HU219682B - Módosított VII faktor - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya eljárás a szöveti faktornak a vérerek újbólielzáródásának (resztenózis), a vérlemezek felgyűlésének gátlására, amiabból áll, hogy a betegnek olyan készítmény terápiás hatásúmennyiségét juttatják be, mely a katalitikus központjában legalább egyolyan módosítással rendelkező VII faktort tartalmaz, mely módosításlényegében gátolja a VII faktor X vagy IX plazmafaktorokat aktiválóképességét. ŕ

Description

KIVONAT

A találmány tárgya eljárás a szöveti faktornak a vérerek újbóli elzáródásának (resztenózis), a vérlemezek felgyűlésének gátlására, ami abból áll, hogy a betegnek olyan készítmény terápiás hatású mennyiségét juttatják be, mely a katalitikus központjában legalább egy olyan módosítással rendelkező VII faktort tartalmaz, mely módosítás lényegében gátolja a VII faktor X vagy IX plazmafaktorokat aktiváló képességét.

A leírás terjedelme 20 oldal (ezen belül 1 lap ábra)

HU 219 682 B

HU 219 682 Β

A jelen találmány antikoagulánsként alkalmazható fehérjékkel foglalkozik. Közelebbről, a jelen találmány a VII faktor olyan módosított alakjaival foglalkozik, melyek gátolják a véralvadást és a szöveti faktort.

A véralvadás különféle vérkomponenseknek vagy -faktoroknak bonyolult kölcsönhatásából álló folyamat, mely végül a fibrinalvadék megjelenéséhez vezet. A vérkomponensek, melyek részt vesznek a koagulációs ,Jcaszkád”-nak nevezett folyamatban, általában proenzimek vagy zimogének, olyan enzimológiailag inaktív fehérjék, melyek egy aktivátor - mely maga is egy aktivált alvadási faktor - hatására proteolitikus enzimekké alakulnak. Ezen az átalakuláson átment faktorokat, melyeket általában „aktív faktoroknak” neveznek, kis „a” betűvel jelölik (például Vlla faktor).

Aktivált X faktor („Xa”) szükséges ahhoz, hogy a protrombin trombinná alakuljon, amelyik azután a fibrinogént alakítja át fibrinné, ami a fibrinolvadék keletkezésének befejező lépése. Az X faktor aktiválására két rendszer vagy folyamat szolgál. Az „intrinsic” folyamat azokat a reakciókat jelenti, melyek a trombin keletkezését csak a plazmában lévő faktorok felhasználásával valósítják meg. A proteázok közvetítette aktivációk sorozata végül a IXa faktort eredményezi, mely a Villa faktorral együtt a X faktort Xa faktorrá hasítja. Hasonló proteolízissel hat a véralvadás „extrinsic” folyamatában a Vlla faktor és kofaktora, a szöveti faktor. A szöveti faktor membránhoz kötött fehérje, és normális körülmények között nem található meg a plazmában. A vérér sérülésekor azonban összekapcsolódhat a Vlla faktorral, mely komplex Ca⁺⁺ és foszfolipid jelenlétében katalizálja a X faktor vagy a IX faktor aktiválódását [Nemerson és Gentry, Biochem., 25:4020-4033 (1986)]. Noha a két koagulációs folyamatnak a viszonyított jelentősége a hemosztázisban nem ismert, az utóbbi években megállapították, hogy a VII faktornak és a szöveti faktornak kulcsszerepe van a véralvadás szabályozásában.

A VII faktor olyan nyomokban lévő plazma-glikoprotein, amelyik egyes láncú zimogénként kering a vérben. A zimogén katalitikusán inaktív [Williams és munkatársai, J. Bioi. Chem., 264: 7536-7543 (1989); Rao és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 6687-6691 (1988)]. Az egyes láncú VII faktort kettős láncú Vlla faktorrá alakíthatja át a Xa, XHa, IXa faktor és a trombin in vitro. A Xa faktorról feltételezik, hogy a VII faktor fő fiziológiai aktivátora. Hasonlóan a hemosztázisban részt vevő néhány más plazmaproteinhez, a VII faktor aktivitása is K-vitamin-függő, amennyiben a fehérje aminoterminálisán csoportba rendeződő glutaminsavak gamma-karboxilációja K-vitamint igényel. Ezekre a gamma-karboxilált glutaminsavakra a VII faktor foszfolipidekkel való kölcsönhatásánál van szükség, mely kölcsönhatásban fém vesz részt.

A VII faktor zimogén aktivált kettős láncú molekulává való átalakulása a molekula középtáján elhelyezkedő egyik belső peptidkötésének a felhasítása révén valósul meg. Az emberi VII faktor aktiválásának hasítóhelye az Arg|₅₂-Ile₁₅₃ kötésnél van [Hagen és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2412-2416 (1986);

Thim és munkatársai, Biochem., 27: 7785-7793 (1988), mindkét cikk referenciaként beépített ezen bejelentésbe], A szarvasmarha VII faktor ugyancsak az Argi₅₂-Ilei₅3 kötés hasításával aktiválódik [Takeya és munkatársai, J. Bioi. Chem., 263:14 868-14 877 (1988)]. Szöveti faktor, foszfolipidek és kalciumionok jelenlétében a kettős láncú Vlla faktor korlátozott proteolízissel gyorsan aktiválja a X és IX faktorokat.

Gyakran szükséges, hogy a beteg koagulációs kaszkádját szelektíven blokkoljuk. Heparin, kumarin, kumarinszármazékok, indándionszármazékok és más hatóanyagok használhatók fel véralvadásgátlóként például a vesedialízis alatt, a mélyvénás trombózis kezelésére, a disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC) kezelésére, és más egészségkárosodásban szenvedőknél, így például dialízisnél heparinos vagy - testen kívül citrátionos kezelés (4 500 309 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) alkalmazható, hogy megakadályozzuk a dialízis alatt a véralvadást. Heparint használnak a mélyvénás trombózis megelőzésére is a sebészeti beavatkozásnak alávetett betegeknél.

A heparinnal vagy más antikoagulánssal történő kezelésnek azonban nem kívánt mellékhatásai lehetnek. A rendelkezésre álló antikoagulánsok általában az egész testben hatnak, és nem speciálisan az alvadók helyén. A heparin például súlyos vérzést okozhat. Továbbá a körülbelül 80 perces felezési ideje miatt a heparin gyorsan eltűnik a vérből, gyakori adagolást igényelve. Minthogy a heparin az antitrombin (AT III) kofaktoraként működik, és az AT III gyorsan eltűnik a DIC kezelésekor, gyakran nehéz fenntartani a kellő heparindozírozást, és folyamatosan mérni kell az AT III és a heparin koncentrációját. Hatástalan a heparin akkor is, ha az AT III szintje extrém módon lecsökken. Továbbá a hosszabb ideig tartó heparinos kezelés fokozhatja a vérlemezek aggregációját is, csökkentve a vérlemezek számát, és közreműködik a csontritkulás kialakulásában. Az indándionszármazékoknak úgyszintén lehet toxikus mellékhatásuk.

A fent röviden ismertetett antikoagulánsokon túl, néhány természetes fehérjéről is megállapították, hogy véralvadásgátló hatásuk van. így például Reutelingsperger (4 736 018 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) a szarvasmarha aortájából és az emberi köldökvénából, artériákból izolált véralvadásgátló fehérjéket. Maki és munkatársai emberi méhlepényből származó antikoaguláns fehérjéket fedeztek fel (4 732 891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Ezenkívül az AT ΠΙ-t gyógyászati céllal antikoagulánsként ajánlják [Schipper és munkatársai, Láncét, 1 (8069):854-856 (1978); Jordán, 4 386 025 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; Bock és munkatársai, 4 517 294 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom],

Ateroszklerózisnál az érelváltozás kialakulásában, az érrekonstrukció után vagy más érsérülésre való reagálásnál fontos esemény a simaizomsejtek osztódása a vérér falában. így például az ateroszklerózis kezelése gyakran jelenti a blokkolt ér kiiktatását érplasztikával, endarterektómiával, redukciós aterektómiával vagy sönt beültetésével, vagyis olyan sebészeti eljárásokkal,

HU 219 682 Β melyeknél az ateroszklerotikus „plakkokat” összenyomják vagy katéterezéssel eltávolítják (érplasztika), bemetszéssel eltávolítják a vérér falából (endarterektómia) vagy természetes vagy szintetikus vezetékkel áthidalják. Ezeknél az eljárásoknál eltávolítják a vérér endotheliumát, megsértik az alatta fekvő érbelhártyaréteget és elpusztulnak a tunica médiához tartozó simaizomszövetek. Az ilyen sérülést a simaizomszövetek szaporodása, és az érbelhártyába való migráció követi, ami jellemzően bekövetkezik néhány héten belül, és tarthat a sérülés utáni hatodik hónapig, majd leáll, ha a felső endotheliális réteg helyreállt. Embernél ezek az elváltozások 20% sejtből és 80% sejten kívüli állományból állnak.

Az érplasztikával, endarterektómiával vagy sönt beültetésével kezelt betegeknek körülbelül 30%-ánál vagy még nagyobb arányban a trombózis léphet fel és/vagy a simaizomsejtek érbelhártyában való szaporodása a vérér újbóli elzáródását és következésképpen a helyreállító műtét sikertelenségét eredményezi. A vérér műtétet követő ilyen elzáródását nevezik resztenózisnak.

Továbbra is igény van olyan javított antikoaguláns készítményekre, melyek viszonylag alacsony dózisban adhatók, és nem idézik elő azokat a nemkívánatos mellékhatásokat, melyek a hagyományos antikoaguláns készítményekkel járnak. A jelen találmány tejesíti ezt az igényt, olyan véralvadásgátlókat nyújtva, melyek specifikusan a sérülés helyén hatnak, további más előnyös tulajdonságaik is vannak.

A találmány tehát olyan új készítményekkel szolgál, melyek antikoaguláns tulajdonságokkal rendelkező, módosított VII faktort tartalmaznak. A módosított VII faktor készítmények a szöveti faktort is gátolják. A módosított VII faktor szekvenciájában legalább egy aminosavmódosítás van, ahol a módosítást úgy választjuk meg, hogy lényegesen csökkenjen az aktivált VII faktornak a X vagy XI plazmafaktorok aktiválását katalizáló képessége, és ezáltal képes legyen gátolni az alvadást. Az új VII faktor aktív helye legalább egy aminosav cseréjével módosított, és ez a módosított forma képes kapcsolódni a szöveti faktorhoz. A módosított VII faktor készítmény általában a lényegében tiszta állapotban lévő anyag.

A találmány szerinti vegyületek különösen alkalmasak a különféle betegségben szenvedők kezelésére, ha gyógyszerkészítmények alakjában adjuk be a véralvadással kapcsolatos állapotok kezelésére.

A módosított VII faktor molekuláknak, mely képesek megkötni a szöveti faktort, de lényegesen csökkent katalitikus képességük van más faktorok aktiválására a véralvadási kaszkádban, hosszabb felezési ideje lehet a plazmában, és ezáltal hosszabb a véralvadásgátló hatásuk, mint más antikoagulánsnak. A találmány szerinti vegyületek tehát olyan állapotok kezelésére javallottak, melyeknél rendszerint antikoagulánsokat alkalmaznak, mint például a mélyvénatrombózis, a tüdőembólia, a hűdés, a disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC) és a szívinfarktus. A készítmények felhasználhatók a vérér újbóli szűkülésének vagy a vérlemezek lerakódásának és az említettekkel kapcsolatos rendellenességeknek a megakadályozására. A koagulációnak, a vérér újbóli beszűkülésének vagy a vérlemezek lerakódásának a megakadályozására szolgáló eljárás például abból áll, hogy a betegnek olyan módosított VII faktort tartalmazó gyógyszerkészítményt adunk be, mely faktor katalízist végző Ser₃₄₄, AsP₂₄₂ és His₁₉₃ triádjának legalább egyik aminosava kicserélt. A kezeléshez olyan mennyiségű készítményt használunk, mely hatásosan gátolja a véralvadást, a vérér resztenózisát, illetve a vérlemezek lerakódását.

A humán célú gyógyszerkészítmények általában a módosított humán VII faktort és gyógyászati szempontból alkalmazható vivőanyagokat és puffereket tartalmaznak.

A humán és szarvasmarha VII faktor előnyösen az aktív hely Ser₃₄₄ aminosavánál módosított oly módon, hogy a Ser-t Gly-nel, Met-nal, Thr-nal vagy - legelőnyösebben - Ala-nal cseréljük ki. A csere történhet kizárólag az említett helyen vagy érintheti a katalitikus triád - melyhez hozzátartozik még a His₁₉₃ és az Asp₂₄₂ is - más helyét vagy helyeit is.

Egy másik szempontból a találmány azokra a polinukleotidmolekulákra vonatkozik, melyek két működőképesen kapcsolódó szekvenciából állnak. A két szekvencia kódolja a pre-pro-fehérjét és a K-vitamin-függő plazmaprotein gla-doménjét, illetve a lag-domén nélküli VII faktor proteint. Expresszálódáskor a nevezett polinukleotid olyan módosított VII faktor molekulát kódol, mely lényegesen nem aktiválja a X és a IX faktorokat, és képes kapcsolódni a szöveti faktorral. Az említett polinukleotid által expresszált módosított VII faktor molekula biológiailag aktív antikoaguláns, azaz képes gátolni a koagulációs kaszkádot és ezáltal a fibrinalvadék vagy fibrinrög kialakulását. Hogy a módosított VII faktort expresszáljuk, a polinukleotidmolekulát emlőssejtvonalba, például BHK, BH 570 vagy 293 sejtvonalakba transzfektáljuk.

Az ábra a Ser₃₄₄ Alá cserével módosított VII faktor DNS-szekvenciáját hordozó expressziós vektor felépítését mutatja. A használt jelölések: „0-1” az adenovírus 5 0-1 térképegység szekvenciája; „E” az SV40 enhancer; MLP az adenovírus fő késői promotere (major laté promoter), SS a kapcsolóhelyek készlete; pA az SV40-ből származó poliadenilációs szignál a késői orientációban.

A jelen találmány új, módosított VII faktorral szolgál, melynek antikoaguláns aktivitása van. A VII faktor lehet zimogén alakjában (azaz egyes láncú molekula formájában) vagy az aktivációs helyén elhasított állapotban.

A módosított VII faktor készítményei alkalmasak az emberbe és különböző emlősökbe való bejuttatásra azzal a céllal, hogy gátoljuk a koagulációs kaszkádot. A módosított VII faktor beadható a betegeknek más antikoagulánsok kíséretében vagy azok helyett.

A VII faktor fontos szerepet játszik a véralvadás kaszkádjában, különösen vonatkozik ez az „extrinsic” folyamatra. Ha a keringő plazmában inaktív, egyes szálú zimogén fehérjeként lévő faktor aktiválódik, a Vlla faktor a szöveti faktorral és kalciumionokkal kombiná3

HU 219 682 Β lódva a X faktort Xa faktorrá, a IX faktort IXa faktorrá aktiválja, ami végeredményként a fíbrinalvadék keletkezéséhez vezet.

A jelen találmányban leírtak lehetőséget nyújtanak arra, hogy a koagulációs kaszkád eseménysorozatát meggátoljuk, megakadályozva a IX és X faktorok Vlla faktorral való aktiválását. A találmány szerinti VII faktor protein katalitikus helye oly módon módosított, hogy ezáltal csökken a Vlla faktor katalitikus aktiválóhatása, noha a molekula továbbra is képes hozzákötődni a szöveti faktorhoz. A módosított VII faktor verseng a VII faktorral és/vagy a Vlla faktorral a szöveti faktorhoz történő kötődésért.

A jelen találmány egyik kivitelezési módja, hogy a katalitikus központ vagy triád kémiai származékképzésével gátoljuk a VII faktor katalitikus aktivitását. A származékképzéshez a VII faktort például irreverzíbilis gátlóanyaggal - mint amilyen a szerves foszforvegyűlet, a szulfonil-fluorid, a peptid-halo-metil-keton vagy az azapeptid - reagáltatjuk vagy acilezzük. Előnyös peptid-halo-metil-keton a PPACK (D-Phe-ProArg-klór-metil-keton; lásd: 4 318 904 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, mely a találmányba referenciaként beépített) és a DEGRck (denzil-GluGly-Arg-klór-metil-keton).

A találmány egy másik kivitelezési módjánál a Vlla faktor katalitikus aktivitását oly módon gátoljuk, hogy aminosavakat cserélünk ki, építünk be vagy ejtünk ki. Az előnyös kivitelezési módnál aminosavcsere történik a VII faktor katalitikus triádjának aminosavszekvenciájában. Katalitikus triádnak nevezzük a Vlla faktor katalitikus helyén közreműködő aminosavakat tartalmazó régiót. A katalitikus triádban a helyettesítés, beépülés vagy deléció általában azokat az aminosavakat érinti, vagy azon aminosavak szomszédságában történik, melyek a katalitikus helyet kialakítják. A humán és szarvasmarha VII faktor protein katalitikus „triádját” képező aminosavak: a Ser₃₄₄, Asp₂₄₂ és a His₁₉₃ (az index az aminosavnak a szekvenciában elfoglalt helyét jelzi). Más emlősfajok VII faktorának katalitikus helye a rendelkezésre álló technikákkal meghatározható, többek között a fehéijeizolálás és az aminosavszekvencia analízise útján. A katalitikus hely felderíthető oly módon is, hogy a szekvenciát más szeril-proteázok - főként a kimotripszin - szekvenciája mellé állítjuk, mely proteázok aktív helyét előzőleg már meghatároztuk [Singler és munkatársai, J. Mól., Bioi., 35: 143-164 (1968)]. Az aktív helyek megállapíthatók az analógiák alapján.

Az aminosav helyettesítését, beépítését vagy delécióját úgy hajtjuk végre, hogy ezzel meggátoljuk vagy másként megakadályozzuk a X és/vagy IX faktorok Vlla faktorral való aktiválását. A VII faktort azonban úgy kell módosítani, hogy továbbra is megtartsa a valódi VII és/vagy Vlla faktorral való versengését a koagulációs kaszkádban a szöveti faktorhoz kötődésért. Ez a versenyképesség könnyen megállapítható, például az itt leírt alvadási vizsgálattal vagy a kompetíciós kötődési vizsgálattal, ahol például olyan sejtvonalat használunk, amelynél a sejtfelszínen szöveti faktor található. Ilyen a humán J82 húgyhólyagkarcinóma-sejtvonal [Sokai és munkatársai, J. Bioi., Chem., 264: 9980-9988 (1989); referenciaként beépítve].

A humán és szarvasmarha VII faktor katalitikus helyét képező Ser₃₄₄, Asp₂₄₂ és His_lg3 aminosavak helyettesíthetők vagy kiejthetők. A jelen találmány szerint előnyös csak egyetlen aminosavat megváltoztatni, ezáltal csökkentjük annak valószínűségét, hogy nő a molekula antigén jellege, vagy hogy lehetetlenné tesszük a szöveti faktorhoz való kötődését. Elvégezhetjük azonban kettő vagy több aminosav megváltoztatását is (helyettesítést, hozzáadást vagy deléciót) és kombinálhatjuk is a helyettesítés(eke)t, a hozzáadás(oka)t és deléció(ka)t. Az emberi és szarvasmarha VII faktornál előnyös a Ser₃₄₄ aminosavat Alá aminosavval kicserélni, de helyettesíthetjük Gly, Met, Thr vagy más aminosavakkal is. Előnyös az Asp-t Glu-val és a His-t Lys-nel vagy Arg-nal helyettesíteni. Általában a helyettesítésnél az aminosavakat úgy kell megválasztani, hogy a fehérje harmadlagos szerkezete a lehető legkevesebbet változzon. A helyettesítéshez használt aminosavak kiválasztásához eligazítást adhat Dayhoff és munkatársai modellje („Atlas of Protein Structure 1978”, Natl. Biomed. Rés. Found., Washington, D. C.; referenciaként beépítve). Az ember a szarvasmarha vagy más faj megfelelő VII faktorának katalitikus helyén elvégezhetjük a fent leírt változtatásokat, és a nyert fehérjét az itt leírt módon megvizsgálhatjuk, hogy a kívánt mértékben gátolt-e a katalitikus aktivitása és rendelkezik-e antikoaguláns hatással. A módosított VII faktor katalitikus aktivitása lényeges mértékben gátolt, általában gyengébb, mint a megfelelő faj természetes VII faktora aktivitásának 5%-a, de még előnyösebb, ha nem éri el az 1%-át.

A jelen találmány szerinti fehérjék a rekombináns DNS-technikák alkalmazásával előállíthatók. Általában egy klónozott természetes VII faktor DNS-szekvenciát módosítunk oly módon, hogy a kívánt fehérjét kódolja. Ezt a módosított szekvenciát azután beépítjük egy expressziós vektorba, amivel a gazdasejtet transzformáljuk vagy transzferáljuk. Előnyös gazdasejtek a magasabb rendű eukarióták sejtjei, különösen a tenyésztett emlőssejtek. Az ember VII faktor teljes nukleotidés aminosavszekvenciája ismert. Lásd a 4 784 950 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmat (referenciaként a bejelentésbe beépítve), mely leírja a humán VII faktor klónozását és expresszálását. A szarvasmarha VII faktor szekvenciáját Takeya és munkatársai írták le [J. Bioi. Chem., 263: 14 868-14 872 (1988); referenciaként beépítve].

Az aminosavszekvencia megválasztására különféle eljárások állnak rendelkezésünkre. A DNS-szekvencia módosítása történhet helyspecifikus mutagenezissel. A helyspecifikus mutagenezis technikái jól ismertek a szakterületen, erre vonatkozó leírást találunk például Zoller és Smith cikkében [DNA; 3: 479-488 (1984)]. Ezek szerint a VII faktor nukleotid- és aminosavszekvenciájának a felhasználásával elvégezhetjük a választott változtatás(oka)t.

A találmány szerinti módosított VII faktor magában foglalja azokat a fehérjéket, melyek aminoterminális ré4

HU 219 682 Β sze (gla dómén) a K-vitamin-függő plazmaprotein IX faktor, a X faktor, a protrombin, a C protein, S protein vagy Z protein egyikének gla doménjével helyettesített. A K-vitamin-függő plazmaproteinek gla doménjét gamma-karboxi-glutaminsavak jelenléte jellemzi, és általában 30-40 aminosav hosszúságú, olyan C-terminálissal, ami megfelel az exon-intron határok helyének az illető génekben. A heterogén gla doménnel rendelkező VII faktor előállítására szolgáló eljárásokat a

784 950 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (referenciaként beépítve) írja le.

A jelen találmányban felhasznált DNS-szekvenciák általában egy pre-pro-peptidet kódolnak a VII faktor protein amino-terminálisánál, hogy a megfelelő poszttranszlációs folyamatot (például a glutaminsavak gamma-karboxilálódását) és a gazdasejtből való kiválasztódást elérjük. A pre-pro-peptid lehet a VII faktoré vagy más K-vitamin-fiiggő plazmaproteiné, mint amilyen a IX faktor, a X faktor, a protrombin, a C protein vagy az protein. Amint az a szakemberek előtt világos, a módosított VII faktor aminosavszekvenciájának további módosításai is elvégezhetőek, amennyiben ezek a változtatások lényegesen nem rontják a fehérje véralvadásgátló hatását. így például a katalitikus triádban módosított VII faktor megváltoztatható az aktivációs hasítóhelyen is, hogy ezzel megakadályozzuk a VII faktor zimogénjének aktivált kettős láncú alakba való átalakulását. Ilyen eljárást ír le az 5 288 629 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (referenciaként beépítve).

A jelen találmányban alkalmazott expressziós vektorok a klónozott gén vagy cDNS transzkripcióját irányítani képes promotert tartalmaznak. A tenyésztett emlőssejtek esetében előnyösek a víruspromoterek és a sejtpromoterek. A víruspromoterekhez tartozik az SV40 promoter [Subramami és munkatársai, Mól. Cell. Bioi, 1: 854-864 (1981)] és a CMV promoter [Boshart és munkatársai, Cell, 41: 521-530 (1985)]. Különösen előnyös víruspromoter az adenovírus 2-ből származó fő késői promoter [Kaufinan és Sharp, Mól. Cell. Bioi., 2: 1304-1319 (1983)]. A sejtpromoterek közé tartozik az egér kappa-gén-promotere [Bergman és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7041-7045 (1983)] és az egér V_H-promoter [Loh és munkatársai, Cell., 33: 85-93 (1983)]. Különösen előnyös sejtpromoter az egér metallotionein-I promoter [Palmiter és munkatársai, Science, 222: 809-814 (1983)]. Az expressziós vektorok tartalmazhatnak RNS-illeszkedési helyeket is a promotertől lefelé és magától a VII faktor szekvenciájának inszerciós helyétől felfelé. Előnyös RNS-illeszkedési helyek nyerhetők az adenovírus- és/vagy immunoglobulin-génekből. Ugyancsak tartalmaznak az expressziós vektorok egy poliadenilációs szignált az inszerciós helytől lefelé elhelyezkedve. Különösen előnyös poliadenilációs szignál az SV40 korai vagy késői poliadenilációs szignálja (Kaufinan és Sharp, lásd fent), az adenovírus 5 E/b régió poliadenilációs szignálja, a humán növekedésihormon-gén terminátor [DeNoto és munkatársai, Nuc. Acids Rés., 9: 3719-3730 (1981)] vagy a humán és szarvasmarha VII faktor gén poliadenilációs szignálja. Az expressziós vektorok tartalmazhatnak nem kódoló vírusleader-szekvenciát is, mint amilyen az adenovírus 2 háromrészű leadere, a promoter és az RNS-illeszkedési helyek között elhelyezkedve; továbbá enhancerszekvenciát, mint amilyen az SV40 enhancere.

A tenyésztett emlőssejtbe a klónozott szekvenciát például kalcium-foszfát közvetítette transzfekcióval [Wigler és munkatársai, Cell, 14: 725-732 (1978); Corsaro és Pearson, Somatic Cell Genetics, 7: 603-616 (1981); Graham és Van dér Eb, Virology, 52d: 456-467 (1973)] vagy elektroporációval [Neumann és munkatársai, EMBO J., 1: 841-845 (1982)] juttatjuk be. Az exogén DNS-t expresszáló sejtek azonosítására és szelektálására a kérdéses gének vagy cDNS mellett általában beviszünk egy gént, ami egy szelektálható fenotípust biztosít (szelektálómarker). Előnyös szelektálómarkerek közé tartoznak azok a gének, melyek hatóanyagokkal - például neomicin, higromicin és metotrexát - szembeni rezisztenciát nyújtanak. Előnyös amplifikálható szelektálómarker a dididrofolát-reduktáz (DHFR) szekvenciája. A szelektálómarkerek áttekintését adja Thilly („Mannalian Cell Technology”, Butterwork Publishers, Staneham, MA; referenciaként beépítve). A szelektálómarkerek választéka jól ismert a szakemberek előtt.

A szelektálómarkerek bevihetők a sejtbe a kérdéses gén bevitelével egy időben egy külön plazmidon vagy ugyanazon a plazmidon. Ha ugyanabban a plazmidban helyezkednek el, a kérdéses gén és a szelektálómarker lehet különböző promoter vagy közös promoter irányítása alatt, az utóbbi elrendezés egy dicisztronos üzenetet eredményez. Az ilyen típusok felépítése ismert a szakterületen [például Levinson és Simonsen, 4 713 339 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom]. Ugyancsak előnyös lehet „carrier-DNS”-ként ismert járulékos DNS-t is bejuttatni a sejtekbe.

Miután a sejtek felvették a DNS-t, megfelelő tápközegben tenyésztjük őket általában 1-2 napig, hogy megkezdődjön a kérdéses gén expressziója. A „megfelelő tápközeg” kifejezés olyan közeget jelent, mely tápanyagokat, valamint a sejtek növekedéséhez és a módosított VII faktor génjének kifejeződéséhez szükséges más alkotórészeket tartalmaz. A közeg általában szénforrást, nitrogénforrást, esszenciális aminosavakat, fehérjét és növekedési faktorokat tartalmaz. A gammakarboxilált módosított VII faktor előállításához a közeg tartalmaz még K-vitamint, előnyösen 0,1-5 pg/ml koncentrációban. Ezután végezzük el a hatóanyag-szelekciót, hogy kiválaszthassuk azokat a sejteket, melyek stabil módon expresszálják a szelekciós markert. Azoknál a sejteknél, ahol amplifikálódó szelekciós markert transzfektáltunk, növelhetjük a hatóanyag-koncentrációt, hogy a klónozott szekvenciák példányszámát megnöveljük, és ezáltal a kifejeződés mértékét fokozzuk. A stabilan transzfektált sejtek kiónjait ezután szűrővizsgálatnak vetjük alá a módosított VII faktor expresszálódása szempontjából.

A jelen találmány számára előnyös emlőssejtvonalak: a COS-1 (ATCC CRL 1650), a hörcsögújszülöttvesesejtvonal (BHK) és a 293 sejtvonal [ATCC CRL

HU 219 682 Β

1573; Graham és munkatársai, J. Gén. Virol., 36: 59-72 (1977)]. Előnyös BHK-sejtvonal a tk—tsl3 BHK-sejtvonal [Waechter és Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:1106-1110 (1982); referenciaként beépítve], amit a továbbiakban itt BHK 570 sejtekként említünk. A BHK 570 sejtvonal az American Type Culture Collectionben (12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852) van letétbe helyezve ATCC CRL 10314 lajstromszámon. Ezen túlmenően számos más sejtvonal is felhasználható a találmányhoz, ideértve a Rat Hep I (patkányhepatóma; ATCC CRL 1600), Rat Hep II (patkányhepatóma; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), humán tüdősejt (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) és a DUKX sejteket [Urlanb és Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, ΊΊ: 4216-4220 (1980)].

A jelen találmány szerint előállított módosított VII faktor anti-VII faktor antitestoszlopon tisztítható affinitáskromatográfiával. Különösen előnyösek a kalciumfüggő monoklonális antitestek, amint azt Wakabayashi és munkatársai [J. Bioi Chem., 261: 11 097-11 108 (1986)] és Thim és munkatársai [Biochem., 27: 7785-7793 (1988)] (mindkettő referenciaként beépítve) leírják. További tisztítás érhető el a szokásos kémiai tisztítási eljárásokkal, például HPLC-vel. Más tisztítási eljárások is ismertek a szakterületen és felhasználhatók a módosított VII faktornak tisztítására (általános összefoglaló: Scopes, R. „Protein Purification”, Spinger-Verlag, N. Y., 1982). Gyógyászati célra előnyös 90-95%-os vagy még előnyösebb 98-99%-os vagy még homogénebb, lényegében tiszta módosított VII faktort használni. Ha a VII faktort részlegesen vagy kellő homogenitásig tisztítottuk, felhasználható terápiás célra.

A találmány egyik megvalósítási módjánál a VII faktort az aktivációs helyénél hasítjuk, átalakítva a kettős láncú alakjává. Az aktiválás a szakterületen ismert módszenei elvégezhető, például a referenciaként beépített alábbi leírások szerint: Osferud és munkatársai, Biochemistry, 11: 2853-2857 (1972); Thomas, 4456 591 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; Hedner és Kisiel, J. Clin. Invest., 71: 1836-1841 (1983); vagy Kiesel és Fujikawa, Behring Inst. Mitt., 73: 29-42 (1983). A nyert módosított „Vlla faktort” azután az alábbiakban leírt módon készítménnyé feldolgozzuk és adagoljuk.

A találmány szerinti módosított VII vagy Vlla faktor vagy ezek gyógyszerkészítményei különösen alkalmasak embernél az intravaszkuláris koagulációval kapcsolatos különböző állapotok kezelésére. így például, noha a mélyvénás trombózis és a tüdőembólia a hagyományos véralvadásgátlókkal kezelhető, az itt ismertetett módosított VII vagy Vlla faktor felhasználható a magas rizikófaktora betegeknél, például akik műtéti beavatkozáson esnek át vagy pangásos szívelégtelenségben szenvednek, a trombuszembóliás komplikációk megelőzésére. Továbbá a módosított VII vagy Vlla faktor antagonistaként működhet a szöveti faktor által kiváltott koagulációnál, gátolva a trombin termelődését és ezáltal a fibrin kiválását. A módosított VII vagy Vlla faktor a szöveti faktor aktivitásának blokkolásán keresztül képes megakadályozni például a véralvadást, a trombózist vagy a vérlemezek lerakódását.

A találmány szerinti módosított VII vagy Vlla faktor különösen alkalmas az akut érsérülés következtében előálló érbelhártya-túlfejlődés vagy újbóli beszűkülés kezelésére. Az akut érsérülés gyorsan (néhány naptól néhány hónapig) zajlik le, ellentétben a krónikus érsérüléssel (például ateroszklerózis), ami a beteg élete folyamán alakul ki. Az akut érsérülést gyakran okozza sebészeti beavatkozás, például vérér-rekonstrukciók, ahol angioplasztikát, endarterektómiát, aterektómiát, érbeültetést vagy hasonló technikát alkalmaznak. A szöveti túlfejlődés (hiperplázia) kialakulhat utólagos válaszként is, például vérérbeültetésnél vagy szervátültetésnél. Minthogy a módosított VII faktor specifikusabb, mint a heparin, általában csak ahhoz a szöveti faktorhoz kötődik, mely a sérülés helyén válik erre kitetté, és minthogy a módosított VII faktor más koagulációs fehérjéket nem károsít, hatása erősebb, és kisebb a valószínűsége, hogy olyan vérzési komplikációkat okoz, mint a heparin, ha a mélyvénás trombózis megelőző megakadályozására használjuk. Egy 70 kg-os betegnél a mélyvénás trombózis gátlására szolgáló napi dózis 50 pg és 25 mg között van, előnyösen 1-10 mg. Az adagolást a sebészeti beavatkozást legalább 6 órával megelőzően kell elkezdeni, és folytatni kell legalább addig, amíg a megműtött járóbeteggé nem válik. A resztenózis kezelésére használt módosított VII vagy Vlla faktor dózisa betegenként változik, de általában a fent megadott dózistartományba esik.

A koszorúér-betegségek kezelésének jelenlegi törekvése a mechanikus beavatkozás felé mutat, amikor is eltávolítják vagy helyettesítik a zavarokat okozó plakkanyagot, azzal a céllal, hogy helyreállítsák a szükséges véráramot a szívkoszorú-verőérben. A mechanikai beavatkozás változatos formái ellenére - ideértve a ballon-érplasztikát, a reduktív ateroektómiát, az érszűkületes szakaszok kicserélését, a lézertechnikát vagy a rotoblatort - ezek a technikák hatékonysága korlátozott, minthogy a kezelést követő 6 hónapon belül az esetek körülbelül 40%-ánál újbóli beszűkülés (resztenózis) lép fel.

A resztenózisról úgy vélik, hogy biológiai folyamatok összetett kölcsönhatásának az eredménye, ideértve a vérlemezek leülepedését és a vérrögképződést, a kemotaxisos és mitogénfaktorok felszabadulását, a vérér simaizomsejtjeinek a dilatált artériaszegmens érbelhártyájába való migrációját és szaporodását.

A vérlemezek mechanikai sérülés helyén történő felhalmozódásának gátlásával korlátozni lehet embernél a resztenózis mértékét. A GpIIb/IIIa monoklonális vérlemezantitestek terápiás felhasználása képes korlátozni embernél a resztenózis mértékét [Califf és munkatársai, N. Engl. J. Med., 330: 956-961 (1994)]. Az antitestek hozzákötődnek a vérlemezek felületén lévő GpIIb/IIIa receptorokhoz, és ezáltal megakadályozzák a vérlemezek összegyűlését. Ezek az adatok arra utalnak, hogy ha az emberi szívkoszorú-verőérben a mechanikai sérülés helyén gátoljuk a vérlemezek felhalmozó6

HU 219 682 Β dását, az jótékony hatással van az események végső kimenetelére. Noha az akut érsérülések helyén vérlemezek felhalmozódása történik, ezeken a helyeken a trombinképződés lehet a felelős a vérlemezek aktiválódásáért és az ezt követő összegyűlésükért.

Amint az alábbi példák mutatják, a jelen találmány szerinti módosított Vlla faktor képes hozzákötődni a sejtfelszíni szöveti faktorhoz. így például a DEGR-VIIa faktor ugyanolyan vagy még nagyobb affinitással kötődik a sejtfelszíni szöveti faktorhoz, mint a természetes Vlla faktor. A DEGR-VIIa faktornak azonban nincs enzimatikus aktivitása, mégis hozzákötődik a szöveti faktorhoz, és a természetes Vlla faktor kompetitív antagonistájaként működik, ezáltal megakadályozza a trombin keletkezéséhez vezető koaguláció extrinsic folyamatának további lépéseit.

A szöveti faktorhoz kötődő, találmány szerinti módosított Vlla faktor molekulák megakadályozzák az érsérülés helyén a vérlemezek felhalmozódását, blokkolva a trombinképződést és a fibrin ezt követő keletkeződését.

Annak köszönhetően, hogy a DEGR-VIIa faktor az akut érsérülés helyén blokkolja a trombin keletkezését és korlátozza vérlemezek leülepedését, megőrzi ugyan a szöveti faktorhoz való kötődési képességét, de elveszti a Vlla faktor enzimatikus aktivitását, felhasználható a vérér újbóli beszűkülésének megakadályozására.

A megállapított mélyvénás trombózisnál és/vagy tüdőembóliánál a módosított VII faktor feltöltő napi dózisa 50 pg és 25 mg között, a fenntartó napi dózisa pedig 500 pg és 10 mg között van a beteg testsúlyától és az állapot súlyosságától függően. Minthogy a módosított VII faktor infúziójánál a vérzéssel kapcsolatos komplikációknak kisebb a valószínűsége, a trombektómiát vagy embolektómiát alkalmazó sebészeti beavatkozások alatt vagy után a módosított VII faktor helyettesítheti vagy csökkentheti a heparindózist.

A jelen találmány szerinti módosított VII faktor készítmények ugyancsak felhasználhatók a szívembólia megakadályozására és a trombózisos rohamok kezelésére. A vérzéses komplikációk alacsony valószínűsége és a módosított VII faktor szelektivitása miatt a módosított VII faktor beadható a roham áldozatának, és megakadályozhatja az elzáródásos artériatrombusz kiteqedését. A módosított VII faktor beadott mennyisége betegenként változik a roham természetétől és súlyosságától függően, de általában az alábbiakban megadott tartományba esik.

A módosított VII faktor gyógyszerkészítményei alkalmasak az akut miokardiális infarktus kezelésére, minthogy a módosított VII faktor in vivő gátolja a koagulációt. A miokardiális infarktus akut fázisa alatt a módosított VII faktor beadható szöveti plazminogén aktivátorral vagy sztreptokinázzal. Akut miokardiális infarktusnál a módosított VII faktor feltöltő napi dózisa legalább 1-25 mg, a fenntartó napi dózis 500 pg és 10 mg között van.

A jelen találmány szerinti módosított VII faktor alkalmas a disszeminált intravaszkuláris koaguláció (DIC) kezelésére. A DIC-ben szenvedő betegre jellemző, hogy sok hajszáleres vérrög alakul ki és gyakran súlyos vérzési problémák jelentkeznek az esszenciális alvadási faktorok megfogyatkozása miatt. A szelektivitásnak köszönhetően a módosított VII faktor nem súlyosbítja a DIC-cel járó vérzési problémákat, mint azt a hagyományos antikoagulánsoknál tapasztalhatjuk, sőt csökkenti vagy meggátolja a további fibrinalvadékok keletkezését a hajszálérhálózatban.

A gyógyszerkészítmény aszerint állítható össze, hogy parenterálisan, helyileg vagy lokálisan kívánjuk alkalmazni megelőző és/vagy gyógykezelési céllal. A gyógyszerkészítményt előnyös parenterálisan bejuttatni, azaz intravénásán, szubkután vagy intramuszkulárisan. Parenterális bevitelhez a találmány szerinti készítmény a módosított VII faktor megfelelő hordozóban, előnyösen vizes közegben készült oldatából áll. A vizes közeg különféle lehet, például víz, pufferolt víz, 0,4%-os sóoldat, 0,3%-os glicinoldat és hasonlók. A módosított VII faktort liposzómakészítményként is célba juttathatjuk a sérülés helyéhez.

A liposzómapreparátumokat a referenciaként itt beépített 4 837 028, 4 501 728 és 4 975 282 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak írják le. A készítmények a hagyományos, jól ismert technikákkal sterilezhetők. A nyert vizes oldatot felhasználásra készen csomagolhatjuk vagy aszeptikus körülmények között szüljük, fagyasztva szárítjuk, és a szárított preparátumból a felhasználás előtt steril vizes oldatot készítünk. A készítmények gyógyászati szempontból alkalmazható adalékanyagokat tartalmazhatnak, melyek a megfelelő fiziológiás körülményeket biztosítják, így pH-beállító és pufferoló ágenseket, ozmotikus körülményeket beállító ágenseket és hasonlókat. Ilyen célra használható például a nátrium-acetát, nátrium-laktát, nátrium-klorid, kálium-klorid, kalcium-klorid stb. A módosított VII faktor koncentrációja ezekben a készítményekben széles határok között változhat, általában kevesebb, mint 0,5%-tól 15 vagy 20 tömeg%-ig, rendszerint azonban a koncentráció 1% vagy legalább 1%. A koncentrációt elsősorban a folyadék térfogata, viszkozitása stb. határozza meg összhangban a bevitel választott módjával.

Az intravénás infúzióra szolgáló tipikus gyógyszerkészítmény 250 ml steril Ringer-oldatot és 10 mg módosított VII faktort tartalmaz. A parenterálisan bevihető készítmények elkészítésének tényleges módszerei jól ismertek és nyilvánvalóak a szakterületen; részletesebb leírásuk például megtalálható a „Remington’s Pharmaceutical Science” kézikönyvben [16. kiadás, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA (1982); referenciaként beépítve].

A módosított VII faktort tartalmazó készítmények alkalmazhatók megelőző és/vagy terápiás kezelési céllal. Terápiás céllal akkor adjuk be a készítményt a kezelendő személynek, ha az a fent nevezett betegségek valamelyikében szenved. Olyan mennyiséget alkalmazunk, ami elegendő a gyógyításhoz vagy legalább a betegség vagy komplikáció lefékezéséhez. Azt a mennyiséget, mely ezekhez szükséges „terápiásán hatásos dózisnak” nevezzük. A tényleges mennyiség függ a beteg7

HU 219 682 Β ség vagy sérülés súlyosságától, a beteg súlyától és általános állapotától, de a módosított VII faktor napi dózisa egy 70 kg testsúlyú személynél nagy általánosságban 0,5-10 mg. Figyelembe kell azonban venni, hogy a találmány szerinti hatóanyagokat súlyos betegségeknél vagy sérült állapotokban használjuk. Ilyen esetekben figyelembe véve azt is, hogy idegen anyagról van szó, ami ugyan minimalizálja a mennyiséget, de a módosított VII faktor immunogenitási problémákat embernél nem okoz, és a kezelőorvos szükségét érezheti, hogy a módosított VII faktor készítményét lényeges feleslegben adja be.

Megelőzéses alkalmazásnál a módosított VII faktort tartalmazó készítményeket akkor adjuk be a páciensnek, ha hajlamos a betegségre vagy sérülésre vagy egyéb más okból az ilyen veszély fennáll. Ezzel fokozzuk a kezelt személy saját antikoagulatív képességeit. Az ekkor használt mennyiséget nevezzük „megelőző hatású dózisnak”. Ennek pontos mennyisége ugyancsak a páciens egészségi állapotától és testtömegétől függ, de egy 70 kg-os embernél a napi adag 0,1-25 mg, leginkább 0,5-10 mg.

A készítményt beadhatjuk egyszeri vagy osztott adagban, mely beosztást a kezelőorvos szabja meg. Járóbetegeknél, akik napi szint fenntartását igénylik, a módosított VII faktor beadható folyamatos infúzióval, például egy hordozható pumparendszer segítségével. A módosított VII vagy Vlla faktor lokális célhoz vivése elvégezhető például perfúzióval, kettős ballonkatéterrel vagy más jól bevált módszerrel. Minden esetben a gyógyszerkészítménynek a találmány szerinti módosított VII faktor olyan mennyiségét kell tartalmaznia, mely elegendő a beteg hatásos kezeléséhez.

Az elmondottak szemléltetésére az alábbiakban példákat adunk meg. A példák kizárólag szemléltető célzatúak, és a találmány oltalmi körét semmi módon nem korlátozzák.

1. példa

A Ser₃44 -> Ala₃44 VII faktor expresszálása

A Ser₃₄₄ -» Ala₃₄₄ VII faktor aktív hely mutáns előállításához az FVII (565+2463)/pDX plazmidot [4 784 950 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom; lajstromszám ATCC 40205] Xbal és Kpnl enzimekkel emésztjük, és a 0,6 kb nagyságú fragmenst, mely a szerin₃₄₄ régiót tartalmazza, kinyeqük. Ezt a fragmenst az ábrán bemutatott módon beklónozzuk az Xbal és Kpnl enzimekkel hasított M13mpl9 vektorba. Ezt és az alábbiakban következő lépéseket általában a szokásos protokollok szerint hajtjuk végre [például Maniatis és munkatársai, „Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., USA (1982); referenciaként beépítve].

Az M13 templáton a mutagenezist Zoller és Smith (lásd fent) módszerével hajtjuk végre, mutagén ZC1656 oligonukleotidot (5’ TGG GCC TCC GGC CTG CCC CTT 3’) és az „univerzális” ZC87 második prímért (5’ TCC CAG TCA CGA CGT 3’) használva. A reakciótermékek szűrővizsgálatát kinázzal kezelt

ZC1656 felhasználásával végezzük. A pozitív plakkokat felvesszük, a templát DNS-t kipreparáljuk, és szekvenáljuk Pstl 1077 hasítóhelytől Kpnl 1213 hasítóhelyig. A mutáns kiónt 1656 jelöléssel láttuk el.

A 1656 kiónt felhasználva, elkészítünk egy expressziós vektort. Az M13 vektorból körülbelül 0,14 kb nagyságú Pstl/KpnI fragmensként izoláljuk a mutagenizált szekvenciát. Ezt a fragmenst hozzáligáljuk az FVII(565+2463)/pDX-ből származó, 1,7 kb nagyságú HindlII/Xbal fragmenshez, az FVII(565+2463)/pDXből származó, 0,5 kb nagyságú Xbal/PstI fragmenshez és az FVII(565+2463)/pDX-ből származó, 4,3 kb nagyságú KpnI/HindlII fragmenshez, amint azt az ábra mutatja. A kívánt mutánsszekvencia jelenlétének megerősítésére a mutáns és a vad típusú kiónokat Pstl enzimmel, az M13 mutáns VII faktor inzertjét Kpnl és Xbal enzimekkel hasítjuk, a hasított DNS-nek elkészítjük a Southem-blotjait és a sávokat radioaktívan jelzett ZC1656 próbával detektáljuk.

A 1656 expressziós vektor két izolátumával (#544 és #545-ként jelöltük) transzferáljuk a hörcsögújszülött BHK 570 vesesejtvonalat (az American Type Culture Collectionben 1034 lajstromszámon letéve). A sejtek előkészítéséhez egy 10 cm-es tenyészedényben lévő BHK 570 sejtekkel összefüggően benőtt tenyészetet 1:10 arányban hígítunk 5 db 10 cm-es tény észedényben lévő nem szelektív tápközegben [10% fetális borjúszérumot és 1% PSN antibiotikumkeveréket (Gibco Life Technologies, Gaitherburg, MD, USA) tartalmazó Dulbecco’s modified Eagle’s médium (DMEM)]. 24 óra elmúltával, amikorra a sejtek benövik a felület 20-30%-át, a sejteket kotranszfektáljuk a 1656 mutációt kódoló expressziós vektor egyik izolátumával, p468 plazmiddal [összetétele: Adenovírus 5 őri, SV40 enhancer, Adenovírus 2 fő késői promoter, Adenovírus 2 háromrészes leader, 5’ és 3’ hasítóhelyek, a DHFR^r cDNS és SV40 poliadenilációs szignál pML-l-ben (Lusky és Botchan, Natúré, 293: 79-81 (1981)] és 10 pg karrier DNS-sel (ultrahanggal feltárt lazacsperma-DNS), amint azt az I. táblázatban mutatjuk. A DNS-t egy 15 ml-es kémcsőbe visszük, hozzáadunk 0,5 ml 2 xHepest (25 g Hepes, 40 g NaCl, 1,8 g KC1,0,75 g Na₂HPO₄.2 H₂O, 5 g dextróz, desztillált vízzel feltöltve, 2,5 1-re; kémhatás beállítva pH=6,95-7,0 értékre), és a cső tartalmát összekeverjük. 0,5 ml 0,25M CaCl₂ hozzáadásával a DNS-t lecsapjuk, miközben egy Pasteur-pipettával levegőt buborékoltatunk át a DNS/Hepes oldaton. A csövek tartalmát vortexszel összekeverjük, szobahőmérsékleten 15 percen át inkubáljuk, és vortexszel ismét megkevertetjük. A DNSkeveréket pipettával cseppenként hozzáadjuk a tenyészedényekhez. A tenyészedényeket gyengén megkevertetjük, és 37 °C hőmérsékleten inkubálunk 4-6 órán keresztül. Az inkubálás után 2 ml Tris-sóoldatban (0,375 g KC1, 0,71 g Na₂HPO₄, 8,1 g NaCl, 3,0 g TrisHCl, 0,5 szacharóz, feltöltve 1 1-re, kémhatás beállítva pH=7,9 értékre) elkészített 20%-os glicerinoldatot adunk minden tenyészedényhez. A tenyészedények tartalmát megforgatva megkeverjük, és szobahőmérsékleten hagyjuk állni 2 percen át. Ezután a tápközeget eltá8

HU 219 682 Β volítjuk a tenyészedényből, és 2 ml Tris-sóoldattal cseréljük ki. A tenyészedényeket 2 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd a Tris-sóoldatot eltávolítjuk, és kicseréljük 10 ml nem szelektív tápközeggel. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 napon keresztül.

I. táblázat Transzfekció*

A plazmid neve	544	545	544 kontroll	545 kontroll
# 544 klón	15 μΐ	-	15 μΐ	-
# 545 klón	-	30 μΐ	-	30 μΐ
p486	1,5 μΐ	1,5 μΐ	-	-
Hordozó DNS	1,6 μΐ	1,6 μΐ	1,6 μΐ	1,6 μΐ

* az alkalmazott DNS-koncentrációk: # 544 klón: 0,7 gg/ml # 545 klón: 0,3 gg/ml P486: 1,49 gg/ml

A kétnapos inkubáció után a sejteket szelekciós tápközegben (10% dializált fetális boíjúszérumot, 1% PSN antibiotikus keveréket és 150 nM methotrexátot tartalmazó DMEM) hígítjuk, és 1:100, 1:250 és 1:500 arányú hígítás mellett maxi tenyészedényekbe visszük. A tenyészeteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy héten át. Egy hét elmúltával a tápközeget szelekciós közeggel kicseréljük, és ellenőrizzük a telepképződést.

Nyolc nappal később, a telepképződés után 12 telepet véletlenszerűen kiválasztunk az #544 és #545 transzfekciós tenyészetek 1:500 arányban hígított edényeiből. Az egyes kiónokat hatlukú lemez egyes lukaiba helyezzük, és szelekciós tápközegben növesztjük. Hét nap múlva a tenyészetek összefüggően benövik a felületet, és a kiónokat 10 cm-es edényekbe csúsztatjuk át szelekciós tápközegben.

A fent leírt kiónokat és kontrolisejteket, melyeket úgy transzfektáltunk, hogy a vad típusú VII faktort expresszálják, metabolikuson jelöljük ³⁵S-Methionine-Cysteine Protein Labeling Mixszel (NEN DuPont Biotechnology Systems; Wilmington, DE, USA). A kiónokat kinövesztjük, és szelektív közegben a pulzusjelöléses kísérletekhez előkészítjük. A sejteket foszfáttal pufferolt sóoldatban (Sigma St. Louis, MO, USA) átöblítjük, és 4 órán át 20 puCi/ml ³⁵S-Cys-³⁵S-Met jelenlétében pulzusjelölésnek tesszük ki. Négy óra elteltével a felülúszót és a sejteket elválasztjuk. A sejteket Lénk és Penman által leírt módszerrel lizáljuk [Cell, 16: 289-302 (1979)], és minden lizátumból 400 μΐ-t előtisztítunk 50 μΐ staph. Aval (Sigma, St. Louis, MO, USA).

A metabolikuson jelölt sejtekből vett mintákat radioimmunoprecipitációval (RIP) lecsapjuk, a mintákat először 4 órán át 6 μΐ anti-VII faktor poliklonális antiszérummal inkubálva. Mindegyik mintához hozzáadunk 60 μΐ mosott Staphylococcus protein A-t, és a mintákat 1,5 órán át, 4 °C hőmérsékleten himbálással kevertetjük. A mintákat centrifugáljuk, és a felülúszót eltávolítjuk. Az üledéket kétszer mossuk 0,7M RIPA pufferrel [10 mM Tris, pH=7,4; 1% deoxikólsav (Calbiochem Corp., La Jolla, CA, USA), 1% Triton X-100, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát, 5 mM EDTA, 0,7M NaCl], egyszer mossuk 0,15M RIPA pufferrel [10 mM Tris, pH=7,4 ; 1% deoxikólsav (Calbiochem Corp., La Jolla, CA, USA), 1% Triton X-100, 0,1 nátrium-dodecilszulfát, 5 mM EDTA, 0,15M NaCl], 100 μΐ 1 χ SDS festéket (50 mM Tris-HCl, pH=6,8; 100 mM ditio-treitol, 2% nátrium-dodecil-szulfát, 0,1% bróm-fenolkék, 10% glicerin) adunk minden mintához, 5 percen át forraljuk a mintákat, majd centrifugálással eltávolítjuk a proteinA-t. Mindegyik mintából 50 μΐ-t futtatunk 10%-os poliakrilamidgélen. Az eredmények azt mutatják, hogy 10 klón közül 9 termelt módosított faktort.

2. példa

A módosított VII faktor antikoaguláns aktivitása

A módosított VII faktor alvadást gátló aktivitását egy egylépéses alvadásvizsgálattal mérjük, vad típusú VII faktort használva kontrollként. A rekombináns fehérjéket lényegében a fentiekben leírtak szerint készítjük el 5 pg/ml K-vitamint tartalmazó tápközegben kinövesztett tenyészet sejtjeiből. Különböző mennyiségű módosított VII faktort (a #544 klónból) vagy rekombináns vad típusú VII faktort 100 μΐ-re hígítunk 50 mM Tris-pufferben, pH=7,5, ami 0,1% BSA-t tartalmaz. Az elegyet 100 μΐ VII faktor deficiens plazmával (George King Bio-Medical Inc., Overland Park, KS, USA) és 200 μΐ tromboplasztin C-vel (Dade, Miami, FI, USA; nyúlagytromboplasztint és 11,8 mM Ca²⁺-t tartalmaz) inkubáljuk. Az alvadási vizsgálatot automata koagulációmérővel (MLA Electra 800, Medical Laboratory Automation Inc., Pleasantville, NY. USA) végezzük, és az alvadási időt átszámítjuk VII faktor aktivitásegységre, egy standard görbét elkészítve, melyhez a normál összegyűjtött humán plazmát (feltételezve, hogy milliliterenként 1 egység VII faktor aktivitással rendelkezik; elkészítve egészséges donoroktól származó citráttal kezelt szérum összegyűjtésével) használjuk, amit 1:5 aránytól 1:640 arányig hígítunk. Ezt a vizsgálati módszert használva, a módosított VII faktor preparátumai nem rendelkeznek kimutatható koagulációs aktivitással. A II. táblázatban összefoglaltuk az eredményeket, feltüntetve az alvadási időket, melyeket a kontroll (nem transzformált) BHK-sejtek közegénél (K-vitaminnal vagy a nélkül), a vad típusú VII faktornál és a módosított VII faktort expresszáló sejtek két izolátumánál mértünk. A VII faktor aktivitása abban mutatkozik meg, hogy esetében az alvadási idő csökken a kontrolimintákhoz viszonyítva.

II. táblázat

Minta	Hígítás	Alvadási idő (s)
Kontroll, K-vitaminnal	1:5	33,1
	1:10	33,4
Kontroll, K-vitamin nélkül	1:5	34,3
	1:10	33,2

HU 219 682 Β

11. táblázat (folytatás)

Minta	Hígítás	Alvadási idő (s)
	1:20	19,0
Vad típusú VII faktor	1:40 1:80	21,5 23,3
Módosított VII faktor (# 6)	1:1	33,5
Módosított VII faktor (# 10)	1:1	32,5

Hogy meghatározzuk a módosított VII faktorok a plazma faktorokra gyakorolt hatását, a módosított VII faktor és a rekombináns vad típusú VII faktor vagy a természetes VII faktor preparátumát X vagy IX faktor- 15 ral inkubáljuk, és az alvadási vizsgálati eljárásokkal vagy poliakrilamidgélelektroforézissel meghatározzuk az aktivitásukat.

3. példa

A módosított VII faktor szöveti faktorhoz kötődő képessége

A módosított VII faktornak a vad típusú VII faktorral szembeni versenyképességét a szöveti faktorért, valamint az alvadást gátló aktivitását egylépéses alvadás- 25 vizsgálattal mérjük meghatározott mennyiségű szöveti faktor (tromboplasztin) jelenlétében.

Az alvadási időt egy egylépéses eljárással határozzuk meg, hasonlóan a 2. példában leírtakhoz. A kísérleti elegy meghatározott mennyiségű szöveti faktort, állandó 30 mennyiségű vad típusú VII faktort és növekvő mennyiségű módosított VII faktort tartalmaz. A VH/VIIa faktor prokoaguláns aktivitásának gátlását a növekvő mennyiségű VII faktor variánst tartalmazó elegy megnövekedett alvadási ideje jelzi.

A vizsgálati mintában lévő VII faktor aktivitását százalékosan adjuk meg egy standard görbéhez viszonyítva, ami a VII faktor aktivitását mutatja normál összegyűjtött plazmában. A standard görbe felvételéhez foszfátpufferoldatban (PBS) elkészítjük a normál összegyűjtött plaz10 ma hígítási sorozatát 1:5 hígítási aránytól kezdve 1:640 hígítási arányig. Feltételezzük, hogy a normál plazma milliliterenként körülbelül 5 ng VII faktort tartalmaz, és ezt tekintjük az aktivitás egy egységének. Az elegy 100 μΐ VII faktor hiányos plazmát, 100 μΐ hígított plazmát és 200 μΐ tromboplasztin-C-t (Dade, Miami, FL, USA) tartalmaz, az alvadási idő mérésére MLA Electra 800 automata műszer szolgál. A standard görbe elkészítéséhez az eredményeket grafikusan ábrázoljuk a százalékos aktivitásoknál (1:5 hígítást tekintjük 100%-os aktivi20 tásnak) másodpercben megadva az alvadási időt.

A vizsgálati eljárás megköveteli, hogy a vad típusú VII faktort és a VII faktor variánst tartalmazó közegben a szérum 1%-nál kisebb mennyiségben legyen jelen. A PBS-ben történő hígítást úgy készítjük el, hogy az alvadási idő a standard görbére essen. A minimális hígítási arány általában 1:2. A végső térfogat 100 μΐ. A kísérletekben két különböző humán Ser₃₄₄ -> Ala₃₄₄ VII faktor variánst vizsgáltunk („#10” és „#6”). Az eredményeket a III. táblázatban foglaltuk össze, melynek adatai mutatják: ahogy nő a VII faktor variáns mennyisége, úgy csökken a Vlla faktor százalékos aktivitása.

111. táblázat

Ser₃₄₄ -» Alá variánssal kapott eredmények [100%-nak tekintjük a 10 μΐ B4A1 (vad típus) közeggel kapott aktivitást]

Ser344 -> Alá klón száma	A variáns közegének mennyisége	A Β4Α1 közegének mennyisége	ΒΗΚ kontroll*	Vlla faktor százalékos aktivitása
#10	10 μΐ	10 μΐ	0	70
#10	20 μΐ	10 μΐ	0	51
#10	30 μΐ	10 μΐ	0	43
#10	40 μΐ	10 μΐ	0	34
#10	50 μΐ	10 μΐ	0	28
#10 (-K)**	20 μΐ	10 μΐ	0	78
#6	10 μΐ	10 μΐ	0	74
#6	20 μΐ	10 μΐ	0	56
#6	30 μΐ	10 μΐ	0	46
#6	40 μΐ	10 μΐ	0	41
#6	50 μΐ	10 μΐ	0	32
#6 (-K)	20 μΐ	10 μΐ	0	85
BHK kontroll	0	10 μΐ	20 μΐ	91
BHK kontroll ( K)	0	10 μΐ	20 μΐ	107

* nem transzfektált BHK- (baby hamster kidney) sejtek közege ** a VII faktor variánsok expresszálásához a sejteket K-vitamint tartalmazó közegben tenyésztjük, ahol a K-vitamint elhagytuk, a táblázatban ,,-K”-val jelöljük.

HU 219 682 Β

A kísérletek azt bizonyítják, hogy a VII faktor Ser₃₄₄ -> Alá variánsa dózisfüggő módon verseng a természetes VII faktorral, és gátolja a natív VH/VIIa faktor prokoaguláns aktivitását. Levonható tehát a következtetés, hogy a humán VII faktor Ser₃₄₄ -> Alá variánsa verseng a natív humán Vlla faktorral, következésképpen gátolja a humán plazmában lévő X és/vagy IX faktor aktiválását.

4. példa

A VII faktor reakciója PPACK-kal

A rekombináns VII faktort transzfektált BHK(baby hamster kidney) sejtekben készítjük el. A fehérje tisztításához és aktiválásához a módszert leírják Thim és munkatársai [Biochemistry 27: 7785-7793 (1989)], Brinkous és munkatársai [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1382-1386 (1989)], Bjoem és Thim [Rés. Discl. No. 269, 564 (1986)] (az említett cikkek referenciaként beépítve). A sejtkultúra közegét szűrjük, csökkentett sókoncentrációban hígítjuk. A hígított közeget anioncserélő kromatográfiával frakcióra bontjuk, eluensként pufferolt kalcium-klorid-oldatot használva. A VII faktort tartalmazó frakciókat tovább tisztítjuk immunokromatográfrával kalciumfüggő anti-VII faktor monoklonális antitestet használva. További tisztítást végzünk két anioncserélő kromatografálással, ahol a VII faktort kalcium-klorid-, illetve nátrium-klorid-oldattal eluáljuk. A végső eluátumban nyerjük a Vlla faktort.

μΜ rekombináns Vlla faktort inkubálunk 5,20 és 60 percen át 20 μΜ PPack-kal (D-fenil-alanil-prolilarginil-klór-metil-keton; Calbiochem, La Jolla, CA, USA). Annyi kromogén S2288 szubsztrátot (H-D-izoleucin-L-prolil-L-arginin-p-nitro-anilid; Kabi Vitrum AB, Molndal, Svédország) tartalmazó puffért adunk a reakcióelegyhez, hogy körülbelül 2,5-szeres hígítást és 0,3 mM S2288 végkoncentrációt érjünk el. Mérjük a keletkezett p-nitro-anilint, és a kapott értékeket a kontrollként használt kezeletlen Vlla faktorral kapott értékhez viszonyítjuk. Az eredmények azt mutatják, hogy az adott reakciókörülmények között a Vlla faktor 60 perc alatt teljesen inaktiválódik.

5. példa

DEGR Vlla faktor előállítása

A 4. példában leírtak szerint rekombináns Vlla faktort készítünk. A rekombináns Vlla faktor 10 mM glicinpufferben (pH=8,0) - mely tartalmaz 10 mM kalciumkloridot és 50 mM nátrium-kloridot - készült oldatát meghígítjuk, hogy a koncentrációja 1,5 mg/ml legyen. Desztillált vízben oldva, tízszeres moláris feleslegben denzil-L-Glu-Gly-Arg-klór-metil-ketont (DEGRck; Calbiochem, La Jolla, CA 92037, USA) adunk a Vlla faktorhoz. Kétórás, 37 °C hőmérsékleten történő inkubálás után további DEGRck-t adunk az oldathoz szintén tízszeres moláris feleslegben, és további 2 órán át inkubálunk 37 °C hőmérsékleten. A Vlla faktorhoz egy harmadik, tízszeres feleslegben lévő DEGREck adagot is adunk, és 4 °C hőmérsékleten inkubálunk 16 órán át. A DEGR-Vlla faktor oldatát kimerítően dializáljuk 4 °C hőmérsékleten Tris-pufferes sóoldattal szemben (0,05 M Tris-HCl, 0,1 M NaCl, pH=7,5), hogy eltávolítsuk a szabad DEGRck-t.

A végső DEGR-VIIa faktor mintát szabad DEGRck-ra megvizsgáljuk Xa faktor kromogénszubsztrátos vizsgálattal. A DEGR-VIIa faktor oldatot hozzáadjuk a tisztított humán Xa faktorhoz, mely mellett kromogén S-2222 szubsztrát is van. Ezt a szubsztrátot specifikusan hasítja a Xa faktor, de nem hasítja a Vlla faktor. Az elegyben lévő kötetlen DEGRck képes a Xa faktorhoz kötődni, és ezáltal gátolja a Xa faktor kromogénes aktivitását. Szabad DEGRck-t adva a Xa faktor oldatához, elkészíthetünk egy standard görbét, mellyel a Xa faktor kromogénes aktivitásának gátlása alapján meghatározhatjuk az oldatban lévő szabad DEGRck mennyiségét. A DEGR-VIIa faktor oldatának analízise azt mutatja, hogy a szabad DEGRck/DEGR-VIIa faktor arány a kimerítő dialízis után kevesebb, mint 0,5%, ami bizonyítja, hogy az alábbiakban leírt különböző vizsgálati rendszerekben a DEGR-VIIa faktor okozta gátlás nem a szabad DEGRck jelenlétének következménye.

6. példa

Xa faktor előállítása patkány-simaizomsejtekkel

Vaszkuláris simaizomsejteket megvizsgálunk abból a szempontból, hogy felszínükön van-e szöveti faktor. Ehhez mérjük a sejtek X faktort aktiváló képességét, olyan kromogén szubsztrátot felhasználva, melyre specifikus a Xa faktor.

Patkányvérér simaizomsejtjeit [Clowes és munkatársai, J. Clin. Invest., 93: 644-651 (1994)] 8000 sejt/luk koncentrációban 96 lukú (American Scientific Products, Chicago, II, USA) lemezekre visszük. A növesztő tápközeg összetétele:

IV. táblázat

500 ml Dulbecco’s Modified Eagle’s Médium (DMEM) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)

10% fetális boíjúszérum (Hyclone, Logan, UT)

ImM nátrium-piruvát (Irvine, Santa Ana, CA)

0,29 mg/ml L-glutamin (Hazelton, Lenexa, KS) xPSN (lOOxPSN-ben: 5 mg/ml penicillin, 5 mg/ml sztreptomicin, 10 mg/ml neomicin) (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD).

órás, 37 °C hőmérsékleten történő inkubálás után a közeget szérummentes közegre cseréljük, melynek összetétele:

V. táblázat

250 ml Dubecco’s Modified Eagle’s Médium (DMEM)

250 ml Ham’s F-12 Médium (Fred Hutchinson Cancer Reserch Center, Seattle, WA) mM nátrium-piruvát

0,29 mg/ml L-glutamin mM transzferrin (JRH, Lenexa, KS) μΜ inzulin (Gibco-BRL) ng szelén (Aldrich, Milwaukee, WI) mg/ml szarvasmarha-szérumalbumin (Sigma, St. Louis, MO).

HU 219 682 Β

A sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 72 órán keresztül. Az inkubáció után vagy PDGF-BB növekedési faktort (10 ng/ml; platelet-derived growth factor, homológ B láncokkal) vagy 10% fetális borjúszérumot adunk a sejtekhez, hogy fokozzuk a szöveti faktor expresszálódását [Taubman és munkatársai, J. Clin. Invest., 91: 547-552 (1993)]. Olyan párhuzamos sejttenyészetet is készítünk, mely nem kap sem növekedési faktort, sem szérumot, hogy azon ellenőrizzük a nem stimulált sejtek intrinsic aktivitását. Hatórás inkubáció után rekombináns humán VHa faktort adunk a sejtekhez 10 nM végkoncentrációban. A sejttenyészetek egy része nem kap VHa faktort, ezek a negatív kontrollok. A sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, majd HEPES-pufferral mossuk (10 mM HEPES, 137 mM nátrium-klorid, 4 mM kálium-klorid, 5 mM kalcium-klorid, 11 mM glükóz, 0,1% BSA). Mosás után a sejteket 5 percig inkubáljuk lukanként 50 μΐ 200 nM plazmatisztított humán X faktor oldatban, melyet 5 mM kalcium-kloridot tartalmazó Tris-pufferes sóoldatban készítünk el. Az egyes lukakhoz hozzáadunk 25 μΐ 0,5 M EDTA-oldatot és 25 μΐ 800 μΜ S-2222 kromogén szubsztrátoldatot (Kabi Pharmacia, Franklin, OH). A lemezeket szobahőmérsékleten inkubáljuk 40 percen át, majd 405 nm-en méljük THERMO MAX Microplate Reader (Molecular Devices, Menlo Park, CA) készülékkel.

A VII. táblázat adatai mutatják, hogy a VHa faktorral kezelt lukak abszorbanciája megnő a kontrolihoz (nem kaptak VHa faktort) viszonyítva. Az abszorbancia megnövekedése közvetlen mértéke a lukakban termelődött Xa faktor mennyiségének és az azt követő, a kromofort felszabadító szubsztráthasításnak. Az adatok azt is bizonyítják, hogy a növekedési faktorral (PDGF-BB) vagy a 10%-os fetális borjúszérummal (FCS) előkezelt sejtek kromogénes aktivitása magasabb, mint a stimulálatlan sejteké.

VI. táblázat

Vizsgálati minta	0^405
Kontroll	0,043
Intrinsic aktivitás	0,247
PDGF-BB	0,360
10% FCS	0,342

Ezek az adatok világosan bizonyítják, hogy a patkányvérér simaizomsejtjeinek a felületén a X faktor Xa faktorrá aktiválódik a VHa faktor hatására.

7. példa

Sejtfelszíni kromogénes aktivitás gátlása DEGR-VIIa faktorral

A fentiekben leírt módon patkányvérér-simaizomsejteket telepítünk a 96 lukú lemezre. A sejteket szérummentes közegben tenyésztjük 72 órán át a fentiekben leírtak szerint, majd 10% fetális boqúszérum hozzáadásával 6 órán át stimuláljuk a szöveti faktor expresszálódását. A stimuláció után csak puffért (kontroll) vagy nM VHa faktort vagy 10 nM VHa faktort+100 nM DEGR-VIIa faktort adunk az egyes lukakba. A sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 2 órán át, majd HEPES-pufferral mossuk. Mosás után a sejteket 5 percen át 50 μΐ 200 nM X faktor oldatban inkubáljuk, amit 5 mM kalcium-kloridot tartalmazó Tris-pufferes sóoldatban készítünk el. Minden lukhoz hozzáadunk 25 μΐ 0,5 M EDTA-oldatot és 25 μΐ kromogén S-2222 szubsztrátoldatot (800 μΜ) (Kabi Pharmacia). A sejteket 40 percen át inkubáljuk szobahőmérsékleten. A kromogénes aktivitást 405 nm-en mérjük a fentiekben ismertetett módon.

A VII. táblázat adatai mutatják, hogy csak a VHa faktorral kezelt sejteknél történt meg a kromogénes aktivitás stimulációja, és a stimulációt gátolta, ha a VHa faktorral egy időben DEGR-VIIa faktorral is inkubáltuk a sejteket. Az eredmények bizonyítják, hogy a DEGR-VIIa faktor kompetitív antagonistaként működik a VHa faktor megkötődésénél, ezáltal gátolja a X faktor aktiválódását és azt követően az S-2222 kromogén szubsztrát hasítását.

VII. táblázat

Vizsgálati minta	od405
Kontroll	0,035
VHa faktor	0,342
VHa faktor+DEGR-VIIa faktor	0,072

8. példa

Sejtfelületi kromogénes aktivitás dózisfüggő gátlása DEGR-VIIa faktorral patkány simaizomsejtjén vizsgálva

A patkány vérér simaizomsejtjeiből lukanként 4000 sejtet telepítünk a 96 lukú tenyésztőlemezre. A növesztő tápközeget kiegészítjük 1% fetális boíjúszérummal (mint a IV. táblázatban, de ott 10% szérum van a közegben). 5 nap után a közeget eltávolítjuk, és növekvő koncentrációjú VHa faktor oldatot, illetve 10 nM VHa faktor mellett növekvő koncentrációban DEGR-VIIa faktort adunk a sejtekhez. Két órán át inkubálunk 37 °C hőmérsékleten, majd a sejteket mossuk, és 5 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk 50 μΐ 200 nM X faktor oldatban, amit Tris-pufferben készítünk el. Mindegyik lukhoz hozzáadunk 25 μΐ 0,5 M EDTA-oldatot és 25 μΐ 800 μΜ S-2222 szubsztrátot (Kabi Pharmacia), majd a lemezeket szobahőmérsékleten inkubáljuk 40 percen át. A kromogénes aktivitást 405 nm-en méljük a fentiekben ismertetett készüléken.

A VIII. táblázat eredményei mutatják azt a dózisfüggő kromogénes aktivitásnövekedést, ami a lukakhoz adott VHa faktor növekvő mennyiségével elérhető. Ha a 100 nM VHa faktorral együtt DEGR-VIIa faktort is adunk a sejtekhez, megfigyelhető a kromogénes aktivitás dózisfüggő gátlása (IX. táblázat). Ha a DEGR-VIIa faktor/VIIa faktor mólaránya 1:1, a kromogénes aktivitás gátlása körülbelül 95%-os. Ezek az adatok arra vallanak, hogy a DEGR-VIIa faktornak lényegesen magasabb affinitása van a sejtfelszínszöveti faktorhoz, mint a natív VHa faktornak. Ha a DEGR-VIIa faktornak és

HU 219 682 Β a Vlla faktornak azonos affinitása lenne, akkor abban az esetben, ha a két molekulát azonos mólarányban adjuk a sejtekhez, a tapasztalt gátlási szint nem lehetne ilyen magas.

VIII. táblázat

Vlla faktor koncentráció	OD405
0,10	0,005
0,39	0,025
1,56	0,058
6,25	0,111
25,00	0,154
100,00	0,208

A IX. táblázat a Xa faktor kromogénes aktivitásának dózisfüggő gátlását mutatja be DEGR-VIIa faktorral patkány simaizomsejtjein. 100 nM Vlla faktor mellett a sejteket növekvő koncentrációjú DEGR-Vlla faktorral együtt inkubáljuk, és a Xa faktor kromogénes aktivitását S-2222 kromogén szubsztrátot használva határozzuk meg.

IX. táblázat

DEGR-VIIa faktor koncentrációja (nM)	OD4o5
0,00	0,208
0,39	0,176
1,56	0,116
6,25	0,073
25,00	0,026
100,00	0,024

9. példa

A Xa faktor keletkezésének gátlása DEGR-Vlla faktorral

A X faktor tisztított, rekombináns, oldható szöveti faktorral történő Xa faktorrá való átalakítását kromogénes módszerrel vizsgáljuk. A szöveti faktor expresszálása és tisztítása Saccharomyces cerevisiae-ből történik [Shigematsu és munkatársai, J. Bioi. Chem., 267; 21 329-21 337 (1992)]. Az oldható szöveti faktor tisztítását és jellemzését Dr. Walt Kisiel végezte (University of New Mexico, Albequergue, NM). A reakcióelegy összetétele: 6,5 μΐ oldható szöveti faktor (2,2 μΜ), 29,0 PCPS (1 mM, Sigma, St. Louis, MO), 29,5 μΐ humán X faktor (4,1 μΜ), 2,77 ml Hank-puffer (25 mM Tris, pH=7,4, 150 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 5 mM CaCl₂, 0,1% BSA). A 96 lukú lemez minden egyes lukába bemérünk 40 μΐ szöveti faktor/X faktor elegyet, 25 μΐ TBS-sel (20 mM Tris, pH=7,4, 150 mM NaCl) hígított Vlla faktort és 25 μΐ TBS-sel hígított DEGR-Vlla faktort. A kontroll 40 μΐ szöveti faktor/X faktor elegyet, 25 μΐ TBS-sel hígított Vlla faktort és 25 μΐ csak TBS-t tartalmaz. A lukakban lévő reakcióelegyhez hozzáadunk 10 μΐ S-2222 (4 mM) kromogén szubsztrátot, és szobahőmérsékleten inkubálunk 2-10 percen keresztül. A mérést 405 nm-en végezzük a fent ismertetett készülékkel.

A X faktor Vlla faktorral történő aktiválásának standard görbéjét úgy állapítjuk meg, hogy a Vlla faktort növekvő koncentrációban adjuk a DEGR-Vlla faktort nem tartalmazó reakcióelegyhez. A X. táblázatban összefoglalt eredmények azt mutatják, hogy a kromogénes aktivitás dózisfüggően növekszik, amint egyre nagyobb mennyiségű Vlla faktort adunk a reakcióelegyhez. 100 nM Vlla faktort tartalmazó elegyhez növekvő mennyiségű DEGR-Vlla faktort adva, a kromogénes aktivitás dózisfüggően csökken (XI. táblázat). Ezek az eredmények bizonyítják, hogy a DEGR-VIIa faktor kompetitív antagonistaként működik a natív Vlla faktor oldható szöveti faktorhoz való kötődésénél, és ezáltal gátolja a Xa faktor keletkezését, amit a kromogén S-2222 szubsztráttal szembeni csökkenő aktivitás alapján mérhetünk.

X. táblázat

A Xa faktor kromogénes aktivitásának fokozása a Vlla faktor növekvő koncentrációban történő hozzáadásával. Az optikai sűrűség (OD₄₀₅) változását mérjük kromogén S-2222 szubsztrát alkalmazásával

Vlla faktor koncentrációja (nM)	θθ405
0,78	0,168
1,156	0,288
3,12	0,478
6,25	0,694
12,50	0,764
25,00	0,790
50,00	0,738
100,00	0,770

XI. táblázat

A Xa faktor kromogénes aktivitásának gátlása DEGR-VIIa faktorral. A DEGR-VIIa faktort az oldható szöveti faktorhoz adjuk hozzá natív Vlla faktor jelenlétében. Az optikai sűrűség (OD₄₀₅) változását mérjük a kromogén S-2222 szubsztrát alkalmazásával

DEGR-VIIa faktor koncentrációja (nM)	θθ405
0	0,810
50	0,750
100	0,609
200	0,296
400	0,167
800	0,083
1600	0,055

HU 219 682 Β

10. példa

A koaguláció gátlása DEGR-VIIa faktorral

A DEGR-VIIa faktor alvadási időre gyakorolt hatásának standard vizsgálati eljárása a következő: a nátrium-citráttal, mint olvadásgátlóval összegyűjtött normál páviánplazma 100 pl-ét hozzáadjuk a TBS-ben (20 mM Tris, pH=7,4,150 mM nátrium-klorid) hígított DEGR-VIIa faktor változó koncentrációjú oldatához. A mintákat összekeverjük, és rövid ideig inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten. A mintákat Electra 800 Automatic Coagulation Timer (Medicial Laboratories Automation, Pleasantville, NY.) készülékbe visszük. Inkubálás után 200 pl 25 mM kalcium-kloridot tartalmazó szövetifaktor-preparátumot adunk a DEGR-VIIa faktor oldathoz. A szöveti faktor preparátumát frissen lefagyasztott páviánagyból készítjük az agyszövetet sóoldattal extrahálva, és a preparátum koagulációképességét páviánplazmában megállapítva. Olyan koncentrációjú szövetifaktor-preparátumot használunk fel, mely 40 másodperc körüli alvadási időt eredményez.

A XII. táblázat bizonyítja, hogy a DEGR-VIIa faktor hozzáadásával dózisfüggően hosszabbodik az alvadási idő. A plazmában 1 pg/ml DEGR-VIIa faktor dózis már szignifikánsan növeli az alvadási időt.

XII. táblázat

Az alvadási idő dózisfuggő növekedése DEGR-VIIa faktor hatására

DEGR-VIIa faktor (pg/ml plazma)	Alvadási idő (mp)
0	40,7
0,5	46,2
1,0	50,8
2,5	64,5
5,0	108,1
10,0	158,4

11. példa

A vérlemezek felgyűlésének gátlása DEGR-VIIa faktorral

A DEGR-VIIa faktor azon képességét, hogy gátolja a vérlemezek felgyűlését az artériatrombózis helyén, főemlősök mechanikusan felsértett artériáján vizsgáljuk. Az aortaendarterektómia modellezéséhez páviánokat használunk, lényegében ahogyan azt Lumsden és munkatársai leírták [Blood, 81: 1762-1770 (1993)]. Eltávolítunk egy 1-2 cm hosszú aortaszakaszt, kifordítjuk és kaparással eltávolítjuk az artéria-belhártyát és a tunica medica 50%-át. Az artériát visszafordítjuk az eredeti helyzetébe, mindkét végén kanült helyezünk el, és beépítjük az állat testen kívül kialakított söntjébe, ezáltal a mechanikusan felsértett artériát a söntön keresztül az állat véráramának tesszük ki. Mielőtt megnyitnánk a söntöt a vérkeringés előtt ¹ ‘In-jelölt antológ vérlemezeket injektálunk intravénásán az állatba. A felsértett artéria helyén történő vérlemez felgyűlését valós idős gammakamera-leképzéssel határozzuk meg.

A DEGR-VIIa faktor vérlemezek felgyűlését gátló hatásának mérésére DEGR-VIIa bóluszt vagy a kontrolinál sóoldatot injektálunk közvetlenül a sönt megnyitása előtt. A felsértett artériákat 60 percen át folyamatosan méqük. 0,005 mg/testsúlykilogramm DEGR-VIIa faktor dózisa gátolja a vérlemezek felgyűlését. 1,0 mg/kg bólusz injektálásnál a vérlemezek felgyűlésének gátlása 90% körüli egy órával a hatóanyag beadása után.

Ezek az adatok azt mutatják, hogy a DEGR-VIIa faktorral történő szövetifaktor-gátlással szignifikánsan megakadályozható a főként vérlemezből álló trombuszok kialakulása főemlősök akut vérérsérülés-modellje esetében.

A fent elmondottak alapján megállapítható, hogy a katalitikus helyeken módosított VII faktor vagy a módosított VII faktor készítmények képesek hozzákötődni a szöveti faktorhoz, de lényegében képtelenek a X és IX faktorokat aktiválni. Minthogy a módosított VII faktor specifikusan szakítja meg a koagulációs kaszkádot anélkül, hogy csökkentené és felhasználná az alvadási faktorokat, várható, hogy a módosított VII faktor készítményeinek alkalmazásával kevesebb nemkívánatos mellékhatás fog megjelenni, mint a jelenleg használatos terápiáknál. Továbbá az itt leírt módosított VII faktor könnyen előállítható rekombináns technikával. Ezek szerint a hatékonyság, a megfelelőség és kisebb dózisok gazdaságossága továbbá a ritkább beadás és a toxicitás viszonylagos hiánya előnyöket biztosít a jelen találmány szerinti készítmények számára.

Noha a jobb megértés céljából az elmondottakat illusztrációkkal és példákkal részletezve adtuk közre, nyilvánvaló, hogy bizonyos változtatások és módosítások még elvégezhetőek a mellékelt igénypontok oltalmi körén belül.

Claims (2)

1. SZEKVENCIALISTA (1) Általános információk (i) Szabadalmaztató (A) Név: ZymoGenetics, Inc. et al.

   (B) Utca: 4225 Roosevelt Way N. E.

   (C) Város: Seattle (D) Állam: Washington (E) Ország: Amerikai Egyesült Államok (F) Postai kódszám: 98105 (G) Telefon: (206)547-8080 (H) Telefax:

   (I) : Telex:

   (ii) A találmány címe: Módosított VII faktor (iii) Szekvenciák száma: 4 (iv) A komputer olvasható formátuma (A) A közvetítőeszköz típusa: floppylemez (B) Komputer: IBM PC kompatibilis (C) Operációs rendszer: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patent In Relase # 1,0, Version # 1,25 (v) Jelenlegi bejelentési adatok:

   (A) A bejelentés száma:

   (B) A benyújtás időpontja: 1994. május 23.

   (C) Osztályozás:

   (vi) Előző bejelentési adatok:

   (A) A bejelentés száma: US 08/065,725 (B) A benyújtás időpontja: 1993. május 21.

   HU 219 682 Β (vi) Előző bejelentési adatok:

   (A) A bejelentés száma: US 07/662,920 (B) A benyújtás időpontja: 1991. február 28.

   (vii) A meghatalmazott adatai:

   (A) Név: Paimelec, Steven W. 5 (B) Regisztrációs száma: 31990 (C) Referencia/listaszám: 13952-8-1PC (viii) A telekommunikációs adatok:

   (A) Telefon: 206-467-9600 (B) Telefax: 415-543-5043 10
2. (2) Az ID NO: 1 szekvencia adatai:

   (i) A szekvencia tulajdonságai:

   (A) Hossza: 2422 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Száltípusa: egyszálú