NO165696B - Fremgangsmaate for fremstilling av et immunreaktivt poroestbaerermateriale. - Google Patents

Description

Immunreaktive, porøse bærermaterialer spiller en viktig rolle i forskjellige grener av teknikken. Eksempelvis behøves slike materialer for analytiske og preparative fremgangsmåter, ved hvilke en partner i en immunreaksjon anvendes fiksert til en uløselig matrix. Fikseringen av partneren i immunreaksjonen til den uløselige bæreren kan foregå ved kjemiske eller fysikalske krefter. Således har det lenge vært kjent metoder for fremstilling av kovalente bindinger mellom et fast bærermateriale og en kjemisk sub-stans som skal bindes til dette, som spesielt også biologisk aktive proteiner. En ulempe ved disse metodene består generelt deri at de bevirker en kjemisk forandring av det biologisk aktive materialet, som i mange tilfeller også har til følge en forandring av den biologiske aktiviteten. En annen kjent fremgangsmåte er innslutningspolymerisasjonen av slike biologisk aktive substanser. Her forblir molekylet som sådan som regel uforandret og bibeholder derfor også den biologiske aktiviteten uforandret. Tilgjengeligheten for den andre partneren i immunreaksjonen, som foreligger i en flytende fase, er imidlertid drastisk innskrenket. Derfor ble det ofte grepet til en tredje kjent fremgangsmåte som unngår ulempene ved den kovalente bindingen og innslutnings-polymerisas jonen, nemlig den adsorptive fikseringen til et egnet bærermateriale. Denne fremgangsmåten har imidlertid den ulempen at bindingen til den faste bæreren er vesentlig svakere enn ved de to førstnevnte metodene, og at det som regel bare kan oppnås en akseptabel bindingsstabilitet på bestemte plastoverflater.

Spesielle problemer opptrådte når det gjaldt hefte-fastheten ved en adsorptiv binding, ved hvilken det skal unngås så vel en kovalent fiksering som også en innslut-ningspolymerisas jon, når det skal anvendes porøse bærermaterialer. Fra US patent 3 888 629 er det kjent en fremgangsmåte som løser dette heftefasthetsproblemet, idet fikseringen gjennomføres i et porøst bærermateriale ved at det finner sted en immunreaksjon mellom de to partnerne i en immunreaksjon, altså mellom antistoff og antigen eller hapten. Det porøse bærermaterialet impregneres da enten med en løsning av den første partneren i immunreaksjonen og deretter med en løsning av den andre partneren i immunreaksjonen, slik at immunreaksjonen kan foregå selv i porøse bærermaterialer under permanent fiksering av det ønskede, immunreaktive stoffet uten kjemisk forandring eller når det gjelder dets tilgjengelighet for andre reaksjonspartnere (PCT-WO 82/02601). I en annen kjent fremgangsmåte sammen-blandes de to løsningene av partnerne i immunreaksjonen først raskt, og deretter impregneres det porøse bærermaterialet raskt med dem (US-A-3 888 629).

Denne fremgangsmåten for binding av et immunreaktivt stoff til et porøst bærermateriale løser riktignok de ovenfor beskrevne problemene, men oppviser imidlertid en annen ulempe, nemlig en ujevn fordeling av den fikserte, immunreaktive substansen på bærermaterialet. Denne ulempen er særlig graverende når dette immunreaktive, porøse bærermaterialet f.eks. skal anvendes for kvantitativ analyse av lavt konsentrerte haptener eller proteiner. Kravet til stabilitet av antigen-antistoff-nettverket, så vel som til lave likevekts-dissosiasjonskonsentrasjoner til den immunreaktive partneren fra immunkompleksene i forhold til kon-sentrasjonen av de haptener og proteiner som skal bestemmes, lar seg bare oppnå når det anvendte antistoffet har en høy affinitet til det aktuelle antigenet. Erfaringsmessig starter bunnfallsdannelsen spontant ved blanding av slike immunreaktive partnere. Ved fremstillingen av tekniske mengder av en immunadsorberer ved impregnering av et porøst bærermateriale med nettopp sammenblandede løsninger av den immunreaktive partneren oppstår det en utfellingsdannelse på bærermaterialet som verken kan kontrolleres i tid eller rom.

Den kvantitative doseringen av immunosorbensen foregår hensiktsmessig ved utskjæring av en bestemt papirflate av et immunreaktivt papir, ved utvalg av et bestemt antall små kuler av et kuleformig, porøst bærermateriale eller ved utveining av en bestemt mengde av det immunreaktive bærermaterialet. Ved ujevn fordeling av det fikserte, immunreaktive stoffet utgår imidlertid en slik enkel doseringsmetode. En annen ulempe ved den kjente immunutfellingstek- nikken består deri at den krever meget høyrensede antigener som nødvendiggjør en forhåndsrensing ved immunosorpsjon og dermed en kostbar fremstillingsmåte.

Det er nå en oppgave for foreliggende oppfinnelse å fremstille porøse, immunreaktive bærermaterialer på enkel måte, som oppviser en overlegen homogenitet når det gjelder fordeling av de immunreaktive bestanddelene og som kan fremstilles på lett og enkel måte og spesielt ikke krever en kostbar forhåndsrensing for fremstillingen.

Denne oppgaven løses ifølge oppfinnelsen ved hjelp av en fremgangsmåte for fremstilling av et porøst bærermateriale inneholdende en immunreaktiv første bestanddel, omfattende at bærermaterialet påføres en løsning av den første bestanddel og en løsning av en andre bestanddel som immunutfeller den første bestanddel uten å forstyrre den spesifikke iramun-reaktiviteten av denne, etterfulgt av tørking av bærermaterialet impregnert med den immunutfelte, første bestanddel.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er kjennetegnet ved at bærermaterialet impregneres med en løsning av den første og den andre bestanddel, hvor minst én av bestanddelene even-.... tue.lt kan foreligge i urenset form, som i tillegg inneholder en inhibitor for immunutfellingsreaksjonen, eventuelt at det først fremstilles et suspensjonsbunnfall av de deltakende bestanddeler i immunreaksjonen som etter vasking oppløses

ved tilsetning av en inhibitor og deretter anvendes for impregnering av den porøse bærer, hvoretter immunutfellingen utløses ved fjerning av inhibitoren eller ved nøytralisering av den inhiberende virkning.

Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes et im-munutf ellingshemmestof f som er reversibelt virksomt og taper sin hemmevirkning ved enkel fjerning eller kjemisk forandring. I nærvær av hemmestoffet kan partnerne i den immunreaksjonen som fører til utfelling, fordele seg helt homogent, og på grunn av den meget langsomt innsettende utfellingen oppnås en fullstendig jevn dekning av bærermaterialet med den aktuelle, ønskede, immunreaktive substansen, som også i teknisk skala fører til helt jevne og reproduserbare resultater.

I motsetning til de kjente fremgangsmåtene for sekvenspåføring av antigen og antistoff (heterogen fremgangsmåte), som det er beskrevet i eksempel 4, impregneres det i den "homogene" fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med en homogen løsning av antigen og antistoff. Derved skilles det mellom to utførelsesformer: ved "1-trinns-fremgangsmåten" fjernes hemmestoffet, som inneholdes i impregnerings-løsningen, fra løsningen under fremstillingsfremgangsmåten eller gjøres uvirksom. Ved "2-trinns-fremgangsmåten" for-håndsimpregneres den porøse bæreren først med et aktivt stoff som opphever virkningen av hemmestoffet ved den etter-følgende impregnering med de immunreaktive bestanddelene.

En mulighet for fjerning av hemmestoffet er et vasketrinn før tørkingen, likeledes kan virkningen av hemmestoffet i det porøse bærermaterialet oppheves ved tilsetninger til vaskeløsningen.

Vasketrinnet er imidlertid intet nødvendig fremgangs-måtetrinn, således kan eksempelvis utfellingen utløses ved fordampning av et flyktig hemmestoff.

Som hemmestoff ved immunutfellingen anvendes fortrinnsvis slike substanser innenfor oppfinnelsens ramme som anvendes ved immunosorptive opprensninger som desorpsjons-middel. Særlig foretrukket for dette er syrer, baser eller chaotrope ioner av Hofmeister-rekken (lyotrop rekke), slike som eksempelvis er beskrevet i "Structure and Stability of Biological Macromolecules, 1969, Marcel Dekker, Inc., New York, side 427, så vel som bestemte organiske forbindelser eller løsningsmidler som acetonitril, urea eller glycerol.

Blant syrer som er egnet innenfor rammen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kommer så vel flyktige så vel som også ikke-flyktige syrer i betraktning. Flyktige syrer kan lett fjernes etter impregneringen av bærermateriale for opphevelse av hemmevirkningen, f.eks. ved oppvar-ming, vakuum o.l. Når det gjelder ikke-flyktige syrer, kan det oppnås en analog effekt ved anvendelse av et salt av en flyktig syre som spaltes av den ikke-flyktige syren under frigjøring av den flyktige syren. Foretrukne eksempler er eddiksyre, propionsyre og saltsyre for flyktige syrer. Likeså kan det anvendes flyktige og ikke-flyktige baser, som f.eks. ammoniakk og t-fosfat.

Videre er slike organiske forbindelser egnet som hemmestoffer som kan påvirke både protein- som også vann-strukturen reversibelt og eksempelvis er beskrevet i "J.F. Brandts, Conformatial Transitions of Proteins in Water", inneholdt i "Structure and Stability of Biological Macromolecules, 1969, Marcel Dekker, Inc., New York, side 213-290. Særlig foretrukket er glycerol og urea.

Som hemmestof fer kommer videre på tale chaotrope ioner, som thiocyanater og jodider. Eksempler på andre egnede ioner er: fluorider, bromider, perklorater, guanidin og sulfater. Fjerning av dem for å oppheve utfellings-hemmingen, kan foregå ved ekstraksjon, f.eks. med organiske løsningsmidler eller blandinger av organiske løsningsmidler (f.eks. estere) eller blandinger av organiske løsningsmidler og vann, eksempelvis vann/alkoholblandinger, eventuelt med tilsetning av ionoforer o.l. Som regel er det derved tilstrekkelig bare med en forandring av ionestyrken for å oppnå den ønskede effekten, dog kan også hemmestoffet fjernes fullstendig. Også en tilsetning av kompleksdannere som EDTA kommer på tale, f.eks. for fjerning av hemmende metallsalter som MgCl2.

De molare konsentrasjonene av de immunreaktive partnerne som fører til utfelling, kan varieres innen vide områder. Fortrinnsvis anvendes de ved oppfinnelsen slik at den partner hvis immunreaktivitet skal utnyttes i det fer-dige bærermaterialet, ikke foreligger i overskudd. Særlig foretrukket anvendes den partner som fører til utfelling i forholdet Heidelberger maksimum. Dette betyr at de to reaksjonspartnerne anvendes i det forhold som er gunstigst for utfelling. Dette forhold kan lett fastslås på forhånd ved hjelp av en uklarhetstest. En tilsvarende uklarhets-kurve finnes eksempelvis i "Methods in Immunology and Immunochemistry", Band III, Academic Press 1971, kapittel

13, side 10. Ved oppstillingen av en slik kurve påføres den uklarhet som oppnås ved konstant mengde av en av rekasjons-partnerne med tiltagende mengde av den andre reaksjonspart-neren. Uklarhetsmaksimum er Heidelberger maksimum.

For å oppnå størst mulig stabilitet hos det bærer-fikserte, immunreaktive stoffet, skal en av partnerne ved immunutfellingen fortrinnsvis være et utfellende antistoff med høyest mulig affinitet til antigenet.

Partnere ved immunutfelling i rammen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er på den ene side et antigen, f.eks. et hapten eller et protein, på den annen side et antistoff. Antigenet kan naturligvis selv likeledes være et antistoff. I et slikt tilfelle, når altså den immunreaktive bestanddel som skal utfelles, selv er et antistoff, kan denne også anvendes i form av et Fab, Fab' hhv. (Fab')2~fragment og så vel være et monoklonalt som også et polyklonalt antistoff. Det utfellende anti-antistoff som så anvendes for fellingen, må utvelges tilsvarende. Anti-antistoffet selv kan da være polyklonalt eller monoklonalt eller et (Fab')2-fragment derav. Dersom det handler om et monoklonalt antistoff eller et fragment derav når det gjelder anti-antistoffet, så skal dette hensiktsmessig ha to forskjellige epitoper ved antigenet. Det kan imidlertid også anvendes monoklonale antistoffer hhv. deres (Fab')2~fragmenter, som bare har én epitop (hvilket er hyppigere) når denne epitopen minst er til stede to ganger på antigenet. Det kan også anvendes blandinger av monoklonale antistoffer som anti-antistoffraksjon for immunutfellingen.

Som immunreaktivt stoff som skal utfelles, kan det

fortrinnsvis også anvendes et protein, til hvilket er koplet et hapten eller antigen. I dette .tilfelle anvendes hensiktsmessig et utfellende antistoff som andre partner ved immunreaksjonen som er rettet mot proteinet. I en ytterligere utførelsesform kan det være koplet et hapten eller antigen til det utfellende antistoffet. Derved kan den andre partneren ved immunreaksjonen være umarkert eller koplet med det samme eller et annet hapten eller antistoff. Alternativt er det proteinet som skal utfelles selv et spesifikt antistoff som utfelles av et anti-antistoff.

Som allerede nevnt ovenfor, er det en spesiell fordel ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen at minst én partner ved immunreaksjonen kan anvendes i urenset form. I motset ning til den kjente immunutfellingsfremgangsmåten, ved hvilken utfellingen starterøyeblikkelig etter sammenblan-ding av immunreaksjonspartnerne, kan hastigheten for utfellingen i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen foregå så kontrollert i suspensjon eller i det porøse bærermaterialet at det ikke opptrer noen medrivningseffekter av fremmedsub-stanser og de sistnevnte ikke må fjernes på forhånd, men ganske enkelt kan utvaskes etter immunutfellingen. Et slikt vasketrinn foretrekkes, da herved små utfellingspartikler, mindre stabile immunkomplekser og adsorptivt bundne antigener fjernes. Til vaskingen egner seg derfor buffere med høy ionestyrke, detergenter, organiske løsningsmidler o.l. så vel som tilsetninger som stabiliserer bunnfallene (carbo-hydrater og proteiner).

Når det skal gis avkall på en forrensing av bestanddelene ved immunutfellingsrensingen, er det hensiktsmessig først å blande løsninger som inneholder det aktuelle antigenet og de aktuelle antistoffene i optimalt Heidelberger-forhold, vaske det utfelte bunnfallet og igjen å oppløse immunutfallet ved tilsetning av hemmestoffet, fortrinnsvis ved syretilsetning. Det oppnås på denne måten en blanding av partnerne ved immunutfellingsreaksjonen som direkte kan påføres på det porøse bærermaterialet.

Naturligvis er det også mulig innenfor oppfinnelsens ramme på vanlig måte på forhånd å rense partnerne ved immunreaksjonen atskilt ved hjelp av immunadsorberere, så å eluere med et hemmestoff og enten å anvende eluatene direkte til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, eller først å fremstille stabile lagringsformer av reaksjonspartnerne ved lyofilisering. Hemmingen av immunutfellingen så vel som saktningen av fellingen i bærermaterialet etter opphevelse av hemmevirkningen kan understøttes ved hjelp av fysikalske metoder, som f.eks. temperatursenkning eller viskositets-økning.

Som bærere kommer innenfor rammen av oppfinnelsen

vanlige faste bærere for immunreaktive substanser i betraktning. Et slikt bærermateriale, som hyppig også betegnes som matrix, kan eksempelvis bestå av glass, plast, papir, porøst

metall o.l, forutsatt at bærermaterialet er tilstrekkelig gjennomhullet av sammenhengende væskegjennomtrengelige hul-rom. Egnet er naturlige, kunstige, organiske eller uorgan-iske polymerer. Likeså kommer fiberaktige, svampaktige eller sintrede substanser i betraktning. Som bærermaterialer kan det anvendes flate, partikkelformige eller andre, tre-dimensjonale, porøse legemer. Foretrukket anvendes flate, porøse bærere som papir, skumstoffolier, glassfibermatter o.l. Da fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen gir en fullstendig homogen fordeling av den immunreaktive substansén i disse flate matrixene, kan en dosering foregå meget enkelt på grunnlag av flateenheter. Slike immunreaktive, flate bærermaterialer egner seg spesielt for anvendelse som fast fase i de heterogene immunoprøvene.

Anvendelsen av et immunreaktivt bærermateriale, som

er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i rammen av heterogene enzymimmunoforsøk, kan f.eks. foregå slik at hapten (H) eller protein (P), som bl.a. inneholdes i en prøve som bufferløsning, serum, plasma, urin, overstående dyrknings-væske, tilsettes en markert binder (B). Som binder kommer bl.a. antistoffer, Fab"-fragment hhv. Fab-fragment så vel som ligander på tale som reagerer spesifikt med haptenet eller proteinet. Som markering av binderen kan det f.eks. anvendes et enzym, en fluorescensetikett eller en radioisotop, i de etterfølgende eksempler ble (3-galactosidase valgt. Mengden av den tilsatte binder kan foreligge molmessig så vel i overskudd som også i underskudd til det hapten eller protein som er til stede i prøven.

Denne blanding inkuberes i en konstant tid, mens kompleksene H-B hhv. P-B dannes. Etter at denne tiden er gått, foreligger det tre arter i reaksjonsblandingen, nemlig komplekset bestående av hapten/protein og binder (H-B, P-B), gjenværende fritt hapten/protein (H/P) og gjenværende fri binder (B).

Disse artene skilles fra hverandre i et andre trinn ved hjelp av immunosorpsjon. For å oppnå dette, påføres blandingen på den immunutfellingsfastfase som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, og som bundet inneholder det hapten hhv. det antistoff som skal påvise mot det protein som skal bestemmes.

Ved haptentesten bindes da den frie binder, men ikke den binder som er mettet med haptenet, til fastfasen. Følge-lig inneholder det overstående hhv. eluatet fra fastfasen den binder som er mettet med haptenet fra prøven. Den kvantitative bestemmelsen av haptenet foregår da via markeringen av binderen i de foreliggende eksemplene via bestemmelsen av B-galactosidase ved hjelp av o-nitrofenyl-p-D-galactosid eller klorfenolrødt-B-D-galactosid.

Ved proteintesten bindes komplekset .av protein og binder, men ikke den frie binderen til fastfasen, idet rester av den frie binderen fjernes ved vasking fra den immunosorbens som er fremstilt ifølge oppfinnelsen. Den kvantitative påvisning av proteinet foregår via den markerte binderen i de følgende eksemplene via bestemmelsen av B-galactosidase ved hjelp av o-nitrofenyl-p-D-galactosid eller klorfenolrødt-B-D-galactosid.

En annen anvendelse er kompetitive immuntester. An-vendelsen av det immunreaktive bærermaterialet som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan foregå slik at analytten (hapten eller protein), som inneholdes i prøven, tilsettes en konstant mengde av markert analytt. Markeringen kan f.eks. være et enzym, en fluorescensetikett, en radioisotop o.l. Denne blandingen tilsettes til matrixen. På matrixen er det immobilisert et antistoff som er rettet mot analyttene. Blandingen inkuberes en bestemt tid på matrixen. I løpet av denne tiden konkurrerer så vel uforandret analytt som også markert analytt om bindingsstillingene på matrixen. Jo mer analytt som er til stede i prøven, jo mindre markert analytt bindes av matrixen og omvendt. Ved slutten av inkuberingsfasen fjernes væsken fra den porøse matrixen, f.eks. ved sentrifugering. Så bestemmes mengden av markert analytt enten i den frie fasen eller mengden av markert analytt som er bundet til matrixen.

En annen anvendelse av bærermaterialene som er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan foregå slik at analytten (hapten eller protein) tilsettes en konstant mengde markert antistoff som er rettet mot analyttene. Mulige markeringsarter for antistoffet er beskrevet ovenfor. Denne blandingen inkuberes enten en bestemt tid og påføres

så på det porøse bærermateriale eller alternativt påføres det på det porøse bærermateriale like etter blandingen. Når analytten er et hapten, inneholder bærermaterialet det haptenet som skal påvise eller et derivat derav i fiksert form, dersom analytten er et protein, inneholder bærermaterialet det protein som skal påvise eller et derivat derav, likeledes i fiksert form. Dersom den første blanding ble inkubert før påføring på bærermaterialet, bindes markerte antistoffer til fortsatt frie bindingsstillinger på det porøse bærermaterialet. Dersom blandingen straks ble påført på bærermaterialet, konkurrerer analytten fra prøven og analytten som er fiksert på bærermaterialet om bindingsstillingene til det markerte antistoffet. Ved slutten av inkuberingsfasen fjernes væsken fra det porøse bærermaterialet, og mengden markert antistoff enten i den flytende fasen eller på det porøse bærermaterialet, bestemmes.

Følgende eksempler forklarer oppfinnelsen ytterligere.

Fremstilling av de stoffer som anvendes ved testene og gjennomføring av testene

A) Fremstilling av polyhaptener ( PH):

Fremstillingen av PH er kjent fra teknikkens stand. Således kan f.eks. et digoxin- eller difenylhydantoin-PH oppnås via reaktive, usymmetriske dicarboxylsyreestere/akti-verte haptenestere og deres binding til et bærerprotein.

Fremstillingen av T3- og T4-PH kan eksempelvis foregå ved direkte kopling av NH2~grupper fra hormon og protein ved hjelp av bis-imidater (EU-A 0078952), eller ved carbodiimid-reaksjonen (Aherne et al., Brit. J. Clin. Pharm. 3, 56,

(1976)) eller den "blandede anhydrid"-reaksjonen (Erlanger et al., Methods in Immunology and Immunochemistry, utg. Williams og Chase, Acad. Press (New York 1967) side 149 ff).' Alternativt kan NH2-funksjonen fra T3 eller T4 beskyttes i et første trinn med acetyl-, trifluoracetyl-, t-butoxycarbo- nyl- eller benzyloxygruppen. Deretter overføres carboxyl-funksjonen til en aktivert ester, f.eks. N-hydroxysuccini-midester, N-hydroxyfthaliraidester, N-hydroxybenztriazol-ester. Et eksempel på en således aktivert T4 er beskrevet i EU-A 0108400, eksempel 3. Omsetning med bærerproteinet gir

PH.

Utvelgelsen av bærerproteiner er ikke begrenset, for så vidt som bare ett tilsvarende "fellende" antistoff står til disposisjon hhv. kan fremstilles.

For så vidt som det foregikk en immunsorptiv oppren-sing av antigen og antistoff, ble det som bærer anvendt "affinitetsadsorberere, aktivert glutardialdehyd", fra Boehringer Mannheim (best. nr. 665525). For de eksemplene som er beskrevet nedenfor, etter forskrift fra fremstil-lerne, ble et saueantistoff mot kanin-IgG hhv. et spesielt antistoff mot haptenet bundet til bæreren for antigenoppren-singen og kanin-IgG bundet til bæreren for antistoffopprens-ingen. Gjennomføringen av immunosorpsjonen foregikk som beskrevet i arbeidsveiledningen til affinitetsadsorbensen. B) Fremstilling av binderen ( eksempel digoxin): Fremstilling av antiserum rettet mot digoxin. Fremstillingen av immunogenet, nemlig humanserumalbumin konjugert med digoxin, foregikk slik det utførlig er beskrevet av V.P. Butler jr. og J.P. Chen, Proe. Nat. Acad. Sei. US 51, 71-78 (1967) så vel som av T.W. Smith, V.P. Butler og E. Haber, Biochemistry 9, 331-337 (1970). Sauer ble immunisert med dette immunogenet og det tilsvarende antiserum utvunnet.

Fremstilling av binderen.

Antiserum, rettet mot digoxin, ble renset til IgG-fraksjonen ved hjelp av ammoniumsulfatfelling og passasje over DEAE-cellulose. Papainspaltningen ble gjennomført etter R.R. Porter, Biochem. J. 73, 119-126 (1959).

Fab-fragmentene ble skilt fra de ikke-fordøyede IgG-molekylene og Fc-fragementene ved hjelp av gelfiltrering over "Sephadex" G 100 og ionevekslerkromatografi over DEAE-cellulose etter litteraturforskriften (K. Malinowski og W.

Manski i "Methods in Enzymology"; J.J. Langone og H. van

Vunakis, utg. Academic Press, vol. 73 (1981) sider 418-459). Den resulterende Fab-fraksjonen ble renset kromatografisk og koplet til p-galactosidase etter forskriften til T. Kitiwaga i "Enzyme Immunoassay; Ishikawa, T. Kawai, K. Miyai, utg.

Igaku Shoin, Tokyo/New York (1981) sider 81-89.

C) Fremstilling av saueantistoff mot kanin- hhv, mus-IgG/ Fcy

Kaninslaktserum hhv. museserum ble underkastet en ammoniumsulfatfelling. Etter passasje over DEAE-cellulose og papainspaltning, gel- og ionevekslerkromatografi (se B)) oppnås Fc-fragmentene fra kanin- hhv. muse-IgG som immuno-gener.

Opparbeidelsen av saueantisera foregikk som beskrevet under B) (immunosorpsjon se A)). D) Gjennomføring av test ( eksempel digoxin): Digoxinstandarder i humanserum (tatt ut fra Elisa-pakningen fra Boehringer Mannheim, best. nr. 199656) ble fortynnet 1:7,5 med 0,9 % NaCl-løsning. Til 200 ul fortynnet standard ble 200 ul binder (20 mU/ml bestemt med orto-nitrofenyl-p-D-galactosid), fremstilt som beskrevet under B), inkubert i PBS pH 7,2 (fosfatbufret saltløsning) ved 37°C.

Deretter tilsettes 50 ul av blandingen på 1 cm<2>av det flate, immunreaktive bærermaterialet. Det ble videre inkubert i 5 min. ved 37°C og sentrifugert i 1 min. med en Eppendorf-sentrifuge.

Enzymaktiviteten til digoxinbinderkompleksene i den frie fasen kan nå måles kinetisk ved tilsetning av klor-fenolrødt-p-D-galactosid (fremstilling ifølge DE 33 45 748) ved 578 nm.

I eksemplene er forløpet av de "stigende" standardkurvene opptegnet, hvorved digoxinkonsentrasjonen i det ufortynnede serum (X-akse) er opptegnet mot den målte optiske tetthet ved 578 nm (Y-akse).

Alternativt kan overskudd, dvs. den mengde binder som er bundet til fastfasen, bestemmes som ovenfor og opptegnes mot den aktuelle digoxinkonsentrasjonen. Det oppnås en "fallende" standardkurve.

Eksempel 1

Fremstilling av T3-( trijodthyronin)- immunpresipitatstrimler Som antigen ble det anvendt: polyhapten, bestående av kanin-IgG og dertil bundet T3 (molforhold). Antigenet ble renset immunsorptivt ved hjelp av en anti-T3-søyle (se A)).

Som antistoff ble det anvendt: polyklonalt antistoff, rettet mot Fc-delen i kanin-IgG. Antistoffet ble renset immunsorptivt ved hjelp av en kanin-IgG-søyle (se A)).

Som strimmel ble det anvendt: blandingsstrimmel av cellull og polyester (firma Kalff, Euskirchen, BRD), eller av lintere, cellull, polyamid (firma Binzer, Hatzfeld, Eder,

BRD) .

Antigen og antistoff opptas atskilt i en 1 mM eddiksyre (for hver c = 1 mg/ml), og blandingen får stå i en time ved romtemperatur. Løsningene blandes så i forholdet 1:3 (antigen-/antistofforholdet tilsvarer da Heidelberger-maksimum) og fortynnes med et ni ganger så stort volum av en løsning av 250 mM eddiksyre og 5 mM natriumacetat.

Strimmelen trekkes gjennom fukteløsningen, væsken klemmes ut og strimmelen tørkes i 60 min. ved 30° i et luftetørkeskap. Strimmelen vaskes kromatografisk i en time med PBS-buffer, ph 6, og tørkes 30 min. ved 30°C i et luftetørkeskap.

Forholdet mellom måleområdet (standard 5 ng T3/ml - standard 0) og standard 0 oppgår til 11,8 (se tabell 1).

Tabell 1

Sammenlikning av T3-immunpresipitatstrimler, fremstilt ifølge forskjellige fremgangsmåter

Eksempel 2

Fremstilling av T3- immunpresipitatstrimler

(Homogen 2-trinns-fremgangsmåte)

Antigen, antistoff og strimler er de samme som i eksempel 1. Strimmelen impregneres med 50 mM NaCl og tørkes deretter i 30 min. ved 50°C i et luftetørkeskap.

Antigen og antistoff opptas hver for seg i 1 mM eddiskyre (hver c = 1 mg/ml) og får stå i en time ved romtemperatur. De to løsningene blandes i forholdet 1:3 og fortynnes med ni ganger så stort volum 50 mM eddiksyre.

Løsningen doseres på strimmelen (væskemetning av strimmelen), og den impregnerte strimmelen tørkes i 60 min. ved 30°C i luftetørkeskap. Strimmelen vaskes en time kromatografisk med PBS-buffer, ph 6,0, og tørkes i 30 min. ved 30°C i et luftetørkeskap.

Forholdet mellom måleområdet (standard 5 ng T3/ml - standard 0) og standard 0 oppgår til 12,0 (se tabell 1).

Eksempel 3

Fremstilling av digoxin- immunpresipitatstrimler

(Homogen 1-trinns-fremgangsmåte)

Som antigen ble det anvendt: polyhapten, bestående av kanin-IgG og dertil bundet digoxin (IgG: digoxin 1:3 til 1:4). Antigenet ble renset immunsorptivt over en anti-K-Fc y -søyle (se A)).

Som antistoff ble det anvendt samme polyklonale antistoff som i eksempel 1.

Som strimmel ble det anvendt en blandingsstrimmel av cellull og polyester (firma Kalff, Euskirchen, BRD).

Antigen og antistoff opptas hver for seg i 100 mM eddiskyre og i konsentrasjonene 1 mg/ml hhv. 3,5 mg/ml, og begge løsninger blandes i forholdet 1:1. Fukteløsningen fortynnes så med fire ganger så stort volum av 200 mM natriumcitratbuffer, pH 3,0.

Strimmelen trekkes gjennom fukteløsningen, væsken klemmes ut, strimmelen tørkes ved gjennomluftning i 10 min. ved 75°C og ettervaskes som i eksempel 1 og tørkes som foran.

Med de således fremstilte digoxin-immunpresipitat-strimlene ble den standardkurven som er vist i fig. 1, oppnådd. Det ble anvendt følgende standarder: 0, 0,3, 0,75, 1,75, 3, 5 ng digoxin/ml. Forholdet mellom måleområdet (standard 5 ng digoxin/ml - standard 0) og standard 0 oppgår til 4,9.

Eksempel 3a

Fremstilling av digoxin- immunpresipitatstrimler

(Uten vasketrinn)

Antigen (200 mg/l) og antistoff (700 mg/l) opptas hver for seg i 50 mM eddiksyre. Etter 15-30 min. ved romtemperatur blandes begge løsningene i forholdet 1/1. I et etterfølgende trinn fortynnes denne løsningen med det samme volumet av 50 mM eddiksyre pluss 40 mM NaCl. Strimlene impregneres med denne løsningen og tørkes i 10 min. ved 75°C.

Strimlene anvendes direkte i testen. Den dermed oppnådde standardkurven tilsvarer den i fig. 1.

Eksempel 4 ( sammenlikning)

Fremstilling av digoxin- immunpresipitatstrimler

(Heterogen 2-trinns-fremgangsmåte)

Antigen, antistoff og strimmel er de samme som i eksempel 3.

Antigen og antistoff opptas hver for seg i 1 mM eddiksyre (c = 5 mg/ml hhv. 17,5 mg/ml). Løsningene får stå i 30 min. ved romtemperatur, så fortynnes antigenløsningen med et 50 ganger så stort volum PBS-buffer, pH 6,0, og strimmelen fuktes med denne. Den tørkes deretter i 10 min. ved 75 °C i et luftetørkeskap. Den tørre strimmelen fuktes deretter med antistoffløsningen, som ble fortynnet 50 ganger med den overstående bufferen, og strimmelen tørkes i 10 min. ved 75°C. Etter vasking av strimmelen med den samme bufferen tørkes den i 10 min. ved 75°C.

Den krumme standardkurven som vises i fig. 2, oppnås. Forholdet mellom måleområdet (standard 5 ng digoxin/ml - standard 0) og standard 0 oppgår til 1,6.

(Alternativt kan først antistoffet og så antigenet fuktes.)

Eksempel 5 ( sammenlikning)

Fremstilling av digoxin- immunpresipitatstrimler

(Suspensj onsfremgangsmåte)

Antigen, antistoff og strimmel er de samme som i eksempel 3. Antigen og antistoff opptas hver for seg i 100 mM eddiksyre (c = 1 mg/ml hhv. c = 3,5 mg/ml), og løsningene får stå i 15 min. ved romtemperatur. Én del antigenløsning, én del antistoffløsning og 1,5 deler 100 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,6, blandes. Blandingen får stå i en time ved romtemperatur. Den dannede suspensjonen avsentrifugeres, den overstående væske kastes, og bunnfallet resuspenderes i et ni ganger så stort volum PBS-buffer, pH 6,0 (homogeni-seres). Strimmelen fuktes så med suspensjonen, slik at strimmelen er mettet med væske. Deretter tørkes i 10 min. ved 75 °C i et luftetørkeskap. Etter en times vasking med PBS-buffer, pH 6,0, tørkes på nytt i 10 min. ved 75°C.

Det oppnås en krummet standardkurve (se fig. 3). Forholdet mellom måleområdet (standard 5 ng digoxin/ml - standard 0) og standard 0 oppgår til 0,19.

Eksempel 6

Fremstilling av difenylhydantoin ( DPH) immunpresipitatstrimler

(Homogen 1-trinns-fremgangsmåte med presipitatvaskinger)

Som antigen ble det anvendt: polyhapten, bestående av kanin-IgG og dertil bundet difenylhydantoin.

Som antistoff ble det anvendt: polyklonalt antistoff, rettet mot Fc-delen i kanin-IgG.

Som strimmel ble det anvendt en blandingsstrimmel av cellull og polyester (firma Kalff, Euskirchen, BRD).

Antigen og antistoff (ikke renset immunsorptivt) opptas hver for seg i 100 mM eddiksyre (c = 1 mg/ml hhv. c = 20 mg/ml). Løsningene får stå i 15 min. ved romtemperatur.

Én del antigenløsning, to deler antistoffløsning og to deler 100 mM kaliumfosfatbuffer, pH 7,6, blandes, og suspensjonen får stå i en time ved romtemperatur. Bunnfallet avsentrifugeres, den overstående væske kastes, og bunnfallet resuspenderes i ni ganger så stort volum 100 mM kalium-fosf atbuf fer . Dette sentrifugerings-/vasketrinn gjentas tre ganger, så vaskes bunnfallet på samme måte saltfritt enda to ganger med destillert vann.

Bunnfallet opptas i 100 mM eddiksyre (c = 5 mg/ml). Den klare antigen-/antistoffløsningen får stå i 15 min. ved romtemperatur og fortynnes så med et fire ganger så stort volum av 200 mM natriumcitratbuffer, pH 3,0.

Strimmelen trekkes gjennom denne impregneringsløs-ningen, løsningen klemmes ut, strimmelen tørkes i 10 min. ved 75°C og ettervaskes som i eksempel 1 og tørkes som foran.

Med DPH-immunpresipitatstrimler som er fremstilt på denne måten, ble den standardkurven som er vist i fig. 4, oppnådd. Det ble anvendt følgende standarder: 0, 2,5, 5, 10, 20, 30 ug DPH/ml. Forholdet mellom måleområdet (standard 30 ug DPH/ml - standard 0) og standard 0 oppgår til 18,2.

Eksempel 7

Fremstilling av TSH- immunpresipitatstrimler

(Homogen 1-trinns-fremgangsmåte med presipitatvasking)

Som antigen ble det anvendt: monoklonalt antistoff, rettet mot human-TSH. Antistoffet (fra Ascites) ble renset ved ammoniumsulfatfelling og kromatografi på DEAE-cellulose.

Som antistoff ble det anvendt: polyklonalt antistoff, rettet mot Fc-delen i muse-IgG. Antistoffet ble renset ved ammoniumsulfatfelling og kromatografi på DEAE-cellulose.

Som strimmel ble det anvendt en blandingsstrimmel av cellull og polyester (firma Kalff, Euskirchen, BRD).

Antigen og antistoff ble hver opptatt i 100 mM kaliumfosfatbuffer, pH 6,0, 0,9 % NaCl (c = 1 mg/ml hhv. c = 17 mg/ml). De to løsningene blandes, og suspensjonen får stå i 30 min. ved romtemperatur. Bunnfallet avsentrifugeres, den overstående væske kastes, og bunnfallet resuspenderes i et ni ganger så stort volum av den ovennevnte buffer. Dette sentrifugerings-/vasketrinn gjentas fem ganger, så vaskes bunnfallet på samme måte saltfritt enda to ganger med destillert vann.

Bunnfallet opptas i 50 mM eddiksyre (c = 5 mg/ml). Den klare antigen-/antistoffløsningen får stå i 15 min. ved romtemperatur og fortynnes så med et fire ganger så stort volum av 20 mM natriumacetatløsning.

Strimmelen trekkes gjennom denne impregneringsløs-ningen, væsken klemmes ut, og strimmelen tørkes så i 30 min. ved 37°C i et luftetørkeskap. Strimmelen vaskes i en time kromatografisk med fosfatbuffer, pH 6,5, og tørkes i 30 min. ved 37°C.

Den standardkurve som er vist i fig. 5, ble oppnådd med TSH-immunpresipitatstrimler som er fremstilt på denne måten. Det ble anvendt følgende standarder: 0, 2, 6, 12, 24, 48 utiTSH/ml.

Eksempel 8

Fremstilling av TSH- immunpresipitatstrimler

(Homogen 2-trinns-fremgangsmåte med presipitatvasking)

Det vaskede bunnfallet fra eksempel 7 ble anvendt.

Samme strimmel ble brukt som i eksempel 7. Den tørre strimmelen ble deretter impregnert med 50 mM NaCl og tørket (10 min. 75°C).

Bunnfallet ble opptatt i litt 500 mM eddiksyre (akku-rat så mye at bunnfallet løste seg), og så ble det fortynnet med 5 mM eddiksyre til c = 1 mg/ml. Løsningen doseres på strimmelen (væskemetning av strimmelen). Den tørkes i 30 min. ved 30°C i et luftetørkeskap. Så vaskes strimmelen kromatografisk med natriumacetat og deretter med fosfatbuffer, pH 6,5, og tørkes ved 37°C.

Med TSH-immunpresipitatstrimler som er fremstilt på denne måten, ble den standardkurven som er vist i fig. 6, oppnådd. Det ble anvendt følgende standarder: 0, 2, 6, 12, 24, 48 IU TSH/ml.

Eksempel 9

(Sammenlikning av impregneringsløsningenes stabiliteter)

Antigen og antistoff er de samme som i eksempel 1. Antigen og antistoff ble hver for seg oppløst i en løsning av hemmestoffet, 0,1 M NaCl og 0,5 % RSA. De to løsningene innstilles med 0,2 N HC1 (eddiksyre og propionsyre gir sammenliknbare resultater) til pH 6,0, pH 4,0 hhv. pH 2,0. Så blandes løsningene av antigen og antistoff som har samme pH, og tidsforløpet for bunnfalldannelse fulgt. Fig. 7 viser at like etter blanding av antigen og antistoff faller immunpresipitat ut ved pH 6,0, ved pH 4,0 dannes det et lite og etter en time fortsatt ikke avsluttet bunnfall, og ved pH 2,0 dannes ikke bunnfall.

Eksempel 10

Fremstilling av T4-( trijodtyronin)- immunpresipitatstrimler

(Uten vasketrinn)

Som antigen ble det anvendt: polyhapten, bestående av kanin-IgG og dertil bundet T4 (molforhold IgG:T4 = 1:3). Antigenet ble renset immunsorptivt over en anti-T4-søyle (se

A)).

Som antistoff ble det anvendt: polyklonalt antistoff, rettet mot Fc-delen i kanin-IgG. Antistoffet ble renset immunsorptivt over en kanin-IgG-søyle (se A)).

Som strimmel ble det anvendt: blandingsstrimmel av cellull og polyester (firma Kalff, Euskirchen, BRD), eller av linter, cellull, polyamid (firma Binzer, Hatzfeld, Eder,

BRD) .

Fremstilling av matrixen:

Antigen (400 mg/ml) og antistoff (1400 mg/l) opptas hver for seg i 50 mM eddiksyre pluss 0,5 % NaCl. Etter 15-30 min. blandes begge løsninger i forholdet 1/1, og strim melen impregneres med denne. Etter tørking (10 min., 75 °C) impregneres strimlene med PBS og tørkes (10 min., 75°C).

Eksempel 10a

Fremstilling av T4- immunpresipitatstrimler

(Med vasketrinn)

Antigen (2 mg/ml) og antistoff (7 mg/ml) oppløses hver for seg i destillert vann. Begge løsninger fortynnes

med 50 mM Na3PC>4i forholdet 1 + 4 . Like store volumer av de fortynnede løsningene blandes. Strimlene impregneres med denne. Strimlene tørkes i 10 min. ved 75°C i et luftetørke-skap. Deretter vaskes kromatografisk med 10 mM fosfatbuffer, til eluatet oppviser en pH-verdi på 5,0.

Etter vaskingen tørkes det.

Eksempel 10b

Fremstilling av T4- immunpresipitatstrimler

(Uten vasketrinn)

Antigen (2 mg/ml) og antistoff (7 mg/ml) oppløses hver for seg i destillert vann. Begge løsninger fortynnes med 50 mM NH4OH i forholdet 1+4. Like store volumer av de fortynnede løsningene blandes. Strimlene impregneres med denne. Strimlene tørkes i 10 min. ved 75°C og anvendes direkte i testen.

De standardkurver som ble oppnådd med strimlene fra eksemplene 10, 10a og 10b, tilsvarer standardkurvene fra de forangående eksemplene.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et porøst bærermateriale inneholdende en immunreaktiv første bestanddel, omfattende at bærermaterialet påføres en løsning av den første bestanddel og en løsning av en andre bestanddel som immunutfeller den første bestanddel uten å forstyrre den spesifikke immunreaktiviteten av denne, etterfulgt av tørk-ing av bærermaterialet impregnert med den immunutfelte, første bestanddel karakterisert vedat bærermaterialet impregneres med en løsning av den første og den andre bestanddel, hvor minst én av bestanddelene eventuelt kan foreligge i urenset.form, som i tillegg inneholder en inhibitor for im-munutf ellingsreaks jonen , eventuelt at det først fremstilles et suspensjonsbunnfall av de deltakende bestanddeler i immunreaksjonen som etter vasking oppløses ved tilsetning av en inhibitor og deretter anvendes for impregnering av den porøse bærer, hvoretter immunutfellingen utløses ved fjerning av inhibitoren eller ved nøytralisering av dens inhiberende virkning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det som inhibitor anvendes en syre eller en base.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat det anvendes en flyktig syre eller base, og at denne fordampes etter impregneringen av bærermaterialet.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 2,karakterisert vedat det som inhibitor anvendes en ikke-flyktig syre eller base og det anvendes et bærermateriale som er impregnert med et salt av en flyktig syre hhv. base.

5. Fremgangsmåte ifølge krav1karakterisert vedat det som inhibitor anvendes glycerol eller urea, og at disse etter impregnering av bærermaterialet ekstraheres med en blanding av minst ett organisk løsningsmiddel og vann.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat det som inhibitor anvendes et metallsalt, og at dettes inhiberende virkning i bærermaterialet oppheves med kompleksdannere.

7 . Fremgangsmåte ifølge et av krav krav 1,karakterisert vedat det som inhibitor anvendes et chaotropt ion av Hofmeister-serien.

8. Fremgangsmåte ifølge krav7,karakterisert vedat det som inhibitor anvendes et thiocyanat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav7,karakterisert vedat det som inhibitoranvendes et alkalijodid.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat partnerne i immunreaksjonen anvendes i forholdet Heidelberger-maksimum.