HU222980B1 - Eljárás humán Alfa-interferon előállítására - Google Patents
Eljárás humán Alfa-interferon előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU222980B1 HU222980B1 HU9800554A HUP9800554A HU222980B1 HU 222980 B1 HU222980 B1 HU 222980B1 HU 9800554 A HU9800554 A HU 9800554A HU P9800554 A HUP9800554 A HU P9800554A HU 222980 B1 HU222980 B1 HU 222980B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- interferon
- hours
- culture
- sendai virus
- cells
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims abstract description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 11
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 6
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 4
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 claims abstract 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 claims abstract 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 claims description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 3
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 claims description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 claims description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 2
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 claims 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 abstract description 19
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 abstract description 19
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 abstract description 18
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 4
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 230000001492 haemagglutinating effect Effects 0.000 description 3
- 230000011488 interferon-alpha production Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 108010001779 Ancrod Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- SKZKKFZAGNVIMN-UHFFFAOYSA-N Salicilamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1O SKZKKFZAGNVIMN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000306 component Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás természetes humán alfa-interferonelőállítására emberi vérből, ammónium-kloridos hemolízissel éspufferelt fiziológiás sóoldatos mosással történő tisztítással, majdtápoldatban történő szuszpen- dálással és Sendai-vírussal valóindukcióval. A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy az emberivérből a fehérvérsejteket leukoforézissel elkülönítik, ismert módontisztítják, ezután a fehérvérsejteket ismert tápoldatbanszuszpendálják és tenyésztik, majd a tenyészet hőmérsékletét 30–40 °C-ra állítják be és kezelik 10–1000 NE/ml ?-interferonnal, ?-interferonnal vagy ?-interfe- ronnal, folytatják a tenyésztést 30–40°C-on 0,5–6 órán keresztül, ezután a tenyészetet első adagként 10–1000 hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírussal inkubálják, majdfolytatják a tenyésztést 0,5–3 órán keresztül, és a tenyészethőmérsékletét 28–30 °C-ra, előnyösen 30 °C-ra csökkentik, ésfolytatják az inkubálást 6–36 óráig, majd a tenyészethez egy másodikadag 10–1000 hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírust adagolnak,ezután a sejteket ismert módon elkülönítik, majd a felülúszó pH-ját1,5–2,5-re savasra, előnyösen pH 2,0-re állítják be. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás természetes humán alfa-interferon előállítására emberi vérből, ammónium-kloridos hemolízissel és puffereit fiziológiás sóoldatos mosással történő tisztítással, majd tápoldatban történő szuszpendálással és Sendai-vírussal való indukcióval.
A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy az emberi vérből a fehérvérsejteket leukoforézissel elkülönítik, ismert módon tisztítják, ezután a fehérvérsejteket ismert tápoldatban szuszpendálják és tenyésztik, majd a tenyészet hőmérsékletét 30-40 °C-ra állítják be és kezelik 10-1000 NE/ml a-interferonnal, β-interferonnal vagy γinterferonnal, folytatják a tenyésztést 30-40 °C-on 0,5-6 órán keresztül, ezután a tenyészetet első adagként 10-1000 hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírussal inkubálják, majd folytatják a tenyésztést 0,5-3 órán keresztül, és a tenyészet hőmérsékletét 28-30 °C-ra, előnyösen 30 °C-ra csökkentik, és folytatják az inkubálást 6-36 óráig, majd a tenyészethez egy második adag 10-1000 hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírust adagolnak, ezután a sejteket ismert módon elkülönítik, majd a felülúszó pH-ját 1,5-2,5-re savasra, előnyösen pH 2,0re állítják be.
A leírás terjedelme 4 oldal
HU 222 980 B1
HU 222 980 Bl
A találmány tárgya eljárás természetes humán alfa-interferon előállítására.
A természetes emberi alfa-interferon kis molekulasúlyú (18-26 kD) fehéqék fiziológiás arányú keveréke (Goren et. al.: J. Interferon Rés., 6. pp 323-329, 1986). Ez a keverék számos különböző biológiai aktivitással rendelkezik. Egyebek között ismeqük antivirális (von Wussow & Jakschies: in: Interferoné., ed.: Niederle & von Wussow, Springer-Verlag, Berlin, pp. 79-91,1990), antibakteriális [Bukholm et al.: Antivir. Rés., 1984 Abstr. 1 (3), p 70; Niesel et al.: J. Interferon Rés., 9 (Suppl. 2.), p S223, 1989], sejtosztódást gátló (Samid: Interferons and Cytokines, 11, pp 38-40,1989, Clemens & McNurlan: J. Biochem., 226, pp 345-360,1985), immunműködést stimuláló (Maudsley et al.: Immuné Responses, Vírus Infections and Disease, pp 15-33, ed.: Dimmock & Minor, IRL Press, Oxford, 1989; Vilcek & DeMayer eds.: Interferon 2; Interferons and the Immuné System, Elsevier Science Publishers, 1984; Virelizer: in: Immuné Responses, Vírus Infections and Disease, pp 1-14, ed.: Dimmock & Minor, IRL Press, Oxford, 1989) és gyulladásgátló (Lemmel & Obert: J. Interferon Rés., 11 (suppl. 1), p S76, 1991; Lemmel et al.: Rheumatology, 7, pp 127-132, 1987; Mécs et al.: in: Abstracts of the ARES Serono Symposium on the Interferon System, p 122,1985) hatásait.
A felsorolt sajátságok alapján az emberi interferont terápiás anyagként alkalmazzák vírusfertőzések [Eddleston & Dixon, eds.: Interferons in the Treatment of Chronic Vírus Infection of the Liver, Pennine Press, Macclesfield, 1990; Levin et al.: Israel J. Med. Sci., 25, pp 364-372; Arvin et al.; J. Infect. Dis., 133 (Suppl.) pp A205-A210, 1976], daganatos megbetegedések (Spiegel: Cancer, 59, pp 626-631, 1987; Roberts: Br. Med. I, 305, pp 1243-1244, 1992; Goldstein & László: Cancer Rés., 46, pp 4315-4329,1986) és autoimmun eredetű gyulladások [Fierlbeck & Rassner: J. Interferon Rés., 9 (Suppl. 2), p S221, 1989; Boccara et al.: J. Interferon Rés., 11 (Suppl. 1.), p S242, 1991; Facon et al.: Br. J. Haematol., 82, p 464, 1991], valamint egyéb módon nem vagy nehezen kezelhető bakteriális fertőzések [Badara et al.: J. Interferon Rés., 9 (Suppl. 2.), p S134,1989; Káplán et al.: J. Interferon Rés., 9 (Suppl. 2.), p S133, 1989; Gauci: Interferons Today and Tomorrow, 8, pp 37-38, 1988] gyógyításában.
Ismeretes, hogy emberi leukocitákban vírusokkal vagy kettős szálú RNS-sel indukálva alfa-interferon (IFN-alfa) állítható elő (Kikuta et al.: J. Gén. Virol., 65, pp 837-841, 1984; Roberts et al.: J. Immunoi., 123, pp 365-369,1979; Saksela et al.: Prog. Med. Virol., 30, pp 78-86,1984).
A természetes interferontermelésnek korlátot szab, hogy jelentősebb mennyiségű IFN-alfa előállításához sok donortól szükséges fehérvérsejtet nyerni. A hagyományos eljárások során (Cantell et al.: In Vitro Monograph, 3, pp 35-38,1974; Mécs és munkatársai: MSZ 2435/80; Tóth M. et al.: Eur. Pat. 8411.5123.6; Tóth M. et. al.: Acta Microbiol. Hung., 31, pp 61-67,1984) a fehérvérsejteket a donoroktól levett vérekből nyerik, centrifugálással elkülönítve a fehérvérsejtekben gazdag frakciót, az úgynevezett „buffy coat”-ot.
Egy donortól 80-150 ml nyers interferon előállításához elegendő leukocitamennyiség nyerhető. Bár a természetes alfa-interferon terápiás értéke messze felülmúlja a géntechnológiai úton nyert IFN-alfáét [Öberg & Alm: J. Interferon Rés., 9 (Suppl. 1.), pp S45-S51, 1989; von Wussow et al.: Láncét, i, pp 882-883, 1988; von Wussow & Jakschies: ibid.], a rendelkezésre álló donorok korlátozott száma és az egyre teqedő hematogén vírusfertőzések (hepatitis B-, C-, E-vírusok, HTV stb.) erősen behatárolják az előállítható természetes IFN-alfa mennyiségét, így a szükségletekhez képest messze nem elegendő a jelenleg megtermelhető természetes IFN-alfa mennyisége.
Stecher A. K. et al., J. Gén. Virol., 65:635-638 (1984) folyóiratcikkben azt írják le, hogy leukocitákat buffy coat módszerrel izolálnak, majd szuszpendálnak táptalajban, a sejteket inkubálják 37 °C-on, majd Sendaivírussal kezelik, és az inkubálást 29-32 °C-on folytatják, majd a sejteket centrifrigálással elkülönítik. Ezzel a módszerrel az interferonkitermelés 2,5-3-szorosára növelhető.
Matsumoto K. et. al., J. Gén. Virol. 67:809—812 (1986) folyóiratcikkében azt írja le, hogy leukocitákat buffy coat módszerrel elkülönítenek, a sejteket tisztítják, majd a tisztított leukocitákat humán szérumot tartalmazó táptalajban szuszpendálják, és inkubálják 2 óra hosszáig 37 °C-on.
Ezután Sendai-vírust adnak az elegyhez, és inkubálják további 14-16 óra hosszáig.
Ezt követően a sejteket centrifugálással elkülönítik a felülúszótól, majd a sejteket újra szuszpendálják és hasonló módon újra kezelik, mint az első lépésben.
így az interferonkitermelést 20-50%-kal tudják javítani.
Célul tűztük ki egy olyan eljárás kidolgozását, amellyel a fenti eljárásokban elértnél nagyobb mértékben tudjuk növelni az interferonkitermelést.
E probléma megoldásához két úton lehet közelíteni : megkísérelhetjük növelni az egy donortól kinyerhető leukocitamennyiséget, vagy fokozni az egy sejt által termelt (fajlagos) IFN-alfa-mennyiséget.
Találmányunk célkitűzése, hogy fokozzuk az egy donorra eső IFN-alfa-termelékenységet mind a kinyerhető fehérvérsejt-mennyiség, mind a fajlagos IFN-alfaprodukció növelése útján.
Találmányunk több felismerésen alapul.
Az első, hogy jelentősen megnövelhetjük az egy donortól származó leukocitamennyiséget, ha nem a teljes vért vesszük le tőle, hanem a fehérvérsejteket átfolyórotorban történő centrifugálással elkülönítjük, majd a vér többi alkotóelemét visszajuttatjuk a donor szervezetébe.
A második, hogy az IFN-alfa termelése során fokozhatjuk a keletkező IFN-alfa-mennyiséget, ha a termelés első 90 perce után az inkubáció hőmérsékletét 37 °Cról 30 °C-ra csökkentve megakadályozzuk az IFN-produkciót gátló inhibitor termelődését.
A harmadik, hogy egy, a fehérvérsejtek manipulálása során e sejtekben egy antivirális karakterű stresszfehérje képződik, amelyet az inkubáció végén a sejtszusz2
HU 222 980 Bl penzióhoz adott Sendai-vírus alkalmazásával a sejtekből kiszabadítva ezzel a fehérjével fokozni tudjuk IFNalfa-készítményünk antivirális terápiás értékét.
A találmány szerinti eljárásban azzal, hogy leukoforézissel elkülönített leukocitákat alkalmazunk és az inkubációshőmérséklet-csökkentési lépést egy második Sendai-vírus-adagolással kombináljuk úgy, hogy közben a sejteket nem különítjük el és nem végzünk újraszuszpendálást - nem várt hatást tudunk elérni az interferonkitermelés növelésében.
A találmány tárgya tehát eljárás természetes humán alfa-interferon előállítására emberi vérből, ammóniumkloridos hemolízissel és puffereit fiziológiás sóoldatos mosással történő tisztítással, majd tápoldatban történő szuszpendálással és Sendai-vírussal való indukcióval.
Az eljárást az jellemzi, hogy az emberi vérből a fehérvérsejteket leukoforézissel elkülönítjük, ismert módon tisztítjuk, ezután a fehérvérsejteket ismert tápoldatban szuszpendáljuk és tenyésztjük, majd a tenyészet hőmérsékletét 30-40 °C-ra állítjuk be, és előkezeljük 10-1000 NE/ml a-interferonnal, β-interferonnal vagy γ-interferonnal, folytatjuk a tenyésztést 30-40 °C-on 0,5-6 órán keresztül, ezután a tenyészetet első adagként 10-1000 hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírussal inkubáljuk, majd folytatjuk a tenyésztést 0,5-3 órán keresztül, és a tenyészet hőmérsékletét 28-30 °C-ra, előnyösen 30 °C-ra csökkentjük, és folytatjuk az inkubálást 6-36 óráig, majd a tenyészethez egy második adag 10-1000 hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírust adagolunk, ezután a sejteket ismert módon elkülönítjük, majd a felülúszó pH-ját 1,5-2,5-re savasra, előnyösen pH 2,0-re állítjuk be.
A fenti módon nyert nyers természetes IFN-alfakészítményt további felhasználásig 4 °C-on vagy -20 °C-on tároljuk, célszerűen 6,5-8,0 pH értéken.
A találmányunk tárgyát képező eljárást az alábbiakban mutaljuk be.
1. példa
Az egészséges donor mindkét kaqába vénás katétert vezetünk. Az egyik katéteren kiáramló vért egy átfolyórotorú centrifugába vezetve a fehérvérsejteket elszeparáljuk, és a többi véralkotó komponenst a másik katéteren keresztül visszajuttatjuk a donor keringésébe.
Ily módon 1-3,5 liter, előnyösen 2,5 liter vérből nyerhetjük ki a fehérvérsejteket, ami a korábbi leukocitakinyerési technológiához viszonyítva donoronként 4-8-szoros fehérvérsejt-mennyiséget eredményez.
A kinyert fehérvérsejteket gradienscentrifúgálással (például Ficoll, Percoll vagy polietilénglikol alkalmazásával), vagy előnyösen ammónium-kloriddal történő hemolízissel (Tóth M. és munkatársai: MSZ 192 254,
1983) tisztítjuk meg a szeparálás során visszamaradt vörösvértestektől.
A szétesett vörösvértestektől elválasztjuk a leukocitákat (például centrifugálással), és a nyomokban még jelen lévő szérummaradékból valamely fiziológiás oldattal előnyösen 20 mM KH2PO4-pufferrel stabilizált 0,83%-os NaCl-oldattal - történő mosással tisztítjuk meg oly módon, hogy egy rész sejtszuszpenzióhoz 4-15 rész - előnyösen 9 rész - puffereit sóoldatot adva egyenletesen felszuszpendáljuk a sejteket, majd a mosófolyadékot megfelelő módon (például centrifugálással) eltávolítjuk.
A tisztított fehérvérsejteket ezután valamely sejtfenntartásra alkalmas tápoldatban (például Eagle-féle minimális esszenciális tápoldat, ennek különféle módosításai - Dulbecco-féle, Glasgow-féle, Earle-féle stb. -, RPMI1640 tápoldat) felszuszpendáljuk.
Előnyösen alkalmazható az alábbi összetételű egyszerű, autoklávozható tápoldat:
Komponens: Mennyiség (mg/1):
CaCl2 100-400
KC1 250-600
MgSO4 vagy MgCl2 100-500
NaCl 4500-8000
NaHCOj 200-4000
NaH2PO4 10-250
Glukóz 0-6000
Fe(NO3)3 0-0,5
A tápoldatot 0,2-5 mg/ml - előnyösen 1 mg/ml fehérjetartalomig emberi szérummal - előnyösen emberi szérumalbuminnal, különösen előnyösen gamma-globulin-mentesített emberi szérummal - egészítjük ki.
A tápoldatot valamely antibiotikummal - előnyösen gentamycinnel vagy neomycinnel - is kiegészítjük.
A sejteket 101 * * * * 6-108 - előnyösen 107 - élő sejt/ml koncentrációra állítjuk be.
Ezután a sejteket emberi alfa-, béta- vagy gammaIFN-kezelésnek vetjük alá.
E célra inducertől mentes nyers vagy tisztított IFN-t alkalmazunk 10-1000 NE/ml - előnyösen 200 NE/ml végkoncentrációban.
Az inkubációt 30-40 °C-on - előnyösen 37 °C-on
- végezzük 0,5-6 óráig, előnyösen 2 óráig.
Ezt követően a sejtszuszpenzióhoz élő, nyers vagy tisztított Sendai-vírust adunk 10-1000, előnyösen 200 hemagglutinációs egység/ml végkoncentrációig.
A szuszpenziót további 0,5-3 órán át 35-39 °C-on
- előnyösen 37 °C-on - inkubáljuk, majd a hőmérsékletet 28-30 °C-ra - előnyösen 30 °C-ra csökkentjük, és így inkubáljuk további 6-36 (előnyösen 15-18) óráig.
Az inkubálás végén a sejtszuszpenzióhoz újabb 10-1000 (előnyösen 200) hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírust adunk, majd a sejteket alkalmas módon (például centrifugálással) az inkubációs közegtől elszeparáljuk.
A felülúszót alkalmas ágenssel (például cc. HC1) pH 2,0 értékre savanyítjuk, és 4 °C-on tartjuk 6-48 (előnyösen 24) óráig.
Ezután pH 6,5-8,0-re (előnyösen 7,4-re) állítjuk a hidrogénion-koncentrációt (például 5 M NaOH-dal), és az így nyert nyers természetes IFN-alfa-készítményt további felhasználásig 4 °C-on vagy -20 °C-on tároljuk.
Claims (4)
1. Eljárás természetes humán alfa-interferon előállítására emberi vérből, ammónium-kloridos hemolízissel és puffereit fiziológiás sóoldatos mosással történő
HU 222 980 Bl tisztítással, majd tápoldatban történő szuszpendálással és Sendai-vírussal való indukcióval, azzal jellemezve, hogy az emberi vérből a fehérvérsejteket leukoforézissel elkülönítjük, ismert módon tisztítjuk, ezután a fehérvérsejteket ismert tápoldatban szuszpendáljuk és te- 5 nyésztjük, majd a tenyészet hőmérsékletét 30-40 °Cra állítjuk be és kezeljük 10-1000 NE/ml a-interferonnal, β-interferonnal vagy γ-interferonnal, folytatjuk a tenyésztést 30-40 °C-on 0,5-6 órán keresztül, ezután a tenyészetet első adagként 10-1000 hemagglu- 10 tinációs egység/ml Sendai-vírussal inkubáljuk, majd folytatjuk a tenyésztést 0,5-3 órán keresztül, és a tenyészet hőmérsékletét 28-30 °C-ra, előnyösen 30 °Cra csökkentjük, és folytatjuk az inkubálást 6-36 óráig, majd a tenyészethez egy második adag 10-1000 he- 15 magglutinációs egység/ml Sendai-vírust adagolunk, ezután a sejteket ismert módon elkülönítjük, majd a felülúszó pH-ját 1,5-2,5-re savasra, előnyösen pH 2,0-re állítjuk be.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy második adagként 200 hemagglutinációs egység/ml Sendai-vírust adunk a tenyészethez.
3. Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubálást 100-400 mg/ml CaCl2-ot, 250-600 mg/ml KCl-ot, 100-500 mg/ml MgSO4-ot vagy MgCl2-ot, 4500-8000 mg/ml NaCl-ot, 200-4000 mg/ml NaHCO3-ot, 10-250 mg/ml NaH2PO4-ot, 0-6000 mg/ml glukózt, 0-0,5 mg/ml Fe(NO3)3-ot tartalmazó, humán szérumalbuminnal vagy gamma-globulin-mentesített humán szérummal 1 mg/ml fehéijekoncentrációra beállított vizes tápoldatban végezzük.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tápoldatot antibiotikummal egészítjük ki.
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9800554A HU222980B1 (hu) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | Eljárás humán Alfa-interferon előállítására |
| DE69830895T DE69830895D1 (de) | 1998-03-13 | 1998-05-08 | Verfahren zur Herstellung von humanen [alpha] Leukozyteninterferon |
| CA002234396A CA2234396C (en) | 1998-03-13 | 1998-05-08 | Method for production of native human leukocyte (alpha) interferon |
| AT98108457T ATE299893T1 (de) | 1998-03-13 | 1998-05-08 | Verfahren zur herstellung von humanen (alpha) leukozyteninterferon |
| EP98108457A EP0945463B1 (en) | 1998-03-13 | 1998-05-08 | Process for the preparation of human leukocyte [alpha] interferon |
| US09/076,194 US6156542A (en) | 1998-03-03 | 1998-05-12 | Method for production of native human leukocyte (alpha) interferon |
| ZA9811554A ZA9811554B (en) | 1998-03-13 | 1998-12-17 | Method for production of human leukocyte (alpha) interferon |
| JP11009879A JPH11253192A (ja) | 1998-03-13 | 1999-01-18 | 白血球（アルファ）インタ―フェロンの調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| HU9800554A HU222980B1 (hu) | 1998-03-13 | 1998-03-13 | Eljárás humán Alfa-interferon előállítására |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9800554D0 HU9800554D0 (en) | 1998-05-28 |
| HUP9800554A2 HUP9800554A2 (hu) | 1999-12-28 |
| HUP9800554A3 HUP9800554A3 (en) | 2000-12-28 |
| HU222980B1 true HU222980B1 (hu) | 2004-01-28 |
Family
ID=89996253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9800554A HU222980B1 (hu) | 1998-03-03 | 1998-03-13 | Eljárás humán Alfa-interferon előállítására |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6156542A (hu) |
| EP (1) | EP0945463B1 (hu) |
| JP (1) | JPH11253192A (hu) |
| AT (1) | ATE299893T1 (hu) |
| CA (1) | CA2234396C (hu) |
| DE (1) | DE69830895D1 (hu) |
| HU (1) | HU222980B1 (hu) |
| ZA (1) | ZA9811554B (hu) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6472208B1 (en) * | 1999-12-13 | 2002-10-29 | Héma-Québec | Method of producing human IFN-α using sendai virus-infected hematopoietic stem cells |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3800035A (en) * | 1971-12-07 | 1974-03-26 | Smithkline Corp | Production of interferon from human leukocytes in the absence of serum |
| HU192254B (en) * | 1983-12-13 | 1987-05-28 | Egyt Gyogyszervegyeszeti Gyar | Process for producing human leucocite and human gamma interferons in consecutive steps |
| JPS62500656A (ja) * | 1984-09-21 | 1987-03-19 | フセソユズニ ナウチノ−イススレドバテルスキ インステイテユト オソボ チステイフ ビオプレパラトフ | ヒト白血球インタ−フェロンの製造方法 |
| JP2888443B2 (ja) * | 1989-12-07 | 1999-05-10 | 日本ケミカルリサーチ株式会社 | ヒト白血球インターフェロン亜種の抗体の製造法及び測定法 |
-
1998
- 1998-03-13 HU HU9800554A patent/HU222980B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-05-08 CA CA002234396A patent/CA2234396C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-08 DE DE69830895T patent/DE69830895D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-08 AT AT98108457T patent/ATE299893T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-08 EP EP98108457A patent/EP0945463B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-12 US US09/076,194 patent/US6156542A/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-12-17 ZA ZA9811554A patent/ZA9811554B/xx unknown
-
1999
- 1999-01-18 JP JP11009879A patent/JPH11253192A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9800554D0 (en) | 1998-05-28 |
| EP0945463A2 (en) | 1999-09-29 |
| HUP9800554A3 (en) | 2000-12-28 |
| HUP9800554A2 (hu) | 1999-12-28 |
| CA2234396C (en) | 2002-11-05 |
| JPH11253192A (ja) | 1999-09-21 |
| ZA9811554B (en) | 1999-02-17 |
| ATE299893T1 (de) | 2005-08-15 |
| EP0945463A3 (en) | 2001-02-07 |
| EP0945463B1 (en) | 2005-07-20 |
| US6156542A (en) | 2000-12-05 |
| DE69830895D1 (de) | 2005-08-25 |
| CA2234396A1 (en) | 1999-09-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0089062B1 (en) | Immunoprophylactic and immunotherapeutic agent | |
| Beatty et al. | Absence of monoclonal-antibody-defined protein complex in boy with abnormal leucocyte function | |
| Neumann et al. | Immune interferon I. Production by lymphokine‐activated murine macrophages | |
| Narayan et al. | Activation of caprine arthritis-encephalitis virus expression during maturation of monocytes to macrophages | |
| US4683199A (en) | Interleukin-2 dependent cytotoxic T-cell clones | |
| RU94045873A (ru) | Композиция альфа-интерферона и способ ее получения из лейкоцитов крови человека | |
| US3800035A (en) | Production of interferon from human leukocytes in the absence of serum | |
| JPS6154040B2 (hu) | ||
| Strander et al. | Interferon response of lymphocytes in disorders with decreased resistance to infections | |
| Stark et al. | Immunologic dysregulation in a patient with familial hemophagocytic lymphohistiocytosis | |
| EP0097353B1 (en) | Improved process for interferon production | |
| HU222980B1 (hu) | Eljárás humán Alfa-interferon előállítására | |
| WO1980002375A1 (en) | High purity animal interferons | |
| Cantell et al. | Rapid production of interferon-γ in uninduced human leukocyte suspensions | |
| Baumgartner et al. | Expression of the VEP13 antigen (CD16) on native human alveolar macrophages and cultured blood monocytes | |
| Hammar et al. | Induction of tubuloreticular structures in cultured human endothelial cells by recombinant interferon alfa and beta | |
| Herberman et al. | [57] Assay of augmentation of natural killer cell activity and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by interferon | |
| EP0127394A2 (en) | Mutant human T cell lines producing immunosuppressive factor and method for obtaining such mutants | |
| CA2078805C (en) | Cytokine preparation | |
| WO1983001899A1 (en) | Process for the production of human gamma-interferon | |
| Cantell | Towards the clinical use of interferon | |
| Gallo et al. | Interleukin-6 serum level and monocyte production in head and neck cancer. | |
| Niehues et al. | Severe combined immunodeficiency (SCID) associated neutropenia: a lesson from monozygotic twins. | |
| Rozenszajn et al. | Colony Growth of T Lymphocytes in vitro: Control and Regulation of Clonal Formation | |
| US4758513A (en) | Human T or B cell lines and a process for producing immunologically active substances using the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HFG4 | Patent granted, date of granting |
Effective date: 20031127 |
|
| MH4A | Lapse of definitive patent protection due to relinquishment |