JP2888443B2 - ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 - Google Patents
ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法Info
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
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- C07K14/56—IFN-alpha
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト白血球由来のインターフェロンの亜種お
よびその亜種に対する抗体を簡便に測定し、分析する方
法およびそれに用いる材料に関する。
よびその亜種に対する抗体を簡便に測定し、分析する方
法およびそれに用いる材料に関する。
ヒト白血球インターフェロンは、ヒトインターフェロ
ン−αとも称され、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用が知ら
れており、臨床応用が開始されている。近年実用化され
てきた遺伝子工学もいち早く応用され、インターフェロ
ンの遺伝子の解析が、飛躍的に進められた。ヒトインタ
ーフェロンは、産生細胞や物理化学的性質の違いから
α、β、γの３種類に分類されている。βに関しては２
種の、γインターフェロンに関しては、それぞれ一種の
分子種が報告されている。それらのインターフェロンと
は対照的にα型インターフェロンには、20種以上のきわ
めて多様な亜種（サブタイプ）が存在することが知られ
ており（Goeddel et al 1980 Nature 287:411−、Pestk
a et al 1987 Annual Review of Biochemistry 56:72
7）、本インターフェロンを実用化するに当り検討が進
められてきた。しかし、その分析方法は、各亜種を高純
度に精製しアミン酸配列を決定するというきわめて煩雑
な方法であった（Rubinstein et al 1979 Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 76:640−）。それぞれの亜種は、共通のア
ミノ酸配列を有しているものの、それぞれ部分的に異な
っており、独立した遺伝子の産物であることが明かにさ
れている。それらは活性発現に当たって種特異性、抗ウ
イルス活性のスペクトラムなどにも異なった特徴を有し
ており、生体内でもなんらかの形で生理活性を分担しあ
い、あるいは協調しあっていることが予測されている。
しかし、生体内で亜種の遺伝子の全てが発現していると
は考えがたく、活性の解析にあたって、蛋白としての亜
種の分布の分析は重要な課題であるが、簡便な分析法が
ない故にこの分野の知見は、きわめて限られたものであ
る（Adolf et al 1987 J.Gen.Virol.68:1669）。さら
に、近年遺伝子工学によって生産された（組換え型）α
型インターフェロンの人体への使用の開始後、抗インタ
ーフェロン中和抗体の惹起が高い頻度で観察されてい
る。
ン−αとも称され、抗ウイルス作用、抗腫瘍作用が知ら
れており、臨床応用が開始されている。近年実用化され
てきた遺伝子工学もいち早く応用され、インターフェロ
ンの遺伝子の解析が、飛躍的に進められた。ヒトインタ
ーフェロンは、産生細胞や物理化学的性質の違いから
α、β、γの３種類に分類されている。βに関しては２
種の、γインターフェロンに関しては、それぞれ一種の
分子種が報告されている。それらのインターフェロンと
は対照的にα型インターフェロンには、20種以上のきわ
めて多様な亜種（サブタイプ）が存在することが知られ
ており（Goeddel et al 1980 Nature 287:411−、Pestk
a et al 1987 Annual Review of Biochemistry 56:72
7）、本インターフェロンを実用化するに当り検討が進
められてきた。しかし、その分析方法は、各亜種を高純
度に精製しアミン酸配列を決定するというきわめて煩雑
な方法であった（Rubinstein et al 1979 Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 76:640−）。それぞれの亜種は、共通のア
ミノ酸配列を有しているものの、それぞれ部分的に異な
っており、独立した遺伝子の産物であることが明かにさ
れている。それらは活性発現に当たって種特異性、抗ウ
イルス活性のスペクトラムなどにも異なった特徴を有し
ており、生体内でもなんらかの形で生理活性を分担しあ
い、あるいは協調しあっていることが予測されている。
しかし、生体内で亜種の遺伝子の全てが発現していると
は考えがたく、活性の解析にあたって、蛋白としての亜
種の分布の分析は重要な課題であるが、簡便な分析法が
ない故にこの分野の知見は、きわめて限られたものであ
る（Adolf et al 1987 J.Gen.Virol.68:1669）。さら
に、近年遺伝子工学によって生産された（組換え型）α
型インターフェロンの人体への使用の開始後、抗インタ
ーフェロン中和抗体の惹起が高い頻度で観察されてい
る。
組換え型のインターフェロンがその性格上、１つの亜
種によって構成されており、この種の抗体の出現は、投
与されたインターフェロンの効力を失わせると考えら
れ、臨床応用上きわめて重大な問題である。また、この
種の抗体が、人体自体がその防御機構の一環として産す
るインターフェロン活性を中和すると考えられ、全く新
たな問題を提起している。しかし効果的な抗体評価法が
ない故に知見は蓄積されていない。以上のように、基礎
科学の立場からも臨床する立場からも、簡便で迅速な亜
種組成、抗体の分析法の開発が待ち望まれている。天然
に存在する全ての亜種を分析する目的では、全ての亜種
を含む部分精製インターフェロンを抗原として、抗体を
作製しなければならない。抗体の作製に当たって、サン
ドイッチ型酵素抗体法による分析法を２抗体法によって
確立するためには、２種の動物を免疫することが好まし
いが、１種の動物で抗体を作製し、その一部を直接酵素
標識し、サンドイッチすることも可能である。いずれに
しても得られた抗体は、全ての亜種を認識できるポリク
ローナル抗体でなければならない。この目的のために各
亜種に対する単クローナル抗体を適当に混合して用いる
ことも可能だが、それらの抗体を産生するハイブリドー
マを確立することは、困難である。それば、１）すべて
の亜種を相当量単離精製し、２）それぞれ細胞融合を行
った上で、３）産生細胞をスクリーニングしなければな
らない上、得られる抗体は各亜種の蛋白の１抗原決定部
位を認識するだけであり、微量にしか含まれていない亜
種は、見逃してしまう可能性が高いなどの欠点があるか
らである。抗白血球インターフェロンポリクローナル抗
体の場合、精製試料中に含まれる不純物に対する抗体の
混入が考えられ、絶対に避けなければならない課題であ
る。
種によって構成されており、この種の抗体の出現は、投
与されたインターフェロンの効力を失わせると考えら
れ、臨床応用上きわめて重大な問題である。また、この
種の抗体が、人体自体がその防御機構の一環として産す
るインターフェロン活性を中和すると考えられ、全く新
たな問題を提起している。しかし効果的な抗体評価法が
ない故に知見は蓄積されていない。以上のように、基礎
科学の立場からも臨床する立場からも、簡便で迅速な亜
種組成、抗体の分析法の開発が待ち望まれている。天然
に存在する全ての亜種を分析する目的では、全ての亜種
を含む部分精製インターフェロンを抗原として、抗体を
作製しなければならない。抗体の作製に当たって、サン
ドイッチ型酵素抗体法による分析法を２抗体法によって
確立するためには、２種の動物を免疫することが好まし
いが、１種の動物で抗体を作製し、その一部を直接酵素
標識し、サンドイッチすることも可能である。いずれに
しても得られた抗体は、全ての亜種を認識できるポリク
ローナル抗体でなければならない。この目的のために各
亜種に対する単クローナル抗体を適当に混合して用いる
ことも可能だが、それらの抗体を産生するハイブリドー
マを確立することは、困難である。それば、１）すべて
の亜種を相当量単離精製し、２）それぞれ細胞融合を行
った上で、３）産生細胞をスクリーニングしなければな
らない上、得られる抗体は各亜種の蛋白の１抗原決定部
位を認識するだけであり、微量にしか含まれていない亜
種は、見逃してしまう可能性が高いなどの欠点があるか
らである。抗白血球インターフェロンポリクローナル抗
体の場合、精製試料中に含まれる不純物に対する抗体の
混入が考えられ、絶対に避けなければならない課題であ
る。
本発明者らは、部分精製されたヒト白血球インターフ
ェロン中に、精製前の白血球培養液（粗インターフェロ
ン液）に存在する亜種の全てが存在することを見いだ
し、これを抗原として抗体を作製した。さらに得られた
抗体を吸収、精製することによって、インターフェロン
の亜種は、すべて認識するがそれ以外の抗原はいっさい
認識しないきわめて特異性の高い抗白血球インターフェ
ロン抗体が得られることを見出した。つぎに、本発明者
らは、きわめて簡単で、効率よくインターフェロンの亜
種を分別できる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の
方法を確立した。そして、これらの方法を組み合わせ
て、酸素抗体法を実施したところ、生物活性と同様の亜
種組成をきわめて簡単に検出しうることを明らかにし、
本発明を完成することができた。本発明は、センダイウ
イルスで刺激したヒト白血球の培養物を粗材料として得
られる部分精製ヒト白血球インターフェロンで免疫した
動物の血清を、ヒト白血球培養液濃縮物を固定化したカ
ラムに通過させ、その通過液を部分精製インターフェロ
ンを固定化したカラムに通して抗ヒト白血球インターフ
ェロン抗体を吸着させ、カラムを洗ったのち、該抗体を
溶出する事を特徴とするヒト白血球インターフェロンの
亜種すべてを認識するポリクロナール抗体の製造法であ
る。
ェロン中に、精製前の白血球培養液（粗インターフェロ
ン液）に存在する亜種の全てが存在することを見いだ
し、これを抗原として抗体を作製した。さらに得られた
抗体を吸収、精製することによって、インターフェロン
の亜種は、すべて認識するがそれ以外の抗原はいっさい
認識しないきわめて特異性の高い抗白血球インターフェ
ロン抗体が得られることを見出した。つぎに、本発明者
らは、きわめて簡単で、効率よくインターフェロンの亜
種を分別できる高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の
方法を確立した。そして、これらの方法を組み合わせ
て、酸素抗体法を実施したところ、生物活性と同様の亜
種組成をきわめて簡単に検出しうることを明らかにし、
本発明を完成することができた。本発明は、センダイウ
イルスで刺激したヒト白血球の培養物を粗材料として得
られる部分精製ヒト白血球インターフェロンで免疫した
動物の血清を、ヒト白血球培養液濃縮物を固定化したカ
ラムに通過させ、その通過液を部分精製インターフェロ
ンを固定化したカラムに通して抗ヒト白血球インターフ
ェロン抗体を吸着させ、カラムを洗ったのち、該抗体を
溶出する事を特徴とするヒト白血球インターフェロンの
亜種すべてを認識するポリクロナール抗体の製造法であ
る。
ヒト白血球を適当な培地（例えばハムF12培地）中に
懸濁し、この懸濁液にセンダイウイルスを適当量（50−
200HA）添加して培養すれば粗インターフェロン液が得
られる。これは公知の方法で行い得る。（Cantell et a
l,1981 Methnds in Enzymology 78:29−）。ついで粗イ
ンターフェロンをさらに、酸性条件下でのロダン酸カリ
ウム沈澱法、エタノール沈澱法の組合せよりなる方法
（Cantell et al ibid:499−）により精製して部分精製
白血球インターフェロンを得ることができる。
懸濁し、この懸濁液にセンダイウイルスを適当量（50−
200HA）添加して培養すれば粗インターフェロン液が得
られる。これは公知の方法で行い得る。（Cantell et a
l,1981 Methnds in Enzymology 78:29−）。ついで粗イ
ンターフェロンをさらに、酸性条件下でのロダン酸カリ
ウム沈澱法、エタノール沈澱法の組合せよりなる方法
（Cantell et al ibid:499−）により精製して部分精製
白血球インターフェロンを得ることができる。
かくして得た部分精製インターフェロンで動物を免疫
するとその血清としてヒト白血球インターフェロンの亜
種すべてに対する抗体を含む抗血清が得られる。このよ
うなポリクローナル抗体中に含まれる不純物に対する抗
体の除去はきわめて困難な課題であったが、不純物固定
化（モック）カラムおよびインターフェロン固定化カラ
ムを用いた親和性クロマトグラフィーを行い特異性をあ
げることによって解決できることが判った。
するとその血清としてヒト白血球インターフェロンの亜
種すべてに対する抗体を含む抗血清が得られる。このよ
うなポリクローナル抗体中に含まれる不純物に対する抗
体の除去はきわめて困難な課題であったが、不純物固定
化（モック）カラムおよびインターフェロン固定化カラ
ムを用いた親和性クロマトグラフィーを行い特異性をあ
げることによって解決できることが判った。
本発明においては、上記のようにして得られた抗血清
を、ヒト白血球培養液の濃縮物を固定化したカラムに通
過させて不純物に対する抗体を除去し、ついで通過液を
上記の部分精製ヒト白血球インターフェロンを固定化し
たカラムに通して抗ヒト白血球インターフェロン抗体を
カラムに吸着させ、カラムを洗浄し、続いて該抗体を溶
出する。溶出には、たとえば、0.1Mクエン酸−0.5M食塩
からなる緩衝液を用いることができる。得られた抗体
は、型どうりプロテインＡセファロースなどをもちいて
精製することができる。サンドイッチ法を用いて白血球
インターフェロンの亜種組成を解析する場合、まず白血
球インターフェロンを分画しなければならない。そのた
めには、種々のクロマトグラフを応用できるが、逆相系
のカラムを用いたHPLCがもっとも分離がよく再現性、迅
速性もふくめて最適である。簡便に試験しようとする場
合、例えば、予め抗白血球インターフェロン抗体（抗体
Ａ、例えば馬抗体）を96穴マイクロプレートにコート
し、１％牛血清アルブミン液などの高濃度蛋白液を適当
量分注しておく。このようにして準備したプレートの各
穴中に、カラムからの溶出液を保持時間に応じて各分画
を分取する。適当な時間をおいてプレートを洗った後、
コートした際に用いた抗体とは別の種の動物より得た抗
体（抗体Ｂ、例えば山羊抗体）の希釈液と反応させる。
再度プレートを洗浄したのち、酵素で標識された、抗体
Ｂに対する抗体と反応させる。この操作の後に、インタ
ーフェロンの亜種のいずれかが存在する分画を含む穴に
は酸素活性が検出されるようになる。酵素活性の強さ
は、発色の度合として測定できる。そのままプレート中
に基質を添加し発色させた後、プレートリーダーを用い
て、迅速に測定することもできる。発色の程度をカラム
からの溶出時間に対してグラフを作製することによっ
て、亜種の存在パターンを容易に解析できるばかりでな
く、その比率を迅速、簡便にそして定量的に分析するこ
とも可能である。また、抗体Ｂに、患者血清を用い、つ
いで酵素標識した抗ヒトイムノグラブリンあるいはプロ
テインＡを用いて処理することによって、患者血清中の
抗体の存在そしてその特異性を容易に解析できる。
を、ヒト白血球培養液の濃縮物を固定化したカラムに通
過させて不純物に対する抗体を除去し、ついで通過液を
上記の部分精製ヒト白血球インターフェロンを固定化し
たカラムに通して抗ヒト白血球インターフェロン抗体を
カラムに吸着させ、カラムを洗浄し、続いて該抗体を溶
出する。溶出には、たとえば、0.1Mクエン酸−0.5M食塩
からなる緩衝液を用いることができる。得られた抗体
は、型どうりプロテインＡセファロースなどをもちいて
精製することができる。サンドイッチ法を用いて白血球
インターフェロンの亜種組成を解析する場合、まず白血
球インターフェロンを分画しなければならない。そのた
めには、種々のクロマトグラフを応用できるが、逆相系
のカラムを用いたHPLCがもっとも分離がよく再現性、迅
速性もふくめて最適である。簡便に試験しようとする場
合、例えば、予め抗白血球インターフェロン抗体（抗体
Ａ、例えば馬抗体）を96穴マイクロプレートにコート
し、１％牛血清アルブミン液などの高濃度蛋白液を適当
量分注しておく。このようにして準備したプレートの各
穴中に、カラムからの溶出液を保持時間に応じて各分画
を分取する。適当な時間をおいてプレートを洗った後、
コートした際に用いた抗体とは別の種の動物より得た抗
体（抗体Ｂ、例えば山羊抗体）の希釈液と反応させる。
再度プレートを洗浄したのち、酵素で標識された、抗体
Ｂに対する抗体と反応させる。この操作の後に、インタ
ーフェロンの亜種のいずれかが存在する分画を含む穴に
は酸素活性が検出されるようになる。酵素活性の強さ
は、発色の度合として測定できる。そのままプレート中
に基質を添加し発色させた後、プレートリーダーを用い
て、迅速に測定することもできる。発色の程度をカラム
からの溶出時間に対してグラフを作製することによっ
て、亜種の存在パターンを容易に解析できるばかりでな
く、その比率を迅速、簡便にそして定量的に分析するこ
とも可能である。また、抗体Ｂに、患者血清を用い、つ
いで酵素標識した抗ヒトイムノグラブリンあるいはプロ
テインＡを用いて処理することによって、患者血清中の
抗体の存在そしてその特異性を容易に解析できる。
〔実施例１〕 採血後48時間以内の新鮮血を2,600rpmで10分間遠心
し、得られた白血球層（バフィーコート）を回収した。
混入する赤血球を、９倍量の冷塩化アンモン溶液（0.83
％）を加えることにより溶血させた後、遠心し沈澱とし
て、精製白血球を得た。本白血球を培地中に107個/mlの
濃度に懸濁した。培地は、４％のガンマグロブリン除去
ヒト血清、50μg/mlのゲンタマイシンを添加した、ハム
Ｆ−12倍地（フロー社）を用いた。本ヒト新鮮白血球浮
遊液に最終濃度が100HA/mlになるようにセンダイウイル
スを添加したのち、37℃で２時間培養した。そののち温
度を28℃に下げ一晩培養を続けた。本培養液を遠心分離
し得られた上清には、50000国際単位/mlから、200000国
際単位/mlのインターフェロン（104国際単位/mg蛋白）
が含まれており、これを粗インターフェロン液とした。
本粗インターフェロン100Lに最終濃度が0.5モルになる
ようにロダン酸カリウム（和光純薬）を添加し、pH3.5
に調整することによって沈澱を得た。この沈澱物に20L
の95％冷エタノールを添加し、ブレンダーで激しく撹拌
することにより、沈澱中のインターフェロンを抽出し
た。pH5.5でインターフェロン以外の蛋白、とくにアル
ブミンを沈澱させ、遠心分離により除いた後、上清をpH
8.0に調整しインターフェロンの沈澱を得た。本沈澱を
ダルベッコー処方りん酸緩衝生理食塩液（pH7.4）に溶
解し、収率30〜80％で部分精製インターフェロン液を得
た（105国際単位/mg蛋白）。かくして得た部分精製ヒト
白血球インターフェロンを山羊及び馬に投与して免疫し
た。免疫にあたって、一回の投与量は２×107単位と
し、完全アジュバントを用いてエマルジョンにした上
で、毎週皮下に注射した。３カ月連続して投与したの
ち、最終回に２×103単位を投与し、その１週間後に採
血し血清を得た。得られた抗血清の抗体価は表１に示す
通りであった。
し、得られた白血球層（バフィーコート）を回収した。
混入する赤血球を、９倍量の冷塩化アンモン溶液（0.83
％）を加えることにより溶血させた後、遠心し沈澱とし
て、精製白血球を得た。本白血球を培地中に107個/mlの
濃度に懸濁した。培地は、４％のガンマグロブリン除去
ヒト血清、50μg/mlのゲンタマイシンを添加した、ハム
Ｆ−12倍地（フロー社）を用いた。本ヒト新鮮白血球浮
遊液に最終濃度が100HA/mlになるようにセンダイウイル
スを添加したのち、37℃で２時間培養した。そののち温
度を28℃に下げ一晩培養を続けた。本培養液を遠心分離
し得られた上清には、50000国際単位/mlから、200000国
際単位/mlのインターフェロン（104国際単位/mg蛋白）
が含まれており、これを粗インターフェロン液とした。
本粗インターフェロン100Lに最終濃度が0.5モルになる
ようにロダン酸カリウム（和光純薬）を添加し、pH3.5
に調整することによって沈澱を得た。この沈澱物に20L
の95％冷エタノールを添加し、ブレンダーで激しく撹拌
することにより、沈澱中のインターフェロンを抽出し
た。pH5.5でインターフェロン以外の蛋白、とくにアル
ブミンを沈澱させ、遠心分離により除いた後、上清をpH
8.0に調整しインターフェロンの沈澱を得た。本沈澱を
ダルベッコー処方りん酸緩衝生理食塩液（pH7.4）に溶
解し、収率30〜80％で部分精製インターフェロン液を得
た（105国際単位/mg蛋白）。かくして得た部分精製ヒト
白血球インターフェロンを山羊及び馬に投与して免疫し
た。免疫にあたって、一回の投与量は２×107単位と
し、完全アジュバントを用いてエマルジョンにした上
で、毎週皮下に注射した。３カ月連続して投与したの
ち、最終回に２×103単位を投与し、その１週間後に採
血し血清を得た。得られた抗血清の抗体価は表１に示す
通りであった。
中和価は100単位/mlのインターフェロン活性を10単位
/mlに減弱できる抗体液の希釈倍率とした。
/mlに減弱できる抗体液の希釈倍率とした。
〔実施例２〕 白血球インターフェロンにきわめて特異性の高い抗性
を得るため以下の処理を行った。センダイウイルスを添
加せずそのほかの処理は、実施例１における粗インター
フェロン液調製時と同様に行って人白血球の培養液をえ
た。本培養液を濃縮したのち（5mg/ml）、20mlのブロム
シアン活性化セファロース（ファルマシア）に固定化
し、カラム（径1.5cm×長さ10cm）に充填した。このカ
ラム（モックカラム）を燐酸緩衝生理食塩液（PBS）で
緩衝化したのち、実施例１で得た各抗血清を通過させ
た。この操作で、インターフェロン以外の抗原に対する
抗体をカラムに吸着させることによって除去した。次
に、前述と同様の操作で部分精製インターフェロンを固
定化したセファロースのカラムを作製した。本カラムを
PBSで緩衝化したのちにこれに上記のモックカラム通過
液を負荷した。カラムをPBSでよく洗ったのち、吸着し
た抗インターフェロン抗体を、0.1Mクエン酸−0.5M食塩
からなる溶出液で溶出した。この操作によって、白血球
培養液に由来しない抗原に対する抗体蛋白を除去した
上、抗インターフェロン抗体を濃縮した。得られた抗体
の特異性を型のごとくウエスタンブロティング法（Towb
in et al 1976 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350−）に
より検定した。その結果を第１図に示した。精製後の抗
インターフェロン抗体は、インターフェロンの易動度に
相当する部分にのみ特異的なブロットを示した。この方
法によって、ヒト白血球インターフェロンにのみ特異的
反応する抗体を得た。この抗体がセンダイウイルス刺激
白血球培養液に存在する全ての亜種を漏らさず認識する
かどうか実施例３に示した実験によって検討した。
を得るため以下の処理を行った。センダイウイルスを添
加せずそのほかの処理は、実施例１における粗インター
フェロン液調製時と同様に行って人白血球の培養液をえ
た。本培養液を濃縮したのち（5mg/ml）、20mlのブロム
シアン活性化セファロース（ファルマシア）に固定化
し、カラム（径1.5cm×長さ10cm）に充填した。このカ
ラム（モックカラム）を燐酸緩衝生理食塩液（PBS）で
緩衝化したのち、実施例１で得た各抗血清を通過させ
た。この操作で、インターフェロン以外の抗原に対する
抗体をカラムに吸着させることによって除去した。次
に、前述と同様の操作で部分精製インターフェロンを固
定化したセファロースのカラムを作製した。本カラムを
PBSで緩衝化したのちにこれに上記のモックカラム通過
液を負荷した。カラムをPBSでよく洗ったのち、吸着し
た抗インターフェロン抗体を、0.1Mクエン酸−0.5M食塩
からなる溶出液で溶出した。この操作によって、白血球
培養液に由来しない抗原に対する抗体蛋白を除去した
上、抗インターフェロン抗体を濃縮した。得られた抗体
の特異性を型のごとくウエスタンブロティング法（Towb
in et al 1976 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350−）に
より検定した。その結果を第１図に示した。精製後の抗
インターフェロン抗体は、インターフェロンの易動度に
相当する部分にのみ特異的なブロットを示した。この方
法によって、ヒト白血球インターフェロンにのみ特異的
反応する抗体を得た。この抗体がセンダイウイルス刺激
白血球培養液に存在する全ての亜種を漏らさず認識する
かどうか実施例３に示した実験によって検討した。
〔実施例３〕 実施例２で得た抗体を用いて、酸素抗体法をおこなっ
た。馬抗インターフェロン抗体を0.1μg/mlに希釈し
た。希釈は、PBSで行った。96穴プレート（ヌンク社）
の各穴に0.1mlずつ分注し37℃にて１時間保持した。プ
レートを転倒して内容物を廃棄したのち、各穴に１％の
牛血清アルブミン（シグマ社）を含むPBS（APBS）を250
μｌずつ加え30分間37℃に保持した。このプレートの各
穴に下記のHPLCの溶出液をカラム保持時間順に分取し
た。HPLCにあたって、C18カラム（HiPore RP−318、バ
イオラッド）に3000万単位のヒト白血球インターフェロ
ンを0.1％のトリフルオロ酢酸（和光純薬）存在下で負
荷し、次いでアセトニトリル（和光純薬）で25％75％の
勾配をもって溶出した。次いで各穴を250μｌの0.05％
の界面活性剤（tween20、バイオラッド）をふくむPBS
（TPBS）で３回ずつ洗浄した。その後各穴に山羊抗イン
ターフェロン抗体をAPBSを用いて0.1μg/mlに希釈し0.1
mlずつ分注した。37℃にて１時間保持した。TPBSで３回
洗浄したのちAPBS中に1000倍希釈したペルオキシダーゼ
標識抗山羊イムノグロブリンＧ（カッペル社）を分注し
37℃にて１時間保持した。TPBSで洗った後バイオラッド
社製ペルオキシダーゼ基質キットを用いて発色した。そ
のパターンを第２図に示した。参考として、同様に分取
したもののインターフェロン活性（抗ウイルス活性）の
パターンを第３図に示した。抗ウイルス活性は、FL細
胞、VSVを用いたダイアプテイク法で測定した。この結
果、抗ウイルス活性を示すすべてのピークが本発明に記
載の方法で得た抗体を用いた酵素抗体法で検出されるこ
とが明らかになった。
た。馬抗インターフェロン抗体を0.1μg/mlに希釈し
た。希釈は、PBSで行った。96穴プレート（ヌンク社）
の各穴に0.1mlずつ分注し37℃にて１時間保持した。プ
レートを転倒して内容物を廃棄したのち、各穴に１％の
牛血清アルブミン（シグマ社）を含むPBS（APBS）を250
μｌずつ加え30分間37℃に保持した。このプレートの各
穴に下記のHPLCの溶出液をカラム保持時間順に分取し
た。HPLCにあたって、C18カラム（HiPore RP−318、バ
イオラッド）に3000万単位のヒト白血球インターフェロ
ンを0.1％のトリフルオロ酢酸（和光純薬）存在下で負
荷し、次いでアセトニトリル（和光純薬）で25％75％の
勾配をもって溶出した。次いで各穴を250μｌの0.05％
の界面活性剤（tween20、バイオラッド）をふくむPBS
（TPBS）で３回ずつ洗浄した。その後各穴に山羊抗イン
ターフェロン抗体をAPBSを用いて0.1μg/mlに希釈し0.1
mlずつ分注した。37℃にて１時間保持した。TPBSで３回
洗浄したのちAPBS中に1000倍希釈したペルオキシダーゼ
標識抗山羊イムノグロブリンＧ（カッペル社）を分注し
37℃にて１時間保持した。TPBSで洗った後バイオラッド
社製ペルオキシダーゼ基質キットを用いて発色した。そ
のパターンを第２図に示した。参考として、同様に分取
したもののインターフェロン活性（抗ウイルス活性）の
パターンを第３図に示した。抗ウイルス活性は、FL細
胞、VSVを用いたダイアプテイク法で測定した。この結
果、抗ウイルス活性を示すすべてのピークが本発明に記
載の方法で得た抗体を用いた酵素抗体法で検出されるこ
とが明らかになった。
〔実施例４〕 予め分取しておいた白血球インターフェロン由来の亜
種をPBS中に各５μg/mlに希釈し96穴プレートの各穴に1
00μｌずつ分注した。37℃で１時間保持することによっ
て固定した。各穴に150μｌのAPBSを分注し30分間37℃
に保持し、非特異的吸着をブロックした。TPBSで洗浄
後、抗インターフェロン抗体の存在が確認された患者血
清をAPBS中に100倍希釈したのち、各穴に100μｌずつ分
注した。対照として馬抗インターフェロン抗体をAPBS中
に0.1μg/mlに希釈したのち100μｌずつ分注した。37℃
で１時間保持したのちTPBSで洗浄し、TPBS中に1000倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトイムノグ
ラブリンＧを100μｌずつ各穴に加えた。対照の穴にはA
PBS中に1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標
識抗馬イムノグロブリンＧ（バイオシス、フランス）を
100μｌずつ加えた。１時間37℃に保持したのちTPBSで
洗浄し、バイオラッド社アルカリフォスファターゼ基質
キットを用いて発色させた。その結果を第４図に示し
た。
種をPBS中に各５μg/mlに希釈し96穴プレートの各穴に1
00μｌずつ分注した。37℃で１時間保持することによっ
て固定した。各穴に150μｌのAPBSを分注し30分間37℃
に保持し、非特異的吸着をブロックした。TPBSで洗浄
後、抗インターフェロン抗体の存在が確認された患者血
清をAPBS中に100倍希釈したのち、各穴に100μｌずつ分
注した。対照として馬抗インターフェロン抗体をAPBS中
に0.1μg/mlに希釈したのち100μｌずつ分注した。37℃
で１時間保持したのちTPBSで洗浄し、TPBS中に1000倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒトイムノグ
ラブリンＧを100μｌずつ各穴に加えた。対照の穴にはA
PBS中に1000倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標
識抗馬イムノグロブリンＧ（バイオシス、フランス）を
100μｌずつ加えた。１時間37℃に保持したのちTPBSで
洗浄し、バイオラッド社アルカリフォスファターゼ基質
キットを用いて発色させた。その結果を第４図に示し
た。
〔発明の効果〕 本発明によればヒト白血球インターフェロンの亜種す
べてを認識する抗血清およびポリクローナル抗体、なら
ばにそれを用いた試料中の該亜種およびその抗体の簡易
な測定および分析法が提供される。
べてを認識する抗血清およびポリクローナル抗体、なら
ばにそれを用いた試料中の該亜種およびその抗体の簡易
な測定および分析法が提供される。
第１図は実施例２において、部分精製白血球インターフ
ェロンをSDSゲル電気泳動したのち、ゲル上の蛋白をニ
トロセルロース膜に電気的に移行して、ウエスタンブロ
ッティングを実施した結果を示す。Ａは馬抗ヒト白血球
インターフェロン血清、Ｂは精製馬抗ヒト白血球インタ
ーフェロン抗体を用いて実施した。それぞれ、レーン１
は還元、レーン２は非還元条件で泳動した。 第２図、第３図は実施例３の試験結果を示すグラフで、
第２図は本発明の抗体により測定されたヒト白血球イン
ターフェロンのHPLC各分画のピーク、第３図は同各分画
のインターフェロン活性のピークをそれぞれ示してい
る。 第４図は実施例４において、予め分取しておいたインタ
ーフェロンの各亜種を用いて抗インターフェロン抗体陽
性の患者血清を酵素抗体法で試験した結果を示すグラフ
である。
ェロンをSDSゲル電気泳動したのち、ゲル上の蛋白をニ
トロセルロース膜に電気的に移行して、ウエスタンブロ
ッティングを実施した結果を示す。Ａは馬抗ヒト白血球
インターフェロン血清、Ｂは精製馬抗ヒト白血球インタ
ーフェロン抗体を用いて実施した。それぞれ、レーン１
は還元、レーン２は非還元条件で泳動した。 第２図、第３図は実施例３の試験結果を示すグラフで、
第２図は本発明の抗体により測定されたヒト白血球イン
ターフェロンのHPLC各分画のピーク、第３図は同各分画
のインターフェロン活性のピークをそれぞれ示してい
る。 第４図は実施例４において、予め分取しておいたインタ
ーフェロンの各亜種を用いて抗インターフェロン抗体陽
性の患者血清を酵素抗体法で試験した結果を示すグラフ
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−13156（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−72722（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500864（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/531
Claims (10)
- 【請求項１】センダイウイルスで刺激したヒト白血球の
培養物を粗材料として得られる部分精製ヒト白血球イン
ターフェロンで免疫した動物の血清を、ヒト白血球培養
液濃縮物を固定化したカラムに通過させ、その通過液を
部分精製インターフェロンを固定化したカラムに通して
抗ヒト白血球インターフェロン抗体を吸着させ、カラム
を洗ったのち、該抗体を溶出する事を特徴とするヒト白
血球インターフェロンの亜種すべてを認識するポリクロ
ナール抗体の製造法。 - 【請求項２】請求項１の方法で得られたポリクロナール
抗体を試料に作用させることを特徴とする試料中のヒト
白血球インターフェロンの亜種の測定法。 - 【請求項３】酵素抗体法を用いて実施される請求項２記
載の測定法。 - 【請求項４】白血球インターフェロンがリンパ芽球型イ
ンターフェロンである請求項２記載の測定法。 - 【請求項５】白血球インターフェロンが組換え型インタ
ーフェロンαである請求項２記載の測定法。 - 【請求項６】白血球インターフェロンが組換え型インタ
ーフェロンαである請求項３記載の測定法。 - 【請求項７】酵素抗体法がサンドイッチ法である請求項
３記載の測定法。 - 【請求項８】２種の動物を免疫して得られる請求項１記
載のポリクロナール抗体を用いてサンドイッチ法で実施
する請求項３または６記載の測定法。 - 【請求項９】試料がカラムクロマトグラフによって分画
されたものである請求項２記載の測定法。 - 【請求項１０】カラムクロマトグラフが逆相高速液体ク
ロマトグラフィーである請求項８記載の測定法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1320275A JP2888443B2 (ja) | 1989-12-07 | 1989-12-07 | ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 |
| US07/621,825 US5240864A (en) | 1989-07-12 | 1990-12-04 | Method of assaying or analyzing subtypes of human leukocyte interferons or their antibodies, and antibodies to be used therefor |
| CA002031450A CA2031450A1 (en) | 1989-12-07 | 1990-12-04 | Method of assaying or analyzing subtypes of human leukocyte interferons or their antibodies, and antibodies to be used therefor |
| EP90313285A EP0431950A1 (en) | 1989-12-07 | 1990-12-07 | Assaying interferons |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1320275A JP2888443B2 (ja) | 1989-12-07 | 1989-12-07 | ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03179262A JPH03179262A (ja) | 1991-08-05 |
| JP2888443B2 true JP2888443B2 (ja) | 1999-05-10 |
Family
ID=18119686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1320275A Expired - Fee Related JP2888443B2 (ja) | 1989-07-12 | 1989-12-07 | ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5240864A (ja) |
| EP (1) | EP0431950A1 (ja) |
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| CA (1) | CA2031450A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
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|---|---|---|---|---|
| HU222980B1 (hu) * | 1998-03-13 | 2004-01-28 | Acapi, Alpha-Chem Advanced Pharmaceutical Industries S.A.E. | Eljárás humán Alfa-interferon előállítására |
| US7087726B2 (en) | 2001-02-22 | 2006-08-08 | Genentech, Inc. | Anti-interferon-α antibodies |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU201100B (en) * | 1988-03-04 | 1990-09-28 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | Process for large-scale production of high purity human leukocyte alpha interferon with reduced endotoxin content and with improved therapeutic effect |
-
1989
- 1989-12-07 JP JP1320275A patent/JP2888443B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1990
- 1990-12-04 US US07/621,825 patent/US5240864A/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-12-04 CA CA002031450A patent/CA2031450A1/en not_active Abandoned
- 1990-12-07 EP EP90313285A patent/EP0431950A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5240864A (en) | 1993-08-31 |
| JPH03179262A (ja) | 1991-08-05 |
| EP0431950A1 (en) | 1991-06-12 |
| CA2031450A1 (en) | 1991-06-08 |
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |