JPH022937A - 酵素標識抗体の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒドロキシアパタイトカラムを用いた酵素標
識抗体の精製法に関するものであり、さらに詳しくは、
酵素標識抗体を未標識抗体および酵素から分離する際に
、ヒドロキシアパタイトカラムを用いる方法に関するも
のである。

（従来の技術） 酵素免疫測定（ＥＩＡ）法は、医学、薬学の分野を中心
に種々の物質の特異的かつ高感度な定量分析手段として
広く活用されている。このＥＩＡ法による測定において
は、抗原を酵素標識して用いる場合もあるが、−ａ的に
は抗体を酵素で標識化して用いられる場合が多い。また
、免疫組織化学の分野においても、−酵素標識抗体は広
範囲に利用されている。

（発明が解決しようとする課題） 抗体を酵素標識する方法としては、グルタルアルデヒド
を用いる方法、過ヨウ素酸法、マレイミド法など多くの
方法が試みられているが、いずれの場合も反応効率１０
０％にはならないため、標識反応後のサンプルは標識抗
体と未標識抗体および酵素の混合物となる。測定の感度
を上げ、また非特異的な発色をできるだけ低くおさえる
ためには、この混合物から８８抗体だけを精製して用い
る必要が生じる。

抗体としてＦａｂ−化したＩ（ＩＧを用いる場合には、
ゲル濾過法により標識抗体と未標識抗体の分離を行なう
ことも可能であるが、その他の場合には簡便で有効な分
離手段はほとんど知られていない。

本発明の目的は、酵素標識抗体を未標識抗体および酵素
から簡便に精製する方法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 上記目的は、酵素標識抗体を分離精製する際に、ヒドロ
キシアパタイトカラムを用いることを特徴とする酵素標
識抗体の分離精製方法により達成される。

本発明の方法を用いて分離するサンプルとしては、マウ
ス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの動物を免疫し
て得られるポリクローナル抗体および細胞融合技術など
を利用して得られるマウス、ラット、ヒトなどに由来す
るモノクローナル抗体のいずれもが対象となり得るが、
より完全な分離を得るためには分子として均一であるモ
ノクローナル抗体がより好ましい。

また本発明の方法は、特にクラスがＩｇＧである抗体、
Ｆａｂ−化されていない抗体を用いる際に有効に用いる
ことができる。

抗体を得るために免疫する抗原としては、ヒトおよび各
種動物由来の細胞、タンパクおよび核酸などの高分子化
合物、ホルモンその他の低分子化合物など、一般に抗原
として使われる全ての物置を用いることができる。低分
子化合物を用いる場合には、抗原性を高めるためにウシ
血清アルブミンなどのタンパク質に結合させた状態で免
疫することが望ましい。

また、抗体に結合させる酵素としては、西洋ワサビペル
オキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクト
シダーゼなど酵素免疫測定に一般に用いられる多くの酵
素が対象となるが、特に西洋ワサビペルオキシダーゼが
好ましく用いられる。

これらの酵素を抗体に結合させる方法としては、グルタ
ルアルデヒドを用いる方法、過ヨウ素酸法、マレイミド
法などこれまでに知られている全て方法が可能である。

結合する酵素の数を一定−にするためにはマレイミド・
ヒンジ法［Ｙｏｓｈｉｔａｋｅら、　　Ｊ、Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ、　９２１４１３（１９８２）　］が優れており、
特に酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる場
合には、この方法が適している。

本発明で用いられるヒドロキシアパタイトカラムは、一
般のカラムクロマトグラフィー用および高速液体カラム
クロマトグラフィー用のいずれもが使用できる。一般力
ラムクロマトグラフィー用の充填剤としてはＢ１ｏ−Ｇ
ｅ１　ＨＴ　”および”８ｉｏ−Ｇｅｌ　ＨＴＰ　　“
（バイオ・ラッド社製）など、また高速液体クロマトグ
ラフィー用のカラムとしては、“ＨＣ＾−Ｃｏ　ｌ　ｕ
ｍｎ“（三井東圧化学（株）製）など多くの市販品が入
手可能である。

分離時間を短くするためには、１ｍｌ／ｍｉｎ程度の高
淳速が可能な高速液体クロマトグラフィーを用いること
が好ましい。

サンプルの溶出のための溶離液としては、リン酸ナトリ
ウムＭ街液、リン酸カリウム緩衝液など一般にヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトで用いられる溶離液が使用
できる。サンプルの溶出は直線濃度勾配、段階的濃度勾
配のいずれもが用いられる。いずれの場合にも低イオン
強度から高イオン強度への濃度勾配が一般的に用いられ
るが、ＰＨ勾配による溶出も可能であり、両者を組み合
わせて用いることがさらに好ましい。また、サンプルに
よっては、低能度のカルシウムイオン、マグネシウムイ
オンなどで効果的な分離が得られることもある。

（実施例） 以下本発明を実施例により詳細に説明する。

実施例１ ヒト結腸癌細胞を免疫して得られたマウスモノクローナ
ル抗体、抗ＣＡ　１９−９抗体（ｃｌａｓｓ　ＩＩＪ　
Ｇ１　）　［Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、Ｓｏｍａｔｉｃ　
Ｃｅ１ｌ　ＧｅｎｅｔｉｃＳ、５　９５７　（１９７９
）　］　５５ｍ］と西洋ワサビペルオキシダーゼ９．２
ｍｇとの結合反応をマレイミド・ヒンジ法により行ない
、１１１１１の反応液を得た。

このうちの１９０μｍをヒドロキシアパタイトカラム（
三井東圧化学（株）製、ＨＣＡカラムＡ−７６１０にア
プライし、高速液体クロマトグラフィー（ファルマシア
（株）製、ファルマシアＦＰＬＣ）を用いて１　ｍｌ／
ｍｉｎの流速で１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ＰＨ５
，８（Ａ液）から５００ｍＭリン酸ナトリウムＭ’Ｓ液
ＰＨ６゜８（Ｂ液）への濃度勾配で溶出させた。充分な
分離を得るために、標識抗体の溶出する１００ｍＭ付近
では濃度勾配をゆるやかにして溶出を行なった。ピーク
の検出は、２８０ｎｍの紫外吸収およびペルオキシダー
ゼに由来する４０３ｎｍの可視吸収を同時にモニターし
て行なった。

溶出パターンは第１図に示す。実線は各々の波長の吸光
度を、点線はグラジェントを表わす。

３個の主要ピークを分収後標識抗体としての活性を測定
した結果、−一一　で示す２番目のピークが目的の標識
抗体であり、１番目のビクは未反応のペルオキシダーゼ
、３番目のとりは未反応の抗体であることが明らかにさ
れた。

実施例２ ヒト乳癌肝転移細胞の膜フラクションを免疫して得られ
たマウスモノクローナル抗体ＤＦ３（Ｃ１ａｓｓ　　Ｉ
ｇＧ１　）　　［Ｋｕｆｃら、ＨｙｂｒｉｄＯｍａ　、
　３２２３　（１９８４）］　１０ｍｇと西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ９．２ｍ（］との結合反応をマレイミド
・ヒンジ法により行ない、２ｍｌの反応液を得た。

このうちの５０μｌをヒドロキシアパタイトカラム（三
井東圧化学（株）製、ＨＣＡカラムＡ−７６１０＞にア
プライし、実施例１と同じ条件で溶出を行なった。２８
０ｎｍの紫外吸収でモニターした溶出パターンを第２図
に示す。各ピークを分収後、各々の４０３ｎｍの吸収お
よび標識抗体としての活性を測定した結果、１番目のピ
ークは未反応のペルオキシダーゼ、２番目のピークが標
識抗体、３番目のピークは未反応の抗体であることが明
らかにされた。

（発明の効果） 本発明は酵素標識抗体を簡便かつ短時間に精製する方法
であり、１段階の精製で標識抗体を未標識抗体および酵
素から特異的に単離することができ、酵素免疫測定を用
いた各種疾患の診断、微量物質の定景をはじめとする多
くの分野で極めて有効に活用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における抗ＣＡ１９−９抗体と西洋ワ
サビペルオキシダーゼの結合反応後の溶液の分離パター
ンである。第２図は、実施例２におけるＤＦ３抗体と西
洋ワサビペルオキシダーゼの結合反応後の溶液の分離パ
ターンである。 特許出願人　東　し　株　式　会　社 吸光度 ｌｊ０３ｎｍ　　Ｑ、１ ２８０ｎｍ　　Ｑ、１ ％（Ｄ；ｌ支）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵素標識抗体を分離精製する際に、ヒドロキシア
   パタイトカラムを用いることを特徴とする酵素標識抗体
   の分離精製方法。