FI88403C - Monoklonala antikroppar, foerfarande foer framstaellning av dessa och affinitetsreningsfoerfarande vari dessa anvaends - Google Patents

Description

1 88403

Monoklonaalisia vasta-aineita, menetelmä niiden valmistamiseksi ja affiniteettipuhdistusmenetelmä, jossa niitä käytetään 5 Keksinnön ala Tämä keksintö koskee antigeenin ja vasta-aineiden puhdistamista affiniteettikromatografialla. Se koskee myös monoklonaalisia vasta-aineita ja niiden valmistusmenetelmää. Tausta 10 Antigeenin puhdistaminen affiniteettikromatogra- fialla käyttäen seerumin vasta-aineita, joita syntyy isäntä-eläimen vasteena antigeenille, ja jotka sidotaan immunoadsor-benttina toimivalle kiinteälle kantajalle, on menetelmä, jota on käytetty monia vuosia. Tällä menetelmällä on kuitenkin ai-15 nakin kaksi vakavaa heikkoutta, jotka vähentävät sen käyttökelpoisuutta. Siten, jos käytetään vasta-aineita, joiden affiniteetti on suuri, erotettaessa antigeeniä näytteestä, vaaditaan ankaria olosuhteita irrottamaan antigeeni vasta-aineista sen jälkeen, kun adsorboitumattomat epäpuhtaudet on huuh-20 dottu pois immunoadsorbenttimassasta. Tähän tarvittavat olosuhteet, esimerkiksi pH alle 3 tai yli 11 tai väkevöity kao-.*·*. trooppi, kuten guanidiini- tai urealiuos, voivat denaturoida antigeenin ja vasta-aineet vähentäen ellei jopa tuhoten, an-| I tigeenin immunokemiallisia ja/tai biologisia ominaisuuksia "/25 ja lyhentäen immunoadsorbentin käyttöikää.

Jotta vältettäisiin ongelmat, jotka liittyvät anti-geeniaffiniteetiltaan korkeiden vasta-aineiden käyttöön, on '·*·' tullut yleiseksi käytännöksi käyttää affiniteetiltaan alhai sia immobilisoituja vasta-aineita immunoadsorbenttina. Näiden ·/.: 30 vasta-aineiden käyttö tekee mahdolliseksi eluoida antigeeni immunoadsorbenttimassasta käyttäen lieviä, denaturoitumista aiheuttamattomia olosuhteita. Välttämättömässä kolonnin pesu-". vaiheessa, jossa eluoidaan epähuhtaudet sidotusta antigeenis tä, eluoituu kuitenkin myös jonkin verran antigeeniä, niin 35 paljon, että erotusteho heikkenee suuresti. Lisäksi affini-: teetiltaan alhaiset vasta-aineet eivät pysty sitomaan 2 38403 tehokkaasti antigeenejä, joita on väliaineessa suhteellisen pieninä pitoisuuksina, so. vähemmän kuin noin 10 ng/ml.

Hybridoomatekniikan kehittyessä on tullut mahdolliseksi saada monoklonaalisia vasta-aineita, joita on sitten 5 ehdotettu käytettäviksi immunoadsorbentteina puhdistettaessa affiniteettimenetelmällä niitä antigeenejä, joita vastaan ne toimivat. Katso esimerkiksi Stenman et ai., J. Immunological Methods 46 (1981) 337; Stallcup et ai., J. Immunology 127 (1981) 924 ja Katzman et ai., Proc. Natl. Acad.

10 Sei. USA 78 (1981) 162. Näissä raporteissa ehdotetaan, että käytettävillä monoklonaalisilla vasta-aineilla olisi enintään vain kohtalainen affiniteetti antigeenejä kohtaan, mikä tekisi mahdolliseksi niiden desorboimisen immunoadsorbentiltä lieviä olosuhteita käyttäen. Siten, kokemukset, joita tähän 15 mennessä on saatu monoklonaalisten vasta-aineiden käytöstä immunoadsorbentteina, viittaavat siihen, että niiden ominaisuudet olisivat samansuuntaisia kuin tavanomaisen antiseerumin "polyklonaalisten" vasta-aineiden, so. affiniteetiltaan alhaisen vasta-aineen käyttö tekee mahdolliseksi antigeenin 20 eluoinnin lievissä olosuhteissa, kun taas käytettäessä affiniteetiltaan korkeaa vasta-ainetta vaaditaan voimakkaita olosuhteita antigeenin irrottamiseksi vasta-aineesta.

Yhteenveto keksinnöstä • Kuten on hyvin tunnettua, muodostetaan hybridoomia 25 fuusioimalla B-lymfosyyttejä sattumanvaraisesti myeloomaso-luihin fuusiota edistävän aineen läsnäollessa. Kukin hybridooma siinä suuressa hybridoomapopulaatiossa, joka voidaan tuottaa fuusiossa, erittää erilaista monoklonaalista vasta-ainetta. Normaalisti hybridoomapopulaatiosta etsitään ne 30 hybridoomat, jotka erittävät vasta-ainetta, jolla on toivottu antigeenispesifisyys, edelleen kloonattaviksi, jotta saataisiin käyttökelpoisia määriä vasta-ainetta. Olemme havainneet, että niiden hybridoomien, jotka erittävät tietyn an-: tigeenin vastaisia vasta-aineita, populaatiossa sekä niiden 35 hybridoomien, jotka erittävät vasta-aineita, joilla on suuri affiniteetti antigeeniä kohtaan, alapopulaatiossa hyvin 3 88403 paljon pienempi populaatio erittää vasta-aineita, joilla on suuri affiniteetti antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristössä, mutta paljon pienempi affiniteetti toisessa ympäristössä, joista ympäristöistä kumpikaan ei ole tuhoisa 5 antigeenin eikä vasta-aineen immunokemiallisille tai biologisille ominaisuuksille, Uskomme, että näiden vasta-aineiden olemassaolo affiniteetiltaan korkeissa antiseerumeissa on jäänyt huomaamatta, koska enemmistö antiseerumissa olevista affiniteetiltaan suurista vasta-aineista on niitä, jotka 10 vaativat ankaria olosuhteita antigeenin erottamiseksi vasta-aineista ja koska nämä ovat dominoivia antiseerumien immuno-kemiallisten ominaisuuksien kannalta.

Siten, olemme havainneet, että pystymme seulomaan hybridoomapopulaation, joka voi olla usean fuusion tuote ja 15 identifioimaan ne hybridoomat, jotka tuottavat monoklonaa-lista vasta-ainetta, jolla on suuri affiniteetti ensimmäisessä ympäristössä ja alhainen affiniteetti toisessa ympäristössä sekä kloonaamaan vähintään yhden näistä hybridoo-mista, jolloin saadaan riittävä määrä sen tuottamaa vasta-20 ainetta, jotta on mahdollista käyttää sitä hyvin tehokkaana immunoadsorbenttina affiniteettikromatografiässä. Tässä yh- ... teydessä katsotaan vasta-aineen affiniteetin olevan korkea, • ' q kun affiniteettivakio (Ka) on noin £ 10 ja alhainen, kun Ka ; ; on noin S 10 .

·'·'· · 25 Lyhyt piirrosten kuvaus ··“ Kuviot 1 ja 2 ovat käyriä, jotka kuvaavat pH:n muu- : tosten vaikutusta radioisotoopilla merkityn, ihmisen kasvu- : hormonin, joka on sidottu neljään, kiinteälle faasille im- mobilisoituun, eri monoklonaaliseen vasta-aineeseen, desorp-.**·.: 30 tioon.

Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Keksintömme mukaisesti antigeenin puhdistus tehdään menetelmällä, joka koostuu seuraavista vaiheista.

a) valitaan monoklonaalinen vasta-aine, jolla on suu-35 ri affiniteetti antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristös-: sä ja alhainen affiniteetti antigeeniä kohtaan toisessa 4 88403 ympäristössä, joista ympäristöistä kumpikaan ei aiheuta oleellisia palautumattomia muutoksia antigeenin toivottuihin immunokemiallisiin ominaisuuksiin; b) immobilisoidaan vasta-aine kiinteälle kantajalle; 5 c) saatetaan immobilisoitu vasta-aine kosketukseen epäpuhdasta antigeeniä sisältävän näytteen kanssa ensimmäisessä ympäristössä, jolloin antigeeni sitoutuu vasta-aineeseen ; d) erotetaan sitoutumattomat epäpuhtaudet sidotusta 10 antigeenistä; ja e) eluoidaan puhdistetussa muodossa oleva antigeeni immobilisoidusta vasta-aineesta käyttäen eluenttina väliainetta, joka on toinen ympäristö.

Kuten jo mainittiin, keksintömme yhteydessä käyttö-15 kelpoiset vasta-aineet voidaan saada seulomalla vasta-aineet, joita tuottaa hybridoomapopulaatio, joka on saatu fuusioimalla yhteen tunnetuin menetelmin myeloomasoluja ja B-lymfosyyttejä. B-lymfosyytit ovat tyypillisesti pernasoluja, jotka on otettu hyperimmunoidusta eläimestä, jolle on 20 ennalta annettu kohdeantigeenia immunogeeniksi. Sen jälkeen, kun ne hybridoomat, jotka tuottavat toivotun antigeenin suhteen spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, on identifioitu, ne voidaan seuloa edelleen niiden hybridoomien, jotka tuottavat vasta-aineita, joiden affiniteetti muuttuu an-25 tigeenia tai vasta-ainetta vaurioittamattomien ympäristömuutoksien mukana, identifioimiseksi. Antigeenit esimerkiksi ovat tavallisesti stabiileja pH-alueella 4 - 10,5. Jotta - saataisiin pH:lie herkkä vasta-aine immunoadsorbenttina käytettäväksi, seulotaan monoklonaalisten vasta-aineiden : 30 populaatio niiden vasta-aineiden identifioimiseksi, joilla on suuri affiniteetti vasta-aineen suhteen, so. Ka noin 109 ja edullisesti £ 10^, yhdessä mainitulla alueella ole- 8 vassa pH:ssa ja pieni affiniteetti, so. Ka noin 10 ja 5 88403 mittaamalla, sen jälkeen kun vasta-aineen on annettu tarttua antigeeniin, desorboituva antigeenimäärä erilaisissa pH:issa, joka mittaus voidaan tehdä esimerkiksi käyttämällä radioisotoopilla merkittyä antigeeniä ja laskemalla 5 kiinteän faasin ja/tai supernatantin emittoima säteily. Samanlainen seulonta voidaan tehdä niiden vasta-aineiden identifioimiseksi, jotka reagoivat muunlaisiin ympäristömuutoksiin.

Tämän keksinnön mukaisesti on edullista käyttää mo-10 noklonaalisia vasta-aineita, joiden antigeenin sitomiskapa-siteetti on herkkä pH:n muutoksille. Tähän tarkoitukseen valitaan vasta-aine, jonka affiniteetti on suuri yhdessä pHrssa ja alhainen toisessa pH:ssa, joka voi olla korkeampi tai alempi kuin ensimmäinen pH. Ensimmäinen pH on 7 tai lähellä 15 sitä tavallisesti, mutta ei välttämättä. Keksinnön piiriin kuuluvaa on kuitenkin myös se, että valitaan vasta-aineita, jotka reagoivat toisenlaisiin ympäristöolosuhteiden muutoksiin. Voidaan esimerkiksi valita monoklonaalinen vasta-aine, jonka affiniteetti muuttuu korkeasta alhaiseksi, 20 kun läsnä on kaotrooppinen liuos eluointiväliaineena. Soveltuviin kaotrooppeihin kuuluvat KBr, KI, KSCN, urea, *··. guanidiini ja MgCl~. Siten voidaan valita monoklonaalisiä ... vasta-aineita, joilla on Ka ' 10 kaotroopin poissaollessa,

' Q

mutta Ka £ 10 tietyn kaotroopin, jonka pitoisuus ei ole 25 haitallinen kyseessä olevalle antigeenille, läsnäollessa. Kaotrooppiherkkyyteen perustuva valinta voidaan tehdä myös puskuriliuoksissa, joilla on tietty pH. Vaihtoehtoisesti voidaan valita vasta-aineita, jotka ovat herkkiä pH:n muutoksille, kun kaotrooppia on läsnä vakiopitoisuutena.

- ' : 30 Monoklonaalisia vasta-aineita, joiden affiniteettia . antigeeniä kohtaan alentavat riittävässä määrin muut kuin pH:n tai kaotrooppipitoisuuden muutokset. Niihin väliaine-herkkyyksiin, joiden suhteen vasta-aineet voidaan tutkia niiden vasta-aineiden valitsemiseksi, joiden antigeenin ' 35 sitomiskykyyn vaikuttaa muutos eluointiväliaineessa, kuu- luvat metyylimannosidiherkkyys ja herkkyys ionittomille tai 6 38403 ionisille detergenteille ja reagensseille, jotka vaikuttavat tiettyihin aminohappoihin, kuten tryptofääniin ja tyrosii-niin.

Valittu monoklonaalinen vasta-aine voidaan affini-5 tettikromatografiakäyttöä varten sitoa mihin tahansa kiinteään kantajaan, joita yleensä käytetään affiniteettikro-matografiässä. Näihin kuuluvat sefaroosi, polystyreeni, lasi, nailon, selluloosa, polymetyylimetakrylaatti, silika-geeli, polyakryyliamidi ja nitroselluloosa, 10 Seuraavat esimerkit valaisevat tämän keksinnön so veltamista monoklonaalisten vasta-aineiden valmistukseen, joiden vasta-aineiden sitoutumisaffiniteetti antigeeniin muuttuu korkeasta ensimmäisessä ympäristössä alhaiseen affiniteettiin toisessa ympäristössä, joista ympäristöistä kum-15 pikaan ei heikennä antigeenin immunokemiallisiä ominaisuuksia sekä tällaisten vasta-aineiden käyttökelpoisuutta immu-noadsorbenttina affiniteettikromatografiässä.

Esimerkki 1

Ihmisen kasvuhormonilla (HGH) hyperimmunoiduista 20 Balb/c-hiiristä otetut pernasolut fuusioitiin polyetyleeni-glykolia käyttäen hiiren myeloomasoluihin (linjat NS-1 tai SP-2XO)· Saadut hybridoomat kloonattiin ja seulottiin niiden löytämiseksi, jotka erittävät HGH-spesifistä vasta-ainet- 125 ta, radioimmuunikokeella, jossa käytettiin I-HGH:a ja 25 hevosen IgG-vasta-ainetta hiirtä vastaan sefaroosihelmillä.

Anti-HGH:a tuottavat hybridoomat seulottiin edelleen niiden identifioimiseksi, jotka tuottavat vasta-aineita, joiden Ka 9 on vähintään noin 10 pH 7:ssä. Nämä seulottiin edelleen niiden identifioimiseksi, joiden affiniteetti oli herkkä 30 pH:n muutoksille alueella pH 4 - 10,5. Neljän monoklonaali- sen vasta-aineen pH-herkkyyttä kuvastavat tiedot annetaan taulukoissa 1 ja 2 ja kuvioissa 1 ja 2. Eri vasta-aineita merkitään kirjaimilla A, B, C ja D, vastaavasti. Nämä tie- 125 dot saatiin seuraavasti: I-merkittyä HGH:a sidottiin 35 pH 7:ssä kuhunkin vasta-aineeseen, joka oli ennalta immobi-lisoitu polystyreenihelmille. Kukin helmi sisälsi noin 1 ng 7 88403 antigeeniä ja sen radioaktiivisuus oli 10 000 cpm. Kolmea kappaletta kunkinlaista helmeä inkuboitiin 1 mltssa PBS:a, joka sisälsi 10 % hevosen seerumia, neljä tuntia ilmoitetussa pH:ssa. pH:n säätäminen tehtiin lisäämällä joko nat-5 riumkarbonaattipuskuria (10 % hevosen seerumissa) pH:n säätämiseksi seitsemäksi tai lisäämällä natriumasetaattipus-kuria (10 % hevosen seerumissa) pH:n säätämiseksi seitsemäksi. Inkuboinnin jälkeen tehtiin laskenta 800 ^ulille su-pernatanttia. Desorboituneen antigeenin antamat laskentatu-10 lokset kussakin pH:ssa annetaan taulukoissa 1 ja 2 käyrinä kuvioissa 1 ja 2.

Taulukko 1 — 3 *

Cpm x 10 desorboituneelle HGH:lie

pH Vasta-aine A Vasta-aine B

15 3,0 4,810 2,442 3.5 4,625 0,803 4.0 4,156 0,357 4.5 1,608 0,248 5.0 0.449 0,206 20 1 5.5 0,176 0,162 6.0 0,220 0,176 6.5 0,336 0,167 i V 7,0 0,328 0,162 *V 25 *Kolmen supernatantin keskiarvo 8 88403

Taulukko 2

Cpm x 10 3 desorboituneelle HGH:lle*

pH Vasta-aine C Vasta-aine_D

7.0 0,236 0,187 5 7,5 0,208 0,336 8.0 0,240 0,321 8.5 0,666 0,277 9.0 0,401 0,237 9.5 1,038 0,287 10 10,0 3,030 0,364 10,5 4,809 0,584 11,0 5,508 3,460 *Kolmen supernatantin keskiarvo 15 Taulukon 1 tiedot, erityisesti esitettynä käyränä kuviossa 1, osoittavat, että vasta-aineen B tarttuminen HGHriin oli suurin piirtein riippumaton pH:n muutoksista pH-alueella 3,5 - 7, mutta että HGH:n tarttuminen vasta-aineeseen A aleni merkittävästi pH-alueella 4,5 - 4,0, mikä 20 osoittaa, että vasta-aine ei sitoisi tehokkaasti antigeeniä pH 4,0:ssa.

Taulukossa 2 ja kuviossa 2 annetut tiedot osoittavat toisaalta, että vasta-aineen D tarttuminen HGH:iin oli suurin piirtein.riippumaton pH-muutoksista alueella pH 7,0 -25 10,5, kun taas vasta-aineen C tarttuminen HGHjiin aleni mer kittävästi alueella pH 9,5 - 10,5, mikä osoittaa, että vasta-aine ei tehokkaasti sitoisi antigeeniä pH 10,5:ssä.

Vasta-aineista A ja C pH:issa 4,0 ja 10,5 eluoidut supernatantit lisättiin PBS-puskuriin (10 % hevosen seeru-30 missä), näytteet yhdistettiin ja pH-säädettiin seitsemäksi.

• Yhdistettyjä näytteitä inkuboitiin vasta-aineilla A, B, C

3a D ja kahdella muulla HGH:n vastaisella monoklonaalisella _ vasta-aineella päällystettyjen polystyreenihelmien kanssa.

Kukin näistä vasta-aineista tunnistaa HGH-molekyylin eri 35 alueet. Joko pH 4:ssä tai pH 10,5:ssä eluoidun antigeenin • immuunireaktiivisuus viiden vasta-aineen kanssa kuudesta 9 88403 tutkitusta, mukaan luettuina vasta-aineet A, B, C ja D, ei ollut heikentynyt ja oli vain hieman vähentynyt kuudennen kanssa. Nämä tiedot osoittavat, että antigeenin eluoin-ti joko pH 4,0:ssa tai pH 10,5:ssä ei heikentänyt sen immu-5 nokemiallisia ominaisuuksia.

Esimerkki 2

Prostatiinihappofosfataasin (PAP), erittäin labiilin entsyymin, vastaisen affiniteetiltaan korkean monoklonaa- 10 lisen vasta-aineen (Ka = 5 x 10 ), joka saatiin seulomal- 10 la PAP:n vastaisia monoklonaalisia vasta-aineita tuottavat hybridoomat, jotka oli saatu fuusioimalla PAP:11a hyperim-munoidun Balb/c-hiiren pernasoluja ja hiiren myeloomasoluja esimerkin 1 mukaisesti, kyvyssä sitoa antigeeniä havaittiin herkkyys pH-alueella 6,0 - 4,0. Vasta-aine kiinnitettiin 15 sefaroosihelmiin CNBr-tekniikkaa käyttäen pitoisuudeksi 1 mg vasta-aineeta/1 ml pakattuja sefaroosihelmiä ja käytettiin PAP:n puhdistamiseen seuraavasti. 170 ^ul:n näyte siemennestettä, joka sisälsi 0,912 mg/ml PAP:a immunoradio-metrisesti määritettynä käyttäen TANDEM-tutkimusvälinettä 20 PAP:lle, jota valmistaa Hybritech, Inc., San Diego, Ca., laimennettiin 5 ml:ksi asetaattipuskurilla (10 % natrium-asetaattia hevosen seerumissa, joka oli 0,15M NaCl:n suh-teen), jolloin saatiin liuos, jossa oli 31 ^ug PAP/ml liuos-: ta, jonka pH oli 6.

V 25 PAP-liuos laskettiin läpi kolonnin, joka sisälsi 1.5 ml sefaroosihelmiä, nopeudella 1 ml/h ja kolonni pestiin

7.5 ml:11a puskuriliuosta. Eluaatin immunometrinen tutkimus (5 ml näytettä ja 7,4 ml pesunestettä) osoitti, että 99,3 % PAP:sta oli adsorboitunut kolonniin. PAP eluoitiin 0,1M

30 asetaattipuskurilla, pH 4, joka oli 0,15M NaCl:n suhteen. Kerättiin kolme 1 ml:n fraktiota ja dialysoitiin yön yli 50 mM sitraattiliuosta, pH 6,0, vastaan. Yhdistettyjen ja [*'. dialysoitujen fraktioiden sisältämän PAP-määrän määritettiin . immunoradiometrisesti olevan 54 % kolonniin syötetystä koko- 35 naismäärästä. Dialysoidun materiaalin puhtaus määritettiin ·/.; natriumdodekyylisulfaatilla ja Ornstein-Davis PAGE:11a.

10 88403

Kummassakin tapauksessa havaittiin yksi juova. Entsyymiak-tiivisuusmittaukset tehtiin ja ne osoittivat, että puhdistetun PAP:n entsymaattinen aktiivisuus oli säilynyt.

46 %:n PAP:sta retentio kolonniin on todennäköises-5 ti, ainakin osaksi, tulosta ei-spesifisestä sitoutumisesta ja suuren vasta-aineylimäärän käytöstä, joka johtaa antigeenin "laahautumiseen" kolonnista. Edellistä voidaan vähentää esikäsittelemällä kolonnin näytteellä eluointiolosuhteissa ja pesemällä huolellisesti kaiken eluoituvan materiaalin 10 poistamiseksi. Jälkimmäistä voidaan vähentää alentamalla kiinnitetyn vasta-aineen määrää. Lopuksi mainittakoon, että sefaroosi ei ole paras mahdollinen matriisi affiniteetti-kromatografiän huokoskoon heterogeenisyyden takia, joka johtaa diffuusioon ja steerisiin ongelmiin.

15 Esimerkki 3

Klamydiaan liittyvän antigeenin puhdistaminen on vaikeaa, sillä se on vaikea saattaa liuosmuotoon. Se voidaan kuitenkin liuottaa erilaisiin detergentteihin. Klamydiaan liittyviä antigeenejä vastaan toimivia monoklonaalisia vasta-20 aineita tuottavat hybridoomat, jotka oli saatu fuusioimalla hyperimmunoitujen Balb/c-hiirien pernasoluja hiiren myeloo-masoluihin esimerkin 1 mukaisesti, tutkittiin niiden deter-genttipitoisuusherkkyyden suhteen. Detergenttien vaikutus neljän tällaisen vasta-aineen sitoutumiseen esitetään tau-25 lukossa 3. Käytetyt detergentit olivat deoksikolaatti (DOC), natriumdodekyylisulfaatti (SDS) ja oktyylifenoksipolyetoksi-etanoli, jota myydään nimellä Nonidet P-40 (NP-40). Vertailuaineena käytettiin Ehrlich-vesivatsaa.

, Taulukossa 3 annettavat tiedot saatiin päällystämällä 30 mikromaljat antigeenillä ja inkuboimalla niitä kunkin vasta-aineen puskuriliuoksella detergenttipitoisuuden ollessa taulukon mukainen. Inkuboinnin jälkeen malja pestiin ja annet-: tiin reagoida lampaan polyklonaalisten vasta-aineiden hiir tä vastaan, jotka oli merkitty piparjuuriperoksidaasilla 35 (HPR), kanssa huoneen lämpötilassa. Malja pestään uudelleen ja annetaan reagoida ortofenyleenidiamiinin (ODP), joka on 11 88403 HRP:n kromageenisubstraatti, liuoksen kanssa. Kunkin syvänteen absorbanssi mitattiin aallonpituudella 490 nm ja annetaan taulukossa 3.

Taulukko 3 5 Detergenttien vaikutus klamydian vastaisten monoklo- naalisten vasta-aineiden aikaansaamaan sitoutumiseen

Vasta-aine- 0.D.1 O.D.l O.D.l O.D.l O.D.l reaktio Ehrlich— Vasta-aine Vasta-aine Vasta-aine Vasta-aine seos Vesivatsa 1234 10 ö

Vesipitoinen* puskuri 0,00 1,06 1,15 1,02 0,95 2% DOC 0,02 1,10 0,70 0,11 0,25 2%NP-40 0,00 0,20 0,11 0,80 0,06 0,5%DOC 0,03 1,37 1,36 1,22 1,25 15 0,1%SDS 0,05 1,17 1,20 1,30 1,05 1. O.D. aallonpituudella 490 mitattuna on 2 näytteen keskiarvo, jossa keskihajonta on 0,05.

2. Vesipitoinen puskuri on Autopow-kudosviljelyväli-20 aine, joka sisältää 8 % hevosen seerumia ja 2 % vasikan si- kiöasteen seerumia. Kaikki kokeessa käytetyt detergentit ‘"S liuotettiin tähän puskuriin.

:***: 3. Käytettiin vertailuaineena.

: Nämä tiedot osoittavat eri detergenttien ja deter- 25 genttipitoisuuden vaikutuksen valittujen monoklonaalisten vasta-aineiden sitoutumiseen. Vasta-aineella nro 1 ja vasta-• - aineella nro 2 oli suhteellisen suuri affiniteetti klamydiaa kohtaan vesipitoisessa puskurissa, johon affiniteettiin ei vaikuttanut mikään detergenteistä paitsi 2 % NP-40. Vasta-* 30 aineen 3 affiniteetti oli alhainen 2 % DOC-liuoksessa, mutta sen korkea affiniteetti säilyi muissa väliaineissa. Vasta-aineen 4 affiniteetti oli alhainen 2 % DOC-liuoksessa ja 2 % NP-40-liuoksessa, mutta korkea muissa väliaineissa.

Toisissa kokeissa antigeenillä päällystettyjä mikro-35 maljoja inkuboitiin ensin detergenttien, joiden pitoisuu-det on annettu taulukossa 3, kanssa yksi tunti ja pestiin 12 88403 sitten. Sen jälkeen klamydian vastaisia vasta-aineita inku-boitiin syvänteissä ja sitten, pesun jälkeen, HRP:lla merkittyjä hiiren vastaisia vasta-aineita. Tätä inkubointia seurasi, pesun jälkeen, inkubointi entsyymin substraatin kanssa.

5 Kustakin syvänteestä mitatut optiset tiheydet verrattuna vesipitoisella puskurilla esikäsitellyistä syvänteistä saatuihin tuloksiin viittasivat siihen, että detergentit eivät olleet haitallisia antigeenille. Siten monoklonaalisia vasta-aineita voitaisiin käyttää klamydia-antigeenin affiniteetti-10 puhdistukseen liuottamalla antigeeni detergenttiin, joka on sopiva vasta-aineen sitoutumisen kannalta ja johtamalla preparaatti immobilisoitua vasta-ainetta sisältävään kolonniin, jolloin antigeeni sitoutuu. Sen jälkeen antigeeni vapautetaan eluoimalla kolonni toisella detergenttikoostumuksella, 15 jossa vasta-aine ei sido antigeeniä.

Edellä olevan perusteella on alan asiantuntijoille selvää, että voidaan tehdä antigeenin tehokas puhdistus af-finiteettikromatografiän avulla käyttäen immunoadsorbenttina monoklonaalista vasta-ainetta, sellaisissa olosuhteissa, 20 jotka eivät denaturoi antigeeniä. Tämän menetelmän erityis-sovellutuksiin kuuluvat sen käyttö sellaisten näytteiden, joissa antigeeni esiintyy luonnostaan, sisältämien antigeenien puhdistukseen ja radioisotoopilla merkityn antigeenin, joka on hajonnut säilytyksen aikana, puhdistukseen. Eräs 25 erityissovellutus on yhdistelmä-DNA-tekniikalla valmistettujen proteiinituotteiden puhdistus. Tällaisista tuotteista voidaan mainita insuliini ja ihmisen kasvuhormoni. Kompleksisten proteiinien, esimerkiksi faktori V:n ja faktori VIII:n, eristäminen seerumista on mahdollista tämän keksin-30 nön mukaista menetelmää käyttäen.

On myös mahdollista kääntää menetelmä toisinpäin ja puhdistaa monoklonaalinen vasta-aine käyttäen immobilisoitua antigeeniä immunoadsorbenttina. Radioisotoopilla merkitty vasta-aine, jota on käytetty immunoradiometrisessa mittauk-35 sessa, ja joka on hajonnut säilytyksen tuloksena, voidaan esimerkiksi puhdistaa tällä tavalla. Monoklonaalinen 13 88403 vasta-aine voidaan myös ottaa talteen vesivatsanesteestä tai viljelyväliaineesta käyttämällä immobilisoitua antigeeniä immunoadsorbenttina.

Vaikka emme halua sitoutua mihinkään erityiseen teo-5 riaan, on Ka:n muuttuminen pH:n muuttuessa todennäköisesti seurausta histidiinitähteiden protonaatiosta tai lysiini-tai mahdollisesti tyrosiini- tai arginiinitähteiden deproto-naatiosta joko vasta-aineessa, antigeenissä tai molemmissa, mikä muuttaa antigeenin ja vasta-aineen kykyä muodostaa komp-10 leksi keskenään. Ne erilliset tähteet, joihin vaikutus kohdistuu, voivat sijaita tai olla sijaitsematta molekyylien tarttuvilla alueilla.

Sen havaintomme perusteella, että vasta-aineet, joita eläimen immuunivaste antigeenille tuottaa, sisältävät vasta-15 aineita, joiden herkkyys ympäristön muutoksille vaihtelee, kuuluu keksintömme piiriin polyklonaalisten antiseerumien fraktiointi sellaisen vasta-aineseoksen saamiseksi, jossa vasta-aineet käyttäytyvät samalla tavalla kuin tämän keksinnön mukaiset ympäristölle herkät monoklonaaliset vasta-ai-20 neet. Tämä fraktiointi voidaan tehdä saattamalla immobili-soitu antigeeni kosketukseen antiseerumiylimäärän kanssa en-: simmäisissä halutuissa ympäristöolosuhteissa, minkä jälkeen immunoadsorbentti pestään sitoutumattoman materiaalin pois-)tamiseksi. Tätä vaihetta seuraa immunoadsorbentin saattami-25 nen kosketukseen toisena ympäristönä toimivan väliaineen ··.·. kanssa niiden vasta-aineiden, jotka eivät eluoidu ensimmäi- sessä ympäristössä, eluoimiseksi. Jos esimerkiksi halutaan saada vasta-aineita, joilla on suuri affiniteetti pH 7:ssä ja pieni affiniteetti pH 4:ssä, saatetaan immobilisoitu an-30 tigeeni kosketukseen antiseerumiylimäärän kanssa pH 7:ssä ja immobilisoitu antigeeni pestään väliaineella, jonka pH ‘ '· on 7, niiden vasta-aineiden, joilla on alhainen affiniteetti pH 7:ssä, poistamiseksi. Sitten immunoadsorbentti eluoidaan ; pH 4:ssä niiden vasta-aineiden, joilla on alhainen affini- 35 teetti pH 4: ssä, poistamiseksi. Eluaatti sisältää sellaisten vasta-aineiden, joiden sitoutuminen antigeeniin on herkkä 14 88403 pH:n muutoksille alueella pH 7-4, muodostaman fraktion. Samanlainen fraktiointi voidaan tehdä urealla ja muilla antigeeni-vasta-aine-sitoutumisen inhibiittoreilla. Tuloksena olevat vasta-ainepopulaatiot voivat vaatia edel-5 leen fraktiointia, jotta saataisiin vielä poistetuksi ne vasta-aineet, jotka eluoituvat enemminkin luontaisen alhaisen affiniteettinsa kuin Ka-"kytkennän" takia.

On myös mahdollista käyttää monoklonaalisia hybri-divasta-aineita, joilla on kaksoisspesifisyys, affini-10 teettipuhdistukseen. Monoklonaalisten hybridivasta-ainei- den tuottamismenetelmää kuvataan Martinin et ai. kanadalaisessa patentissa numero 1 213 229 "Antibodies Having Dual Specifities, Their Preparation And Uses Therefor", joka tässä mainitaan viitteenä.

15 Monoklonaalisella hybridivasta-aineella on kaksi spesifisyyttä, jotka voivat olla eri antigeeneille. Käytettävä hybridivasta-aine valitaan siten, että sillä on pH- tai muu ympäristöherkkyys spesifisyydessä sille antigeenille, jolle sitä on tarkoitus käyttää immunoadsor-20 benttina affiniteettikromatografiassa. Hybridin toinen spesifisyys valitaan siten, että sillä on suuri affiniteetti toisen antigeenin, joka on kiinnitetty kiinteälle kantajalle, suhteen. Kun hybridivasta-aine levitetään kiinteälle kantajalle, toinen antigeeni sitoo sen kanta-' 25 jaan. Hybridin affiniteetti toista antigeeniä kohtaan ei : tietenkään saa olla merkittävästi alempi niissä ympäris töolosuhteissa, joissa ensimmäisen eli kohdeantigeenin eluoituminen on mahdollista. Toisen antigeenin sitoutumi-: nen vasta-aineeseen on edullisesti kuitenkin herkkä jol- 30 lekin erilaiselle ympäristön tilalle kuin se, joka mahdollistaa kohdeantigeenin eluoinnin immunoadsorbentista. Hybridivasta-aine voidaan esimerkiksi valita siten, että affiniteetti kohdeantigeenia kohtaan alenee pH:n laskiessa ja affiniteetti toista antigeeniä kohtaan ale-. 35 nee pH:n kohotessa. Tämä mahdollistaa monoklonaalisen hybridivasta-aineen desorboinnin helposti kiinteältä is 88403 kantajalta, kun sitä halutaan sen takia, että kantajaan on epäpuhtauksien kontaminoima tai muista kantajan käyttökelpoisuutta alentavista syistä.

Keksintömme mukaisia ympäristölle herkkiä vasta-ai-5 neita voidaan käyttää myös liuoksessa epästabiilien antigeenien säilytykseen kiinteässä faasissa. Esimerkiksi radioiso-toopilla merkitty antigeeni voidaan sitoa immobilisoituun vasta-aineeseen säilytystä varten ja desorboida tarvittaessa. Ennen desorptiota voidaan immunoadsorbentti pestä mah-10 dollisten säilytyksen aikana syntyneiden hajoamistuotteiden poistamiseksi. Myös päinvastainen menetelmä on mahdollinen, so. antigeeniä voidaan käyttää epästabiilin vasta-aineen säilyttämiseen kiinteässä faasissa. Esimerkiksi radiometrisessä tutkimuksessa käytettävää radioisotoopilla merkittyä 15 vasta-ainetta voidaan säilyttää antigeeni-vasta-aine-komp-leksina ja desorboida tämä tarvittaessa.

Edellä oleva on kuvaus keksintömme tämänhetkisistä edullisista suoritusmuodoista, jota keksintöä rajoittavat vain liitteenä olevat patenttivaatimukset.

Claims (26)

1. Menetelmä monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, jolla vasta-aineella on suuri affiniteetti sitä 5 vastaavaa antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristössä ja alhainen affiniteetti tätä antigeeniä kohtaan toisessa ympäristössä, joista ympäristöistä kumpikaan ei oleellisesti muuta antigeenin eikä vasta-aineen immunokemiallisia ominaisuuksia irreversiibelisti, tunnettu siitä, 10 että a) seulotaan hybridoomat ja valitaan hybridoomapo-pulaatio, joka tuottaa antigeenille spesifisiä monoklonaa-lisia vasta-aineita, b) seulotaan vaiheen (a) populaatio ja valitaan 15 hybridoomien alapopulaatio, joka tuottaa monoklonaalisia vasta-aineita, joilla on suuri affiniteetti antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristössä, c) seulotaan vaiheen (b) alapopulaatio ja valitaan hybridoomien alapopulaatio, joka tuottaa monoklonaalisia 20 vasta-aineita, joilla on alhainen affiniteetti antigeeniä kohtaan toisessa ympäristössä, jolloin kumpikaan ympäristöistä ei ole vahingollinen antigeenin eikä vasta-aineiden immunokemiallisille tai biologisille ominaisuuksille, ja ; d) kloonataan ainakin yksi vaiheessa (c) valituista •25 hybridoomista, niin että saadaan riittävä määrä monoklonaalisia vasta-aineita.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on ensimmäinen pH, ja toinen ym- :30 päristö on nestemäinen väliaine, jolla on toinen pH.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen ympäristön pH ja toisen ympäristön pH ovat alueella noin 4 - 10,5.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ;35 tunnettu siitä, että vasta-aineen ja antigeenin 17 88403 välinen sitoutumisvakio ensimmäisessä ympäristössä on ä 109 ja vasta-aineen ja antigeenin välinen sitoutumisvakio toisessa ympäristössä on s 108.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että sitoutumisvakio ensimmäisessä ympäristössä on ä 1010 ja sitoutumisvakio toisessa ympäristössä on s 10®.

6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ympäristö on nes- 10 temäinen väliaine, jolla on ensimmäinen detergenttipitoi-suus ja toinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on toinen detergenttipitoisuus.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen deter- 15 gentti ovat ionisia tai ei-ionisia detergenttejä.

8. Menetelmä antigeenin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: a) immobilisoidaan jonkin patenttivaatimuksista 1 -7 mukaisesti valmistettu vasta-aine, jolla on korkea af- 20 finiteetti antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristössä ja alhainen affiniteetti antigeeniä kohtaan toisessa ym- • _ : päristössä, joista ympäristöistä kumpikaan ei oleellises- ti muuta antigeenin eikä vasta-aineen immunokemiallisia • tai biologisia ominaisuuksia irreversiibelisti, 25 b) sidotaan antigeeni vasta-aineeseen ensimmäisessä ympäristössä; c) erotetaan sitoutumattomat epäpuhtaudet sidotusta antigeenistä; ja d) eluoidaan puhtaassa muodossa oleva antigeeni im-" 30 mobilisoidusta vasta-aineesta käyttäen eluenttina väliai-' netta, joka on toinen ympäristö.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, t u n- ____: n e t t u siitä, että ensimmäinen ympäristö on nestemäi- • nen väliaine, jolla on ensimmäinen pH ja toinen ympäristö *··-' 35 on nestemäinen väliaine, jolla on toinen pH. ie 88403

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen pH ovat välillä noin 4 ja 10,5.

11. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että ensimmäinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on ensimmäinen detergenttipitoi-suus ja toinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on toinen detergenttipitoisuus.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen deter-gentti ovat ionisia tai ei-ionisia detergenttejä.

13. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineen ja antigeenin välinen sitoutumisvakio ensimmäisessä ympäristössä on > 15 109 ja vasta-aineen ja antigeenin välinen sitoutumisvakio toisessa ympäristössä on < 108.

14. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistetun vasta-aineen puhdistamiseksi, jolla on suuri affiniteetti antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristössä 20 ja alhainen affiniteetti antigeeniä kohtaan toisessa ympäristössä, joista ympäristöistä kumpikaan ei oleellisesti muuta antigeenin eikä vasta-aineen immunokemiallisia tai biologisia ominaisuuksia irreversiibelisti, tunnet-t u siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 25 a) immobilisoidaan antigeeni kiinteälle kantajalle; b) sidotaan vasta-aine antigeeniin ensimmäisessä ympäristössä; c) erotetaan sitoutumattomat epäpuhtaudet sidotusta vasta-aineesta; ja 30 d) eluoidaan puhdistetussa muodossa oleva vasta- - · aine immobilisoidusta antigeenistä käyttäen eluenttina vä liainetta, joka on toinen ympäristö.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ympäristö on nes- 35 temäinen väliaine, jolla on ensimmäinen pH ja toinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on toinen pH. 19 88403

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen pH ovat välillä noin 4 ja 10,5.

16 88403

17. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että ensimmäinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on ensimmäinen detergenttipitoi-suus ja toinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on toinen detergenttipitoisuus.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen deter-gentti ovat ionisia tai ei-ionisia detergenttejä.

19. Patenttivaatimuksen 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineen ja antigeenin välinen sitoutumisvakio ensimmäisessä ympäristössä on > 109 15 ja vasta-aineen ja antigeenin välinen sitoutumisvakio toisessa ympäristössä on s 10®.

20. Menetelmä seerumin vasta-aineiden fraktioimi-seksi sellaisen fraktion saamiseksi, jolla on suuri affiniteetti antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristössä ja 20 alhainen affiniteetti antigeeniä kohtaan toisessa ympäristössä, joista ympäristöistä kumpikaan ei oleellisesti muu-.···. ta antigeenin eikä vasta-aineiden immunokemiallisia tai :·.·. biologisia ominaisuuksia irreversiibelisti, tunnet- | ' t u siitä, että immobilisoidaan antigeeni kiinteälle kan- 25 tajalle, saatetaan antigeeni kosketukseen seerumin vasta-aineiden kanssa ensimmäisessä ympäristössä vasta-aineiden sitomiseksi antigeeniin ja eluoidaan vasta-ainefraktio käyttäen eluenttina väliainetta, joka on toinen ympäristö, jolloin eluoituneella vasta-aineella on alhainen affini-: 30 teetti antigeeniä kohtaan toisessa ympäristössä.

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäinen ympäristö on nes-temäinen väliaine, jolla on ensimmäinen pH, ja toinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on toinen pH. 20 8 8403

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ensimmäisen ympäristön pH ja toisen ympäristön pH ovat alueella noin 4 - 10,5.

23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että ensimmäinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on ensimmäinen detergenttipitoi-suus ja toinen ympäristö on nestemäinen väliaine, jolla on toinen detergenttipitoisuus.

24. Patenttivaatimuksen 23 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että ensimmäinen ja toinen deter- gentti ovat ionisia tai ei-ionisia detergenttejä.

25. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aineen ja antigeenin välinen sitoutumisvakio ensimmäisessä ympäristössä on > 109 15 ja vasta-aineen ja antigeenin välinen sitoutumisvakio toisessa ympäristössä on < 108.

26. Monoklonaalinen vasta-aine, jolla on suuri affiniteetti sitä vastaavaa antigeeniä kohtaan ensimmäisessä ympäristössä ja alhainen affiniteetti tätä antigeeniä koh- 20 taan toisessa ympäristössä, joista ympäristöistä kumpikaan ei oleellisesti muuta antigeenin eikä vasta-aineen immuno-kemiallisia ominaisuuksia irreversiibelisti, tunnet- t u siitä, että se on valmistettu jonkin patenttivaati muksista 1-7 mukaisella menetelmällä. 2i 38403