JPH03179262A - ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト白血球由来のインターフェロンの亜種およ
びその亜種（二対する抗体を簡便に測定し、分析する方
法およびそれ（こ用いる材料に関する。

〔従来の技術〕

ヒト白血球インターフェロンは、ヒトインターフェロン
−ａとも称され、抗ウィルス作用、抗％ｆ＋傷作用が知
られており、臨床応用が開始されている。近年実用化さ
れてきた遺伝子工学もいち早く応用され、インターフェ
ロンの遺伝子の解析が、飛躍的（こ進められた。ヒトイ
ンターフェロンは、産生細胞や物理化学的性質の違いか
らα、β、γの３種類（二分類されている。βに関して
は２種の、γインターフェロンくこ関しては、それぞれ
一種の分子種が報告されている。それらのインターフェ
ロンとは対照的にα型インターフェロンには、２０種以
上のきオ）めで多様な亜種（サブタイプ）が存在するこ
とが知られており（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ｅｔａｌ　１９８
０　Ｎａｔｕｒｅ　２８７：４１１＝　　Ｉ’ｅｓｔｋ
ａ　ｅｔ　ａ１１９８７　　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅ
ｗ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５６：７２７）、
本インターフェロンを実用化する（二当り検討が進めら
れてきた。しかし、その分析方法は、各亜種を高純度に
精製しアミノ酸配列を決定するというきわめて煩雑な方
法であった（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ　１９
７９　　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７６：６４０−）。

それぞれの亜種は、共通のアミノ酸配列を有しているも
のの、それぞれ部分的に異なっており、独立した遺伝子
の産物であることが明かにされている。それらは活性発
現に当たって種特異性、抗ウィルス活性のスペクトラム
などｔこも異なった特徴を有しており、生体内でもなん
らかの形で生理活性を分担しあい、あるいは協調しあっ
ていることが予測されている。

しかし、生体内で亜種の遺伝子の全てが発現していると
は考えがたく、活性の解析にあたって、蛋白としての亜
種の分布の分析は重要な課題であるが、簡便な分析法が
ない故にこの分野の知見は、きわめて限られたものであ
る（Ａｃｌｏｌｆ　ｅｔ　ａ１１９８７　　Ｊ、　Ｇｅ
ｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８ニア６６９）。さらに、近年
遺伝子工学（こまって生産された（組換え型）α型イン
ターフェロンの人体への使用の開始後、抗インターフェ
ロン中和抗体の惹起が高い頻度で観察されている。

〔発明の解決しようとする課題〕

組換え型のインターフェロンがその性格上、１つの亜種
によって構成されており、この種の抗体の出現は、投与
されたインターフェロンの効力を失わせると考えられ、
臨床応用上きわめて重大な問題である。また、この種の
抗体が、人体自体がその防御機構の一環として産するイ
ンターフェロン活性を中和すると考えられ、全く新たな
問題を提起している。しかし効果的な抗体評価法がない
故に知見は蓄積されていない。以上のように、基礎科学
の立場からも臨床する立場からも、簡便で迅速な亜種組
成、抗体の分析法の開発が待ち望まれている。天然に存
在する全ての亜種を分析する目的では、全ての亜種を含
む部分精製インターフェロンを抗原として、抗体を作製
しなければならない。抗体の作製に当たって、サンドイ
ンチ型酵素抗体法による分析法を２抗体法によって確立
するためには、２種の動物を免疫することが好ましいが
、１種の動物で抗体を作製し、その一部を直接酵素標識
し、サンドイッチすることも可能である。いずれにして
も得られた抗体は、全ての亜種を認識できるポリクロー
ナル抗体でなければならない。この目的のために各亜種
に対する単クローナル抗体を適当に混合して用いること
も可能だが、それらの抗体を産生ずるハイブリドーマを
確立することは、困難である。それは、１）すべての亜
種を相当量単離精製し、２）それぞれ細胞融合を行った
上で、３）産生細胞をスクリーニングしなければならな
い上、得られる抗体は各亜種の蛋白の１抗原決定部位を
認識するだけであり、Ｗｉ量Ｇこしか含まれていない亜
種は、見逃してしまう可能性が高いなどの欠点があるか
らである。抗白血球インターフェロンポリクローナル抗
体の場合、精製試料中に含まれる不純物に対する抗体の
混入が考えられ、絶対に避けなければならない課題であ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、部分精製されたヒト白血球インターフェ
ロン中に、精製前の白血球培養液（粗インターフェロン
液）に存在する亜種の全てが存在することを見いだし、
これを抗原として抗体を作製した。さらに得られた抗体
を吸収、精製することによって、インターフェロンの亜
種は、すべて認識するがそれ以外の抗原はいっさい認識
しないきわめて特異性の高い抗白血球インターフェロン
抗体が得られることを見出した。つぎに、本発明者らは
、きわめて簡単で、効率よくインターフェロンの亜種を
分別できる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ
）の方法を確立した。そして、これらの方法を組み合わ
せて、酵素抗体法を実施したところ、生物活性と同様の
亜種組成をきわめて簡単に検出しうろことを明らかにし
、本発明を完成することができた。本発明は、センダイ
ウィルスで刺激したヒト白血球の培養物からえられる部
分精製ヒト白血球インターフェロンで動物を免疫し、そ
の血清を採取する事を特徴とするヒト白血球インターフ
ェロンの亜種すべてを認識する抗血清の製造法、ヒト白
血球培養液濃縮物を固定化したカラムに上記の方法で得
られた抗血清を通過させ、その通過液を、部分精製ヒト
白血球インターフェロンを固定化したカラムに通して抗
ヒト白血球インターフェロン抗体を吸着させ、カラムを
洗ったのち、該抗体を溶出することを特徴とするヒト白
血球インターフェロンの亜種すべてを認識するポリクロ
ーナル抗体の製造法およびカラムクロマトグラフィーに
よって分取した白血球インターフェロン亜種を用いて抗
原抗体反応により試料中の該亜種に対する抗体を検出す
る事を特徴とする該抗体の分析方法である。

ヒト白血球を適当な培地（例えばハムＦ１２培地）中に
懸濁し、この懸濁液にセンダイウィルスを適当ｊｌ（５
０−２００ＨＡ）添加して培養すれば粗インターフェロ
ン液が得られる。これは公知の方法で行い得る。（Ｃａ
ｎｔｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、　　１９８ｔＭｅｔｈｎｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　７８　：２９−）。ラ
イで粗インターフェロンをさらに、酸性条件下でのロダ
ン酸カリウム沈澱法、エタノール沈澱法の組合せよりな
る方法（Ｃａｎｔｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ　１ｂｉｄ：４Ｈ
−）により精製して部分精製白血球インターフェロンを
得ることができる。

かくして得た部分精製インターフェロンで動物を免疫す
るとその血清としてヒト白血球インターフェロンの亜種
すべてに対する抗体を含む抗血清が得られる。このよう
なポリクローナル抗体中に含まれる不純物に対する抗体
の除去はきわめて困難な課題であったが、不純物固定化
（モック）カラムおよびインターフェロン固定化カラム
を用いた親和性クロマトグラフィーを行い特異性をあげ
ることによって解決できることが判った。

本発明においては、上記のようにして得られた抗血清を
、ヒト白血球培養液の濃縮物を固定化したカラムに通過
させて不純物に対する抗体を除去し、ついで通過液を上
記の部分精製ヒト白血球インターフェロンを固定化した
カラムに通して抗ヒト白血球インターフェロン抗体をカ
ラムに吸着させ、カラムを洗浄し、続いて該抗体を溶出
する。

溶出には、たとえば、０．１　Ｍクエン酸−０，５Ｍ食
塩からなる緩衝液を用いることができる。得られた抗体
は、型どうりプロティンＡセファロースなどをもちいて
精製することができる。サンドイッチ法を用いて白血球
インターフェロンの亜種組成を解析する場合、まず白血
球インターフェロンを分画しなければならない。そのた
めには、種々のクロマトグラフを応用できるが、逆相系
のカラムを用いたＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃがもっとも分離がよく
再現性、迅速性もふくめで最適である。簡便に試験しよ
うとする場合、例えば、予め抗白血球インターフェロン
抗体（抗体Ａ、例えば馬抗体）を９６穴マイクロプレー
トにコートし、１％牛血清アルブミン液などの高濃度蛋
白液を適当量分注しておく。このようにして準備したプ
レートの各穴中に、カラムからの溶出液を保持時間に応
じて各分画を分取する。適当な時間をおいてプレートを
洗った後、コートした際に用いた抗体とは別の種の動物
より得た抗体（抗体Ｂ、例えば山羊抗体）の希釈液と反
応させる。再度プレートを洗浄したのち、酵素で標識さ
れた、抗体Ｂに対する抗体と反応させるこの操作の後に
、インターフェロンの亜種のいずれかが存在する分画を
含む六番こは酵素活性が検出されるようになる。酵素活
性の強さは、発色の度合として測定できる。そのままプ
レート中に基質を添加し発色させた後、プレートリーダ
ーを用いて、迅速に測定することもできる。発色の程度
をカラムからの溶出時間に対してグラフを作製すること
によって、亜種の存在のパターンを容易（こ解析できる
ばかりでなく、その比率を迅速、簡便にそして定量的に
分析することも可能である。また抗体Ｂに、患者血清を
用い、ついで酵素標識した抗ヒトイムノグロブリンある
いはプロティンＡを用いて処理することによって、患者
血清中の抗体の存在そしてその特異性を容易に解析でき
る。

〔実施例１〕 採血後４８時間以内の新鮮血をｌＬ６００　ｒｐｍで１
０分間遠心し、得られた白血球層（バフィーコート）を
回収した。混入する赤血球を、９倍量の冷塩化アンモン
溶液（０，８３％）を加えることにより溶血させた後、
遠心し沈澱として、精製白血球を得た。本白血球を培地
中に１０個／ｍｌの濃度に懸濁した。培地は、４％のガ
ンマグロブリン除去ヒト血清、５０μ９／ｍｌのゲンタ
マイシンを添加した、ハムＦ−１２倍地（フロー社）を
用いた。本ヒト新鮮白血球浮遊液に最終濃度が１００　
ＨＡ／ｍｌになるようにセンダイウィルスを添加したの
ち、３７℃で２時間培養した。そののち温度を２８℃に
下げ一晩培養を続けた。本倍養液を遠心分離し得られた
上清には、５００００国際単位／　ｍ　１から、２１１
００００国際単位／　ｍ　１のインターフェロン（１０
国際単位／　ｍ　ｙ蛋白）が含まれており、これを粗イ
ンターフェロン液とした。木組インターフェロンＩＱＯ
Ｌに最終濃度が０５モルになるようにロダン酸カリウム
（和光紬薬）を添加し、ｐ　Ｈ５，５に調整することに
よって沈澱を得た。この沈澱物に２０Ｌの９５％冷エタ
ノールを添加し、ブレンダーで激しく撹拌することによ
り、沈澱中のインターフェロンを抽出した。ｐ■■５５
でインターフェロン以外の蛋白、とくにアルブミンを沈
澱させ、遠心分離により除いた後、上清をｐＨ１８，０
に調整しインターフェロンの沈澱を得た。本沈澱をダル
ベツコ−処方りん酸緩衝生理食塩液（ｐＴ−Ｉ　７．４
　’）に溶解し、収率３０〜８０％で部分精製インター
フェロン液を得た（１０国際単位／ｍｆ蛋白）。かくし
て得た部分精製ヒト白血球インターフェロンを山羊及び
馬に投与して免疫した。免疫にあたって、−Ｑｏの投与
量は２×１０　単位とし、完全アジュバントを用いてエ
マルジョンにした上で、毎週皮下に注射した。３力月連
続して投与したのち、最終同番こ２×１０　単位を投与
し、その１週間後（こ採血し血清を得た。得られた抗血
清の抗体価は表１に示す通りであった。

第 表 馬 血 清 容量 （ｍｌ） 中和価　蛋白量 （／ｍ　１　）　（ｍｆ／ｍ　ｌ） 容量 山羊血清 中和価　蛋白量 血 清 ００ ｓｏ、ｏｏ。

０ ３０ ６０．０００ 不純物カラム 通過部 ８０ ＋５．（１００ ５０ １８，０００ インターフェロン カラム溶出部 ５ ２５０．０００ ８ ５ ３１０．０００ 中和価は１００単位／　ｍ　ｌのインターフェロン活性
を１０単位／ｍｌ　Ｇこ減弱できる抗体液の希釈倍率と
した。

〔実施例２〕 白血球インターフェロンにきわめて特異性の高い抗血清
を得るため以下の処理を行った。センダイウィルスを添
加せずそのほかの処理は、実施例１における粗インター
フェロン液調製時と同様に行って大白血球の培養液をえ
た。本培養液を濃縮シタノち（５ｍｇＡｍｌ）、２０ｍ
１　のブロムシアン活性化セファロース（ファルマシア
）に固定化し、カラム（径１．５　Ｃｍ　Ｘ長さ１０Ｃ
ｍ）　　に充填した。

このカラム（モックカラム）を燐酸緩衝生理食塩液（Ｐ
ＢＳ）で緩衝化したのち、実施例１で得た各抗血清を通
過させた。この操作で、インターフェロン以外の抗原に
対する抗体をカラムに吸着させることによって除去した
。次に、前述と同様の操作で部分精製インターフェロン
を固定化したセファロースのカラムを作製した。本カラ
ムをＰＢＳで緩衝化したのちにこれに上記のモツクカラ
ム通過液を負荷した。カラムをＰＢＳでよく洗ったのち
、吸着した抗インターフェロン抗体を、０１Ｍクエン酸
−０，５Ｍ食塩からなる溶出液で溶出した。この操作に
よって、白血球培養液に由来しない抗原に対する抗体蛋
白を除去した上、抗インターフェロン抗体を濃縮した。

得られた抗体の特異性を型のごとくウェスタンプロティ
ング法（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ　１９７６　　Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　７６：４３５０−）　　により検定
した。その結果を第１図に示した。精製後の抗インター
フェロン抗体は、インターフェロンの易動度に相当する
部分にのみ特異的なプロットを示した。この方法によっ
て、ヒト白血球インターフェロンにのみ特異的反応する
抗体を得た。この抗体がセンダイウィルス刺激白血球培
養液に存在する全ての亜種を漏らさず認識するかどうか
実施例３に示した実験によって検討した。

〔実施例３〕 実施例２で得た抗体を用いて、酵素抗体法をおこなった
。馬抗インターフェロン抗体を０．１μｇ／ｍｌ　　に
希釈した。希釈は、ＰＢＳで行った。

９６穴プレート（ヌンク社）の各式にＱ、ｉｍｌずつ分
注し３７℃にて１時間保持した。プレートを転倒して内
容物を廃棄したのち、各式に１％の牛血清アルブミン（
シグマ社）を含む１’ＢＳ（ＡＩ’ＢＳ）を２５０μｍ
ずつ加え３０分間３１℃に保持した。このプレートの各
式に下記のＨＰ　Ｌ　Ｃの溶出液をカラム保持時間順に
分取した。ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃにあたって、０１８カラム
（ＨｉＰｏｒｅ　ＲＰ−３１８、バイオラッド）に３０
００万単位のヒト白血球インターフェロンを０．１％の
トリフルオロ酢酸（和光補薬）存在下で負荷し、次いで
アセトニトリル（和光補薬）で２５％−７５％の勾配を
もって溶出した。次いで各式を２５０μｌの０．０５％
の界面活性剤（ｔｗｅｅｎ　２０、バイオラッド）をふ
くむＰＢＳ　（ＴＩ’ＢＳ　）で３回ずつ洗浄した。そ
の後金穴に山羊抗インターフェロン抗体をＡＰＢＳを用
いて０．１μｆ／ｍ１に希釈し０．１ｍｌずつ分注した
。３７℃にて１時間保持した。ＴＰＢＳで３回洗浄した
のちＡＰＢＳ中に１０００倍希釈したペルオキシダーゼ
標識抗山羊イムノグロブリンＧ（カッベル社）を分注し
３７℃にて１時間保持した。ＴＩ’ＢＳで洗った後バイ
オラッド社製ペルオキシダーゼ基質キットを用いて発色
した。そのパターンを第２図に示した。参考として、同
様に分取したもののインターフェロン活性（抗ウィルス
活性）のパターンを第３図に示した。抗ウィルス活性は
、ＦＬ細胞、■Ｓ■を用いたダイアブティク法で測定し
た。この結束、抗ウィルス活性を示すすべてのピークが
本発明に記載の方法で得た抗体を用いた酵素抗体法で検
出されることが明らかになった。

〔実施例４〕 予め分取しておいた白血球インターフェロン由来の亜種
をＰＢＳ中に各５μｆ／ｍｌに希釈し９６穴プレートの
各式に１００μｌずつ分注した。

３７℃で１時間保持することによって固定した。

各式に１５０μｍのＡＰＢＳを分注し３０分間３７℃に
保持し、非特異的吸着をブロックした。

ＴＰＢＳで洗浄後、抗インターフェロン抗体の存在が確
認された患者血清をＡＰＢＳ中に１００倍希釈したのち
、各式に１００μｌ　ずつ分注した。

対照として馬抗インターフェロン抗体をＡＰＢＳ中に０
．１μｆ／　ｍ　１に希釈したのち１００μｍずつ分注
した。３７℃で１時間保持したのちＴＰＢＳで洗浄し、
ＡＰＢＳ中をこ１０００倍に希釈したアルカリフォスフ
ァターゼ標識抗ヒトイムノグロブリンＧを１００μｍず
つ各式に加えた。対照の穴にはＡＰＢＳ中に１０００倍
に希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗馬イムノグ
ロブリンＧ（バイオシス、フランス）を１００μｌずつ
加えた。１時間３７℃に保持したのちＴＰＢＳで洗浄し
、バイオラッド社アルカリフォスファターゼ基質キット
を用いて発色させた。その結果を第４図に示した。

〔発明の効果〕

本発明によればヒト白血球インターフェロンの亜種すべ
てを認識する抗血清およびポリクローナル抗体、ならび
にそれを用いた試粕中の該亜種およびその抗体の簡易な
測定および分析法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２において、部分精製白血球インターフ
ェロンをＳＤ８ゲル電気泳動したのち、ゲル上の蛋白を
ニトロセルロース膜に電気的に移行して、ウェスタンブ
ロッティングを実施した結果を示す。Ａは馬抗ヒト白血
球インターフェロン血清、Ｂは精製馬抗ヒト白血球イン
ターフェロン抗体を用いて実施した。それぞれ、レーン
１は還元、レーン２は非還元条件で泳動した。 第２図、第３図は実施例３の試験結果を示すグラフで、
第２図は本発明の抗体により測定されたヒト白血球イン
ターフェロンのＨＰ　Ｌ　Ｃ各分画のピーク、第５図は
同各分画のインターフェロン活性のピークをそれぞれ示
している。 第４図は実施例４において、予め分取しておいたインタ
ーフェロンの各亜種を用いて抗インターフェロン抗体陽
性の患者血清を酵素抗体法で試験した結果を示すグラフ
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　センダイウイルスで刺激したヒト白血球の培養物を
   粗材料として得られる部分精製ヒト白血球インターフェ
   ロンで動物を免疫し、その血清を採取することを特徴と
   するヒト白血球インターフェロンの亜種すべてを認識す
   る抗血清の製造法。 ２　ヒト白血球培養液濃縮物を固定化したカラムに請求
   項１の方法で得られた抗血清を通過させ、その通過液を
   部分精製インターフェロンを固定化したカラムに通して
   抗ヒト白血球インターフェロン抗体を吸着させ、カラム
   を洗ったのち、該抗体を溶出する事を特徴とするヒト白
   血球インターフェロンの亜種すべてを認識する抗体の製
   造法。 ３　請求項２の方法で得られたポリクローナル抗体を試
   料に作用させることを特徴とする試料中のヒト白血球イ
   ンターフェロンの亜種の測定法。 ４　酵素抗体法を用いて実施される請求項３記載の測定
   法。 ５　白血球インターフェロンがリンパ芽球型インターフ
   ェロンである請求項３記載の測定法。 ６　白血球インターフェロンが組換え型インターフェロ
   ンαである請求項３記載の測定法。 ７　酵素抗体法がサンドイッチ法である請求項４記載の
   測定法。 ８　２種の動物を免疫して得られる請求項２記載のポリ
   クローナル抗体を用いてサンドイッチ法で実施する請求
   項４または１記載の測定法。 ９　試料がカラムクロマトグラフによって分画されたも
   のである請求項３記載の測定法。 １０　カラムクロマトグラフが逆相高速液体クロマトグ
   ラフィーである請求項９記載の測定方法。 １１　カラムクロマトグラフによって分画した白血球イ
   ンターフェロンの亜種を抗白血球インターフェロンポリ
   クローナル抗体に作用させることを特徴とする該ポリク
   ローナル抗体の分析方法。 １２　抗白血球インターフェロンポリクローナル抗体が
   酵素標識されている請求項１１記載の分析方法。 １３　試料が患者血清である請求項１１記載の分析法。