METODOS PARA PURIFICACION DE PROTEINA
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a la purificación de proteína, en particular, a la purificación que utiliza cromatografía de hidroxiapatito . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las proteínas A y G son a menudo empleadas para purificar anticuerpos por cromatografía de afinidad. Véase por ejemplo, R. Vola et al. (1994), Cell Biophys . 24-25:27- 36; Aybay e Imir (2000), J. Immunol . Methods 233 (1-2) : 77-81;
Ford et al. (2001), J. Chromatogr. B 754:427-435. Estas proteínas son empleadas debido a que se enlazan a una porción constante (Fc) de muchos anticuerpos diferentes. Las proteínas de fusión recombinante que incluyen una porción Fc de un anticuerpo IgG, pueden ser purificadas usando métodos similares . Cuando se produce una proteína para uso farmacológico, es importante remover los contaminantes tóxicos o inmunogénicos, tales como otras proteínas. Específicamente, la Proteína A es inmunogénica y, en grandes cantidades, potencialmente tóxica. Alguna Proteína A puede lixiviar en una muestra durante la cromatografía de afinidad cuando la Proteína A agregada a un soporte sólido es usada como un absorbente. Véase por ejemplo, Bensinger et al. (1984), J. REF . : 156616 Biol. Response Modif. 3:347-351; Ventura et al . (1987), Cáncer Treat . Rep. 71 (4) :411-413 (ambas las cuales están incorporadas aquí en su totalidad) . Los anticuerpos monoclonales biespecífieos, han sido separados de otros anticuerpos enlazándolos y eluyéndolos de hidroxiapatito, subsecuentes a una pre-purificación por cromatografía de afinidad usando la Proteína A agregada a un soporte sólido como un absorbente. Tarditi et al. (1992), J. Chromatography 599:13-90; Ford et al. (2001), J. Chromatography B 754:427-435. Los anticuerpos monoclonales también se han enlazado y eluido del hidroxiapatito. Ahmad (1999) , Hidroxiapatito de Cerámica como una Etapa de Refinación para la Purificación de Anticuerpo Monoclonal, Resumen de Recuperación de Productos Biológicos Conferencia #9 en Whistler, British Columbia. La presente invención proporciona un proceso simplificado y ampliamente aplicado, para usar cromatografí de hidroxiapatito para la purificación de anticuerpos y otras proteínas . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La cromatografía de afinidad es una herramienta poderosa para la purificación de proteínas, tales como anticuerpos y proteínas de fusión Fc. Sin embargo, si las proteínas son manufacturadas para uso terapéutico, es de interés la presencia de otras proteínas qué incluyen una proteína usada como parte de un absorbente de afinidad, la cual puede lixiviar en una muestra durante la cromatografía de afinidad. Además, otros contaminantes de proteínas pueden también estar presentes en una muestra, tales como por ejemplo, proteínas derivadas de células hospedadoras que producen la proteína a ser purificada. La invención proporciona entre otras cosas, una técnica de alto rendimiento para resolver estos problemas a través de cromatografía de hidroxiapatito en un modo que fluye el cual involucra procesamiento mínimo. Por consiguiente, la invención proporciona en un aspecto, un método para separar una proteína de una segunda proteína que comprende, someter la proteína a cromatografía de hidroxiapatito cuando, (1) la proteína ha sido previamente purificada por cromatografía de afinidad usando la segunda proteína agregada a un soporte sólido como un absorbente, (2) la segunda proteína puede enlazarse a un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante, y (3) la proteína no se enlaza a hidroxiapatito mientras la segunda proteína se enlaza a hidroxiapatito bajo las condiciones usadas. La proteína puede comprender una porción Fc de un anticuerpo. Opcionalmente, la proteína puede ser TNFR:FC. La segunda proteína puede ser la Proteína A o Proteína G. La invención además, proporciona un método para purificar una proteína de una muestra que' comprende la proteína y al menos, un contaminante de proteína que comprende someter la muestra a cromatografía de hidroxiapatito, en donde la proteína se separa de al menos, un contaminante de proteína por cromatografía de hidroxiapatito en una solución en la cual se realiza la cromatografía de hidroxiapatito, en donde la mayoría de las moléculas de la proteína son recuperadas a través del flujo y lavado, en donde la proteína ha sido previamente purificada por cromatografía de afinidad usando una segunda proteína agregada a un soporte sólido como un absorbente, y en donde la segunda proteína se enlaza a un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante. La segunda proteína puede o no puede estar presente a un nivel detectable en la muestra, y la proteína se puede separar de la segunda proteína por cromatografía de hidroxiapatito en la solución usada. La proteína y al menos, un contaminante de proteína, pueden haber sido secretados en un medio de cultivo por células animales cultivadas, tales como células CHO. La proteína puede comprender una porción Fc de un anticuerpo y puede, por ejemplo, ser TNFR:FC o un anticuerpo. La segunda proteína puede ser la Proteína A y Proteína G. La solución en la cual la cromatografía de hidroxiapatito ocurre, puede comprender un amortiguador de fosfato de sodio a una concentración entre alrededor de 5 milimolares y alrededor de 50 milimolares, opcionalmente entre alrededor de 15 milimolares y alrededor de 35 milimolares , y puede tener un pH entre alrededor de 6.0 y alrededor de 8.6. La invención además proporciona en otro aspecto, un método para separar una proteina de fusión recombinante de una segunda proteína que comprende, someter la proteína de fusión recombinante a cromatografía de hidroxiapatito cuando, (1) la proteína de fusión recombinante ha sido previamente purificada por cromatografía de afinidad usando la segunda proteína agregada a un soporte sólido como un absorbente, y (2) la proteína de fusión recombinante comprende una porción Fc de un anticuerpo y parte o toda una proteína no anticuerpo. En una modalidad, la proteína de fusión recombinante puede ser TNFR: Fc . En todavía otro aspecto, la invención además abarca un método para separar una proteína de fusión recombinante de una segunda proteína que comprende, someter la proteína de fusión recombinante a cromatografía de hidroxiapatito cuando, (1) la proteína de fusión recombinante no se enlaza a hidroxiapatito y la segunda proteína se enlaza a hidroxiapatito bajo las condiciones usadas, (2) la proteína de fusión recombinante ha sido previamente purificada por cromatografía de afinidad usando la segunda proteína agregada a un soporte sólido como un absorbente, y (3) la proteína de fusión recombinante comprende la región Fc de un anticuerpo. En otra modalidad, la invención proporciona un método para purificar una proteína de fusión recombinante de una muestra que comprende, la proteína de fusión recombinante y al menos, un contaminante de proteína que comprende someter la muestra a cromatografía de hidroxiapatito, en donde la proteína de fusión recombinante comprende una porción Fc de un anticuerpo y parte o toda una proteína no anticuerpo, y en donde la proteína de fusión recombinante ha sido previamente purificada por cromatografía de afinidad usando una segunda proteína agregada a un soporte sólido como un absorbente. La mayoría de las moléculas de la proteína de fusión recombinante pueden ser recuperadas a través del flujo y lavado. La proteína de fusión recombinante puede ser TNFR: Fc, y la segunda proteína puede ser la Proteína A o Proteína G. La cromatografía de hidroxiapatito se puede llevar a cabo en una solución que comprende un amortiguador de fosfato de sodio, opcionalmente a una concentración entre 5 milimolares y alrededor de 50 milimolares, o entre alrededor de 15 milimolares y alrededor de 35 milimolares, y opcionalmente a un pH entre alrededor de S .0 y alrededor de 8.6. La proteína de fusión recombinante y/o al menos, un contaminante de proteína pueden ser secretados en un medio de cultivo por células animales cultivadas, opcionalmente células CHO. En todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un método para separar TNFR:FC de la Proteína A que comprende, someter TNFR:FC a cromatografía de hidroxiapatito subsecuente a purificar TNFR:FC por cromatografía de afinidad usando una Proteína A agregada a un soporte sólido como un absorbente. En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para purificar TNFR:FC que comprende, someter una muestra que comprende TNFR:FC y al menos, un contaminante de proteína a cromatografía de hidroxiapatito bajo condiciones en donde la mayoría de las moléculas de TNFR: Fc son recuperadas a través del flujo y lavado. Una modalidad adicional proporciona un método para purificar TNFR: Fc que comprende, someter TNFR : Fc a cromatografía de hidroxiapatito bajo condiciones en donde el TNFR: Fc no se enlaza a hidroxiapatito, en donde TNFR: Fc se separa de al menos, un contaminante de proteína. La invención además proporciona, en todavía otro aspecto, un método para separar una proteína de fusión recombinante de proteínas de células hospedadoras que comprende, cargar una muestra que comprende la proteína de fusión recombinante en hidroxiapatito, someter la proteína de fusión recombinante a cromatografía de hidroxiapatito bajo condiciones en donde la proteína de fusión recombinante no se enlaza al hidroxiapatito, y recuperar una muestra que comprende la proteína de fusión recombinante a través del flujo combinado y lavado. En todavía otro aspecto, se proporciona un método para separar una proteína de proteínas de células hospedadoras que comprende, someter una muestra que comprende la proteína y al menos, una proteína de célula ospedadora a cromatografía de hidroxiapatito, en donde la proteína se separa de al menos una proteína de célula hospedadora, en donde la proteína comprende un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante, en donde la mayoría de las moléculas de la proteína son recuperadas a través del flujo y lavado, y en donde tanto la proteína como la proteína de célula hospedadora han sido secretadas en un medio de cultivo por células animales cultivadas, tales como por ejemplo, células CHO. La concentración de las proteínas de células hospedadoras pueden ser menos de alrededor de 100 partes por millón, y la proteína puede ser TNFR:FC. La invención también proporciona una preparación purificada de TNFR : Fc, en donde la preparación comprende menos de 3 partes por millón de Proteína A y menos de 100 partes por millón de proteínas de células animales hospedadoras, opcionalmente menos de 2 partes por millón de Proteína A y/o menos de 75 partes por millón de proteínas de células hospedadoras . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra el perfil de elución de una corrida de columna de hidroxiapatito en 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8 en la cual se cargó una muestra que comprende TNFR:FC como la mayoría de especies, como se 'describe en el Ejemplo 2. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones Absorbente: Un absorbente es al menos una molécula agregada a un soporte sólido, o al menos una molécula que es, la misma, un sólido, la cual se usa para realizar la cromatografía . Cromatografía de afinidad: La cromatografía de afinidad es cromatografía que utiliza las interacciones específicas, reversibles, entre biomoléculas por ejemplo, la habilidad de la Proteína A para enlazarse a una porción Fc de un anticuerpo IgG, preferentemente las propiedades generales de una molécula, tales como un punto isoeléctrico, hidrofobicidad, o tamaño, para efectuar la separación cromatográfica . En la práctica, la ¦ cromatografía de afinidad involucra usar un absorbente, tal como la Proteína A agregada a un soporte sólido, a moléculas cromatográficamente separadas, que se enlazan más o menos estrechamente al absorbente. Véase Ostrove (1990) en Guide to Proteina Purificatio . Methods in Enzymology 182:357-379, la cual está incorporada aquí en su totalidad . Anticuerpo: Un anticuerpo es una proteína o complejos de proteínas, cada una de las cuales comprende al menos, un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable y al menos, un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo " constante . Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de cadenas únicas, anticuerpos diméricos, o algunos complejos de orden superior de proteínas que incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos heterodiméricos . Cromatografía: La cromatografía es la separación de moléculas químicamente diferentes en una mezcla a partir de otra por percolación de la mezcla a través de un absorbente, el cual absorbe o retiene diferentes moléculas más o menos fuertemente. Las moléculas que son al menos fuertemente absorbidas en, o retenidas por el absorbente, se liberan del absorbente bajo condiciones en donde aquellas no son más f ertemente absorbidas o retenidas . Dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante: Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico a, o substancialmente similar a un dominio de origen humano o animal CL, CH1, CH2, CH3 o CH4. Véase por ejemplo, Charles A Hasemann y J. Donald Capra, Immunoglobulins : Structure and Function, en William E. Paul, ed. , Fundamental Immunology, Segunda Edición, 209, 210-218 (1989), la cual está incorporada por referencia aquí en su totalidad. Contaminante: Un contaminante es cualquier molécula extraña u objetable, particularmente una macromolécula biológica tal como un ADN, un AR o una proteína, distinta de la proteína a ser purificada que está presente" en una muestra de una protelna a ser purificada. Los contaminantes incluyen por ejemplo, otras proteínas de células que secretan la proteína a ser purificada y otras proteínas, tales como la Proteína A, que son parte de un absorbente usado para cromatografía de afinidad que puede lixiviar en una muestra durante la cromatografía de afinidad. Porción Fc de un anticuerpo: La porción Fc de un anticuerpo incluye dominios de inmunoglobulina humana o animal CH2 y CH3 , o dominios de inmunoglobulina substancialmente similares a estos. Para propósitos de la invención, la actividad biológica de una porción Fc de un anticuerpo para el propósito de determinar la similitud substancial, es la habilidad a ser unida por una segunda proteína que se enlaza a porciones Fc que se originan naturalmente de anticuerpos, tales como la Proteína A o Proteína G. Para discusión, véase Hasemann and Capra, supra, en 212-213. Proteínas de células hospedadoras: Las proteínas de células hospedadoras son codificadas por el genoma que se origina naturalmente de una célula hospedadora, en la cual, se introduce el ADN que codifica una proteína que es purificada. Las proteínas de células hospedadoras pueden ser contaminantes de la proteína a ser purificada, los niveles de los cuales pueden ser reducidos por purificación. Las proteínas de células hospedadoras pueden ser- ensayadas por cualquier método apropiado que incluye, electroforesis en gel y teñido y/o ensayo ELISA, entre otros. Cromatografía de idroxiapatito : la cromatografía de hidroxiapatito es cromatografía que usa hidroxiapatito de cerámica como un absorbente. Véase por ejemplo, Marina J. Gorbunoff (1990) , Protein Chromatography on Hydroxyapatite Columns, en Guide to Protein Purification, Murray P. Deutscher, ed., Methods in Enzymology 182:329-339, la cual está incorporada aquí en su totalidad. Anticuerpo IgG: Para propósitos de la invención, un anticuerpo IgG es un anticuerpo que incluye al menos, un dominio de inmunoglobulina constante de tipo ?. Para discusión, véase Hasemann and Capra, supra, en 226. Polipéptido: Para propósitos de la invención, "polipéptido" es usado intercambiablemente con "proteína" . Proteína: Una proteína es cualquier cadena de al menos, cinco aminoácidos ligados por enlaces peptídicos. Proteína A: Proteína A es una proteína originalmente descubierta en la pared celular de Staphylococcus que se enlaza específicamente a una porción Fc de un anticuerpo IgG. Para propósitos de la invención, "Proteína A" es cualquier proteína idéntica o substancialmente similar a la Proteína A de Staphylococcus, que incluye formas recombinantes y/o comercialmente disponibles de la Proteína A. Para propósitos de la invención, la actividad biológica de la Proteína A para el propósito de determinar la similitud substancial, es la capacidad para enlazarse a una porción Pc de un anticuerpo IgG. Proteína G: La Proteína G es una proteína originalmente descubierta en la pared celular de Streptococcus que se enlaza específicamente a una porción Fc de un anticuerpo IgG. Para propósitos de la invención, la "Proteína G" es cualquier proteína idéntica o substancialmente similar a la Proteína G de Streptococcus, que incluye formas recombinantes y/o comercialmente disponibles de la Proteína G. Para propósitos de la invención, la actividad biológica de la Proteína G para el propósito de determinar la similitud substancial, es la capacidad para enlazarse a una porción Fc de un anticuerpo IgG. Proteína LG: La Proteína LG es una proteína de fusión recombinante que se enlaza a los anticuerpos IgG que comprenden porciones de tanto Proteína G (véase definición anterior) , como Proteína L. La proteína L fue originalmente aislada de la pared celular de Peptostreptococcus . · La Proteína LG comprende dominios de enlace IgG de tanto Proteína L como G. Vola et al. (1994) Cell . Biophys . 24-25: 27-36, la cual está incorporada aquí en su totalidad. Para propósitos de la invención, la "Proteína LG" es cualquier proteína idéntica o substancialmente similar a la Proteína LG, que incluye formas comercialmente disponibles y/o recombinantes de la Proteína LG. Para propósitos de la invención, la actividad biológica de la Proteína LG para propósitos de determinar la similitud substancial, es la capacidad para enlazarse a un anticuerpo IgG. Purificar: Purificar una proteína, significa reducir las cantidad de elementos extraños u obj ecionables , especialmente macromoléculas biológicas tales como proteínas o ADN, que pueden estar presentes en una muestra de la proteína. La presencia de proteínas extrañas puede ser ensayada por cualquier método apropiado que incluye electroforesis en gel y teñido y/o ensayo ELISA. La presencia de ADN puede ser ensayada por cualquier método apropiado que incluye, electroforesis en gel y teñido y/o ensayos que emplean reacción en cadena de la polimerasa. Proteína de fusión recombinante : Una proteína de fusión recombinante es cualquier proteína que comprende parte o todo de dos o más proteínas que no son fusionadas en su estado natural. Ejemplos de tales proteínas incluyen, pero no se limitan al, activador del receptor humano de NF-KappaB fusionado a una porción Fc de un anticuerpo (huRANK:Fc) , célula endotelial interna de túnica cinasa-delta, fusionada a una porción Fc de un anticuerpo (TEKdelta : Fc) , y receptor del factor necrosis del tumor fusionado a una porción Fc de un anticuerpo (TNFR : Fc) . Separar: Una proteína se separa de una segunda proteína en una mezcla que comprende ambas proteínas cuando la mezcla es sometida a un proceso, de manera tal que al menos, la mayoría de las moléculas de la proteína se remueven de tal porción de la mezcla que comprende al menos, la mayoría de las moléculas de la segunda proteína. Substancialmente similar: Para propósitos de la invención, las proteínas son substancialmente similares si son al menos, 80%, preferiblemente al menos, 90% idénticas entre sí en la secuencia de aminoácido y mantienen o alteran en una manera deseable, la actividad biológica de la proteína no alterada. Incluidos en los aminoácidos considerados idénticos para propósitos de determinar si las proteínas son substancialmente similares, están aminoácidos que son substituciones conservativas que improbablemente afectan la actividad biológica, que incluyen los siguientes: Ala para Ser, Val para lie, Asp para Glu, Thr para Ser, Ala para Gly, Ala para Thr, Ser para Asn, Ala para Val, Ser para Gly, Tyr para Phe, Ala para Pro, Lys para Arg, Asp para Asn, Leu para lie, Leu para Val, Ala para Glu, Asp para Gly, y estos cambios a la inversa. Véase por ejemplo, Neurath et al., The Proteins . Academic Press, New York (1979) . El porcentaje de identidad de las dos secuencias de aminoácido ¦ puede ser determinado por inspección visual y cálculos matemáticos, o más preferiblemente, la comparación se hace comparando la información de secuencia usando un programa 1 GAP' o de 'APERTURA' de computadora tal como el programa del Grupo de Genética por Computadora (GCG; adison, WI) , versión del paquete Wisconsin 10.0, (Devereux et al., 1984, Nucí. Acids Res. 12:387) u otros programas de computadoras comparables. Los parámetros de omisión preferidos para el programa 'GAP' o de 'APERTURA' incluyen: (1) la matriz de comparación de aminoácido pesado de Gribskov y Burgess ((1986), Nucí. Acid Res. 14:6745) , como se describe por Schwartz y Dayhoff, eds . , Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), u otras matrices de comparación comparables; (2) una penalización de 30 para cada apertura y una penalización adicional de 1 para cada símbolo en cada apertura para secuencias de aminoácido; (3) sin penalización para aperturas finales; y (4) sin penalización máxima para aperturas grandes. Se pueden usar también otros programas usados por aquellos expertos en la técnica de comparación de secuencias . TNFR: "TNFR" se refiere a proteínas que comprenden secuencias de aminoácido que son idénticas o substancialmente similares a la secuencia de un receptor del factor necrosis del tumor de mamífero nativo (TNFR) . La actividad biológica para propósitos de determinar la similitud substancial, significa la capacidad para enlazarse al factor necrosis del tumor (TNF) , para transducir una señal biológica iniciada por el enlace TNF a una célula, o reaccionar 'con anticuerpos anti-TNFR que se originan contra TNFR de fuentes naturales (es decir, no recombinantes) . Un TNFR puede ser cualquier TNFR de mamífero, que incluye TNFR de murina o humano. Tales TNFR se describen en la Patente Estadounidense No. 5,395,760, la cual está incorporada aquí por referencia en su totalidad y en la Patente Estadounidense No. 5,610,279, la cual está incorporada por referencia aquí en su totalidad. Un TNFR particularmente preferido, es aquel descrito en la Patente Estadounidense No. 5,395,750, el cual tiene un peso molecular aparente por SDS-PAGE de alrededor de 80 kilodaltons en su forma glicosilada. TNFR : Fc : TNFR : Fc es una proteína de fusión recombinante que comprende toda o una parte de un dominio extracelular de un TNFR fusionado a una región Fc de un anticuerpo. Tal dominio extracelular incluye, pero no está limitado a, secuencias de aminoácido substancialmente similares a los aminoácidos 1-163, 1-185 o 1-235 de la Figura 2A de la Patente Estadounidense No. 5,395,760. Dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable: Un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable es un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o substancialmente similar a un dominio VL o VH de origen humano o animal . Para propósitos de la invención, la actividad biológica de un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo variable para propósitos de determinar la similitud substancial, es el enlace antígeno. Descripción del Método El proceso de purificar una proteina a menudo involucra numerosas etapas . La presente invención abarca un proceso para reducir la cantidad de una segunda proteina en una mezcla que comprende, una proteína que es purificada y una segunda proteina, en donde la segunda proteína es introducida durante una etapa de cromatografía de afinidad en la cual, la segunda proteína es parte del absorbente. La remoción de tal segunda proteína puede ser requerida cuando los puntos isoeléctricos de la proteina a ser purificada y un complejo de la segunda proteína con la proteína a ser purificada son cerrados, debido a que la cromatografía de intercambio iónico es improbable que afecte una separación de tales proteínas. El uso de hidroxiapatito hace de la separación tanto posible como simple. Los métodos de la invención también han agregado la ventaja de remover otras materias obj ecionables de la proteína. Además, la invención comprende un método para purificar una proteína que comprende, una región Fc de un anticuerpo que usa cromatografía de hidroxiapatito bajo condiciones en donde la proteína es recuperada en el flujo y lavado, y al menos un contaminante de proteína es retenido en el hidroxiapatito. En un aspecto, los métodos de la invención pueden reducir la cantidad de una segunda proteína, y/o un complejo de la segunda proteína con la proteína a ser purificada, la cual es introducida durante la cromatografí de afinidad, en una muestra que contiene la proteína a ser purificada. En este aspecto, la cromatografía de hidroxiapatito se realiza bajo condiciones tales que la proteína a ser purificada no se enlaza al hidroxiapatito, pero la segunda proteína, y/o un complejo de la segunda proteína con la proteína a ser purificada, sí se enlazan. El proceso de la invención puede en algunas modalidades, involucrar también al menos dos etapas. Primero, la proteína se somete a una etapa de pre-purificación de cromatografía de afinidad usando la segunda proteína agregada a un soporte sólido como un absorbente. Segundo, la cromatografía de hidroxiapatito se realiza bajo condiciones de manera tal que la proteína no se enlaza a hidroxiapatito, pero la segunda proteína, y/o un complejo de la segunda proteína con la proteína a ser purificada, sí se enlazan. El proceso completo de purificación de proteína puede incluir otras etapas antes y/o después de cada una de estas etapas . Previo al equilibrio y cromatografía, el medio de cromatografía de hidroxiapatito puede ser pre-equilibrado en una solución elegida, por ejemplo, una sal y/o solución amortiguadora. El pre-equilibrio sirve la función de desplazar una solución usada para regenerar y/o almacenar el medio de cromatografía. Uno de habilidades" en la técnica comprenderá que la composición de la solución de pre-equilibrio depende de la composición de la solución de almacenamiento y la solución a ser usada para la cromatografía subsecuente. De este modo, las soluciones de pre-equilibrio apropiadas pueden incluir el mismo amortiguador o sal usados para realizar la cromatografía, opcionalmente, a una concentración superior que es usada para realizar la cromatografía. Amortiguadores y sales que pueden ser usados para la cromatografía se discuten abajo. Por ejemplo, cuando la solución usada para realizar la cromatografía comprende fosfato de sodio a una concentración dada, el pre-equilibrio puede tomar lugar en una solución que comprende fosfato de sodio a una concentración superior. Como una ilustración de esto, si la solución se usa para realizar la cromatografía, comprende fosfato de sodio entre alrededor de 0.5 milimolares y alrededor de 50 milimolares, el pre-equilibrio puede ocurrir en una solución que comprende fosfato de sodio a concentraciones entre alrededor de 0.2 molar y alrededor de 0.5 molar, más preferiblemente, en concentraciones de fosfato de sodio entre alrededor de 0.3 y alrededor de 0.4 molarj inclusive. Antes que la muestra se aplique a la columna, el medio de cromatografía de hidroxiapatito puede ser equilibrado en el amortiguador o sal que será usado para cromatografiar la proteína. Como se discute abajo, la cromatografía (y carga de la proteína a ser purificada) , puede ocurrir en una variedad de amortiguadores o sales que incluyen sales de sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, cloruro, fluoruro, acetato, fosfato y/o citrato y/o amortiguador Tris. Tales amortiguadores o sales pueden tener un pH de al menos alrededor de 5.5. En algunas modalidades, el equilibrio puede tomar lugar en una solución que comprende un amortiguador Tris o fosfato de sodio. Opcionalmente, el amortiguador de fosfato de sodio está a una concentración entre alrededor de 0.5 milimolares y alrededor de 50 milimolares, más preferiblemente, a una concentración entre alrededor de 15 milimolares y 35 milimolares. Preferiblemente, el equilibrio toma lugar a un pH de al menos alrededor de 5.5. El equilibrio puede tomar lugar a pH entre alrededor de 6.0 y alrededor de 8.6, preferiblemente a pH entre alrededor de 6.5 y 7.5. Más preferiblemente, la solución comprende un amortiguador de fosfato de sodio a una concentración de alrededor de 25 milimolares y a un pH de alrededor de 6.8. Cualquiera o todas las etapas cromatográficas de la invención, se pueden llevar a cabo por cualquiera de los medios mecánicos . La cromatografía se puede llevar a cabo en una columna. La columna se puede correr con o sin presión y desde la parte superior a la inferior o inferior a superior. La dirección del flujo del fluido en la columna puede ser invertida durante el proceso de cromatografía. La cromatografía puede también llevarse a cabo usando un proceso por lotes en el cual, el soporte sólido se separa del líquido usado para cargar, lavar y eluir la muestra por cualquier medio adecuado, incluyendo gravedad, centrifugación o filtración. La cromatografía también se puede llevar a cabo poniendo en contacto la muestra con un filtro que absorbe o retiene algunas moléculas en la muestra más fuertemente que otros . La proteína puede ser producida por células hospedadoras vivas que han sido diseñadas por ingeniería genética para producir la proteína. Los métodos para diseñar por ingeniería genética células para producir proteínas, son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Ausabel et al., eds . (1990) . Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York) . Tales métodos incluyen, introducir ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la proteína en células hospedadoras vivas . Estas células hospedadoras pueden ser células bacterianas, células fúngicas o preferiblemente, células animales que crecen en cultivo. Las células hospedadoras bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de Escheríchia coli. Ejemplos de cepas E. coli adecuadas incluyen: HB101, DH5 , GM2929, JM109, KW251, NM538, NM539, y cualquier cepa de E. coli que falla al desdoblar el ADN extraño. Las células hospedadoras fúngicas que pueden ser usadas incluyen, pero no se limitan a células de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, y Aspergillus . Unos cuantos ejemplos de líneas de células animales que pueden ser usadas incluyen CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, DCK, 293, 3T3, y W138. Las nuevas líneas de células animales pueden ser establecidas usando métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (por ejemplo, por transformación, infección viral, y/o selección) .
Opcionalmente, la proteína puede ser secretada por las células hospedadoras en el medio. La concentración de proteína de una muestra en cualquier etapa de purificación, puede ser determinada por cualquier método adecuado. Tales métodos son bien conocidos en el arte e incluyen: 1) métodos colorimétricos tales como el ensayo Lowry, el ensayo Bradford, el ensayo Smith, y el ensayo de oro coloidal; 2) métodos que utilizan las propiedades de absorción UV de proteínas; y 3) estimación visual basada en bandas de proteínas teñidas en geles que dependen de la comparación con los estándares de proteínas de cantidad conocida en el mismo gel. Véase por ejemplo, Stoschek (1990). Cuantificación de Proteína, en Guide to Protein Purification. Methods in Enzymol . 182:50-68. La proteína que se somete a purificación como se contempla por la invención, comprende uno o más dominios de inmunoglobulinas de anticuerpos constantes y puede, pero no necesita, comprender un dominio (s) de inmynoglobulina de anticuerpo variable único o múltiple. Pueden ser proteínas que se originan naturalmente o una proteína de fusión recombinante . Puede comprender una porción Fc de un anticuerpo. Puede también comprender una proteína no anticuerpo. Algunas proteínas específicamente contempladas para uso con la invención incluyen, proteínas de fusión recombinante que comprenden uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante, opcionalmente una porción Fc de un anticuerpo, y una proteína idéntica a, o substancialmente similar a una de las siguientes proteínas: un ligando flt3 (como se describe en la solicitud internacional no. O 94/28391, la cual está incorporada por referencia aquí en su totalidad) , un ligando CD40 (como se describe en la Patente Estadounidense No. 6,087,329, la cual está incorporada por referencia aquí en su totalidad) , eritropoyetina, trombopoyetina, calcitonina, ligando Fas, ligando para el activador receptor de NF-kappa B (RANKL) , ligando que induce apoptosis relacionado con el factor de necrosis del tumor (TNF) (TRAIL, como se describe en la solicitud internacional No. WO 97/01633, la cual está incorporada por referencia aquí en su totalidad) , linfopoyetina derivada de estroma tímico, factor de estimulación de la colonia del granulocito, factor de estimulación de la colonia del granulocito-macrófago (GM-CSF, como se describe en la Patente Australiana No. 5,8819, la cual está incorporada por referencia aquí en su totalidad), factor de crecimiento de células mástil, factor de crecimiento de células troncales, factor de crecimiento epidérmico, RANTES, hormona de crecimiento, insulina, insulinotropina, factores de crecimiento como la insulina, hormona paratiroides , interferonas, factores de crecimiento del nervio, glucagona, interleucinas 1 hasta 18, factores de estimulación de la colonia, linfotoxina-ß, factor necrosis del tumor (TNF) , factor inhibitorio de leucemia, oncostatina M, y varios ligandos para las moléculas de superficie celular ELK y Hek (tal como los ligandos para las cinasas relacionadas con eph o LERKS) . Las descripciones de proteínas que pueden ser purificadas de conformidad con los métodos inventivos, se pueden encontrar en por ejemplo, Human Cytokines : Handbook of Basic and Clinical Research, Vol . II (Aggarwal y Gutterman, eds . Blackwell Sciences, Cambridge, MA, 1998) ; Growth Factors : A practical Approach (McKay and Leigh, eds., Oxford University Press Inc., New York, 1993); y The Cytokine Handbooks (A. . Thompson, ed. , Academic Press, Sand Diego, CA, 1991) . Las proteínas contempladas por la invención, también incluyen proteínas de fusión recombinante que comprenden uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante, opcionalmente una porción Fc de un anticuerpo, más un receptor para cualquiera de las proteínas mencionadas anteriormente o proteínas substancialmente similares a tales receptores. Estos receptores incluyen: ambas formas de TNFR (referida como p55 y p75) , receptores de interleucina-1 tipos I y II (como se describe en la Patente EP No. 0 460 846, Patente Estadounidense No. 4,968,607, y Patente Estadounidense No. 5,767,064, las cuales están incorporadas por referencia aqui en su totalidad), receptor de Interleucina-2 , receptor de Interleucina-4 (como se describe en la Patente EP No. 0 367 566 y Patente Estadounidense No. 5,856,296, las cuales están incorporadas aquí por referencia en su totalidad) , receptor de Interleucina-15 , receptor de Interleucina-17 , receptor de Interleucina-18 , receptor del factor de estimulación de la colonia de granulocitos-macrófagos , receptor del factor de estimulación de la colonia de granulocitos, receptores para el factor inhibidor de oncostatina-M y leucemia, receptor activador de NF-Kappa B (RANK, como se describe en la Patente Estadounidense No. 6,271,349, la cual está incorporada por referencia en su totalidad) , receptores para TRAIL (que incluyen receptores TRAIL 1, 2, 3 y 4), y receptores que comprenden dominios de muerte, tales como Fas o Receptor que induce Apoptosis (AIR) . Otras proteínas que pueden ser purificadas usando el proceso de la invención incluyen, antígenos de diferenciación (referidos como proteínas CD) , o sus ligandos o proteínas substancialmente similares a cualquiera de estas, las cuales están fusionadas al menos a un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante, opcionalmente a una porción Fc de un anticuerpo. Tales antígenos se describen en Leukocyte Typing VI (Proceedings of the VIth International Workshop and Conference, Kishimoto, Kikutni et al., eds., Kobe, Japón, 1996) . Las proteínas CD similares se describen en seminarios subsecuentes. Ejemplos de tales antígenos incluyen CD27, CD30, CD39, CD40, y ligandos de estos (ligando CD27, ligando CD30, etc.) . Varios de los antigenos CD son elementos de la familia del receptor TNF, la cual también incluye al ligando 41BB y 0X40. Los ligandos son a menudo elementos de la familia TNF, como son ligando 41BB y ligando OXO40. Por consiguiente, los elementos de las familias TNF y TNFR pueden también ser purificados usando la presente invención. Las proteínas enzimáticamente activas o sus ligandos, pueden también ser purificadas de conformidad con la invención. Ejemplos incluyen proteínas de fusión recombinante que comprenden al menos, un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante más toda o parte de una de las siguientes proteínas o sus ligandos, o una proteína substancialmente similar a una de estas : elementos de la familia metaloproteinasa-desintegrina, varias , cinasas, glucocerebrosidasa, superóxido dismutasa, activador del plasminógeno del tejido. Factor VIII, Factor IX, apolipoproteína E, apolipoproteína A-I, „ globinas, un antagonista IL-2, antitripsina alfa-1, Enzima que convierte a TNF-alfa, ligandos para cualquiera de las enzimas mencionadas anteriormente, y numerosas otras enzimas y sus ligandos. El método de la invención también puede ser usado para purificar anticuerpos o porciones de los mismos y anticuerpos quiméricos, es decir, anticuerpos que tienen dominios de inmunoglobulina de anticuerpo constante humano acoplados a uno o más dominios de inmunoglobulina de anticuerpo variable de murina, o fragmentos de los mismos. El método de la invención puede también ser usado para purificar conjugados que comprenden, un anticuerpo y una substancia citotóxica o luminiscente. Tales substancias incluyen: derivados de maitansina (tal como DMI) ; enterotoxinas (tales como enterotoxina de Staphylococco) ; isótopos de yodo (tal como yodo-125) ; isótopos de tecnio (tal como Tc-99m) ; fluorocromos de cianina (tal como Cy5.518); y proteínas que inactivan al ribosoma (tal como buganina, gelonina o saporina-S6) . Ejemplos de anticuerpos o anticuerpo/citotoxina o conjugados de anticuerpo/luminoforo contemplados por la invención, incluyen, aquellos que reconocen cualquiera o una combinación de las proteínas descritas anteriormente y/o los siguientes antígenos: CD2 , CD3 , CD4 , CD8 , CDlla, CD14 , CD18, CD20, CD22, CD23, CD25, CD33, CD40, CD44, CD52, CD80 (B7.1) , CD86 (B7.2), CD147, IL-la- IL-?ß, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, receptor IL-2, receptor IL-4, receptor IL-6, receptor IL-13, subunidades del receptor IL-18, PDGF-ß, VEGF, TGF, TGF-P2 , TGF-ß? , receptor EGF, receptor VEGF, complemento C5, IgE, antígeno de tumor CA125, antígeno de tumor MUCl, antígeno PEM, LCG (el cual es un producto de gen que está expresado en asociación con cáncer de pulmón), HER-2, una glicoproteína asociada al tumor TAG-72, el antígeno SK-1, epítopes asociados al tumor que están presentes en niveles elevados en el suero de pacientes con cáncer de colon y/o pancreático, epítopes asociados con cáncer o proteínas expresadas en células de cáncer de mama, colon, células escamosas, de próstata, pancreáticas, pulmón, y/ riñon, y/o en células de melanoma, glioma, o neuroblastoma, el núcleo necrótico de un tumor, integrina alfa 4 beta 7, la integrina VLA-4, integrinas B2, receptores TRAIL 1, 2, 3 y 4, RANK, ligando RANK, TNF-cc, molécula de adhesión VAP-1, molécula de adhesión de células epiteliales (EpCAM) , molécula de adhesión intercelular-3 (ICAM-3) , adhesina leucointegrina, glicoproteína de plaquetas gp IIB/lIIa, cadena pesada de miosina cardiaca, hormona paratiroides, rNAPc2 (el cual es un inhibidor del factor del tejido VHa) , MHC 1, antígeno carcinoembriónico (CEA), alfa-fetoproteína (AFP) , factor necrosis del tumor (TNF) , CTLA-4 (el cual es un antígeno asociado con el linfocito T citotóxico) , receptor Fc-?-?, HLA-DR 10 beta, antígeno HLA-DR, L-selectina, IFN-?, Virus Sincitial Respiratorio, virus de inmunodeficiencia humana (VIH) , virus de la hepatitis B (VHB) , Streptococcus mutans, y Staphylococcus aureus. La invención puede además, ser usada para purificar anticuerpos anti-idiotípicos , o proteínas substancialmente similares, que incluyen pero no se limitan a anticuerpos anti-idiotípicos contra: un anticuerpo objetivo al antígeno del tumor gp72 un anticuerpo contra el gangliosido GD3 ; o un anticuerpo contra el gangliosido GD2. En cromatografía de afinidad, un absorbente puede comprender un soporte sólido adecuado con una segunda proteína agregada a este. Una muestra de proteína que contiene la proteína a ser purificada, puede ser aplicada a este absorbente. El absorbente puede ser subsecuentemente lavado en una solución que no interfiere con el enlace de la segunda proteína al dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante de la proteína. La proteína puede posteriormente, ser eluida del absorbente con una solución que interfiere con el enlace del dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante por la segunda proteína. La segunda proteína es cualquier proteína que se puede enlazar a un dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante, la cual puede, pero no necesita ser, una proteína de fusión recombinante . Opcionalmente, la segunda proteína puede ser la Proteína G, Proteína LG, o Proteína A. La segunda proteína puede ser agregada a cualquier soporte sólido adecuado que incluye: agarosa, sefarosa, sílice, carbón colodión, arena y cualquier otro material adecuado. Tales materiales son bien conocidos en la técnica. Cualquier método adecuado puede ser usado para agregar la segunda proteína al soporte sólido. Los métodos para agregar proteínas a un soporte sólido son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Ostrove (1990), en Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 182:357-371. Además, tales soportes sólidos que ya tienen la segunda proteína agregada, son comercialmente disponibles de un número de fabricantes que incluyen BioRad, Merck, Amersham Pharmacia Biotech, y Millipore Corporation. En una etapa opcional, una muestra de proteína que comprende la proteína a ser purificada más los contaminantes, se carga en el absorbente, el cual comprende la segunda proteína agregada a un soporte sólido, en una solución que comprende un amortiguador y/o una sal . Los amortiguadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores de fosfato, amortiguadores Tris, amortiguadores de acetato, y/o amortiguadores de citrato. Las sales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, acetato de sodio, acetato de potasio, acetato de amonio, sales de calcio y/o sales de magnesio. Por ejemplo, la solución puede comprender Tris a concentraciones entre alrededor de 5 milimolares y 100 milimolares y cloruro de sodio a concentraciones entre alrededor de 50 milimolares y 250 milimolares . Sin embargo, otros amortiguadores y sales pueden ser usados. Después de cargar, el absorbente se puede lavar con más de la misma solución. La proteína puede ser eluida usando una solución que interfiere con el enlace de la segunda proteína al dominio de inmunoglobulina de anticuerpo constante. Esta solución puede incluir un agente caotrópico, tal como guanidino, un agente que puede ya sea incrementar o disminuir el pH, y/o una sal. Esta solución puede incluir ácido acético, glicina, o ácido cítrico. La elución se puede realizar disminuyendo el pH. Por ejemplo, el pH puede ser disminuido a alrededor de 4.5 o menos, típicamente entre alrededor de 3.3 hasta alrededor de 4.0, usando una solución que comprende citrato o acetato, entre otras posibilidades. Alternativamente, el pH puede ser incrementado, típicamente arriba de alrededor de 8.5. Las soluciones apropiadas para efectuar tales eluciones pueden comprender Tris o carbonato de sodio, entre otras posibilidades. Otros métodos de elución son también disponibles . Los protocolos para tal cromatografía de afinidad son bien conocidos en la técnica. Véase por ejemplo, Miller y Stone (1978), J. Immunol . ethods 24 (1-2) : 111-125. Condiciones para enlace y elución, pueden ser fácilmente optimizadas por aquellos expertos en la técnica. En los métodos de la invención, la proteína es sometida a cromatografía de hidroxiapatito bajo condiciones en las cuales la proteína no se enlaza a hidroxiapatito, pero la segunda proteína, y/o un complejo de la segunda proteína con la proteína la cual puede estar presente después de la cromatografía de afinidad, sí lo hace. La muestra es cargada en hidroxiapatito y se realiza la cromatografía en una solución que comprende un amortiguador y/o una sal a un pH mayor de alrededor de 5.5. Preferiblemente, la cromatografía puede ocurrir en una solución que es la misma como, o similar a aquella en la cual la proteína se carga en el medio de cromatografía. La cromatografía de hidroxiapatito puede ocurrir bajo condiciones en donde la proteína y la segunda proteína se enlazan entre sí para formar un complejo, o bajo condiciones en donde no lo forman. De este modo, en el caso formador, la separación de la proteína de la segunda proteína, puede vincular la separación de la proteína de un complejo de la segunda proteína con la proteína. En el último caso, la separación de la proteína de la segunda proteína puede vincular precisamente esto. La cromatografía y carga pueden ocurrir en una variedad de amortiguadores y/o sales que incluyen, sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, cloruro, fluoruro, acetato, fosfato, citrato y/o amortiguadores Tris. Ejemplos específicos -de tales amortiguadores y sales son: Tris, fosfato de sodio, fosfato de potasio, fosfato de amonio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, cloruro de magne'sio, cloruro de calcio, fluoruro de sodio, fluoruro de potasio, fluoruro de amonio, fluoruro de calcio, fluoruro de magnesio, citrato de sodio, citrato de potasio, citrato de amonio, acetato de magnesio, acetato de calcio, acetato de sodio, acetato de potasio o acetato de amonio . El intervalo de pH es elegido para optimizar las condiciones de cromatografía y para retener las características deseadas de la proteína de interés. Para la mayoría de las proteínas de interés, pueden variar entre alrededor de 6.0 y alrededor de 8.6, preferiblemente entre alrededor de 6.5 y alrededor de 7.5. Sin embargo, ciertas proteínas son conocidas por ser resistentes a pH extremos, y puede ser posible un intervalo más amplio. En una modalidad, la solución de carga/cromatografía comprende un amortiguador de fosfato de sodio a una concentración entre alrededor de 0.5 milimolares y alrededor de 50 milimolares, más preferiblemente a una concentración entre alrededor de 15 milimolares y 35 milimolares de fosfato de sodio. Opcionalmente , la solución comprende un amortiguador de fosfato de sodio a una concentración de alrededor de 25 milimolares y a un pH de alrededor de 6.8. En otra modalidad, la solución de carga comprende Tris a un pH entre alrededor de 6.0 y alrededor de 9.0, preferiblemente entre alrededor de 6.5 y alrededor 8.0. Se colecta el flujo del líquido, el cual comprende la protelna a ser purificada. El amortiguador Seleccionado y/o sal en la concentración seleccionada, permiten a la segunda proteína enlazarse al hidroxiapatito, mientras la segunda proteína a ser purificada no. Un experto en la técnica se guiará por el conocimiento en el arte, en la determinación de cual amortiguador o sal es apropiado para la proteína particular a ser purificada. Véase por ejemplo, Gorbunoff (1990) , Protein Chromatography on Hydroxyapatite Columns, en Guide to Protein Purification, ethods in Enzymology 182:329-339; Scopes, Protein Purification : rincipies and Practice, Tercera Edición, pp . 173-175, Springer, 1994 (descripción de la cual está incorporada por referencia aquí) . Sin embargo, un experto habilidoso puede fácilmente determinar la concentración óptima del amortiguador o sal seleccionado para uso mediante, por ejemplo, corrida de un gradiente del amortiguador o sal seleccionado a través de una columna de hidroxiapatito, en la cual una muestra que comprende la proteína a ser purificada y la segunda proteína, han sido aplicadas. Las fracciones del efluente de la columna se pueden colectar y analizar para determinar la concentración del amortiguador o sal en la cual la proteína y la segunda proteína eluyen. Los análisis adecuados incluyen por ejemplo, una medición de la conductancia eléctrica con un - medidor de conductividad (para determinar la concentración de sal en la muestra) , más la electroforesis en gel o ensayo ELISA (para determinar la identidad de las proteínas en la muestra) .
Opcionalmente, el hidroxiapatito puede ser lavado con más de la misma solución en la cual la muestra de proteína se cargó, y esta solución lavada puede también ser colectada y combinada con el flujo del liquido. Subsecuentemente, para recolección del flujo y, opcionalmente, el lavado, el cual comprende la proteína a ser purificada, las proteínas que pueden permanecer enlazadas al hidroxiapatito pueden ser liberadas retirando el medio de cromatografía usando una solución que comprende el amortiguador o sal usados para la cromatografía, pero a una molaridad superior. Después, la columna puede ser regenerada usando una solución que tendrá el efecto de liberar la mayoría o todas las proteínas del medio de cromatografía y reducir o eliminar cualquier contaminación microbiana que puede estar presente en el medio de cromatografía. En una modalidad, tal solución puede comprende hidróxido de sodio. Otros reactivos pueden también ser usados. Subsecuentemente, la columna puede ser enjuagada y almacenada en una solución que puede disuadir el crecimiento microbiano. Dicha solución puede comprender hidróxido de sodio, pero otros reactivos pueden también ser apropiados . La segunda proteína, un complejo de la proteína y la segunda proteína, y/o otras proteínas que pueden estar presentes en una muestra de la proteína a ser purificada, pueden ser monitoreadas por cualquier mé°dio apropiado.
Preferiblemente, la técnica debe ser bastante sensitiva para detectar contaminantes en el intervalo entre alrededor de 2 partes por millón (ppm) (calculado como nanogramos por miligramos de la proteína a ser purificada) y 500 ppm. Por ejemplo, el ensayo inmunosorbente unido a la enzima (ELISA) , un método bien conocido en la técnica, puede ser usado para detectar la contaminación de la proteína por la segunda proteína. Véase por ejemplo, Reen (1994), Enzyme-Liked Immunosorbent Assay (ELISA) , en Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol . 32: 461-466, la cual se incorpora aguí por referencia en su totalidad. En un aspecto, la cromatografía de hidroxiapatito no puede reducir la contaminación de manera detectable por una segunda proteína, especialmente si el material cargado en el hidroxiapatito tiene niveles de la segunda proteína, que son cerrados a, o debajo de niveles detectables. Alternativamente, la cromatografía de hidroxiapatito puede reducir la contaminación por una segunda proteína en al menos, alrededor de dos veces, preferiblemente al menos, alrededor de tres veces, más preferiblemente al menos, alrededor de cinco veces, todavía más preferiblemente al menos, alrededor de diez veces, aún más preferiblemente al menos, alrededor de quince veces, más preferible al menos, alrededor de veinte veces. Preferiblemente, la contaminación de la proteína por la segunda proteína después de la cromatografía de hidroxiapatito, no es más de alrededor de 400 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 360 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 320 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 280 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 240 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 200 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 160 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 140 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 120 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 100 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 80 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 60 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 40 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 20 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 10 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 5 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 1 ppm y más preferiblemente, no más de alrededor que 0.5 ppm. La contaminación por la segunda proteína puede variar de niveles no detectables hasta alrededor de 5 ppm o de aproximadamente alrededor de 5 ppm hasta alrededor de 400 ppm. Sí una proteína es purificada para uso farmacológico, uno de habilidades en la técnica comprenderá que el nivel preferido de la segunda protelna puede depender de la dosis semanal de la proteína a ser administrada por paciente, Con el propósito de que el paciente no recibirá más que una cierta cantidad de un contaminante de proteina por semana. De este modo, sí la dosis requerida semanalmente de la proteína se disminuye, el nivel de contaminación por una segunda proteína puede, posiblemente, incrementarse. De forma similar, otros contaminantes de proteínas, que incluyen proteínas de células hospedadoras que pueden estar presentes en una muestra de la proteína a ser purificada, pueden ser monitoreados por cualquier medio apropiado, que incluyen ensayos ELISA. En otro aspecto, la contaminación de la proteína por otras proteínas, se puede reducir después de la cromatografía de hidroxiapatito, preferiblemente por al menos alrededor de dos veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de tres veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de cinco veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de diez veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de veinte veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de treinta veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de cuarenta veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de cincuenta veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de sesenta veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de setenta veces - más, más preferiblemente, por al menos alrededor de 80 veces, más preferiblemente, por al menos alrededor de 90 veces y más preferiblemente, por al menos alrededor de 100* veces. En otro aspecto, la contaminación de la proteína por otras proteínas después de la cromatografía de hidroxiapatito no es más de alrededor de 10,000 ppm, preferiblemente, no más de alrededor de 2500 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 400 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 360 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 320 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 280 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 240 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 200 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 160 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 140 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 120 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 100 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 80 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 60 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 40 ppm, más preferiblemente, no más de alrededor de 30 ppm, más preferiblemente , no más de alrededor de 20 ppm, más preferiblemente, no m s de alrededor de 10 ppm, y más preferiblemente , no más de alrededor de 5 ppm. Tal contaminación puede variar de niveles no detectables hasta alrededor de 10 ppm, o desde alrededor de 10 ¦ ppm hasta alrededor de 10,000 ppm. Si una proteína es purificada para uso f rmacológico, uno de habilidades en la técnica comprenderá que los niveles aceptables de otros contaminantes de proteínas pueden depender de la dosis semanal de la proteína a ser administrada por paciente, como se explica anteriormente . La cantidad de ADN que puede estar presente en una muestra de proteína a ser purificada, puede ser determinada por cualquier método adecuado. Por ejemplo, uno puede usar un ensayo utilizando reacción en cadena de la polimerasa. Opcionalmente, la técnica puede detectar contaminación de ADN a niveles de 10 picogramos por miligramo de proteína o mayor. Los niveles de ADN pueden ser reducidos por cromatografía .de hidroxiapatito, opcionalmente por alrededor de dos veces, preferiblemente, por alrededor de cinco veces, más preferiblemente, por alrededor de diez veces, más preferiblemente, por alrededor de quince veces, más preferiblemente, por alrededor de 20 veces. Opcionalmente, los niveles de ADN después de la cromatografía de hidroxiapatito son menos de alrededor de 20 picogramos por miligramo de proteína, preferiblemente, menos de 15 picogramos por miligramo de proteína, más preferiblemente, menos de 10 picogramos por miligramo de proteína, más preferiblemente, menos de 5 picogramos por miligramo de proteína. Los siguientes ejemplos son ofrecidos por medio de ilustración y sin limitación.
EJEMPLO 1 Reducción en Niveles de Proteína A en una Muestra que Comprende TNFR: Fc usando Cromatografía de Hidroxiapatito Este experimento demuestra que la cromatografía de hidroxiapatito puede reducir niveles de proteína residual A, en una muestra de proteína que comprende TNFR:FC que contiene una cantidad definida de proteína A, la cual puede formar un complejo con TNFR:FC. Una columna de hidroxiapatito de cerámica (Tipo II, Bio-Rad, 80 µ) , 18 cm de altura y 1.6 cm de diámetro interno, se equilibró previamente con dos volúmenes de columna de fosfato de sodio 0.4 molar, a pH 6 y se equilibró con cuatro volúmenes de columna de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8, el cual tiene una conductividad de 2.8 miliSiemens (mS) . Se cargó en la columna, una muestra de proteína (5.11 miligramos/mililitro) , en 668 mililitros de 25 mM de fosfato de sodio, a pH 6.8 que comprende TNFR.- Fc y proteína A (209 ppm) . La cantidad de proteína A en la muestra se determinó usando un ensayo ELISA. Se colectó el flujo del líquido que contiene TNFR:FC. La columna se lavó con tres volúmenes de columna de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8, y lo lavado se colectó y se combinó con el flujo. La proteína colectada en el flujo y lavada, se esterilizó por filtración y se almacenó a 2-8°C hasta que se llevó a cabo la purificación en la siguiente etapa. La mayaría del TNFR:FC cargado se recuperó (97%) en el flujo del líquido más el lavado. La cantidad de proteina A en el flujo más el lavado, se midió a 11 ppm. Después de esto, la columna se retiró usando tres volúmenes de columna de 0.4 molar de fosfato de sodio, a pH 6.8, regenerado, usando dos volúmenes de columna de 1 molar de hidróxido de sodio y se enjuagó con tres volúmenes de columna de 0.1 molar de hidróxido de sodio, 10 milimolares de fosfato de sodio, y se almacenó en la misma solución, en tal condición que está listo para reutilizarse. EJEMPLO 2 Reducción en los Niveles de Proteínas de Células Hospedadoras en una Muestra que Comprende TNFR:FC Usando Cromatografía de Hidroxiapatito El siguiente experimento demuestra que los niveles de proteína de células hospedadoras en una muestra que comprende TNFR:FC, pueden ser reducidos por cromatografía de hidroxiapatito . Una columna de hidroxiapatito de cerámica (Tipo II, Bio-Rad, 80 µ) , 10 cm de altura y 1.1 cm de diámetro interior, se equilibró previamente con dos volúmenes de columna de 0.3 molar de fosfato de sodio, a pH 6.8 y se equilibró con tres volúmenes de columna de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8, el cual tiene una conductividad de 2.8 mS . Se cargaron en la columna, alrededor de 1.9 gramos de proteína en un volumen de 382 mililitros de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8. Esta muestra incluye TNFR:FC, el cual comprende la vasta mayoría de la muestra, y las proteínas de células hospedadoras (545 ppm) . La cantidad de proteínas de células hospedadoras en la muestra se determinó usando ensayos ELISA. Se colectó el flujo del líquido que comprende TNFR:FC. La columna se lavó con tres volúmenes de columna de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6, y lo lavado se colectó y se combinó con el flujo. Se recuperó la mayoría del TNF : Fc cargado (92%) en el flujo del líquido más el lavado. El TNFR:FC colectado se esterilizó por filtración. La cantidad de proteínas de células hospedadoras se disminuyó al menos, alrededor de setenta veces (de 545 ppm hasta 7 ppm) , cuando se compara con el material cargado en la columna de hidroxiapatito . Posteriormente, la columna se retiró usando tres volúmenes de columna de 0.3 molar de fosfato de sodio, a pH 6.8, se enjuagó con un volumen de la mitad de columna de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8, regenerado, usando dos volúmenes de columna de 1 molar de hidróxido de sodio, enjuagado con tres volúmenes de columna de 0.1 molar de hidróxido de sodio, 10 milimolares de fosfato de sodio, y se almacenó en la misma solución, en tal condición que está listo para reutilizarse . La figura 1 muestra los perfiles de absorbancia y conductividad de la columna. La mayoría de la proteína en la muestra fluye a través de la columna antes d¾l incremento en conductividad (hasta alrededor de 20 mS) , causado por la adición de 0.3 molar de fosfato de sodio, entre alrededor de 55 y 59 volúmenes de columna. El gran incremento en conductividad (hasta alrededor de 200 mS) , posteriormente corresponde a la adición de 1.0 molar de hidróxido de sodio para regenerar la columna como se explica anteriormente. Puesto que el TNFR:FC constituye la vasta mayoría de especies en la muestra de proteína cargada en la columna, este perfil indica que el TNFR:FC fluye a través de una corrida de columna de hidroxiapatito en 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8. EJEMPLO 3 Reducción en Proteína Residual A y Otras Proteínas en una Muestra de TNFR:FC por Cromatografía de Hidroxiapatito de Cerámica El siguiente experimento muestra que los niveles ¦ de proteína A y otros contaminantes de proteína, pueden ser simultáneamente reducidos usando cromatografía de hidroxiapatito . Una columna de hidroxiapatito de cerámica (Tipo II, Bio- Rad. 80 µ) , 18 cm de altura y 1.6 cm de diámetro interno, se equilibró previamente con dos volúmenes de columna de 0.4 M de fosfato de sodio, a pH 6.8 y se equilibró con tres volúmenes de columna de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8. Se cargaron en la columna, alrededor de 3.2 gramos de protelna en alrededor de 5 mg/ml en 25 milimolares de fosfato de sodio que comprende TNFR:FC, Proteína A, la cual forma un complejo con TNFR:FC bajo estas condiciones, (entre alrededor de 97 ppm y alrededor de 106 ppm) , y otras impurezas relacionadas con el proceso (PRI; entre alrededor de 59 ppm y alrededor de 67 ppm) . Las cantidades de Proteína A y PRI en la muestra se determinaron usando ensayos ELISA. Se colectó el flujo del líquido que contiene TNFR :Fc . La columna se lavó con tres volúmenes de columna de 25 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8, y lo lavado se colectó. Casi todo (99-100%) el TNFR:FC cargado se recuperó en el flujo del líquido más el lavado. La cantidad de Proteína A y PRI en la muestra se redujo por 5.3-5.4 veces y 2.8-3.7 veces, respectivamente, cuando se compara con el material cargado en la columna de hidroxiapatito . Posteriormente, la columna se retiró usando cinco volúmenes de columna de 0.4 molar de fosfato de sodio, a pH 6.8, regenerado, usando dos volúmenes de columna de 1 M de hidróxido de sodio, se enjuagó en tres volúmenes de columna de 10 milimolares de fosfato de sodio, a pH 6.8, 0.1 M de hidróxido de sodio, y se almacenó en la misma solución, en tal condición que está listo para reutilizarse . La presente invención no está limitada en el ámbito por las modalidades específicas descritas aquí, las cuales están propuestas como ilustraciones únicas de aspectos individuales de la invención, y métodos y componentes funcionalmente equivalentes están dentro del ámbito de la invención. Sin embargo, varias modificaciones de la invención además de aquellas descritas aquí, serán aparentes para un experto de habilidades en la técnica, a partir de la siguiente descripción y dibujos acompañantes. Tales modificaciones están propuestas para caer dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.