, Factor IXa: pág. 40-41, Factor Xa: pág. 34-35, Factor XIa pág. 128-129, Factor XIIa: pág.
194, PCa: pág. 34-35, pág. 159, calicreína: pág. 103-104 o elastasa (O'Reilly y col., 1999; Antiangiogenic activity of the cleaved conformation of the serpin antithrombin: Science 285:1926-1928).
La invención se refiere además a polipéptidos de fusión Factor VII/IIa albúmina modificados según la invención, que comprenden modificaciones adicionales dentro del resto de Factor VII/IIa.
En particular, están abarcadas por la invención modificaciones del Factor VII/FVIIa en que el Factor VII/IIa se ha modificado entre Arg144 y Arg152 del polipéptido añadiendo al menos parte de un péptido de activación de un polipéptido diferente dependiente de vitamina K o reemplazando al menos parte del supuesto péptido de activación de un polipéptido de Factor VII/FVIIa con al menos parte de un péptido de activación de un polipéptido diferente dependiente de vitamina K como se describe en la solicitud de patente europea 04019485.4 (que se incorpora en la presente solicitud por referencia) y que se describe en el siguiente párrafo.
El FVII está en particular relacionado estrechamente con otras proteínas de dominio Gla como FIX, FX y proteína C, en que el dominio Gla N-terminal está seguido por dos dominios de Factor de crecimiento epidérmico (e Gf ) seguidos por el dominio de proteasa de serina de tipo tripsina. Llama la atención la gran diferencia en la semivida plasmática de estas proteínas plasmáticas estrechamente relacionadas:
FVII 2-4 horas
Proteína C: 6-8 horas
FIX: 18-30 horas
FX: 20-42 horas
Las moléculas están altamente conservadas, estando la diferencia más notable dentro del dominio de activación. Para FVII no se ha descrito péptido de activación. Sin embargo, durante la activación, FVII, además de la escisión en Arg152, también podría escindirse en Arg144, lo que da como resultado la liberación de un supuesto péptido de activación de 8 aminoácidos que contiene un sitio de N-glicosilación conservado. La secuencia entre Arg144 y Arg152 se llama en la solicitud de patente europea 04019485.4 "péptido de activación supuesto".
Sorprendentemente, la longitud de los péptidos de activación y las modificaciones postraduccionales de los péptidos de activación se correlacionan con una semivida aumentada:
Tabla 4
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Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento de preparación de un polipéptido de Factor VII/IIa modificado enlazado a albúmina, que comprende modificar el polipéptido de Factor VII/IIa en la región entre Arg144 y Arg152, de modo que el polipéptido de Factor VII/IIa modificado tenga una semivida aumentada en comparación con el polipéptido de Factor VII/IIa en que esta región no se ha modificado.
La invención se refiere además a un procedimiento de preparación de tal polipéptido de Factor VII/IIa modificado enlazado con albúmina, que comprende modificar el polipéptido de Factor VII/IIa en la región entre Arg144 y Arg152 de dicho polipéptido de Factor VlI/IIa enlazado con albúmina a añadiendo al menos parte de un péptido de activación de un segundo polipéptido dependiente de vitamina K o reemplazando al menos parte del supuesto péptido de activación de un polipéptido de Factor VII/IIa por al menos parte de un péptido de activación de un polipéptido diferente dependiente de vitamina K.
La invención incluye además mutaciones adicionales dentro de la secuencia del polipéptido de Factor VII/IIa, que mejoran la actividad catalítica, prolongan la semivida plasmática o modifican la interacción con el Factor Tisular. Se describen mutaciones particularmente útiles del Factor VII en Shah y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:4229-4234, en las que se citan mejoras en la función de las proteínas. Otras mutaciones útiles del Factor VII/IIa se exponen en la descripción de la técnica anterior del documento de solicitud de patente europea 04019485.4.
La invención se refiere además a un polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión Factor VII/VIIa y albúmina, tal como se describe en esta solicitud. El término "polinucleótido(s)" se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. El polinucleótido puede ser de ADN monocatenario o bicatenario, ARN monocatenario o bicatenario. Tal y como se emplea en esta memoria, el término "polinucleótido(s)" incluye también ADNs o ARNs que comprenden una o varias bases modificadas y/o bases inusuales, tales como inosina. Se apreciará que se puede realizar una variedad de modificaciones en el ADN y el ARN que sirven para muchos fines útiles, conocidos por los expertos en la técnica. El término "polinucleótido(s)", tal y como se emplea en este documento, incluye tales formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo, por ejemplo, células simples y complejas. El experto entenderá que, debido a la degeneración del código genético, un polipéptido dado puede estar codificado por diferentes polinucleótidos. Estas "variantes" están incluidas en esta invención.
Preferentemente, el polinucleótido de la invención es un polinucleótido aislado. El término polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente exento de otras secuencias de ácido nucleico, tales como y sin limitación, otro ADN y ARN cromosómico y extracromosómico. Los polinucleótidos aislados se pueden purificar a partir de una célula hospedadora. Los procedimientos convencionales de purificación de ácido nucleico, conocidos por los expertos en la técnica, se pueden utilizar para obtener polinucleótidos aislados. El término también incluye polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados químicamente.
Aún otro aspecto de la invención es un plásmido o un vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención. Preferentemente, el plásmido o el vector es un vector de expresión. En una realización particular, el vector es un vector de transferencia para uso en terapia génica humana.
Todavía otro aspecto de la invención es una célula hospedadora que comprende un polinucleótido de la invención o un plásmido o un vector de la invención.
Las células hospedadoras de la invención se pueden emplear en un procedimiento para producir un polipéptido de fusión FVII/VIIa y albúmina, el cual forma parte de esta invención. El procedimiento comprende:
- cultivar células hospedadoras de la invención en condiciones tales que se expresa el polipéptido de fusión FVII/VIIa y albúmina; y
- opcionalmente recuperar el polipéptido de fusión FVII/VIIa y albúmina a partir del medio de cultivo.
Expresión de las variantes propuestas:
La producción de proteínas recombinantes a niveles elevados en células hospedadoras adecuadas requiere el ensamblaje de los ADNc modificados mencionados anteriormente, en unidades de transcripción eficaces junto con elementos reguladores adecuados en un vector de expresión recombinante, que se puede propagar en diferentes sistemas de expresión, de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Los elementos reguladores eficaces de la transcripción se podrían obtener a partir de virus que tienen como hospedadores naturales células animales o a partir del ADN cromosómico de células animales. Preferentemente, se pueden utilizar combinaciones de promotor-potenciador obtenidas a partir del Virus de Simio 40, adenovirus, virus de polioma BK, citomegalovirus humano, o la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, o combinaciones de promotorpotenciador que incluyen genes transcritos de forma constitutiva y potente en células animales, tales como beta-actina o GRP78. Con el fin de lograr niveles elevados y estables de ARNm transcrito a partir de los ADNc, la unidad de transcripción debe contener en su parte 3' proximal una región de ADN que codifica una secuencia de terminación de la transcripción-poliadenilación. Preferentemente, esta secuencia se obtiene a partir de la región de transcripción temprana del Virus de Simio 40, del gen de beta-globina de conejo o del gen activador de plasminógeno tisular humano.
Los ADNc se integran a continuación en el genoma de una línea celular hospedadora adecuada para la expresión de los polipéptidos de fusión Factor VII/IIa enlazados con albúmina. Preferentemente, esta línea celular debería ser una línea celular animal de origen vertebrado a fin de asegurar un plegamiento correcto, la Y-carboxilación de los residuos de ácido glutámico dentro del dominio Gla, la formación de enlaces disulfuro, la glicosilación ligada a asparagina, la glicosilación ligada a O y otras modificaciones postraduccionales, así como la secreción en el medio de cultivo. Ejemplos de otras modificaciones postraduccionales son la O-sulfatación de tirosina, la hidroxilación, el procesamiento proteolítico de la cadena de polipéptido naciente y la escisión de la región del propéptido. Ejemplos de líneas celulares que se pueden utilizar son células COS de mono, células L de ratón, células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster, células embrionarias de riñón humano 293 y preferentemente células CHO de hámster.
El vector de expresión recombinante que codifica los ADNc correspondientes se puede introducir en una línea celular animal de varias maneras diferentes. Por ejemplo, los vectores de expresión recombinantes se pueden crear a partir de vectores basados en virus animales diferentes. Ejemplos de éstos son vectores basados en baculovirus, virus vaccinia, adenovirus y preferentemente virus del papiloma bovino.
Las unidades de transcripción que codifican los ADNs correspondientes también se pueden introducir en células animales junto con otro gen recombinante que puede actuar como un marcador seleccionable dominante en estas células, con el fin de facilitar el aislamiento de clones de células específicas que han integrado el ADN recombinante en su genoma. Ejemplos de este tipo de genes marcadores seleccionables dominantes son fosfotransferasa de amino glicósido Tn5, que confiere resistencia a la geneticina (G418), fosfotransferasa de higromicina, que confiere resistencia a la higromicina, y acetil transferasa de puromicina, que confiere resistencia a la puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica un marcador seleccionable de este tipo, puede estar en el mismo vector que el que codifica el ADNc de la proteína deseada, o puede estar codificado en un vector separado que se introduce y se integra simultáneamente en el genoma de la célula hospedadora, dando como resultado con frecuencia una unión física fuerte entre las diferentes unidades de transcripción.
Otros tipos de genes marcadores seleccionables, que se pueden utilizar junto con el ADNc de la proteína deseada, se basan en diversas unidades de transcripción que codifican la reductasa de dihidrofolato (dhfr). Después de la introducción de este tipo de genes en células que carecen de actividad dhfr endógena, preferentemente células CHO (DUKX-B11, DG-44) esto permitirá que éstas crezcan en medios que carecen de nucleósidos. Un ejemplo de un medio de este tipo es F12 de Ham sin hipoxantina, timidina ni glicina. Estos genes dhfr se pueden introducir junto con las unidades transcripcionales de ADNc del Factor de coagulación, en células CHO del tipo anterior, ya sea ligados en el mismo vector o en diferentes vectores, creando de este modo líneas celulares positivas para dhfr que producen la proteína recombinante.
Si las líneas celulares anteriores se cultivan en presencia del inhibidor citotóxico de dhfr, metotrexato, aparecerán nuevas líneas de células resistentes al metotrexato. Estas líneas celulares pueden producir proteína recombinante con una tasa incrementada debido al número amplificado de dhfr unida ya las unidades transcripcionales de la proteína deseada. Cuando estas líneas celulares se propagan con concentraciones crecientes de metotrexato (1-10000 nM), se pueden obtener nuevas líneas celulares que producen la proteína deseada con una tasa muy elevada.
Las líneas celulares anteriores que producen la proteína deseada se pueden cultivar a gran escala, ya sea mediante cultivo en suspensión o sobre diversos soportes sólidos. Ejemplos de estos soportes son microvehículos basados en matrices de dextrano o de colágeno, o soportes sólidos en forma de fibras huecas o diversos materiales cerámicos. Cuando se cultiva en un cultivo en suspensión celular o sobre microvehículos, el cultivo de las líneas celulares anteriores se puede realizar como un cultivo discontinuo o como un cultivo por perfusión con una producción continua de medio condicionado durante periodos de tiempo prolongados. Por lo tanto, de acuerdo con la presente invención, las líneas celulares anteriores son muy adecuadas para el desarrollo de un procedimiento industrial para la producción de las proteínas recombinantes deseadas.
La proteína recombinante, que se acumula en el medio de células secretoras de los tipos anteriores, se puede concentrar y purificar mediante una variedad de procedimientos bioquímicos y cromatográficos, incluyendo procedimientos que utilizan diferencias de tamaño, carga, hidrofobicidad, solubilidad, afinidad específica, etc. entre la proteína deseada y otras sustancias en el medio de cultivo celular.
Un ejemplo de una purificación de este tipo es la adsorción de la proteína recombinante a un anticuerpo monoclonal que está inmovilizado sobre un soporte sólido. Después de la desorción, la proteína se puede purificar adicionalmente mediante una variedad de técnicas cromatográficas basadas en las propiedades anteriores.
Se prefiere purificar el polipéptido de Factor VN/Na enlazado con albúmina de la presente invención con una pureza de hasta > 80 %, más preferentemente > 95 %, y se prefiere particularmente un estado farmacéuticamente puro, que tiene una pureza superior al 99,9 % con respecto a macromoléculas contaminantes, en particular otras proteínas y ácidos nucleicos, y está exento de agentes infecciosos y pirógenos. Preferentemente, un polipéptido de Factor VlI/VIIa enlazado con albúmina aislado o purificado de la invención está sustancialmente exento de otros polipéptidos.
Los polipéptidos de Factor VlI/IIa enlazados con albúmina descritos en esta invención se pueden formular como preparaciones farmacéuticas para uso terapéutico. Las proteínas purificadas se pueden disolver en soluciones tampón acuosas, fisiológicamente compatibles, convencionales a las que se puede añadir, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proporcionar preparaciones farmacéuticas.
Tales vehículos y excipientes farmacéuticos así como formulaciones farmacéuticas adecuadas son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo "Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins", Frokjaer y col., Taylor & Francis (2000) o "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3a edición, Kibbe y col., Pharmaceutical Press (2000)). En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante del polipéptido de la invención se puede formular en forma liofilizada o soluble estable. La variante del polipéptido se puede liofilizar a través de una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. Las formulaciones liofilizadas se reconstituyen antes del uso mediante la adición de uno o varios diluyentes farmacéuticamente aceptables tales como agua estéril para inyección o solución salina fisiológica, estéril.
Las formulaciones de la composición se suministran al individuo por cualquier medio de administración farmacéuticamente adecuado. Se conocen varios sistemas de administración y se pueden usar para administrar la composición a través de cualquier vía conveniente. Preferentemente, las composiciones de la invención se administran sistémicamente. Para uso sistémico, las variantes de Factor VII/IIa enlazado con albúmina de la invención se formulan para administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdérmica) o enteral (por ejemplo, oral, vaginal o rectal) según procedimientos convencionales. La ruta de administración más preferida es la administración intravenosa. Las formulaciones se pueden administrar continuamente por infusión o por inyección en bolo. Algunas formulaciones incluyen sistemas de liberación lenta.
Los polipéptidos de Factor VII/IIa enlazados con albúmina, biológicamente activos, modificados de la presente invención se administran a pacientes en una dosis terapéuticamente eficaz, lo que significa una dosis que es suficiente para producir los efectos deseados, prevenir o disminuir la gravedad o la transmisión del estado o la indicación tratada, sin llegar a una dosis que produce efectos secundarios adversos intolerables. La dosis exacta depende de muchos factores como, por ejemplo, la indicación, la formulación y el modo de administración y se tiene que determinar en ensayos preclínicos y clínicos para cada indicación respectiva.
La composición farmacéutica de la invención se puede administrar sola o junto con otros agentes terapéuticos. Estos agentes se pueden incorporar como parte del mismo agente farmacéutico.
Los diversos productos de la invención son útiles como medicamentos. Por consiguiente, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de FVII/VIIa enlazado con albúmina, tal y como se describe en el presente documento, un polinucleótido de la invención o un plásmido o un vector de la invención.
Los ADNs modificados de esta invención también se pueden integrar en un vector de transferencia para uso en la terapia génica humana.
Otro aspecto de la invención es el uso de un polipéptido de FVII/IIa enlazado con albúmina tal y como se describe en el presente documento, de un polinucleótido de la invención, de un plásmido o un vector de la invención, o de una célula hospedadora de la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de trastornos hemorrágicos. Los trastornos hemorrágicos incluyen pero no se limitan a la hemofilia A. En otra realización de la invención, el tratamiento comprende terapia génica humana.
La invención también se refiere a un procedimiento para tratar a un individuo en una o varias de las siguientes indicaciones: "episodios hemorrágicos y cirugía en pacientes con hemofilia heredada o adquirida con inhibidores de Factores de la coagulación (FVIII o FIX)", "reversión de déficits de la hemostasia desarrollados como consecuencia de tratamientos con fármacos como fármacos antiplaquetarios o fármacos anticoagulantes", "mejora de la hemostasia secundaria", "déficits de la hemostasia desarrollados durante infecciones o durante enfermedades tales como la carencia de vitamina K o enfermedad hepática grave", "resección hepática", "déficits de la hemostasia desarrollados como consecuencia de mordeduras de serpientes", "hemorragias gastrointestinales". Otras indicaciones preferidas son "trauma", "consecuencias de una transfusión masiva (coagulopatía dilucional)", "carencias de factores de coagulación distintos de FVIII y FIX", "VWD", "carencia de FI", "carencia de FV", "carencia de FVII", "carencia de FX", "carencia de FXIII", "SUH", "enfermedades plaquetarias heredadas o adquiridas y trastornos como trombocitopenia, ITP, TTP, síndrome de HELLP, síndrome de Bernard-Soulier, trombastenia de Glanzmann, HIT", "síndrome de Chediak-Higahi", "síndrome de Hermansky-Pudlak", "síndrome de Rendu-Osler", "púrpura de Henoch-Schonlein" y "curación de heridas". El procedimiento comprende administrar a dicho individuo una cantidad eficaz del polipéptido de FVII/VIIa enlazado con albúmina tal como se describe en el presente documento. En otra realización, el procedimiento comprende administrar al individuo una cantidad eficaz del polinucleótido de la invención o de un plásmido o un vector de la invención. Alternativamente, el procedimiento puede comprender administrar al individuo una cantidad eficaz de las células hospedadoras de la invención descritas en el presente documento.
Descripción de las tablas y los dibujos:
Figura 1:
El sitio de restricción XhoI introducido en el sitio del codón de detención natural de FVII mediante la sustitución de TAG por TCG, está subrayado. El sitio NotI utilizado para una construcción adicional está subrayado dos veces. La secuencia de aminoácidos del extremo C-terminal del Factor VII se proporciona en código de tres letras (encuadrada).
Figura 2:
Esquema de las secuencias del enlazador insertado entre el extremo C-terminal del Factor VII y el extremo N-terminal de la albúmina en las diversas estructuras artificiales de pFVII. El sitio de escisión de trombina en pFVII-834 está subrayado. Las asparaginas de los sitios de N-glicosilación se subrayan dos veces.
Figura 3:
Las proteínas de fusión FVII y albúmina se activaron por la actividad de FXa y la actividad de FVIIa se midió en un ensayo STACLOT®. El gráfico muestra la actividad de proteínas con un enlazador de mayor longitud con respecto a la proteína sin enlazador (obtenida a partir del plásmido pFVII-974).
Figura 4:
Resultados de experimentos de PK con Factor VII de tipo silvestre (pFVII-659), proteínas de fusión FVII y albúmina, FVII obtenido a partir del plasma (pdFVII) y rFVIIa (NovoSeven®) según se mide con ELISA.
Ejemplos:
Ejemplo 1: Generación de ADNc que codifican polipéptidos de fusión FVII - albúmina
Una secuencia que codifica el Factor VII se amplificó con PCR a partir de una genoteca de ADNc de hígado humano (ProQuest, Invitrogen) usando los cebadores We1303 y We1304 (SEQ ID NO 1 y 2). Después de una segunda ronda de PCR usando los cebadores We1286 y We1287 (Se Q ID NO 3 y 4), el fragmento resultante se clonó en pCR4TOPO (Invitrogen). A partir de éste, el ADNc de FVII se transfirió como un fragmento EcoRI en el sitio EcoRI de pIRESpuro3 (BD Biosciences) en el que se había delecionado previamente un sitio XhoI interno. El plásmido resultante se denominó pFVII-659.
Posteriormente se introdujo un sitio de restricción XhoI en pFVII-659 en el sitio del codón de detención natural de FVII (figura 1) mediante mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con protocolos convencionales (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) usando los oligonucleótidos We1643 y We1644 (SEQ ID NO 5 y 6). El plásmido resultante se denominó pFVII-700.
Los oligonucleótidos We1731 y We1732 (SEQ ID NO 7 y 8) se reasociaron en concentraciones equimolares (10 pmol) en condiciones estándar de PCR, se rellenaron y se amplificaron usando un protocolo de PCR de 2 min de desnaturalización inicial a 94 °C, seguida por 7 ciclos de 15 s de desnaturalización a 94 °C, 15 s de reasociación a 55°C y 15 s de elongación a 72 °C, y finalizó con una etapa de extensión de 5 min a 72 °C. El fragmento resultante se digirió con las endonucleasas de restricción XhoI y NotI y se ligó en pFVII-700 digerido con las mismas enzimas. El plásmido resultante se denominó pFVII-733, que contenía la secuencia que codificaba FVII y una extensión C-terminal de un enlazador de glicina/serina escindible con trombina.
Basándose en pFVII-733, se insertaron otros enlazadores sin sitio de corte para trombina y sitios de N-glicosilación adicionales. Para ello, las parejas de cebadores We2148 y We2149 (SEQ ID NO 9 y 10), We2148 y We2150 (SEQ ID NO 9 y 11), We2148 y We2151 (SEQ ID NO 9 y 12), We2152 y We2153 (SEQ ID NO 13 y 14), We2152 y We2154 (SEQ ID NO 13 y 15), We2152 y We2155 (SEQ ID NO 13 y 16) y We2156 y We2157 (SEQ ID NO 17 y 18), respectivamente, se reasociaron y se amplificaron tal y como se ha descrito anteriormente. Los fragmentos respectivos de PCR se digirieron con endonucleasas de restricción XhoI y BamH1 y se insertaron en pFVII-733 digerido con las mismas enzimas. En el sitio BamH1 de los plásmidos resultantes, así como en el de pFVII-733, se insertó un fragmento BamH1 que contenía el ADNc de albúmina humana madura. Este fragmento se había generado con PCR sobre una secuencia de ADNc de albúmina usando los cebadores We1862 y We1902 (SEQ ID NO 19 y 20) en condiciones convencionales. Los plásmidos finales se denominaron pFVII-935, pFVII-936, pFVII-937, pFVII-938, pFVII-939, pFVII-940, pFVII-941 y pFVII-834, respectivamente. Sus secuencias enlazadoras y la secuencia C-terminal de FVII y N-terminal de la albúmina se describen en la figura 2.
Basándose en pFVII-938, se generaron las secuencias de enlazador más cortas mediante mutagénesis por deleción. Para ello, se emplearon los cebadores de mutagénesis We2247 y We2248 (SEQ ID NO 23 y 24), We2249 y We2250 (SEQ ID NO 25 y 26), We2251 y We2252 (SEQ ID NO 27 y 28) y We2253 y We2254 (SEQ ID NO 29 y 30) en protocolos de mutagénesis convencionales (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) para generar los plásmidos pFVII-1014, pFVII-1015, pFVII-1016 y pFVII-1370, respectivamente.
Con el fin de generar una proteína de fusión FVII y albúmina sin enlazador, se aplicó mutagénesis por deleción tal y como se ha indicado anteriormente, al plásmido pFVII-935 usando los cebadores We2181 y We2182 (SEQ ID NO 31 y 32). El plásmido resultante se denominó pFVII-974.
Basándose en el plásmido pFVII-974, se aplicó mutagénesis por inserción para generar 1 a 3 enlazadores de aminoácidos. Para ello, se emplearon los cebadores de mutagénesis We2432 y We2433 (SEQ ID NO 33 y 34), We2434 y We2435 (SEQ ID NO 35 y 36) y We2436 y We2437 (SEQ ID NO 37 y 38) en protocolos de mutagénesis convencionales (QuickChange XL Site Directed Mutagenesis Kit, Stratagene) para generar los plásmidos pFVII-1158, pFVII-1159 y pFVII-1160, respectivamente.
Otras estructuras artificiales se generaron con procedimientos similares, aplicando en protocolos de mutagénesis convencionales, los cebadores de mutagénesis We2713 y We2714 (SEQ ID NO 39 y 40) sobre el plásmido pFVII-1370, We2715 y We2716 (SEQ ID NO 41 y 42) sobre el plásmido pFVII-1370, We2717 y We2718 (SEQ ID NO 43 y 44) sobre el plásmido pFVII-1016 y We2756 y We2757 (s Eq ID NO 45 y 46) sobre el plásmido pFVII-935 para generar los plásmidos pFVII-1361, pFVII-1362, pFVII-1363 y pFVII-1382, respectivamente
Las secuencias de los enlazadores y las secuencias del extremo C-terminal de FVII y N-terminal de albúmina de los plásmidos descritos anteriormente, se resumen en la figura 2.
Ejemplo 2: Transfección y expresión de polipéptidos de fusión Factor VII - albúmina
Los plásmidos se cultivaron en E. coli TOP10 (Invitrogen) y se purificaron utilizando protocolos convencionales (Qiagen). Las células HEK-293 se transfectaron usando el reactivo Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y se dejaron crecer en medio exento de suero (Invitrogen 293 Express) en presencia de 50 ng/ml de vitamina K y 4 |jg/ml de puromicina. Las poblaciones de células transfectadas se propagaron a través de matraces T en frascos rotatorios a partir de los cuales se recogió el material sobrenadante para purificación.
Ejemplo 3: Purificación de FVII y polipéptidos de fusión FVII - albúmina
La recogida de cultivos celulares que contenían FVII o proteína de fusión FVII y albúmina se aplicó sobre una columna FF de 2,06 ml de Q-Sefarosa equilibrada previamente con tampón HEPES 20 mM pH 7,4. Posteriormente, la columna se lavó con 10 volúmenes del mencionado tampón HEPES. La elución de las moléculas de FVII unidas se consiguió ejecutando un gradiente lineal de NaCl desde 0 a 1,0 M en tampón HEPES 20 mM dentro de 20 volúmenes de columna. El eluato contenía aproximadamente 85-90 % del antígeno de FVII aplicado con concentraciones de proteína entre 0,5 y 1 g/l.
Alternativamente, FVII se purificó mediante cromatografía usando factor tisular inmovilizado tal como se ha descrito en el documento EP 0770625B1.
El antígeno de FVII y la actividad se determinaron tal y como se describe en el ejemplo 4.
Ejemplo 4: Determinación de la actividad de FVII y del antígeno.
La actividad de FVII se determinó usando un kit para ensayo cromogénico, disponible comercialmente (Chromogenix Coaset FVII empleando plasma humano estándar) basándose en el procedimiento descrito por Seligsohn y col. Blood (1978) 52:978-988.
La actividad de FVIIa se determinó usando un kit para ensayo, disponible comercialmente (STACLOT®)VIIa-rTF, Diagnostica Stago) basándose en el procedimiento descrito por Morissey y col. (1993) Blood 81:734-744.
El antígeno de FVII se determinó mediante un ELISA cuya ejecución es conocida por los expertos en la técnica. Brevemente, las microplacas se incubaron con 120 j l por pocillo de anticuerpo de captura (IgG de oveja anti FVII humano, Cedarlane CL20030AP, diluida 1:1000 en tampón A [Sigma C3041]) durante una noche a temperatura ambiente. Después de lavar las placas tres veces con tampón B (Sigma P3563), cada pocillo se incubó con 200 j l de tampón C (Sigma P3688) durante una hora a temperatura ambiente. Después de otras tres etapas de lavado con tampón B, diluciones en serie de la muestra del ensayo en tampón B, así como diluciones en serie de plasma humano estándar (Dade Behring; 50 - 0,5 mU/ml [1 mU equivale a 0,5 ng])) en tampón B (volúmenes por pocillo: 100 jl), se incubaron durante dos horas a temperatura ambiente. Después de tres etapas de lavado con tampón B, 100 j l de una dilución 1:5000 en tampón B del anticuerpo de detección (IgG de oveja anti FVII humano, Cedarlane CL20030K, marcado con peroxidasa) se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante otras dos horas a temperatura ambiente. Después de tres etapas de lavado con tampón B, se añadieron 100 j l de solución de sustrato (TMB, Dade Behring, OUVF) por pocillo y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 j l de solución de parada sin diluir (Dade Behring, OSFA) preparó las muestras para su lectura en un lector de microplacas adecuado a 450 nm de longitud de onda. Las concentraciones de las muestras del ensayo se calcularon después usando la curva patrón con plasma humano estándar como referencia.
Ejemplo 5: Activación de FVII y de polipéptidos de fusión FVII-albúmina con el Factor Xa
Polipéptidos de FVII purificados tal y como se ha descrito en el ejemplo 3, se dializaron frente a un tampón que consistía en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, Na-citrato 1 mM, 1 g/l de Na-caprilato a pH 8,5. Dentro de este entorno de tampón, FVII fue activado a FVIIa mediante incubación con FXa (preparación disponible comercialmente, 100 UI/ml, ERL), fosfolípidos (Phospholipon 25P, 1 g/l, Rhone Poulenc-Nattermann, Colonia) y Ca++ (solución de CaCh en agua destilada, 1 M) durante diversos intervalos de tiempo a 37 °C. Las concentraciones finales fueron -30 a 65 UI/ml de FVII, medidas por el ensayo cromogénico; 0,5 % de FXa en relación con FVII, es decir, 1 UI de FXa y 200 UI de FVII, 0,02 g/l de fosfolípidos y CaCh 5 mM.
La activación finalizó con la adición de 10 % (v/v) de un tampón que consistía en HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, Nacitrato 200 mM, 1 g/l de Na-caprilato a pH 5,0.
Para controlar la escisión de las moléculas, en paralelo se aplicó a SDS-PAGE una muestra de la mezcla de activación y una muestra no activada correspondiente, se tiñeron con azul de Coomassie y se analizó la densidad de las bandas.
Brevemente, las muestras se redujeron, se aplicaron a SDS-PAGE (gradiente de 8-16 % de poliacrilamida, geles de Tris-glicina de Novex®, Invitrogen; de acuerdo con las instrucciones del fabricante) y se tiñeron con azul de Coomassie G-250. Las bandas resultantes se analizaron (Versa DOC®, Bio-Rad) y se calcularon las concentraciones relativas de proteína utilizando el programa informático Image Quant (V 4.20, Amersham).
Ejemplo 6: La actividad de las proteínas de fusión FVII-albúmina depende de la longitud del enlazador
Proteínas de fusión FVII-albúmina con longitud del enlazador entre 0 y 31 aminoácidos se activaron tal y como se ha descrito anteriormente y se determinó la actividad de FVIIa en un ensayo STACLOT®. Aunque los polipéptidos de fusión independientes de la longitud del enlazador mostraban un grado comparable de escisión con FXa, las actividades de FVIIa de las proteínas de fusión de albúmina medidas a través del ensayo de la actividad, mostraban un resultado sorprendente: cuanto mayor era longitud del enlazador entre el resto de FVII y de albúmina, mayor era la actividad específica y molar de FVIIa medida (figura 3 y tabla 5) y la estructura artificial sin enlazador (974) mostraba menos de la mitad de actividad de FVIIa, en comparación con las estructuras artificiales con péptidos enlazadores de 19 o más aminoácidos de longitud. Incluso un aminoácido como enlazador (pFVII-1158) incrementaba la actividad específica y molar de la proteína de fusión en un 31 %, en comparación con una proteína de fusión sin enlazador (pFVII-974). Esto sugería firmemente que la fusión directa de las secuencias de FVII y albúmina podía conducir a una situación conformacional en la que el resto de albúmina interfiere con la conformación de su parte FVIIa o su interacción con su sustrato. Esta interferencia parece que se reduce significativamente en las estructuras artificiales que tienen un enlazador peptídico intercalado entre el Factor VII/IIa y la albúmina.
La proteína de fusión con albúmina sin enlazador (974) mostraba aproximadamente un 25 % de actividad específica y molar cuando se comparaba con NovoSeven® (tabla 6).
Tabla 5:
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Tabla 6:
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Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende al menos un polipéptido de Factor VII o Factor VIIa o un fragmento o variante del mismo, fusionado con albúmina, en el que al menos uno de tales polipéptidos de Factor VII o Factor VIIa está localizado en el extremo N-terminal de la proteína de fusión y en el que la proteína de fusión tiene actividad biológica de Factor VII/Ma y en el que un enlazador peptídico separa el resto del Factor VII o Factor VIIa en el extremo N-terminal de la proteína de fusión, del resto de albúmina, comprendiendo dicho enlazador al menos 7 aminoácidos y unidades de repetición que comprenden glicina y serina.
2. Un polipéptido fusionado con albúmina según la reivindicación 1, en el que la proteína de fusión tiene al menos el 25 % de actividad biológica específica y molar de Factor VII/IIa en comparación con el Factor VII o el Factor VIIa de tipo silvestre no fusionado respectivo o un fragmento o variante del mismo.
3. Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende un polipéptido de Factor VII o Factor VIIa según la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína de fusión tiene una semivida plasmática funcional incrementada in vivo en comparación con un Factor VII o un Factor VIIa no fusionado.
4. Un polipéptido fusionado con albúmina que comprende un polipéptido de Factor VII o Factor VIIa según la reivindicación 3, en el que la proteína de fusión tiene una semivida funcional in vivo que se incrementa al menos un 100 % en comparación con un Factor VII o un Factor VIIa no fusionado.
5. El polipéptido fusionado con albúmina según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el enlazador contiene un sitio de escisión para proteasa.
6. El polipéptido fusionado con albúmina según la reivindicación 5, en el que el sitio de escisión se puede escindir mediante una proteasa de la coagulación seleccionada del grupo que consiste en Factor IIa, Factor IXa, Factor Xa, Factor XIa, Factor XIIa, proteína C activada, elastasa o calicreína.
7. El polipéptido fusionado con albúmina según las reivindicaciones 1 a 6, en el que el enlazador se modifica mediante la inserción de sitios para modificaciones postraduccionales y en el que la modificación postraduccional comprende uno o varios sitios de N-glicosilación de estructura Asn-X-Ser/Thr, en la que X representa cualquier aminoácido excepto prolina.
8. El polipéptido fusionado con albúmina según las reivindicaciones 1 a 4, en el que el enlazador peptídico comprende las SEQID NO 47 a 55.
9. El polipéptido fusionado con albúmina según las reivindicaciones 1 a 7, en el que el enlazador peptídico es flexible y no inmunógeno.
10. El polipéptido fusionado con albúmina según las reivindicaciones 1 a 7, en el que el enlazador peptídico comprende al menos 19 aminoácidos.
11. El polipéptido fusionado con albúmina según la reivindicación 1 a 10, en el que dicho polipéptido fusionado con albúmina se modifica de modo que la modificación comprende añadir mediante inserción al menos parte del péptido de activación de un polipéptido diferente dependiente de vitamina K, o añadir mediante inserción un análogo de dicho péptido de activación del polipéptido diferente dependiente de vitamina K.
12. Los polipéptidos fusionados con albúmina según las reivindicaciones 1 a 11, en los que el resto de polipéptido de Factor VII o de Factor VIIa tiene actividad procoagulante.
13. Polipéptido fusionado con albúmina según las reivindicaciones 1 a 12, para su uso como medicamento.
14. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz del polipéptido fusionado con albúmina de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, junto con un vehículo o un excipiente farmacéuticamente aceptable.
15. Una molécula de ácido nucleico en la que dicha molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica el polipéptido fusionado con albúmina de la reivindicación 10 a 12, en la que dicha secuencia de polinucleótidos está localizada en el extremo 3' de una secuencia de nucleótidos que codifica un propéptido que media en la carboxilación gamma de la parte fusionada del Factor VII/IIa.
16. Un plásmido o un vector en el que dicho plásmido o vector comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15.
17. Un plásmido o un vector según la reivindicación 16, en el que dicho plásmido o vector es un vector de expresión.
18. Un vector según la reivindicación 16, en el que dicho vector es un vector de transferencia para su uso en terapia génica humana.
19. Una célula hospedadora en la que dicha célula hospedadora comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 15 a 18.
20. Un procedimiento de fabricación de un polipéptido fusionado con albúmina de la reivindicación 1 a 12, en el que dicho procedimiento comprende:
a. proporcionar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido fusionado con albúmina que se puede expresar en un organismo;
b. expresar el ácido nucleico en el organismo para formar un polipéptido fusionado con albúmina; y
c. purificar el polipéptido fusionado con albúmina.
21. Una composición farmacéutica en la que dicha composición farmacéutica comprende un plásmido o vector según la reivindicación 16 a 18.
22. Un polipéptido fusionado con albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 15 o un plásmido o vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la coagulación de la sangre.
23. Un polipéptido fusionado con albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 15 o un plásmido o vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, o una célula hospedadora según la reivindicación 19 para el tratamiento de una o más de las siguientes indicaciones: hemofilia A, hemofilia B, episodio hemorrágico relacionado con cirugía, trastornos hepáticos que conducen a trastornos de la coagulación de la sangre, "episodios hemorrágicos y cirugía en pacientes con hemofilia heredada o adquirida con inhibidores de Factores de la coagulación (FVIII o FIX)", "reversión de déficits de la hemostasia desarrollados como consecuencia de tratamientos con fármacos tales como fármacos antiplaquetarios o fármacos anticoagulantes", "mejora de la hemostasia secundaria", "déficits de la hemostasia desarrollados durante infecciones o durante enfermedades tales como la carencia de vitamina K o enfermedad hepática grave", "resección hepática", "déficits de la hemostasia desarrollados como consecuencia de mordeduras de serpientes", "hemorragias gastrointestinales", "trauma", "consecuencias de una transfusión masiva (coagulopatía dilucional)", "carencias de factores de coagulación distintos de FVIII y FIX", "VWD", "carencia de FI", "carencia de FV", "carencia de FVII", "carencia de FX", "carencia de FXIII", "SUH", "enfermedades plaquetarias heredadas o adquiridas y trastornos como trombocitopenia, ITP, TIP, síndrome de HELLP, síndrome de Bernard-Soulier, trombastenia de Glanzmann, “HIT”, "síndrome de Chediak-Higahi", "síndrome de Hermansky-Pudlak", "síndrome de Rendu-Osler", "púrpura de Henoch-Schonlein" y "curación de heridas".
24. Un polipéptido fusionado con albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 15 o un plásmido o vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la coagulación de la sangre, en el que dicho polipéptido fusionado con albúmina, polinucleótido, plásmido o vector se formula para administración subcutánea.
25. Un polipéptido fusionado con albúmina según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, un polinucleótido según la reivindicación 15 o un plásmido o vector según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 para el tratamiento o la prevención de un trastorno de la coagulación de la sangre, en el que dicho polipéptido fusionado con albúmina, polinucleótido, plásmido o vector se administra mediante administración subcutánea.
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WO (1) WO2007090584A1 (es)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003530838A (ja) * 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
KR101492422B1 (ko) * 2006-04-11 2015-02-12 체에스엘 베링 게엠베하 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법
US7939632B2 (en) * 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
EP1867660A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
WO2007144173A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-21 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
JP5448839B2 (ja) * 2006-12-22 2014-03-19 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー インビボで長い半減期を有する修飾された凝固因子
US20110154516A1 (en) * 2007-10-15 2011-06-23 Stafford Darrel W Human factor ix variants with an extended half life
EP2444491B1 (en) 2008-04-21 2016-11-16 Novo Nordisk Healthcare Ag Hyperglycosylated human coagulation factor IX
CN103739712B (zh) 2008-06-24 2016-10-05 德国杰特贝林生物制品有限公司 具有延长的体内半衰期的因子viii、冯·维勒布兰德因子或它们的复合物
US20120121613A1 (en) * 2009-01-19 2012-05-17 Bayer Healthcare Llc Protein conjugate having an endopeptidase- cleavable bioprotective moiety
ES2730800T3 (es) 2009-02-03 2019-11-12 Amunix Pharmaceuticals Inc Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
EP3243835B1 (en) 2009-02-11 2024-04-10 Albumedix Ltd Albumin variants and conjugates
US9849188B2 (en) 2009-06-08 2017-12-26 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
DK2440228T3 (en) 2009-06-08 2018-12-17 Amunix Operating Inc Glucose regulating polypeptides and methods for their preparation and use
US20120148557A1 (en) * 2009-08-20 2012-06-14 Ulrich Kronthaler Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
AU2010290131C1 (en) 2009-08-24 2015-12-03 Amunix Operating Inc. Coagulation factor VII compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) * 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
GB2488077A (en) 2009-10-30 2012-08-15 Novozymes Biopharma Dk As Albumin variants
MX2012005527A (es) 2009-11-13 2012-08-08 Grifols Therapeutics Inc Preparaciones que contienen el factor de von willebrand (fvw) procedimientos, kits y aplicaciones relacionados con las mismas.
CN102753575A (zh) * 2010-01-28 2012-10-24 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 因子vii融合多肽
MX348567B (es) * 2010-06-04 2017-06-20 Tiumbio Co Ltd Proteina de fusion que tiene actividad de factor vii.
CN103140237A (zh) 2010-07-09 2013-06-05 比奥根艾迪克依蒙菲利亚公司 因子ix多肽及其使用方法
EA201291482A1 (ru) * 2010-07-09 2013-10-30 Байоджен Айдек Хемофилия Инк. Химерные факторы коагуляции
TWI557135B (zh) 2010-11-03 2016-11-11 介控生化科技公司 經修飾之第九因子多胜肽及其用途
JP2012125190A (ja) * 2010-12-15 2012-07-05 Kakei Gakuen 会合ユニット作製用リンカーペプチド
CN103561758B (zh) * 2011-02-04 2017-06-16 奥克塔法马股份有限公司 通过沉降灭活/去除凝血因子的方法
RU2620072C2 (ru) * 2011-10-06 2017-05-22 Ханми Сайенс Ко., Лтд. ПРОИЗВОДНЫЕ ФАКТОРОВ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VII И VIIa, КОНЪЮГАТЫ И КОМПЛЕКСЫ, СОДЕРЖАЩИЕ ИХ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
US20140315817A1 (en) 2011-11-18 2014-10-23 Eleven Biotherapeutics, Inc. Variant serum albumin with improved half-life and other properties
EP2814502B1 (en) 2012-02-15 2017-09-13 CSL Behring GmbH Von willebrand factor variants having improved factor viii binding affinity
CA2864126A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Biogen Idec Ma Inc. Recombinant factor viii proteins
SI3564260T1 (sl) 2012-02-15 2023-02-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Sestavki faktorja VIII in postopki njegove izdelave in uporabe
MX2014010278A (es) 2012-03-16 2015-03-05 Novozymes Biopharma Dk As Variantes de albumina.
AU2013270683A1 (en) * 2012-06-08 2014-12-11 Biogen Ma Inc. Chimeric clotting factors
US20150252345A1 (en) 2012-09-25 2015-09-10 Biogen Idec Ma Inc. Methods of Using FIX Polypeptides
CA2890766A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 Novozymes Biopharma Dk A/S Albumin variants
TWI641382B (zh) * 2013-01-31 2018-11-21 韓美藥品股份有限公司 於包含因子ｖｉｉ之組成物中使病毒失活之方法
EP3318124A3 (en) 2013-02-16 2018-05-30 Albumedix A/S Pharmacokinetic animal model
US9175279B1 (en) 2013-03-15 2015-11-03 Csl Limited Method of purifying factor VII and/or factor VIIa
TWI788044B (zh) 2013-03-15 2022-12-21 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｉｘ多肽調配物
DK2796145T3 (da) 2013-04-22 2018-01-29 Csl Ltd Et kovalent kompleks af von Willebrand-faktor og faktor VIII linket af en disulfidbro
EP3033097B1 (en) 2013-08-14 2021-03-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor viii-xten fusions and uses thereof
CN114736305B (zh) 2014-01-10 2023-05-05 比奥贝拉蒂治疗公司 因子viii嵌合蛋白及其用途
US20170042981A1 (en) * 2014-04-11 2017-02-16 Csl Limited Half-life extended factor fviia protein for prevention and treatment of bleeding and dosing regimens therefor
ES2844232T3 (es) 2014-07-02 2021-07-21 CSL Behring Lengnau AG Factor de Von Willebrand modificado
DE102014112212A1 (de) * 2014-08-26 2016-03-03 Akesion Gmbh Rekombinante Fusionsproteine zur Vorbeugung oder Behandlung von Adhäsionen bei Geweben oder Organen
WO2016188905A1 (en) 2015-05-22 2016-12-01 Csl Behring Recombinant Facility Ag Methods for preparing modified von willebrand factor
CN107787328B (zh) 2015-05-22 2021-08-06 康诺贝林伦瑙有限公司 用于治疗血友病的截短的血管性血友病因子多肽
CN104926946B (zh) * 2015-07-13 2021-09-17 中国科学院广州生物医药与健康研究院 具有延长体内半衰期的adamts13-mdtcs融合蛋白及其应用
CN106397570B (zh) * 2015-07-31 2019-11-15 袁武梅 一种羧基末端肽及长效干扰素
CN106397571A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 李金松 一种新型羧基末端肽及长效白介素7
CN108472337B (zh) 2015-08-03 2022-11-25 比奥贝拉蒂治疗公司 因子ix融合蛋白以及其制备和使用方法
AU2016308504A1 (en) 2015-08-20 2018-01-18 Albumedix Ltd. Albumin variants and conjugates
GB201520021D0 (en) 2015-11-13 2015-12-30 Asterion Ltd Fusion polypeptide
DK3383894T3 (da) * 2015-12-02 2020-06-02 CSL Behring Lengnau AG Forbedrede medier til eksprimering af rekombinante vitamin k-afhængige proteiner
EP3184149A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Julius-Maximilians-Universität Würzburg Soluble glycoprotein v for treating thrombotic diseases
SG10201912498YA (en) 2016-01-07 2020-02-27 CSL Behring Lengnau AG Mutated truncated von willebrand factor
EP3400238B1 (en) 2016-01-07 2021-05-19 CSL Behring Lengnau AG Mutated von willebrand factor
CN106279436B (zh) * 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 活化的人凝血因子vii融合蛋白及其制备方法与用途
EP3502143A4 (en) 2016-08-19 2020-07-15 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CN107759696A (zh) 2016-08-19 2018-03-06 安源医药科技（上海）有限公司 人白介素7融合蛋白及其制备方法
SG11201901989VA (en) * 2016-09-13 2019-04-29 Bayer Healthcare Llc Factor viia glycoforms
KR20190075920A (ko) * 2016-09-20 2019-07-01 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트 인자 xi에 대한 신규 항체 및 그의 용도
DK3538133T3 (da) 2016-11-11 2021-04-19 CSL Behring Lengnau AG Trunkeret von willebrand faktor polypeptider til behandling af hæmofili
TW201828974A (zh) 2016-11-11 2018-08-16 瑞士商Ｃｓｌ貝林重組技能公司 用於血管外施予以治療或預防凝血疾病之截短型類血友病因子（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）多肽類
CN108727486A (zh) * 2017-04-24 2018-11-02 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 长效神经生长因子、制备方法及其组合物
US11141466B2 (en) 2017-06-22 2021-10-12 CSL Behring Lengnau AG Modulation of FVIII immunogenicity by truncated VWF
KR20190086269A (ko) * 2018-01-12 2019-07-22 재단법인 목암생명과학연구소 체내 지속형 재조합 당단백질 및 이의 제조방법
KR102134571B1 (ko) * 2018-06-15 2020-07-16 주식회사 알테오젠 혈액응고인자 VII/VIIa 융합단백질의 제조 방법
JP2022520886A (ja) * 2019-03-27 2022-04-01 シギロン セラピューティクス， インコーポレイテッド 第ｖｉｉ因子療法のための組成物、デバイス及び方法
AU2020277640A1 (en) 2019-05-17 2022-01-20 Csl Behring Ag Haptoglobin for use in treating an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
WO2021001522A1 (en) 2019-07-04 2021-01-07 CSL Behring Lengnau AG A truncated von willebrand factor (vwf) for increasing the in vitro stability of coagulation factor viii
WO2021094344A1 (en) 2019-11-11 2021-05-20 CSL Behring Lengnau AG Polypeptides for inducing tolerance to factor viii
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
CA3206884A1 (en) 2021-02-01 2022-08-04 Kevin AKERET Method of treating or preventing an adverse secondary neurological outcome following a haemorrhagic stroke
CN117321074A (zh) 2021-05-07 2023-12-29 瑞士杰特贝林生物制品有限公司 用于产生重组触珠蛋白(Hp)β链的表达系统
WO2024047219A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Csl Behring Ag Haptoglobin for use in treating or preventing exaggerated erectile response or erectile dysfunction

Family Cites Families (112)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5019A (en) * 1847-03-13 Shirt-bosom
US5625041A (en) 1990-09-12 1997-04-29 Delta Biotechnology Limited Purification of proteins
US4970300A (en) 1985-02-01 1990-11-13 New York University Modified factor VIII
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US5641663A (en) 1985-11-06 1997-06-24 Cangene Corporation Expression system for the secretion of bioactive human granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) and other heterologous proteins from steptomyces
IL87258A (en) 1987-07-28 1994-02-27 Gist Brocades Nv SECYMOREVYULK surrogate cells and their use for the expression of polypeptides
JP2791418B2 (ja) 1987-12-02 1998-08-27 株式会社ミドリ十字 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体
AU633020B2 (en) 1988-07-23 1993-01-21 Novozymes Delta Limited New secretory leader sequences
US5705363A (en) 1989-03-02 1998-01-06 The Women's Research Institute Recombinant production of human interferon τ polypeptides and nucleic acids
GB8909916D0 (en) 1989-04-29 1989-06-14 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5667986A (en) 1989-10-18 1997-09-16 Delta Biotechnology Limited Yeast promoter for expressing heterologous polypeptides
US5580560A (en) 1989-11-13 1996-12-03 Novo Nordisk A/S Modified factor VII/VIIa
US5766897A (en) 1990-06-21 1998-06-16 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Cysteine-pegylated proteins
US5646012A (en) 1991-04-30 1997-07-08 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Yeast promoter and use thereof
FR2676070B1 (fr) 1991-04-30 1994-09-30 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisation.
US5223408A (en) 1991-07-11 1993-06-29 Genentech, Inc. Method for making variant secreted proteins with altered properties
US6348327B1 (en) 1991-12-06 2002-02-19 Genentech, Inc. Non-endocrine animal host cells capable of expressing variant proinsulin and processing the same to form active, mature insulin and methods of culturing such cells
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686900B1 (fr) 1992-01-31 1995-07-21 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides ayant une activite de stimulation des colonies de granulocytes, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5364771A (en) 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
FR2694294B1 (fr) 1992-07-30 1994-09-09 Rhone Poulenc Rorer Sa Promoteur de levure et son utilisateur.
DE4226971C2 (de) 1992-08-14 1997-01-16 Widmar Prof Dr Tanner Modifizierte Pilzzellen und Verfahren zur Herstellung rekombinanter Produkte
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
HU219682B (hu) 1993-05-21 2001-06-28 Novo Nordisk A/S. Módosított VII faktor
US5621039A (en) 1993-06-08 1997-04-15 Hallahan; Terrence W. Factor IX- polymeric conjugates
DK144093D0 (es) 1993-12-23 1993-12-23 Novo Nordisk As
FR2719593B1 (fr) 1994-05-06 1996-05-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur préparation et composition pharmaceutique les contenant.
AT403167B (de) 1994-11-14 1997-11-25 Immuno Ag Selektion und expression von fremdproteinen mittels eines selektions-amplifikations-systems
JPH11501506A (ja) 1994-12-12 1999-02-09 ベス イスラエル デアコネス メディカル センター キメラ型サイトカインおよびその利用
AU6455896A (en) 1995-07-11 1997-02-10 Chiron Corporation Novel factor viii:c polypeptide analogs with altered metal-binding properties
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
DE19538715A1 (de) 1995-10-18 1997-04-30 Behringwerke Ag Verfahren zur Reinigung von Faktor VII und aktiviertem Faktor VII
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
US6110707A (en) 1996-01-19 2000-08-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
US6087129A (en) 1996-01-19 2000-07-11 Betagene, Inc. Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
AU718254B2 (en) 1996-01-19 2000-04-13 Betagene, Inc. Recombinant expression of proteins from secretory cell lines
JP3735921B2 (ja) 1996-02-07 2006-01-18 三菱ウェルファーマ株式会社 ＧＰＩｂ・脂質複合体およびその用途
EP0910628B1 (en) 1996-04-24 2006-03-08 The Regents of The University of Michigan Inactivation resistant factor viii
US20040092442A1 (en) 1996-04-24 2004-05-13 University Of Michigan Inactivation resistant factor VIII
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
US5959075A (en) 1996-08-02 1999-09-28 Zymogenetics, Inc. Testis-specific insulin homolog polypeptides
US7026447B2 (en) 1997-10-09 2006-04-11 Human Genome Sciences, Inc. 53 human secreted proteins
CA2305690A1 (en) 1997-10-09 1999-04-22 Human Genome Sciences, Inc. 53 human secreted proteins
ATE283034T1 (de) 1998-04-27 2004-12-15 Opperbas Holding Bv Pharmazeutische zusammensetzungen enthaltend faktor viii und neutrale liposomen
AU3998799A (en) 1998-05-20 1999-12-06 Genentech Inc. Treatment for hemophilia
EP1088084B1 (en) 1998-06-15 2006-09-13 GTC Biotherapeutics, Inc. Erythropoietin analog-human serum albumin fusion protein
DK1107989T3 (da) 1998-08-25 2010-05-25 Merck Patent Gmbh Ekspression og eksport af angiostatin og endostatin som immunfusiner
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1180121B9 (en) 1999-05-17 2004-09-08 Conjuchem, Inc. Long lasting insulinotropic peptides
WO2000071714A2 (en) 1999-05-24 2000-11-30 The American National Red Cross Methods of reducing factor viii clearance and compositions therefor
WO2001001749A2 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Genentech, Inc. FVIIa ANTAGONISTS
WO2001029242A2 (en) 1999-10-21 2001-04-26 Monsanto Company Post-translational modification of recombinant proteins produced in plants
JP5179689B2 (ja) 2000-02-11 2013-04-10 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗体ベース融合タンパク質の循環系内半減期の増強
RU2278123C2 (ru) * 2000-02-11 2006-06-20 Максиджен Холдингз Лтд. Молекулы, подобные фактору vii или viia
US20050100991A1 (en) 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6946134B1 (en) 2000-04-12 2005-09-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
JP2003530838A (ja) 2000-04-12 2003-10-21 ヒューマン ゲノム サイエンシズ インコーポレイテッド アルブミン融合タンパク質
AU2001275897A1 (en) 2000-07-12 2002-01-21 Immunex Corporation Improvement of cell culture performance
DE60137950D1 (de) 2000-10-02 2009-04-23 Novo Nordisk Healthcare Ag Verfahren zur herstellung vitamin-k-abhängiger proteine
MXPA03003388A (es) 2000-10-18 2005-03-07 Maxygen Aps Moleculas de proteina c o similares a las de proteina c activadas.
JP2004528014A (ja) 2000-12-07 2004-09-16 イーライ・リリー・アンド・カンパニー Ｇｌｐ−１融合タンパク質
AU2002248329B2 (en) 2001-01-12 2007-06-28 The American National Red Cross Methods and compositions for reducing heparan sulfate proteoglycan-mediated clearance of factor VIII
MXPA03008210A (es) 2001-03-12 2005-03-07 Progenetics Llc Produccion de altos niveles del factor ix transgenico sin rescate del gen, y sus usos terapeuticos.
US20050244931A1 (en) 2001-04-12 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20060084794A1 (en) 2001-04-12 2006-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050054051A1 (en) 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2002097038A2 (en) 2001-05-25 2002-12-05 Human Genome Sciences, Inc. Chemokine beta-1 fusion proteins
WO2002103024A2 (en) 2001-06-14 2002-12-27 The Scripps Research Institute Stabilized proteins with engineered disulfide bonds
EP1423136A4 (en) 2001-08-10 2007-07-25 Epix Pharm Inc POLYPEPTIDE CONJUGATES HAVING INCREASED CIRCULATION HALF-VIES
WO2003030821A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
ES2516041T3 (es) 2001-10-10 2014-10-30 Ratiopharm Gmbh Remodelación y glicoconjugación de la hormona del crecimiento humano (hGH)
WO2005003296A2 (en) 2003-01-22 2005-01-13 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2471363C (en) 2001-12-21 2014-02-11 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
CA2484556A1 (en) 2001-12-21 2003-07-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20080167238A1 (en) 2001-12-21 2008-07-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
MXPA04006053A (es) 2001-12-21 2005-03-31 Immunex Corp Metodos para purificacion de proteina.
AU2003244516A1 (en) * 2002-02-07 2003-09-02 Novozymes Delta Limited Hiv inhibiting proteins
CA2475388A1 (en) 2002-02-14 2003-08-21 William J. Rutter Chimeric molecules for cleavage in a treated host
EP1572936A2 (en) 2002-03-05 2005-09-14 Eli Lilly And Company Heterologous g-csf fusion proteins
WO2003093313A2 (en) 2002-04-29 2003-11-13 Baxter International Inc. Antagonists of factor viii interaction with low-density lipoprotein receptor-related protein
MXPA04012496A (es) 2002-06-21 2005-09-12 Novo Nordisk Healthcare Ag Glicoformos del factor vii pegilados.
CN1241946C (zh) 2002-07-01 2006-02-15 美国福源集团 对多种细胞具刺激增生作用的人血清白蛋白重组融合蛋白
FR2841904B1 (fr) 2002-07-03 2004-08-20 Inst Nat Sante Rech Med Analogues de facteurs x clivables par la thrombine
CN1480466A (zh) * 2002-09-03 2004-03-10 �й������ž�����ҽѧ��ѧԺ����ҽ 一类溶栓抗凝双功能融合蛋白及应用
AU2003265866A1 (en) 2002-09-03 2004-03-29 Vit Lauermann Targeted release
EP1444986A1 (en) 2003-02-07 2004-08-11 Aventis Behring GmbH Pharmaceutical preparation for the improved treatment of blood-clotting disorders
US20050176108A1 (en) 2003-03-13 2005-08-11 Young-Min Kim Physiologically active polypeptide conjugate having prolonged in vivo half-life
WO2004082640A2 (en) 2003-03-19 2004-09-30 New Century Pharmaceuticals, Inc. Human serum albumin conjugates with therapeutic compounds
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP3552627A1 (en) * 2003-05-06 2019-10-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Clotting factor-fc chimeric proteins to treat hemophilia
AU2004251145C1 (en) 2003-06-12 2011-04-14 Eli Lilly And Company GLP-1 analog fusion proteins
CA2537273A1 (en) 2003-09-05 2005-03-17 Gtc Biotherapeutics, Inc. Method for the production of fusion proteins in transgenic mammal milk
BRPI0417916A (pt) * 2003-12-31 2007-04-10 Merck Patent Gmbh proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada
NZ548612A (en) 2004-02-09 2009-11-27 Human Genome Sciences Inc Albumin fusion proteins comprising tandem GLP-1
DE602005019038D1 (de) 2004-05-04 2010-03-11 Novo Nordisk Healthcare Ag O-verknüpfte glykoformen von faktor vii und verfahren zu deren herstellung
EP1598367A1 (en) 2004-05-18 2005-11-23 ZLB Behring GmbH Modified coagulation factors with enhanced stability and their derivatives
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
BRPI0514396A2 (pt) 2004-08-17 2009-05-12 Csl Behring Gmbh polipeptìdeos dependentes de vitamina k modificada
WO2006027111A1 (en) 2004-09-06 2006-03-16 Zlb Behring Gmbh Modified coagulation factor viii with enhanced stability
AU2006233638A1 (en) 2005-04-14 2006-10-19 Csl Behring Gmbh Modified coagulation Factor VIII with enhanced stability and its derivates
MX2008001865A (es) 2005-08-12 2008-04-15 Human Genome Sciences Inc Proteinas de fusion de albumina.
EP1816201A1 (en) 2006-02-06 2007-08-08 CSL Behring GmbH Modified coagulation factor VIIa with extended half-life
KR101492422B1 (ko) 2006-04-11 2015-02-12 체에스엘 베링 게엠베하 치료용 폴리펩타이드의 생체내 회수율을 증가시키는 방법
WO2007146038A2 (en) 2006-06-07 2007-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
EP1867660A1 (en) 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
JP5448839B2 (ja) 2006-12-22 2014-03-19 ツェー・エス・エル・ベーリング・ゲー・エム・ベー・ハー インビボで長い半減期を有する修飾された凝固因子
US8283319B2 (en) 2007-02-12 2012-10-09 Csl Behring Gmbh Therapeutic application of Kazal-type serine protease inhibitors

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