ES2349024T3 - Metodo para aumentar la recuperacion in vivo de polipeptidos terapeuticos. - Google Patents
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Abstract
Uso de un polipéptido terapéutico, fusionado directamente o a través de un péptido engarzador con un polipéptido que intensifica la recuperación in vivo, en comparación con la recuperación in vivo del correspondiente polipéptido terapéutico no fusionado, y en que el polipéptido que intensifica la recuperación es una albúmina, una variante polimórfica presente en la naturaleza o un fragmento de la misma, en que el fragmento tiene una longitud de por lo menos 20 aminoácidos, para aumentar la recuperación in vivo.
Description
Campo del invento: 5
El presente invento se refiere al campo de los polipéptidos terapéuticos modificados con una recuperación in vivo aumentada en comparación con su polipéptido progenitor no modificado. Es decir, el invento se refiere a unas fusiones de polipéptidos 10 terapéuticos con unos polipéptidos que intensifican la recuperación, que están conectados directa u opcionalmente por un péptido engarzador.
La esencia del invento es demostrada en particular por unos polipéptidos dependientes de la vitamina K, 15 tales como p.ej. el Factor VII humano, el Factor VIIa humano, el Factor IX humano y la proteína C humana como el polipéptido terapéutico, y por una albúmina como el polipéptido que intensifica la recuperación. Por lo tanto, en particular, el invento se refiere también a 20 unas secuencias de ADNc (ácido desoxirribonucleico cromosomal) que codifican cualquiera de los polipéptidos dependientes de la vitamina K y sus derivados, fusionados genéticamente con un ADNc que codifica una albúmina de suero humano, que se pueden engarzar por unos 25 oligonucleótidos que codifican unos engarzadores peptídicos intermedios, exhibiendo dichos derivados codificados una recuperación in vivo mejorada, a unos vectores de expresión recombinantes que contienen dichas secuencias de ADNc, a células anfitrionas transformadas 30 con dichos vectores de expresión recombinantes, a polipéptidos recombinantes y sus derivados que tienen unas actividades biológicas comparables con las del polipéptido de tipo salvaje sin modificar, pero que tienen una mejorada recuperación in vivo, y a procedimientos para la producción de dichos polipéptidos recombinantes y de sus derivados. El invento cubre 5 también a un vector de transferencia destinado a usarse en la terapia génica humana, que comprende dichas secuencias de ADN modificadas que son útiles para aumentar los niveles del producto in vivo.
10
Antecedentes del invento:
Polipéptidos terapéuticos
Son polipéptidos terapéuticos en el sentido de este invento unas proteínas o unos polipéptidos que, después 15 de su aplicación a un ser humano o animal, pueden producir un efecto profiláctico o terapéutico. Estos polipéptidos terapéuticos son aplicados a un ser humano o a un animal por las vías oral, tópica, parenteral u otras. Unas clases específicas de polipéptidos 20 terapéuticos cubiertos, es decir por los ejemplos en este invento, son los polipéptidos dependientes de la vitamina K que en cierta extensión están disponibles comercialmente en su versión derivada de un plasma o recombinante. 25
Polipéptidos intensificadores de la recuperación
Son polipéptidos intensificadores de la recuperación en el sentido de este invento cualesquiera polipéptidos o proteínas que, después de su fusión con un polipéptido 30 terapéutico aumentan la recuperación in vivo de la fusión, en comparación con la del polipéptido terapéutico no modificado. Ejemplos específicos de dichos polipéptidos intensificadores de la recuperación son una albúmina, variantes o fragmentos de la misma, e inmunoglobulinas, variantes o fragmentos de las mismas.
Recuperación in vivo 5
La recuperación in vivo es definida como el porcentaje de un polipéptido terapéutico, que es detectable en la circulación después de un breve periodo de tiempo después de la aplicación (5-10 minutos) en relación con la cantidad total de polipéptido terapéutico 10 que se ha administrado. Como una base para el cálculo de la concentración esperada del polipéptido terapéutico en la circulación, se supone en general un volumen de plasma de 40 ml por kg.
15
Proteínas de fusión o polipéptidos de fusión
Son proteínas de fusión o polipéptidos de fusión, en el sentido de este invento, unas proteínas que pueden ser expresadas a partir de construcciones artificiales genéticas, que comprenden un ácido nucleico que codifica 20 un polipéptido terapéutico o variantes del mismo y un ácido nucleico que codifica un polipéptido intensificador de la recuperación, en cuya construcción artificial ambos ácidos nucleicos están engarzados en cuadro de una manera tal que la expresión en una célula anfitriona en la que 25 se ha introducido dicha construcción artificial genética, genera una proteína en la que el polipéptido terapéutico está engarzado por un engarce peptídico con el polipéptido intensificador de la recuperación. Opcionalmente, el polipéptido terapéutico y el 30 polipéptido intensificador de la recuperación pueden estar también conectados por un corto engarzador peptídico.
Polipéptidos dependientes de la vitamina K
Los polipéptidos dependientes de la vitamina K que 5 son modificados después de la traducción mediante carboxilación en posición gamma y comprenden p.ej. los Factores de coagulación de la sangre II (protrombina), VII, IX y X, las proteínas anticoagulantes C y S, y la proteína Z que dirige hacia la trombina, la proteína ósea 10 osteocalcina, la proteína de matriz que inhibe la calcificación, la proteína del gen 6 específico para la detención del crecimiento (Gas6) que regula el crecimiento de las células, y las cuatro proteínas Gla transmembranales (TMGPs) cuya función es en el momento 15 actual desconocida. Entre estos polipéptidos, algunos se usan para tratar ciertos tipos de hemofilia y trastornos hemorrágicos. La hemofilia A es un trastorno hemorrágico heredado. Resulta de una deficiencia de Factor VIII de coagulación de la sangre que está vinculada con el 20 cromosoma X y la manifestación clínica es una tendencia aumentada a la hemorragia. La enfermedad es tratada por inyección de concentrados del FVIII procedentes de un plasma o de fuentes recombinantes. La hemofilia B es causada por el Factor IX no funcional o ausente, y es 25 tratada con concentrados del Factor IX procedentes de un plasma o con una forma recombinante del Factor IX. Tanto en la hemofilia A como en la hemofilia B, el problema médico más grave para tratar la enfermedad es la generación de aloanticuerpos contra los factores de 30 reemplazo. Hasta aproximadamente un 30 % de todos los pacientes de hemofilia A desarrolla anticuerpos para el Factor VIII. Los anticuerpos para el Factor IX son menos frecuentes.
El modelo actual de la coagulación señala que el desencadenamiento fisiológico de la coagulación es la formación de un complejo entre un Factor tisular (TF) y 5 el Factor VIIa (FVIIa) sobre la superficie de células que expresan el TF, que normalmente están situadas fuera de la vasculatura. Esto conduce a la activación del Factor IX y del Factor X, generando finalmente algo de trombina. En un bucle de retroalimentación positiva la trombina 10 activa - directa o indirectamente - al Factor VIII y al Factor IX, el denominado brazo “intrínseco” de la cascada de coagulación de la sangre, amplificando de esta manera la generación del Factor Xa, que es necesario para la generación del estallido completo de trombina con el fin 15 de conseguir una hemostasia. Se mostró que por administración de concentraciones suprafisiológicas del Factor VIIa se puede conseguir una hemostasia, evitando la necesidad del Factor VIIIa y del Factor IXa. La clonación del ADNc para el Factor VII (documento de 20 patente de los EE.UU. US 4.784.950) hace posible desarrollar el Factor VII activado como un producto farmacéutico. El Factor VIIa fue administrado satisfactoriamente por primera vez en 1988. Desde entonces, el número de indicaciones del Factor VIIa ha 25 crecido constantemente, mostrando un potencial de convertirse en un agente hemostático universal para detener una hemorragia (Erhardtsen, 2002). Sin embargo, el corto período de tiempo de semivida del Factor VIIa, de aproximadamente 2 horas, y la reducida recuperación in 30 vivo están limitando su aplicación.
Factor VII y Factor VIIa
El FVII es una glicoproteína monocatenaria con un peso molecular de 50 kDa, que es segregada por células hepáticas dentro del torrente sanguíneo como un zimógeno inactivo de 406 aminoácidos. Contiene 10 residuos de 5 ácido γ-carboxi-glutámico localizados en el dominio Gla terminal de N del polipéptido. Los residuos de Gla requieren vitamina K para su biosíntesis. En el extremo terminal de C con respecto del dominio Gla están localizados dos dominios de factores de crecimiento 10 epidérmico seguidos por un dominio de serina proteasa del tipo de tripsina. Unas modificaciones adicionales del FVII posteriores a la traducción comprenden una hidroxilación (Asp 63), una glicosilación del tipo en N (Asn145 y Asn322) así como una glicosilación del tipo en 15 O (Ser52 y Ser60).
El FVII es convertido en su forma activa Factor VIIa mediante una proteólisis del enlace peptídico único en Arg152-Ile153 que conduce a la formación de dos cadenas de polipéptidos, una cadena ligera (de 24 kDa) en el 20 extremo terminal de N y una cadena pesada (de 28 kDa) en el extremo terminal de C, las cuales son mantenidas juntas mediante un puente de disulfuro. En contraste con otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K, no se ha descrito pata el FVII ningún péptido de 25 activación que sea disociado y separado durante la activación de estos otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K. Es esencial para conseguir la conformación activa del Factor VIIa, la formación de un puente salino después de una disociación por 30 activación entre Ile153 y Asp343. La disociación por activación del Factor VII se puede conseguir in vitro por los factores Factor Xa, Factor XIIa, Factor IXa, Factor VIIa, la proteasa activadora del Factor siete (FSAP) y la trombina. Mollerup y colaboradores (Biotechnol. Bioeng. (1995) 48: 501-505) informaron que también se realiza alguna disociación en la cadena pesada junto a Arg290 y o 5 Arg315.
El Factor VII está presente en un plasma en una concentración de aproximadamente 500 ng/ml. Alrededor de 1 % o 5 ng/ml del Factor VII se presentan como Factor VIIa. Se encontró que el período de tiempo de semivida en 10 plasma del Factor VII es de aproximadamente 4 horas y el del Factor VIIa es de aproximadamente 2 horas. El periodo de tiempo de semivida del Factor VIIa de 2 horas constituye una grave desventaja para el uso terapéutico del Factor VIIa, puesto que conduce a la necesidad de 15 múltiples inyecciones i.v. (intravenosas) o de una infusión continua para conseguir la hemostasia. Esto da como resultado un costo muy alto del tratamiento y una inconveniencia para el paciente. Tanto un mejoramiento en el período de tiempo de semivida en plasma como en la 20 recuperación in vivo podrían proporcionar un beneficio para el paciente. Hasta ahora no está comercialmente disponible ninguna formulación farmacéutica de un Factor VIIa con una mejorada recuperación in vivo ni se ha publicado ningún dato que muestre variantes de FVII/FVIIa 25 con una recuperación in vivo mejorada. Puesto que el Factor VII/VIIa tiene el potencial de ser usado como un agente hemostático universal, todavía sigue existiendo una alta necesidad médica de desarrollar unas formas del Factor VIIa que tengan una mejorada recuperación in vivo. 30
Factor IX
El FIX humano es una glicoproteína monocatenaria con un peso molecular de 57 kDa, que es segregada por células hepáticas dentro del torrente sanguíneo como un zimógeno inactivo de 415 aminoácidos. Contiene 12 residuos de 5 ácido γ-carboxi-glutámico localizados en el dominio Gla terminal de N del polipéptido. Los residuos de Gla requieren vitamina K para su biosíntesis. Están situados en el extremo terminal de C con respecto al dominio Gla dos dominios de factores de crecimiento epidérmico y un 10 péptido de activación seguido por un dominio de serina proteasa del tipo de tripsina. Otras modificaciones del FIX posteriores a la traducción comprenden una hidroxilación (Asp 64), una glicosilación del tipo en N (Asn157 y Asn167) así como una glicosilación del tipo en 15 O (Ser53, Ser61, Thr159, Thr169 y Thr172), una sulfatación (Tyr155) y una fosforilación (Ser158).
El FIX es convertido en su forma activa Factor IXa por proteólisis del péptido de activación junto a Arg145-Ala146 y Arg180-Val181, conduciendo a la formación de dos 20 cadenas de polipéptidos, una cadena ligera terminal de N (de 18 kDa) y una cadena pesada terminal de C (de 28 kDa), que son mantenidas juntas por un puente de disulfuro. Una disociación por activación del Factor IX se puede conseguir in vitro p.ej. por el Factor Xla o el 25 Factor VIIa/TF.
El Factor IX está presente en un plasma humano en una concentración de 5-10 µg/ml. Se encontró que el período de tiempo de semivida en plasma del Factor IX en seres humanos es de aproximadamente 15-18 horas (White GC 30 y colaboradores 1997. Thromb Haemost. 78:261-265; Ewenstein BM y colaboradores 2002. Transfusion 42:190-197).
Puesto que los pacientes de hemofilia B reciben con frecuencia bisemanalmente unas administraciones profilácticas del Factor IX para evitar unas hemorragias 5 espontáneas, es deseable reducir los intervalos de aplicación aumentando la recuperación in vivo del producto de Factor IX aplicado. Tanto un mejoramiento en el período de tiempo de semivida en plasma como en la recuperación in vivo podrían proporcionar un beneficio 10 para el paciente. Hasta ahora no está disponible comercialmente ninguna formulación farmacéutica del Factor IX con un mejorado periodo de tiempo de semivida en plasma o una mejorada recuperación in vivo ni ha sido publicado ningún dato que muestre unas variantes del 15 Factor IX con un prolongado período de tiempo de semivida in vivo y con una mejorada recuperación in vivo. Por lo tanto, existe todavía una alta necesidad médica de desarrollar unas formas del Factor IX que tengan un más largo periodo de tiempo de semivida in vivo y/o una 20 mejorada recuperación in vivo.
Los fármacos a base de polipéptidos terapéuticos recombinantes son usualmente caros y no todos los países pueden afrontar unas terapias costosas basadas en dichos fármacos. Un aumento de la recuperación in vivo de estos 25 fármacos hará también que un tratamiento del estado de la técnica sea más barato, y subsiguientemente más pacientes se beneficiarán de él.
Ballance y colaboradores (documento de solicitud de patente internacional WO 01/79271) describen unos 30 polipéptidos de fusión de una multitud de diferentes proteínas terapéuticas de las que, cuando están fusionadas a una albúmina de suero humano, se predice que tendrán un aumentado período de tiempo de semivida funcional in vivo y una prolongada vida en almacenamiento. Se describen unas largas listas de potenciales partícipes en la fusión, sin mostrar por 5 datos experimentales para casi la totalidad de estas proteínas que los respectivos polipéptidos de fusión con una albúmina retienen realmente una actividad biológica y tienen propiedades mejoradas. Entre dicha lista de polipéptidos terapéuticos también se mencionan los 10 factores Factor IX y FVII/FVIIa como ejemplos del invento. Ballance y colaboradores no dicen nada acerca de la recuperación in vivo de estas proteínas de fusión.
Recuperación in vivo de polipéptidos dependientes de la 15 vitamina K
Se ha informado que la recuperación in vivo de un FIX recombinante (BeneFIX, Genetics Institute) de 0,84 – 0,86 UI/dl (= unidades internacionales por decilitro) por UI/kg es significativamente más baja en pacientes de 20 hemofilia B que la de un FIX derivado de plasma, tal como Mononine, de 1,17 – 1,71 UI/dl por UI/kg (White G. y colaboradores, Semin Hematol 35 (Suppl. 2): 33-38 (1998); Ewenstein B.M. y colaboradores Transfusion 42(2): 190-197 (2002)). Como una consecuencia de esto, se han de aplicar 25 unas proporciones más altas por lo menos en un 20 % de un FIX recombinante en comparación con un FIX derivado de plasma para conseguir un tratamiento comparablemente eficiente de la hemofilia B.
Sheffield (Sheffield WP y colaboradores (2004) Br. 30 J. Haematol. 126:565-573) expresaron un polipéptido humano de fusión de Factor IX y albúmina, y mostraron en experimentos farmacocinéticos que en unos ratones desactivados genéticamente (conocidos como knockout) con FIX, la recuperación in vivo de la proteína humana de fusión del FIX y una albúmina era significativamente más baja (menos que la mitad) que la de la molécula de FIX 5 humano no fusionado.
Se ha informado que la recuperación in vivo de un FVIIa recombinante (NovoSeven, Novo Nordisk) es de aproximadamente 19 a 22 % en pacientes deficientes en cuanto a FVII (Berrettini M y colaboradores 2001. 10 Haematologica 86:640-645) y de aproximadamente 46-48 % en paciente de hemofilia (Lindley CM y colaboradores, 1994. Clin. Pharmacol. Ther. 55:638-648). Similarmente, se describió que la recuperación in vivo de un rFVIIa era de aproximadamente 34 % en perros con hemofilia A y de 15 aproximadamente 44 % en perros con hemofilia B, respectivamente (Brinkhous KM y colaboradores, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. 86:1382-1386).
ESENCIA DEL INVENTO: 20
Puesto que los polipéptidos terapéuticos en general son bastante caros debido a sus costosos procesos de producción, un aumento en la recuperación in vivo ayudaría a proporcionar dichos productos a un precio más barato y a tratar a más personas que lo que actualmente 25 es posible. Además, una frecuencia reducida de las aplicaciones mejoraría la conveniencia para los pacientes.
Por lo tanto, el problema técnico que subyace al presente invento fue el de desarrollar unos polipéptidos 30 terapéuticos, en particular unos polipéptidos dependientes de la vitamina K, que muestren una aumentada recuperación in vivo, y por lo tanto faciliten la reducción de la dosis o de la frecuencia con la que es aplicado el producto.
SUMARIO DEL INVENTO: 5
Sorprendentemente, se encontró que unos polipéptidos dependientes de la vitamina K, cuando son expresados como proteínas de fusión con una albúmina, exhiben unas mejoradas recuperaciones in vivo. Por vía de ejemplo no limitativo, se encontró que en contraste con los 10 resultados obtenidos con una proteína de fusión del Factor IX y una albúmina, publicados por Sheffield y colaboradores (Sheffield WP y colaboradores, (2004) Br. J. Haematol. 126:565-573) las proteínas humanas de fusión del FIX y una albúmina exhiben una mejorada recuperación 15 in vivo en comparación con el Factor IX no fusionado. Se encontró además que unas fusiones del Factor VII/VIIa con una albúmina de suero humano conducen a unas proteínas de fusión del Factor VII/FVIIa que retienen la actividad biológica del Factor VII/FVIIa y presentan una 20 recuperación in vivo acrecentada.
Un aspecto del invento son por lo tanto unos polipéptidos terapéuticos fusionados con el extremo terminal de N o de C de una albúmina o de cualquier otro polipéptido intensificador de la recuperación, en que las 25 proteínas presentan por lo menos un 110 %, preferiblemente más de un 125 %, incluso más preferiblemente más de un 140% de la recuperación in vivo del respectivo polipéptido o péptido terapéutico no fusionado, producido por vía recombinante. 30
Otro aspecto del invento son unos polipéptidos dependientes de la vitamina K que están fusionados con el extremo terminal de N o C de una albúmina o de cualquier otro péptido intensificador de la recuperación. Las proteínas de fusión presentan un aumento significativo de la recuperación in vivo de los respectivos polipéptidos dependientes de la vitamina K del tipo salvaje, que se 5 han producido por vía recombinante.
Un aspecto adicional del invento son unas proteínas de fusión en las que unos polipéptidos del Factor VII/VIIa están fusionados con el extremo terminal de N de una albúmina que presenta un aumento significativo de la 10 recuperación in vivo en comparación con la del Factor VII/VIIa no fusionado, producido por vía recombinante.
Otro aspecto del invento son unas proteínas de fusión en las que los polipéptidos del Factor IX están fusionados con el extremo terminal de N de una albúmina 15 que presenta un aumento significativo de la recuperación in vivo en comparación con la de un Factor IX no fusionado.
Un aspecto del invento son, por lo tanto, unos polipéptidos dependientes de la vitamina K que están 20 fusionados con el extremo de N o de C de una albúmina que aumenta la recuperación in vivo en comparación con la del correspondiente polipéptido no fusionado por vía recombinante en por lo menos un 10 %, preferiblemente más de un 25 %, incluso más preferiblemente más de un 40 %. 25
El invento abarca unos polipéptidos terapéuticos, en particular unos polipéptidos dependientes de la vitamina K engarzados al extremo terminal de N o de C de un polipéptido intensificador de la recuperación tal como una albúmina, unas composiciones, unas composiciones 30 farmacéuticas, unas formulaciones y unos estuches. El invento abarca también el uso de dichos polipéptidos terapéuticos engarzados a dicho polipéptido intensificador de la recuperación, en ciertas indicaciones médicas en las que también serían aplicables los polipéptidos terapéuticos no fusionados. El invento abarca también unas moléculas de ácidos nucleicos que 5 codifican los polipéptidos terapéuticos engarzados a los polipéptidos que intensifican la recuperación del invento, así como unos vectores que contienen estos ácidos nucleicos, unas células anfitrionas transformadas con estos ácidos nucleicos y vectores, y unos métodos de 10 producir los polipéptidos terapéuticos engarzados a los polipéptidos intensificadores de la recuperación, del invento, usando estos ácidos nucleicos, estos vectores, y/o estas células anfitrionas.
El invento proporciona también una composición que 15 comprende un polipéptido dependiente de la vitamina K o un fragmento o variante de la misma, opcionalmente un engarzador peptídico, y una albúmina, o un fragmento o variante de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Otro objetivo del invento es el de 20 proporcionar un método para tratar a pacientes con trastornos hemorrágicos. El método comprende la operación de administrar una cantidad efectiva del polipéptido de fusión, que incluye el polipéptido dependiente de la vitamina K. 25
Otro aspecto del invento es el de proporcionar una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión con una albúmina, que comprende un polipéptido dependiente de la vitamina K, o un fragmento o una variante del mismo, 30 opcionalmente un engarzador peptídico, y una albúmina, o un fragmento o variante de la misma, así como un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico.
El invento proporciona también un método para la producción de un polipéptido de fusión con una albúmina, que comprende un polipéptido dependiente de la vitamina 5 K, o un fragmento o una variante del mismo, un engarzador peptídico, y una albúmina, o un fragmento o una variante de la misma, en que el método comprende:
(a) proporcionar un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido 10 dependiente de la vitamina K engarzado al polipéptido de albúmina expresable en una célula de mamífero;
(b) expresar el ácido nucleico en el organismo para formar un polipéptido dependiente de la vitamina K 15 engarzado al polipéptido de albúmina; y
(c) purificar el polipéptido dependiente de la vitamina K engarzado al polipéptido de albúmina.
Un polipéptido de fusión con una albúmina del presente invento comprende preferiblemente por lo menos 20 un fragmento o una variante de un polipéptido dependiente de la vitamina K y por lo menos un fragmento o una variante de una albúmina de suero humano, que están asociados/as entre sí, tal como por fusión genética (es decir, que el polipéptido de fusión con una albúmina es 25 generado por traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica la totalidad o una parte de un polipéptido dependiente de la vitamina K es unido en cuadro con el extremo 5’ de un polinucleótido que codifica la totalidad o una parte de una albúmina 30 opcionalmente engarzada por un polinucleótido que codifica una secuencia de engarzador, introduciendo un péptido engarzador entre el residuo de polipéptido dependiente de la vitamina K y el residuo de una albúmina).
En una forma de realización, el invento proporciona un polipéptido de fusión de una albúmina con un 5 polipéptido dependiente de la vitamina K, que comprende, o alternativamente consiste en, un polipéptido dependiente de la vitamina K, activo o activable terapéuticamente y/o activo o activable biológicamente, que está fusionado con el extremo terminal de N de un 10 polipéptido de albúmina de suero.
En otras formas de realización, el invento proporciona un polipéptido de fusión de una albúmina, que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento activo o activable terapéuticamente y/o activo o 15 activable biológicamente de un polipéptido dependiente de la vitamina K, y un engarzador peptídico fusionado con el extremo terminal de N de una albúmina de suero.
En otras formas de realización, el invento proporciona un polipéptido de fusión de una albúmina con 20 un polipéptido dependiente de la vitamina K, que comprende, o alternativamente consiste en, una variante activa o activable terapéuticamente y/o activa o activable biológicamente de un polipéptido dependiente de la vitamina K fusionado con el extremo terminal de N de 25 un polipéptido de albúmina de suero, y opcionalmente un engarzador peptídico.
En otras formas de realización adicionales, el invento proporciona un polipéptido de fusión de una albúmina con un polipéptido dependiente de la vitamina K, 30 que comprende, o alternativamente consiste en, un fragmento o una variante activo/a o activable terapéuticamente y/o activo/a o activable biológicamente, de un polipéptido dependiente de la vitamina K fusionado con el extremo terminal de N de un fragmento o una variante de una albúmina de suero, y opcionalmente un engarzador peptídico. 5
En algunas formas de realización, el invento proporciona un polipéptido de fusión con una albúmina, que comprende, o alternativamente consiste en, la parte madura de un polipéptido dependiente de la vitamina K, fusionada con el extremo de N de la parte madura de una 10 albúmina de suero, y opcionalmente un engarzador peptídico.
Las proteínas de fusión del presente invento se pueden usar terapéuticamente en todas aquellas indicaciones para las que se pueden aplicar los 15 polipéptidos o las proteínas que no se han fusionado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DEL INVENTO
Es un objetivo del presente invento proporcionar un método para aumentar la recuperación in vivo de 20 polipéptidos terapéuticos en comparación con la de polipéptidos terapéuticos no fusionados, en particular polipéptidos dependientes de la vitamina K o fragmentos o variantes de los mismos, por fusión con el extremo terminal de N o C de un polipéptido intensificador de la 25 recuperación, tal como una albúmina humana o fragmentos o variantes de la misma. Como ejemplos no limitativos del invento, se proporcionan unas fusiones de polipéptidos terapéuticos, en particular polipéptidos dependientes de la vitamina K, con el extremo terminal de N de una 30 albúmina de suero, opcionalmente con un engarzador peptídico intermedio entre el polipéptido dependiente de la vitamina K y la albúmina.
Los términos “albúmina de suero humano” (HSA, acrónimo de human serum albumin) y albúmina humana (HA, acrónimo de human albumin) se usan intercambiablemente en 5 el presente contexto. Los términos “albúmina” y “albúmina de suero” son más amplios, y abarcan una albúmina de suero humano (y fragmentos y variantes de la misma) así como una albúmina procedente de otra especie (y fragmentos y variantes de la misma). 10
Como se usa en el presente contexto, el término “albúmina” se refiere colectivamente a un polipéptido o una secuencia de aminoácidos de una albúmina, o a un fragmento o variante de una albúmina, que tiene una o más actividades funcionales (p.ej. actividades biológicas) de 15 una albúmina. En particular, “albúmina” se refiere a una albúmina humana o fragmentos de la misma, especialmente a la forma madura de una albúmina humana, como se muestra aquí en SEQ ID No: 20, o a una albúmina procedente de otros vertebrados, o fragmentos de la misma, o a 20 compuestos análogos o variantes de estas moléculas o a fragmentos de los/las mismos/as.
La parte de albúmina de los polipéptidos engarzados con una albúmina puede comprender la longitud total de la secuencia de HA que antes se ha descrito, o puede incluir 25 uno o más fragmentos de la misma, que son capaces de estabilizar o prolongar la actividad terapéutica. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de 10 o más aminoácidos o pueden incluir aproximadamente 15, 20, 25, 30, 50 o más aminoácidos contiguos procedentes de la 30 secuencia de HA, o pueden incluir una parte o la totalidad de los dominios específicos de la HA.
La parte de albúmina de los polipéptidos engarzados con una albúmina del invento puede ser una variante de una HA normal. La parte de polipéptido dependiente de la vitamina K de los polipéptidos engarzados con una albúmina del invento, puede consistir también en unas 5 variantes de los polipéptidos dependientes de la vitamina K que aquí se describen. El término “variante” incluye inserciones, deleciones (supresiones) y sustituciones, ya sea conservativas o no conservativas, cuando dichos cambios no alteren sustancialmente al sitio activo, o al 10 dominio activo que confiere las actividades terapéuticas de los polipéptidos dependientes de la vitamina K.
En particular, los polipéptidos del invento engarzados con una albúmina, pueden incluir variantes polimórficas presentes en la naturaleza de una albúmina 15 humana y fragmentos de una albúmina humana. La albúmina se puede derivar de cualquier vertebrado, especialmente de cualquier mamífero, un ser humano, un animal bovino, ovino o porcino. Las albúminas que no son de mamíferos incluyen, pero no están limitadas a, las de aves de 20 corral y der salmón. La parte de albúmina del polipéptido engarzado con una albúmina puede proceder de un animal diferente del de la parte de polipéptido dependiente de la vitamina K.
Hablando en términos generales, un fragmento o una 25 variante de una albúmina tendrá una longitud de por lo menos 20, de manera preferible por lo menos 40, de manera sumamente preferible más que 70 aminoácidos. La variante de albúmina puede consistir preferente en, o alternativamente comprender, por lo menos un dominio 30 completo de una albúmina o fragmentos de dichos dominios, por ejemplo los dominios 1 (amino ácidos 1-194 de SEQ ID NO:20), 2 (amino ácidos 195-387 de SEQ ID NO: 20), 3 (amino ácidos 388-585 de SEQ ID NO: 20), 1 + 2 (1-387 de SEQ ID NO: 20), 2 + 3 (195-585 de SEQ ID NO: 20) o 1 + 3 (amino ácidos 1-194 de SEQ ID NO: 20 + amino ácidos 388-585 de SEQ ID NO: 20). Cada dominio está constituido a su 5 vez por dos subdominios homólogos, a saber los 1-105, 120-194, 195-291, 316-387, 388-491 y 512-585, con unas flexibles regiones engarzadoras situadas entre subdominios, que comprenden los residuos desde Lys106 a Glu119, desde Glu292 a Val315 y desde Glu492 a Ala511. 10
La parte de albúmina de una proteína de fusión con una albúmina del invento, puede comprender por lo menos un subdominio o dominio de HA o unas modificaciones conservativas del mismo.
El invento se refiere a un polipéptido dependiente 15 de la vitamina K modificado, que comprende engarzar el polipéptido dependiente de la vitamina K, o un fragmento o una variante del mismo, con el extremo terminal de N o de C de un polipéptido de albúmina, o un fragmento o una variante del mismo, opcionalmente de manera tal que se 20 introduzca un engarzador peptídico intermedio entre el polipéptido dependiente de la vitamina K modificado y la albúmina, de manera tal que el polipéptido dependiente de la vitamina K modificado tiene una recuperación in vivo aumentada en comparación con la del polipéptido 25 dependiente de la vitamina k que no ha sido engarzado con una albúmina.
El término “polipéptido dependiente de la vitamina K” como se usa en esta solicitud, incluye, pero no se limita a, un polipéptido terapéutico que consiste en 30 Factor VII, Factor VIIa, Factor IX, Factor IXa, Factor X, Factor Xa, Factor II (protrombina), Proteína C, Proteína C activada, Proteína S, Proteína S activada, GAS6, GAS6 activada, Proteína Z, Proteína Z activada, y similares. Además, los útiles polipéptidos dependientes de la vitamina K pueden ser de tipo salvaje o pueden contener mutaciones. El grado y la situación de la glicosilación o 5 de otras modificaciones posteriores a la traducción pueden variar dependiendo de las células anfitrionas que se hayan escogido y de la naturaleza del entorno celular anfitrión. Cuando se hace referencia a unas específicas secuencias de aminoácidos, están abarcadas en esta 10 solicitud unas modificaciones posteriores a la traducción de dichas secuencias.
El término “polipéptidos dependientes de la vitamina K” dentro de la anterior definición, incluye unos polipéptidos que tienen la secuencia natural de 15 aminoácidos. Incluye también unos polipéptidos con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo terminal de N o terminal de C modificado incluyendo deleciones o adiciones de aminoácidos terminales, siempre y cuando que estos 20 polipéptidos retengan sustancialmente la actividad del respectivo polipéptido dependiente de la vitamina K. El término “polipéptido dependiente de la vitamina K” dentro de la anterior definición incluye también unas variaciones alélicas que pueden existir y aparecer de un 25 individuo a otro. El término “polipéptido dependiente de la vitamina K” dentro de la anterior definición incluye además unas variantes de polipéptidos dependientes de la vitamina K. Dichas variantes difieren en uno o más residuos de aminoácidos con respecto de la secuencia de 30 tipo salvaje. Ejemplos de dichas diferencias pueden incluir un truncamiento del extremo terminal de N y/o de C por uno o más residuos de aminoácidos (p.ej. 1 a 10 residuos de aminoácidos), o una adición de uno o más residuos suplementarios junto al extremo terminal de N y/o de C, así como sustituciones conservativas de aminoácidos, es decir unas sustituciones realizadas 5 dentro de grupos de aminoácidos con características similares, p.ej. (1) pequeños aminoácidos, (2) aminoácidos de carácter ácido, (3) aminoácidos polares, (4) aminoácidos de carácter básico, (5) aminoácidos hidrófobos y (6) aminoácidos aromáticos. Ejemplos de 10 dichas sustituciones conservativas se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
- (1)
- Alanina Glicina
- (2)
- Ácido aspártico Ácido glutámico
- (3a)
- Asparagina Glutamina
- (3b)
- Serina Treonina
- (4)
- Arginina Histidina Lisina
- (5)
- Isoleucina Leucina Metionina Valina
- (6)
- Fenilalanina Tirosina Triptófano
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Las fusiones de un polipéptido dependiente de la vitamina K y una albúmina del invento tienen una recuperación in vivo aumentada por lo menos en un 10 %, de manera preferible por lo menos en un 25 % y de manera más preferible por lo menos en un 40 %, en comparación 20 con unos polipéptidos dependientes de la vitamina K no fusionados.
La recuperación in vivo de los polipéptidos engarzados de una albúmina y el Factor VII del invento es usualmente por lo menos alrededor de un 10 %, de manera 25 preferible por lo menos alrededor de un 25 %, de manera más preferible por lo menos alrededor de un 40 % más alta que la recuperación in vivo de la forma de tipo salvaje del Factor VII humano.
La recuperación in vivo de los polipéptidos 5 engarzados de una albúmina y el Factor VIIa del invento es usualmente de por lo menos alrededor de un 10 %, de manera preferible por lo menos alrededor de un 25 %, de manera más preferible por lo menos alrededor de un 40 % más alta que la recuperación in vivo de la forma del tipo 10 salvaje del Factor VIIa humano.
La recuperación in vivo de los polipéptidos engarzados de una albúmina y el Factor IX del invento es usualmente de por lo menos alrededor de un 10 %, de manera preferible por lo menos alrededor de un 25 %, de 15 manera más preferible por lo menos alrededor de un 40 % más alta que la recuperación in vivo de la forma del tipo salvaje del Factor IX humano.
De acuerdo con el invento, el residuo de polipéptido dependiente de la vitamina K es acoplado con el residuo 20 de una albúmina mediante un engarzador peptídico. El engarzador debería ser flexible y no inmunogénico. Engarzadores ilustrativos incluyen (GGGGS)n o (GGGS)n o (GGS)n, en que n es un número entero mayor o igual que 1 y en que G representa glicina y S representa serina. 25
En otra forma de realización del invento, el engarzador peptídico situado entre el residuo de polipéptido dependiente de la vitamina K y el residuo de una albúmina contiene unos sitios de consenso para la adición de modificaciones posteriores a la traducción. 30 Preferiblemente, dichas modificaciones consisten en sitios de glicosilación. Más preferiblemente, dichas modificaciones consisten en por lo menos un sitio de glicosilación en N con la estructura Asn - X - Ser/ Thr, en la que X designa a cualquier aminoácido excepto prolina. Incluso más preferiblemente, dichos sitios de glicosilación en N son introducidos cerca del extremo 5 terminal de amino y/o de carboxi del engarzador peptídico, de manera tal que ellos son capaces de proteger a unos neoepítopos potenciales que puedan desarrollarse junto a las secuencias en las que el residuo de polipéptido dependiente de la vitamina K está 10 en transición dentro del engarzador peptídico y en las que el engarzador peptídico está en transición dentro de la secuencia de residuo de albúmina, respectivamente.
El invento se refiere adicionalmente a un polinucleótido que codifica una fusión de un polipéptido 15 dependiente de la vitamina K y una albúmina, como se describe en esta solicitud. El término “polinucleótido(s)” se refiere generalmente a cualquier poli(ribonucleótido) o poli(desoxirribonucleótido) que puede ser un ARN o ADN sin modificar o un ARN o ADN 20 modificado. El polinucleótido puede ser un ADN mono- o bi-catenario, o un ARN mono- o bi-catenario. Como se usa en el presente contexto, el término “polinucleótido(s)” incluye también ADN’s o ARN’s que comprenden una o más bases modificadas y/o bases desacostumbradas, tales como 25 inosina. Se apreciará que se pueden hacer una diversidad de modificaciones en los ADN y ARN, que sirven para muchas finalidades útiles que son conocidas para los que poseen experiencia en la especialidad. El término “polinucleótido(s)” tal como se emplea en el presente 30 contexto, abarca dichas formas, modificadas de manera química, enzimática o metabólica, de polinucleótidos, así como las formas químicas de ADN y ARN que son características de virus y células, incluyendo, por ejemplo, células simples y complejas.
La persona experta en la especialidad entenderá que, debido a la degeneración del código genético, un 5 polipéptido dado puede ser codificado por diferentes polinucleótidos. Estas “variantes” están abarcadas por este invento.
Preferiblemente, el polinucleótido del invento es un polinucleótido aislado. El término polinucleótido 10 “aislado” se refiere a un polinucleótido que está sustancialmente exento de otras secuencias de ácidos nucleicos, tales como y sin limitarse a otros ADN y ARN cromosomales y extracromosomales. Los polinucleótidos aislados pueden ser purificados a partir de una célula 15 anfitriona. Unos convencionales métodos de purificación de ácidos nucleicos, conocidos para los profesionales expertos, se pueden usar para obtener polinucleótidos aislados. El término incluye también polinucleótidos recombinantes y polinucleótidos sintetizados por vía 20 química.
Todavía otro aspecto del invento es un plásmido o vector que comprende un polinucleótido de acuerdo con el invento. Preferiblemente, el plásmido o vector es un vector de expresión. En una forma particular de 25 realización, el vector es un vector de transferencia para usarse en la terapia génica de seres humanos.
Todavía otro aspecto del invento es una célula anfitriona, que comprende un polinucleótido del invento o un plásmido o un vector del invento. 30
Las células anfitrionas del invento se pueden emplear en un método de producir una fusión de un polipéptido dependiente de la vitamina K y una albúmina, que es parte del invento. El método comprende:
- cultivar células anfitrionas del invento en unas condiciones tales que se exprese la fusión de un polipéptido dependiente de la vitamina K y una albúmina; 5 y
- opcionalmente recuperar la fusión de un polipéptido dependiente de la vitamina K y una albúmina a partir del medio de cultivo.
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EXPRESIÓN DE LOS POLIPÉPTIDOS PROPUESTOS
La producción de proteínas recombinantes con altos niveles en apropiadas células anfitrionas requiere el ensamblaje de los ADNc’s modificados que antes se han mencionado, para dar unas eficientes unidades de 15 transcripción conjuntamente con apropiados elementos reguladores en un vector de expresión recombinante, que puede ser propagado en diferentes sistemas de expresión de acuerdo con métodos conocidos para los expertos en la especialidad. Unos eficientes elementos reguladores de la 20 transcripción se podrían derivar de unos virus que tengan células de animales como sus anfitriones naturales, o del ADN cromosomal de células de animales. Preferiblemente, se pueden usar unas combinaciones de promotores e intensificadores que se derivan del Virus de Simio 40, 25 adenovirus, virus de polioma de BK, citomegalovirus humanos, o de la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous, o unas combinaciones de promotores e intensificadores que incluyen unos genes transcritos de manera fuertemente constitutiva en células de animales 30 tales como la beta-actina o la GRP78. Con el fin de conseguir unos altos niveles estables de ARNm (mensajeros) transcritos a partir de los ADNc’s, la unidad de transcripción debería de contener en su parte próxima de 3’, una región de ADN que codifique una secuencia de terminación de la transcripción y de poliadenilación. Preferiblemente, esta secuencia se 5 deriva de la región de transcripción temprana del Virus de Simio 40, del gen de beta-globina de conejo o del gen del activador de plasminógeno de tejido humano.
Los ADNc’s son luego integrados dentro del genoma de un apropiado linaje de células anfitrionas para la 10 expresión de los polipéptidos de fusión de polipéptidos terapéuticos y albúminas. Preferiblemente, este linaje de células deberá ser un linaje de células de animales con origen de vertebrados con el fin de asegurar un correcto plegamiento, una correcta carboxilación en posición gamma 15 de residuos de ácido glutámico dentro del dominio Gla, una formación de enlaces de disulfuro, una glicosilación vinculada a asparagina, una glicosilación vinculada a O y otras modificaciones posteriores a la traducción, así como una secreción dentro del medio de cultivación. 20 Ejemplos de otras modificaciones posteriores a la traducción son una sulfatación en O de tirosina, una hidroxilación, una fosforilación, un tratamiento proteolítico de la cadena de polipéptido naciente y una disociación de la región de propéptido. Ejemplos de 25 linajes de células que se pueden usar son células COS de mono, células L de ratón, células C127 de ratón, células BHK-21 de hámster, células de riñón embrionario humano 293 y células de CHO de hámster.
El vector recombinante que codifica los ADNc’s 30 correspondientes puede ser introducido en varias maneras diferentes dentro de un linaje de células de un animal. Por ejemplo, unos vectores de expresión recombinante pueden ser creados a partir de unos vectores basados en diferentes virus de animales. Ejemplos de éstos son unos vectores basados en baculovirus, virus vaccínia, adenovirus, y preferiblemente virus de papiloma bovino. 5
Las unidades de transcripción que codifican los correspondientes ADN’s pueden ser introducidas también dentro de células de animales conjuntamente con otro gen recombinante que puede funcionar como un marcador seleccionable dominante en estas células, con el fin de 10 facilitar el aislamiento de clones de células específicas que tienen integrado el ADN recombinante dentro de su genoma. Ejemplos de este tipo de genes marcadores seleccionables dominantes son la amino glicósído fosfotransferasa Tn5, que confiere resistencia a la 15 geneticina (G418), la higromicina fosfotransferasa, que confiere resistencia a higromicina, y la puromicina acetil transferasa, que confiere resistencia a puromicina. El vector de expresión recombinante que codifica dicho marcador seleccionable puede residir o 20 bien en el mismo vector que el que codifica el ADNc del deseado polipéptido, o puede ser codificado en un vector separado que es introducido e integrado simultáneamente en el genoma de la célula anfitriona, dando como resultado frecuentemente un apretado engarce físico entre 25 las diferentes unidades de transcripción.
Otros tipos de genes marcadores seleccionables, que se pueden usar conjuntamente con el ADNc de la deseada proteína, están basados en diversas unidades de transcripción que codifican la dihidrofolato reductasa 30 (dhfr). Después de una introducción de este tipo de gen dentro de células que carecen de actividad endógena de dhfr, preferentemente células CHO (DUKX-B11, DG-44) esto hará posible que éstas crezcan en unos medios que carecen de nucleósidos. Un ejemplo de dicho medio es el F12 de Ham sin hipoxantina, timidina ni glicina. Estos genes de dhfr pueden ser introducidos conjuntamente con las 5 unidades de transcripción de ADNc de un factor de coagulación dentro de células CHO del tipo anterior, ya sea engarzados en el mismo vector o en diferentes vectores, creando de esta manera unos linajes de células positivas para dhfr, que producen una proteína 10 recombinante.
Si los anteriores linajes de células se hacen crecer en la presencia del agente inhibidor de dhfr citotóxico metotrexato, emergerán nuevos linajes de células resistentes al metotrexato. Estos linajes de células 15 pueden producir una proteína recombinante a una velocidad aumentada debido al número amplificado de dhfr engarzado y de las unidades de transcripción de proteína que se desean. Cuando se propagan estos linajes de células en concentraciones crecientes de metotrexato (1-10.000 nM), 20 se pueden obtener nuevos linajes de células que producen la proteína deseada a una velocidad muy alta.
Los anteriores linajes de células que producen la deseada proteína se pueden hacer crecer a una gran escala, ya sea en un cultivo en suspensión o sobre 25 diversos soportes sólidos. Ejemplos de estos soportes son unos micro vehículos basados en matrices de dextrano o colágeno, o unos soportes sólidos en la forma de fibras huecas o de diversos materiales cerámicos. Cuando se hacen crecer en un cultivo en suspensión de células o 30 sobre micro vehículos, la cultivación de los anteriores linajes de células se puede realizar o bien como un cultivo discontinuo o como un cultivo en perfusión con producción continua de un medio acondicionado durante prolongados períodos de tiempo. Así, de acuerdo con el presente invento, los anteriores linajes de células son bien idóneos para el desarrollo de un procedimiento 5 industrial para la producción de las deseadas proteínas recombinantes.
La proteína recombinante, que se acumula en el medio de células secretoras de los tipos anteriores, se puede concentrar y purificar por una diversidad de métodos 10 bioquímicos y cromatográficos, incluyendo métodos que utilizan diferencias en cuanto al tamaño, la carga, la hidrofobia, la solubilidad, la afinidad específica, etc., entre la deseada proteína y otras sustancias en el medio de cultivación de células. 15
Un ejemplo de dicha purificación es la adsorción de la proteína recombinante en un anticuerpo monoclonal o un péptido de fijación, que está inmovilizado sobre un soporte sólido. Después de una desorción, la proteína puede ser purificada adicionalmente por una diversidad de 20 técnicas cromatográficas basadas en las anteriores propiedades.
Es preferido purificar el polipéptido terapéutico, p.ej. la fusión de un polipéptido dependiente de la vitamina K y una albúmina del presente invento con una 25 pureza mayor que 80 %, de manera más preferible mayor que 95 %, y se prefiere particularmente un estado puro farmacéuticamente que es puro en más de 99,9 % con respecto a macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y otros ácidos nucleicos, y está exento 30 de agentes infecciosos y pirógenos. Preferiblemente, un polipéptido terapéutico aislado o purificado, p.ej. una fusión de un polipéptido dependiente de la vitamina K y una albúmina del invento está sustancialmente exento de otros polipéptidos.
El polipéptido terapéutico, y respectivamente la fusión de un polipéptido dependiente de la vitamina K y 5 una albúmina, que se describe en este invento, se puede formular en la forma de formulaciones farmacéuticas para uso terapéutico. Las proteínas purificadas pueden ser disueltas en convencionales soluciones tamponadoras acuosas fisiológicamente compatibles, a las que se pueden 10 añadir, opcionalmente, excipientes farmacéuticos para proporcionar formulaciones farmacéuticas.
Dichos vehículos y excipientes farmacéuticos así como dichas apropiadas formulaciones farmacéuticas son bien conocidos/as en la especialidad (véase, por ejemplo, 15 “Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins” [desarrollo de formulaciones farmacéuticas de péptidos y proteínas], Frokjaer y colaboradores, Taylor & Francis (2000) o “Handbook of Pharmaceutical Excipients” [manual de excipientes farmacéuticos], 3ª edición, Kibbe 20 y colaboradores, Pharmaceutical Press (2000)). En particular, la composición farmacéutica que comprende la variante de polipéptido del invento puede ser formulada en una forma liofilizada o soluble estable. El polipéptido terapéutico puede ser liofilizado por una 25 diversidad de procedimientos conocidos en la especialidad. Unas formulaciones liofilizadas son reconstituidas antes del uso mediante la adición de uno o más diluyentes farmacéuticamente aceptables, tales como agua estéril para inyección o una solución salina 30 fisiológica estéril.
Las formulaciones de la composición son suministradas al individuo pertinente por cualquier medio de administración apropiado farmacéuticamente. Se conocen diversos sistemas de suministro y se pueden usar para administrar la composición por cualquier vía conveniente. 5 Preferiblemente, las composiciones del invento se administrar por una vía sistémica. Para el uso sistémico, las proteínas de fusión engarzadas con albúmina del invento son formuladas para suministro por vía parenteral (p.ej. intravenosa, subcutánea, intramuscular, 10 intraperitoneal, intracerebral, intrapulmonar, intranasal o transdérmica) o enteral (p.ej. oral, vaginal o rectal) de acuerdo con métodos convencionales. La vía más preferente de administración es una administración por vía intravenosa. Las formulaciones se pueden administrar 15 de un modo continuo por infusión o por inyección de bolos. Algunas formulaciones abarcan unos sistemas de liberación lenta.
Los polipéptidos terapéuticos del invento, y respectivamente los polipéptidos dependientes de la 20 vitamina K engarzados con una albúmina del presente invento, se administran a los pacientes en una dosis terapéuticamente efectiva, que significa una dosis que es suficiente para producir los deseados efectos, evitar o disminuir la gravedad o la diseminación de la condición o 25 indicación que esté siendo tratada, sin llegar a una dosis que produzca unos intolerables efectos colaterales desfavorables. La dosis exacta depende de muchos factores, tales como p.ej. la indicación, la formulación y el modo de administración, y ha de ser determinada en 30 pruebas preclínicas y clínicas para cada indicación respectiva.
La composición farmacéutica del invento puede ser administrada a solas o en conjunción con otros agentes terapéuticos. Estos agentes pueden ser incorporados como parte del mismo producto farmacéutico.
Los diversos productos del invento son útiles como 5 medicamentos. Correspondientemente, el invento se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido dependiente de la vitamina K engarzado con una albúmina como aquí se describe, un polinucleótido del invento, o un plásmido o vector del invento. 10
Los ADN’s modificados de este invento pueden ser integrados también dentro de un vector de transferencia para usarse en la terapia génica de seres humanos.
Otro aspecto del invento es el uso de un polipéptido terapéutico del invento, p.ej. un polipéptido dependiente 15 de la vitamina k engarzado con una albúmina como aquí se describe, de un polinucleótido del invento, de un plásmido o vector del invento o de una célula anfitriona del invento, para la producción de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevención de trastornos 20 hemorrágicos. Los trastornos hemorrágicos incluyen pero no se limitan a la hemofilia A. en otra forma de realización del invento, el tratamiento comprende una terapia génica de seres humanos.
El invento concierne también a un método para tratar 25 a un individuo en una o más de las siguientes indicaciones: “hemofilia A o B”, “episodios hemorrágicos en pacientes con deficiencias de coagulación heredadas o adquiridas”, “episodios de oclusión vascular tales como p.ej. trombosis en pacientes con deficiencias de factores 30 heredadas o adquiridas”, “sepsis”, “episodios de hemorragia y operaciones quirúrgicas en pacientes con hemofilia heredada o adquirida con unos agentes inhibidores para Factores de coagulación (FVIII o FIX)”, “inversión de déficits de hemostasia desarrollados como consecuencia de tratamientos con fármacos, tales como fármacos contra plaquetas o fármacos contra la 5 coagulación”, “mejoramiento de una hemostasia secundaria”, “déficits de hemostasia desarrollados durante infecciones o durante padecimientos tales como deficiencia de la vitamina K o una enfermedad hepática grave”, “resección del hígado”, “déficits de hemostasia 10 desarrollados como consecuencia de mordeduras de serpientes“ y “hemorragias gastrointestinales”. Unas indicaciones asimismo preferidas son “traumas”, “consecuencias de una transfusión masiva (coagulopatía por dilución)”, “deficiencias de factores de coagulación 15 distintos de FVIII y FIX”, “VWD”, “deficiencia de FI”, “deficiencia de FV”, “deficiencia de FVII”, “deficiencia de FX“, “deficiencia de FXIII”, “HUS”, “enfermedades y trastornos de plaquetas heredadas/os o adquiridas/os tales como trombocitopenia, ITP, TTP, síndrome de HELLP, 20 síndrome de Bernard-Soulier, tromboastenia de Glanzmann, “HIT”, “síndrome de Chediak-Higahi”, “síndrome de Hermansky-Pudlak”, “síndrome de Rendu-Osler”, “púrpura de Henoch-Schonlein”, “curación y cicatrización de heridas” y “sepsis”. El método comprende administrar a dicho 25 individuo una cantidad eficiente del polipéptido dependiente de la vitamina K engarzado con una albúmina como aquí se describe. En otra forma de realización, el método comprende administrar al individuo una cantidad suficiente del polipéptido del invento o de un plásmido o 30 vector del invento. Alternativamente, el método puede comprender administrar al individuo una cantidad
DESCRIPCIÓN DE TABLAS Y DIBUJOS
5
Figura 1:
Sitio de restricción por XhoI introducido en el sitio del codón de detención de FVII natural mediante reemplazo de TAG por TCG. La base mutada está indicada en letra negrita. El sitio para NotI, usado para la construcción 10 adicional está doblemente subrayado. La secuencia de aminoácidos del extremo terminal de C del Factor VII se da en un código de tres letras (encuadrado).
Figura 2: 15
Bosquejo de las secuencias de engarzadores que se han introducido entre el extremo terminal de C del Factor VII y el extremo terminal N de una albúmina en las diversas construcciones artificiales de pFVII. Las asparaginas de los sitios de glicosilación en N están doblemente 20 subrayadas.
Figura 3:
Bosquejo de las secuencias engarzadoras que se han introducido entre el extremo terminal de C del Factor IX 25 y del extremo terminal de N de una albúmina en las diversas construcciones artificiales de pFIX. Las asparaginas de los sitios de glicosilación en N están doblemente subrayadas.
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EJEMPLOS:
Ejemplo 1: Generación de ADNc’s que codifican FVII y proteínas de fusión de FVII con albúminas
La secuencia codificadora del Factor VII fue 5 amplificada por una PCR (reacción en cadena de polimerasa) a partir de una biblioteca de ADNc de hígado humano (de ProQuest, Invitrogen) usando los cebadores We1303 y We1304 (SEQ ID NO 1 y 2). Después de una segunda ronda de PCR usando los cebadores We1286 y We1287 (SEQ ID 10 NO 3 y 4) el resultante fragmento fue clonado dentro de pCR4TOPO (de Invitrogen). Desde allí el ADNc FVII fue transferido como un fragmento de EcoRI dentro del sitio para EcoRI de pIRESpuro3 (de BD Biosciences) en el que un sitio interno para XhoI había sido suprimido previamente. 15 El resultante plásmido fue denominado pFVII-659.
Subsiguientemente se introdujo un sitio de restricción con XhoI dentro del pFVII-659 junto al sitio del codón de detención de FVII natural (Figura 1) por una mutagénesis dirigida a un sitio de acuerdo con protocolos 20 clásicos (Site Directed Mutagenesis Kit [estuche de mutagénesis dirigida a un sitio] QuickChange XL de Stratagene) usando los oligonucleótidos We1643 y We1644 (SEQ ID NO 5 y 6). El plásmido resultante fue denominado pFVII-700. 25
Los oligonucleótidos We1731 y We1732 (SEQ ID NO 7 y 8) fueron reanillados en concentraciones equimolares (10 pmol) en condiciones clásicas de PCR, rellenados y amplificados usando un protocolo de PCR a base de una desnaturalización inicial durante 2 min. (minutos) a 30 94ºC, seguida por 7 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 15 s (segundos), de un reanillado a 55ºC durante 15 s y de una elongación a 72ºC durante 15 s, y finalizado por una operación de prolongación de 5 min. a 72ºC. El resultante fragmento fue digerido con las endonucleasas de restricción XhoI y NotI y ligado dentro del pFVII-700 digerido con las mismas enzimas. El 5 resultante plásmido fue denominado pFVII-733, que contiene una secuencia de codificación de FVII y una prolongación terminal de C de un engarzador de glicina/serina disociable con trombina.
Basándose en el pFVII-733 se introdujeron otros 10 engarzadores sin ningún sitio de disociación con trombina, y sitios adicionales de glicosilación en N. Para esto, los pares de cebadores We2148 y We2149 (SEQ ID NO 9 y 10), We2148 y We2151 (SEQ ID NO 9 y 11), We2152 y We2154 (SEQ ID NO 12 y 13), We2152 y We2155 (SEQ ID NO 12 15 y 14) y We2156 y We2157 (SEQ ID NO 15 y 16), respectivamente, fueron reanillados y amplificados como antes se ha descrito. Los respectivos fragmentos de PCR fueron digeridos con las endonucleasas de restricción XhoI y BamH1 e introducidos dentro del pFVII-733 digerido 20 con las mismas enzimas. Dentro del sitio para BamH1 de los plásmidos resultantes, así como dentro del de pFVII-733, se introdujo un fragmento de BamH1 que contenía el ADNc de una albúmina humana madura. Este fragmento había sido generado por una PCR sobre una secuencia de ADNc de 25 albúmina usando los cebadores We1862 y We1902 (SEQ ID NO 17 y 18) en condiciones clásicas. Los plásmidos finales fueron denominados pFVII-935, pFVII-937, pFVII-939, pFVII-940, pFVII-941 y pFVII-834, respectivamente.
Con el fin de generar una proteína de fusión de FVII 30 y una albúmina sin ningún engarzador, se aplicó una mutagénesis por deleción como antes se señala sobre el plásmido pFVII-935 usando los cebadores We2181 y We2182 (SEQ ID NO 25 y 26). El plásmido resultante fue denominado pFVII-974. Las secuencias de engarzador y las secuencias de FVII en el extremo terminal de C y de albúmina en el extremo terminal de N de estos plásmidos 5 se bosquejan en la Figura 2.
Ejemplo 2: Generación de ADNc’s que codifican el FIX y proteínas de fusión de FIX con albúminas
Una secuencia codificadora del Factor IX fue 10 amplificada por una PCR a partir de una biblioteca de ADNc de hígado humano (de ProQuest, Invitrogen) usando los cebadores We1403 y We1404 (SEQ ID NO 27 y 28). Después de una segunda ronda de PCR usando los cebadores We1405 y We1406 (SEQ ID NO 29 y 30) el resultante 15 fragmento fue clonado dentro de pCR4TOPO (de Invitrogen). A partir de allí, el ADNc del FIX fue transferido como un fragmento de EcoRI en el sitio para EcoRI del vector de expresión pIRESpuro3 (de BD Biosciences) en el que había sido previamente suprimido un sitio interno para XhoI. El 20 plásmido resultante fue denominado pFIX-496 y era el vector de expresión para el tipo salvaje del Factor IX.
Para la generación de construcciones artificiales de fusión con albúminas, el ADNc del FIX fue vuelto a amplificar por una PCR en condiciones clásicas usando los 25 cebadores We2610 y We2611 (SEQ ID NO 31 y 32), suprimiendo el codón de detención e introduciendo en su lugar un sitio para XhoI. El resultante fragmento del FIX fue digerido con las endonucleasas de restricción EcoRI y XhoI y ligado dentro de un pIRESpuro3 digerido con EcoRI 30 / BamH1 conjuntamente con un fragmento de engarzador digerido con XhoI / BamH1 como se describe seguidamente. Se generaron dos diferentes fragmentos de engarzadores de glicina/serina. Los oligonucleótidos We2148 y We2150 (SEQ ID NO 9 y 33) fueron reanillados en concentraciones equimolares (10 pmol) en condiciones de PCR clásicas, rellenados y amplificados usando un 5 protocolo de PCR a base de una desnaturalización inicial durante 2 min. a 94ºC, seguida por 7 ciclos de desnaturalización durante 15 s a 94ºC, de un reanillado a 55ºC durante 15 s y de una elongación a 72ºC durante 15 s, y finalizado por una operación de prolongación a 72ºC 10 durante 5 min. El mismo proceso se realizó usando los oligonucleótidos We2156 y We2157 (SEQ ID NO 15 y 16).
Los resultantes fragmentos de engarzadores fueron digeridos con las endonucleasas de restricción XhoI y BamH1 y usados por separado en la reacción de ligación 15 antes descrita. Los resultantes dos plásmidos contenían por lo tanto la secuencia de codificación para el FIX y una prolongación en el extremo terminal de C de un engarzador de glicina/serina. En la siguiente operación de clonación, estos plásmidos fueron digeridos con BamH1 20 y se introdujo un fragmento de BamH1 que contenía el ADNc de una albúmina humana madura. Este fragmento había sido generado por PCR sobre una secuencia de ADNc de albúmina usando los cebadores We1862 y We1902 (SEQ ID NO 17 y 18) en condiciones clásicas. Los plásmidos finales fueron 25 denominados pFIX-980 y pFIX-986, respectivamente. Sus secuencias de engarzadores y las secuencias del FIX terminal de C y de la albúmina terminal de N están bosquejadas en la Figura 3.
Para conseguir un tratamiento eficiente del 30 propéptido en unas células que expresan el FIX en altas cantidades, se requiere la expresión concomitante de furina (Wasley LC y colaboradores, 1993. PACE/Furin can process the vitamin K-dependent pro-factor IX precursor within the secretory pathway [la PACE/furina puede tratar el precursor del pro-factor IX dependiente de la vitamina K dentro de la trayectoria secretoria] J. Biol. Chem. 5 268:8458-8465). La furina fue amplificada a partir de una biblioteca de ADNc de hígado (de Ambion) usando los cebadores We1791 y We1792 (SEQ ID NO 34 y 35). Una segunda ronda de PCR usando los cebadores We1808 y We1809 (SEQ ID NO 36 y 37) proporcionó un fragmento de furina en 10 donde se había suprimido el dominio transmembranal (TM) terminal de carboxi y se había introducido un codón de detención; este fragmento fue clonado dentro de pCR4TOPO (de Invitrogen). Desde allí el ADNc de furinaΔTM fue transferido como un fragmento de EcoRI/NotI dentro de los 15 sitios para EcoRI/NotI de pIRESpuro3 (de BD Biosciences), en donde había sido suprimido previamente un sitio interno para XhoI. El plásmido resultante fue denominado pFu-797. La secuencia de aminoácidos de la furina segregada, codificada por el pFu-797, es dada como SEQ-ID 20 NO 38.
Ejemplo 3: Transfección y expresión de FVII, de FIX y de las respectivas proteínas de fusión con albúminas
Los plásmidos se hicieron crecer en TOP10 de E.coli 25 (de Invitrogen) y se purificaron usando protocolos clásicos (de Qiagen). Las células HEK-293 fueron transfectadas usando el reactivo Lipofectamine 2000 (de Invitrogen) y hechas crecer en un medio exento de suero (Invitrogen 293 Express) en la presencia de 50 ng/ml de 30 vitamina K y de 4 µg/ml de puromicina. La transfección concomitante del ADNc de furinaΔTM se realizó en una relación molar de 1:5 (pFu-797: respectiva construcción artificial con pFIX). Las poblaciones de células transfectadas fueron diseminadas a través de matraces T dentro de botellas rodantes o de fermentadores a pequeña escala, a partir de lo cual se cosecharon los materiales 5 sobrenadantes para su purificación.
Ejemplo 4: Purificación de FVII y de polipéptidos de fusión de FVII con albúminas
Una cosecha de cultivo celular que contenía FVII o 10 una proteína de fusión de FVII y albúmina fue aplicada sobre una columna con Q-sepharose FF de 2,06 ml, que previamente había sido equilibrada con un tampón Hepes 20 mM de pH 7,4. Subsiguientemente, la columna fue lavada con 10 volúmenes del mencionado tampón Hepes. La elución 15 de las moléculas de FVII unidas se consiguió desarrollando un gradiente lineal desde 0 a 1,0 M de NaCl en un tampón Hepes 20 mM dentro de 20 volúmenes de columna. El material eluido contenía alrededor de 85-90 % del antígeno de FVII aplicado, en unas concentraciones de 20 proteínas comprendidas entre 0,5 y 1 g/l.
Alternativamente, el FVII fue purificado por cromatografía usando un factor tisular inmovilizado tal como se describe en el documento EP 0770625B1.
El antígeno de FVII y su actividad se determinaron 25 tal como se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 5: Determinación de la actividad y del antígeno de FVII.
La actividad de FVII se determinó usando un estuche 30 de ensayo cromogénico comercialmente disponible (Chromogenix Coaset FVII) basándose en el método descrito por Seligsohn y colaboradores, Blood (1978) 52:978-988.
La actividad de FVIIa se determinó usando un estuche de ensayo comercialmente disponible (STACLOT®)VIIa-rTF, de Diagnostica Stago) basándose en el método descrito por 5 Morissey y colaboradores (1993) Blood 81:734-744.
El antígeno de FVII fue determinado mediante un ELISA cuyo rendimiento es conocido para los expertos en la especialidad. Dicho brevemente, unas microplacas fueron incubadas con 120 µl por pocillo del anticuerpo de 10 captura (IgG de FVII anti humano de cordero, Cedarlane CL20030AP, diluido a 1:1.000 en un Tampón A [Sigma C3041]) durante una noche a la temperatura ambiente. Después de haber lavado las placas tres veces con el Tampón B (Sigma P3563), cada pocillo fue incubado con 200 15 µl de un Tampón C (Sigma P3688) durante una hora a la temperatura ambiente. Después de otras tres operaciones de lavado con el tampón B, unas diluciones en serie de la muestra de ensayo en el tampón B así como unas diluciones en serie de un plasma humano patrón (Dade Behring; 50 – 20 0,5 mU/ml) en el tampón B (volúmenes por pocillo: 100 µl) se incubaron durante dos horas a la temperatura ambiente. Después de tres operaciones de lavado con el tampón B, se añadieron a cada pocillo 100 µl de una dilución a 1:5.000 en el tampón B del anticuerpo de detección (IgG de FVII 25 anti humano de cordero, Cedarlane CL20030K, marcado con una peroxidasa) y se incubaron durante otras dos horas a la temperatura ambiente. Después de tres operaciones de lavado con el tampón B, se añadieron 100 µl de una solución del substrato (TMB, Dade Behring, OUVF) por cada 30 pocillo y se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 µl de una solución de detención no diluida (Dade Behring, OSFA) preparó a las muestras para la lectura en un apropiado lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. Luego, las concentraciones de las muestras de ensayo se calcularon usando la curva patrón con un plasma 5 humano patrón como referencia.
Ejemplo 6: Purificación de FIX y de polipéptidos de fusión de FIX y albúminas
Una cosecha de cultivo de células que contenía FIX o 10 la proteína de fusión de FIX y una albúmina se aplicó sobre una columna con Q-sepharose FF, previamente equilibrada con una mezcla de TrisxHCl 50 mM y un tampón de NaCl 100 mM de pH 8,0. Subsiguientemente, la columna fue lavada con un tampón de equilibrado que contenía 200 15 mM de NaCl. La elución de FIX o de los polipéptidos de fusión de FIX unido(s) se consiguió desarrollando un gradiente de sales. El material eluido fue purificado adicionalmente sobre hidroxil-apatito por cromatografía en columna. Para esta finalidad, el material eluido de la 20 columna con Q-Sepharose FF se cargó sobre una columna de cromatografía con hidroxil-apatito, equilibrada con una mezcla de TrisxHCl 50 mM y un tampón de NaCl 100 mM de pH 7,2 . La columna fue lavada con el mismo tampón y el FIX o el FIX-HAS se eluyeron usando un gradiente de una sal 25 fosfato. El material eluido fue dializado para reducir la concentración salina y usado para un análisis bioquímico así como para la determinación de la recuperación in vivo. El antígeno y la actividad de FIX se determinaron tal como se describe en el Ejemplo 7. 30
Ejemplo 7: Determinación del antígeno y de la actividad de FIX
La actividad de FIX se determinó como actividad de coagulación usando unos reactivos de aPTT comercialmente disponibles (Dade Behring, Pathromtin SL y un plasma 5 agotado en cuanto a FIX).
El antígeno de FIX se determinó mediante un acceso de ELISA a protocolos clásicos conocidos para los expertos en la especialidad. Dicho brevemente, unas microplacas fueron incubadas con 100 µl por pocillo del 10 anticuerpo de captura (anticuerpos emparejados para un ELISA de FIX 1:200, Cedarlane) durante una noche a la temperatura ambiente. Después de haber lavado las placas tres veces con un tampón B de bloqueo (Sigma P3563), cada uno de los pocillos fue incubado con 200 µl de un tampón 15 C (Sigma P3688) durante una hora a la temperatura ambiente. Después de otras tres operaciones de lavado con el tampón B, unas diluciones en serie de la muestra de ensayo en el tampón B así como unas diluciones en serie de un subpatrón (SHP) en un tampón B (volúmenes por 20 pocillo: 100 µl) se incubaron durante dos horas a la temperatura ambiente. Después de tres operaciones de lavado con el tampón B, se añadieron 100 µl de una dilución a 1:200 en un tampón B del anticuerpo de detección (anticuerpos emparejados para ELISA DE FIX, 25 marcado con peroxidasa, 1:200, Cedarlane) se añadieron a cada uno de los pocillos y se incubaron durante otras dos horas a la temperatura ambiente. Después de tres operaciones de lavado con el tampón B, se añadieron 100 µl de una solución de substrato (TMB, Dade Behring, OUVF) 30 por cada pocillo y se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente en la oscuridad. La adición de 100 µl de una solución de detención no diluida (Dade Behring, OSFA) preparó a las muestras para la lectura en un apropiado lector de microplacas a una longitud de onda de 450 nm. Las concentraciones de las muestras de ensayo se calcularon luego usando la curva patrón con un plasma 5 humano patrón como referencia.
Ejemplo 8: Comparación del FVII y de las proteínas de fusión de FVII y albúminas con respecto a la recuperación in vivo 10
Un FVII recombinante de tipo salvaje y los polipéptidos de fusión de FVII y albúminas que antes se han descrito fueron administrados por vía intravenosa a ratas CD/Lewis narcotizadas (a razón de 6 ratas por sustancia) con una dosis de 100 µg/kg de peso corporal. 15 Se extrajeron muestras de sangre a intervalos apropiados comenzando a los 5 minutos después de la aplicación de las sustancias de ensayo a partir de la arteria carótida. El contenido de antígeno de FVII se cuantificó subsiguientemente por un ensayo Elisa que es específico 20 para el Factor FVII humano (véase anteriormente). Los valores medios de los respectivos grupos de ratas se usaron para calcular la recuperación in vivo.
La recuperación in vivo se determinó a los 5 min. después de una aplicación de los productos (Tabla 2). Los 25 niveles de FVII y respectivamente del antígeno de FVIIa, medidos por cada ml de plasma a los 5 min después de una aplicación por vía intravenosa a través de la vena caudal, se pusieron en relación con la cantidad de producto aplicado por kg. Alternativamente, se calculó un 30 porcentaje poniendo en relación el nivel determinado de antígeno (UI/ml) a los 5 min. después de una infusión con el nivel teórico de producto esperado con una recuperación de 100 % (producto aplicado por kg dividido por un volumen teórico de plasma de 40 ml por kg).
Se encontró que las recuperaciones in vivo de las proteínas de fusión de FVII, determinados 5 correspondientemente en ratas habían aumentado significativamente en comparación con la del FVII de tipo salvaje recombinante no fusionado. Ellas habían aumentado en un múltiplo entre 2,3 y 7,9 con respecto al FVII de tipo dependiendo de la construcción artificial usada. 10
Tabla 2: Recuperación in vivo del FVII y de las proteínas de fusión de FVII y albúminas
Las recuperaciones in vivo (porcentaje de sustancia en circulación durante 5 minutos después de la aplicación) 15 del FVII de tipo salvaje y de las proteínas de fusión de FVII y albúminas después de una aplicación por vía intravenosa de 100 µg/kg en ratas (n = número de experimentos)
20
- Polipéptido de FVII derivado de pFVII
- Fusión con albúmina Recuperación in vivo [%] Aumento con relación al tipo salvaje (659) [%]
- 974
- Si 56,7 787
- 935
- Si 22,4 311
- 937
- Si 45,6 (n = 2) 634 (n = 2)
- 939
- Si 16,7 232
- 940
- Si 31,3 (n = 2) 434 (n = 2)
- 941
- Si 25,8 358
- 834
- Si 27,3 (n = 2) 379 (n = 2)
- 659 (FVII de tipo salvaje)
- No 7,2 (n = 3) 100
Ejemplo 9: Comparación del FIX y de polipéptidos de fusión de FIX y albúminas con respecto a la recuperación in vivo
Un FIX recombinante, comercialmente disponible (BeneFIX, de Wyeth, y rFIX de tipo salvaje) y unos 5 polipéptidos de fusión de FIX y albúminas (rFIX-L-HSA 980/797 y rFIX-L-HSA 986/797) se administraron por vía intravenosa a conejos narcotizados (4 conejos por sustancia) y unas ratas CD/Lewis (6 ratas por sustancia) respectivamente, con una dosis de 50 UI/kg de peso 10 corporal. Se extrajeron muestras de sangre a intervalos apropiados, comenzando a los 5 minutos después de la aplicación de las sustancias de ensayo a partir de la arteria carótida. El contenido de antígeno de FIX se cuantificó subsiguientemente por un ensayo Elisa que es 15 específico para el Factor IX humano (véase anteriormente). Los valores medios de los respectivos grupos se usaron para calcular la recuperación in vivo después de 5 min.
Las recuperaciones in vivo calculadas a los 5 min. 20 después de la infusión, se recopilan en la Tabla 3. Los niveles del antígeno de FIX, medidos por cada ml de plasma a los 5 min. después una aplicación por vía intravenosa a través de la vena caudal se pusieron en relación con la cantidad de producto aplicado por kg. 25 Alternativamente, se calculó un porcentaje poniendo en relación el nivel de antígeno determinado (UI/ml) a los 5 minutos después de la infusión con el nivel teórico de producto esperado en una recuperación de 100 % (producto aplicado por kg dividido por un volumen supuesto de 30 plasma de 40 ml por kg).
En ratas así como en conejos se encontró que las recuperaciones in vivo de las proteínas de fusión de FIX habían aumentado de una manera significativa en comparación con la del FIX recombinante no fusionado, preparado por los solicitantes o el producto de FIX 5 comercialmente disponible BeneFIX. El aumento con respecto al BeneFIX fue de 49,7, 69,4 o 87,5 %, dependiendo de la especie de animal o de la construcción artificial que se usó. Comparados con el correspondiente FIX de tipo salvaje, los aumentos de la recuperación de 10 las proteínas de fusión de FIX fueron incluso más altos.
Tabla 3:
Recuperaciones in vivo (cantidad de sustancia a los 5 minutos después de la aplicación de preparaciones de FIX recombinante (BeneFIX, rFIX 496/797) y de proteínas de 15 fusión de FIX y albúminas (rFIX-L-HSA 980/797 y rFIX-L-HSA 986/797) y después de una aplicación por vía intravenosa de 50 UI/kg dentro de ratas y de 50 UI/kg dentro de conejos respectivamente. El porcentaje de la recuperación in vivo se calculó basándose en un volumen 20 supuesto de plasma de 40 ml/kg).
- Experimento con ratas Experimento con conejos
- recuperación in vivo UI/ml por UI/kg/[%]*
- en relación con BeneFIX [%] recuperación in vivo UI/ml por UI/kg/[%]* en relación con BeneFIX [%]
- rFIX 496/797
- 0,462/18,5 74,6 n.d.** -
- rFIX-L-HSA 980/797
- 1,162/46,5 187,5 1,26/5,6 149,7
- rFIX-L-HSA 986/797
- 1,051/42,0 169,4 n.d.** -
- BeneFIX
- 0,621/24,8 100 0,846/33,8 100
* Calculado basándose en un volumen de plasma de 40 ml/kg
** no determinado
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<400> 1 ggcaggggca gcactgcag 19
<210> 2 15 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador de PCR 20
<400> 2 cacaggccag ggctgctgg 19
<210> 3 <211> 27 <212> ADN 25 <213> Artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 3 gcggctagca tggtctccca ggccctc 27 30
<210> 4 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial
<220> 35 <223> Cebador de PCR
<400> 4 gcggcggccg cctagggaaa tggggctcgc 30
<210> 5 <211> 33 40 <212> ADN <213> Artificial
<220> <223> Cebador de mutagénesis
<400> 5 gagccccatt tccctcgagg gccgccgcaa ggg 33
<210> 6 <211> 33 <212> ADN 5 <213> Artificial
<220> <223> Cebador de mutagénesis
<400> 6 cccttgcggc ggccctcgag ggaaatgggg ctc 33 10
<210> 7 <211> 61 <212> ADN <213> Artificial
<220> 15 <223> Cebador de PCR
<400> 7
<210> 8 <211> 62 20 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 8 25
<210> 9 <211> 52 <212> ADN <213> artificial 30
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 9 ctcgagcggg ggatctggcg ggtctggagg ctctggaggg tcgggaggct ct 52
<210> 10 35 <211> 37 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR 40
<400> 10 ggatccagag cctcccgacc ctccagagcc tccagac 37
<210> 11 <211> 59 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 11 5 ggatcccgac cctccagacc cgccagatcc cccagagcct ccagagcctc ccgaccctc 59
<210> 12 <211> 49 <212> ADN <213> artificial 10
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 12 ctcgagcaac ggatctggcg ggtctggagg ctctggaggg tcgggaggc 49
<210> 13 15 <211> 48 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR 20
<400> 13 ggatccgttt cccccagagc ctccagagcc tcccgaccct ccagagcc 48
<210> 14 <211> 64 <212> ADN 25 <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 14 30
<210> 15 <211> 56 <212> ADN <213> artificial
<220> 35 <223> Cebador de PCR
<400> 15 ctcgagcaat ggatctggcg ggtctggagg ctctggaggg tcgaatggct ctggag 56
<210> 16 <211> 64 40 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 16
<210> 17 <211> 31 <212> ADN 5 <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 17 gtgggatccg atgcacacaa gagtgaggtt g 31 10
<210> 18 <211> 35 <212> ADN <213> artificial
<220> 15 <223> Cebador de PCR
<400> 18 cacggatccc tataagccta aggcagcttg acttg 35
<210> 19 <211> 406 20 <212> PRT <213> humana
<400> 19 25
<210> 20 <211> 585 <212> PRT <213> humano
<400> 20 5
<210> 21 <211> 415 <212> PRT <213> humana 5
<400> 21
<210> 22 <211> 1335 <212> ADN <213> humana 5
<400> 22
<210> 23 <211> 1386 <212> ADN 5 <213> humanao
<400> 23
<210> 24 <211> 1830 5 <212> ADN <213> humano
<400> 24
<210> 25 5 <211> 27 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de mutagénesis 10
<400> 25 ccccatttcc cgatgcacac aagagtg 27
<210> 26 <211> 27 <212> ADN <213> artificial
<220> 5 <223> Cebador de mutagénesis
<400> 26 cactcttgtg tgcatcggga aatgggg 27
<210> 27 <211> 21 10 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 27 15 ccactttcac aatctgctag c 21
<210> 28 <211> 23 <212> ADN <213> artificial 20
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 28 caattccaat gaattaacct tgg 23
<210> 29 25 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR 30
<400> 29 atgcagcgcg tgaacatgat c 21
<210> 30 <211> 25 <212> ADN 35 <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 30 tcattaagtg agctttgttt tttcc 25 40
<210> 31 <211> 21 <212> ADN <213> artificial
<220> 45 <223> Cebador de PCR
<400> 31 gattcgaatt cgcccttatg c 21
<210> 32 <211> 32 <212> ADN 5 <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 32 cgctcgaggt gagctttgtt ttttccttaa tc 32 10
<210> 33 <211> 46 <212> ADN <213> artificial
<220> 15 <223> Cebador de PCR
<400> 33 ggatccagat cccccagagc ctccagagcc tcccgaccct ccagag 46
<210> 34 <211> 18 20 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 34 25 caaggagacg ggcgctcc 18
<210> 35 <211> 19 <212> ADN <213> artificial 30
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 35 gcccaaggag gggattggc 19
<210> 36 35 <211> 30 <212> ADN <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR 40
<400> 36 gtggaattca tggagctgag gccctggttg 30
<210> 37 <211> 38 <212> ADN 45 <213> artificial
<220> <223> Cebador de PCR
<400> 37 cacgcggccg ctcactacag ccgttgcccc gcctccac 38
<210> 38 5 <211> 704 <212> PRT <213> humana
<400> 38 10
Claims (15)
- REIVINDICACIONES
- 1. Uso de un polipéptido terapéutico, fusionado directamente o a través de un péptido engarzador con un polipéptido que intensifica la recuperación in vivo, en 5 comparación con la recuperación in vivo del correspondiente polipéptido terapéutico no fusionado, y en que el polipéptido que intensifica la recuperación es una albúmina, una variante polimórfica presente en la naturaleza o un fragmento de la misma, en que el 10 fragmento tiene una longitud de por lo menos 20 aminoácidos, para aumentar la recuperación in vivo.
- 2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido terapéutico comprende una proteína dependiente de la vitamina K. 15
- 3. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el polipéptido terapéutico comprende el Factor IX, el Factor VII o el Factor VIIa o un fragmento o una variante de los mismos.
- 4. Uso de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en 20 el que el residuo de polipéptido terapéutico está fusionado con el extremo terminal de N del residuo de albúmina.
- 5. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el polipéptido terapéutico es el Factor VII o el 25 Factor VIIa.
- 6. Uso de acuerdo con la reivindicación 5, caracterizado porque un engarzador peptídico separa al residuo del Factor VII o del Factor VIIa con respecto del residuo de albúmina. 30
- 7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque el engarzador peptídico es modificado por la inserción de sitios para modificaciones posteriores a la traducción.
- 8. Uso de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la modificación posterior a la traducción comprende uno o más sitios de glicosilación en 5 N con la estructura Asn - X - Ser/Thr, en que X designa a cualquier aminoácido excepto prolina.
- 9. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 5 hasta 8, caracterizado porque el residuo del polipéptido Factor VII tiene una actividad procoagulante. 10
- 10. Uso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el polipéptido terapéutico es el Factor IX.
- 11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque un engarzador peptídico separa al residuo del Factor IX con respecto del residuo de 15 albúmina.
- 12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque el engarzador peptídico es modificado por la introducción de sitios para modificaciones posteriores a la traducción. 20
- 13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la modificación posterior a la traducción comprende uno o más sitios de glicosilación en N con la estructura Asn - X - Ser/Thr, en que X designa a cualquier aminoácido excepto prolina. 25
- 14. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 10 hasta 13, caracterizado porque el residuo del polipéptido Factor IX tiene una actividad procoagulante.
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