NO830712L - Homogen immunoproeve med merket monoklonal anti-analytt - Google Patents

Description

Utviklingen av immunologiske analyseteknikker har tilveiebragt svært nyttige analytiske.- fremgangsmåter for påvisning av forskjellig organiske stoffer av diagnostisk, medisinsk, miljømessig, og industriell betydning, som opptrer i flytende medier i svært lave konsentrasjoner. Immunologiske analyser er basert på den spesifike gjensidige immunologiske bindingspåvirkning mellom stoffet som skal bestemmes, her-etter betegnet analytt, f.eks. et antigen, hapten-celler antistoff, og dets bindingspartner, f.eks. det tilsvarende antistoff eller antigen.

Ved vanlig brukte immunologiske analyseteknikker, blandes

en prøve som skal analyseres med reagenssystemer av forskjellige sammensetninger i en flytende reaksjonsblanding. Slike systemer omfatter vanligvis (i) et merket konjugat, som er et konjugat av analytten eller en spesifik bindingsanalog derav, og et markørstoff, og (ii) en begrensende mengde av et antistoff (antianalytt) til analytten. I reaksjonsblandingen konkurrerer så analytten i prøven og det merkede konjugatet om å bindes til antianalytten, hvorved det dannes en antistoffbundet type, og en fri type av det merkede konjugatet. Den relative mengde eller forholdet mellom det merkede kongugatet som fåes i den bundne typen, og den frie typen, er en funksjon av tilstedeværelsen, (eller mengden) av analytten i prøven. Følgelig kan man måle det merkede stoffet i den frie eller bundne typen, og korrelere den målte mengde med nærværet eller mengden av analytt i prøven.

Den første immunologiske analysen som ble utviklet, var

den radioaktive immunologiske analysen som benytter en radioaktiv isotop som markør. På grunn av ubekvemheten og vanskelighetene med å håndtere radioaktive materialer, er det utviklet analysesystemer hvor det brukes andre materialer enn radioaktive isotoper som markørbestanddel, f.eks. omfattende enzym kofaktorer, enzym substrater, enzym modula-torer, -aktivatorer og -inhibitorer, ringslutningsreaktanter,

spinnradikaler, enzymer, bakteriofager, metaller og organo-metalliske komplekser, organiske og uorganiske katalysatorer, prostetiske grupper, kjemiluminiserende reaktanter og fluorescerende molekyler.

Når det merkede konjugatet i den bundne arten praktisk talt ikke lar seg skille fra det merkede konjugatet i den frie typen, ved hjelp av de midlene som brukes for å undersøke etter markøren, slik som i tilfellet med radioaktiv immunologisk analyse, må den bundne typen og den frie typen adskilles fysisk for å fullføre analysen. Innen teknikken betegnes denne analysetypen for "heterogen". Når det kan skilles mellom den bundne typen og den frie typen av det merkede konjugatet, i nærvær av hverandre, kan man følge et "homogent" format, og undergå separasjonstrinnet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører immunologiske analyse-fremgangsmåter og reagenssystemer for kvantitativ eller kvalitativ bestemmelse av en analytt i en prøve hvor det anvendes merkede antistoffer.

Merkede antistoffer har vært brukt i heterogene immunilogiske analyser hvor det anvendes en rekke forskjellige markørstof-fer, blant dem. fluorescerende markører (Coons-net al., J. Immunol. 45:159 (1942)), radioaktive markører (Miles og Hales, Nature 219:186 (1968)), enzym markører (US patent

rir. 3.654.090) o.l. For en alminnelig oversikt vises det til "Principles of Competitive Protein-Binding Assays, utgitt av Odell and Daughaday, J.B. Lippincott, Philadel-fia (1972) side 260 og følgende. Til tross for vesentlige iboende fordeler ved bruken av merkede antistoffer,-i direkte immunologiske analyseteknikker sammenlignet med konkurrerende teknikker, hvor det anvendes merkede analyttkonjugater, har det bare vært gjort begrenset bruk av merkede antistoffer på området homogene immunologiske analyser.

US patentskrift nr. 4.2 33.4 02 og Litman et al., Anal.

Biochem. 106:223 (1980) beskriver en enzymkanalisert ad-'komst til en homogen immunologisk analyse. Ved denne teknikken merkes to populasjoner av antistoffer til analytten, hver for seg med to forskjellige enzymer, i det produktet av det ene av enzymene er et substrat for det andre enzymet. Når medlemmer av de to merkede antistoffpopulasjonen bindes til analytten, bringes de to enzymene i nær kontakt med hverandre, noe som resulterer i en forøket produksjonshas-tighet for signalet som til slutt måles. Denne teknikken krever merking av to forskjellige sett antistoffer med to forskjellige enzymer for å få de to merkede antistoff-reagensene.

Et i noen grad lignende prinsipp finnes i den energiover-førende, homogene immunologiske analyseteknikken beskrevet i US patentskrift nr. 3.996.345 og Ullman et al., J. Biol. Chem. 251:4172 (1976). Ved denne teknikken merkes anti-analytt med den ene av et par av et fluorescensfrembringer-stoff og fluorescensstopper-stoff, og et annet reagens dannes av det andre stoffet i dette paret konjugert med analytt. Binding av merket antistoff til det merkede analyttkonjugatet gir en endring i fluorescens på grunn av stans i energioverføring. Tilstedeværelsen av analytt fra en prøve frembringer konkurranse om denne bindingen, og en tilsvarende minking i fluorescensstansing. Denne teknikken krever også fremstillingen av tp merkede reagenser og, som rapportert av Ullman et al., gir en uønsket tofase-respons.

En annen homogen teknikk rapportert i litteraturen hvor det anvendes merkede antistoffer, omfatter merkingen med enzymet fosfolipase C [Wei og Rube, Clin. Chem. 23:1386

(1977).]. Binding av en analytt med høy molekylvekt (IgG) til det enzymmerkede antistoffet forårsaker sterisk inhibering av den katalyttiske virkning til fosfolipase C på

dets substrat, normale erytrocytter. Følsomheten og sær-egenheten til en slik teknikk begrenses alvorlig av vanske-

ligheten med å fremstille antistoffer med enhetlig bindings-begjærlighet og -særegenhet, og å fjerne ikke-spesifike proteiner fra antistoffpreparatet. Ettersom vanlig brukte fremgangsmåter ble anvendt for å fremstille antiserum, krev-des det vesentlige mengder med renset analytt som et immuni-serende middel. Antiserumet som fremstilles ved hjelp av disse fremgangsmåtene, vil bestå av en ganske ulik samling av antistoffer med forskjellig særegenhet og bindingsbegjær-lighet overfor analytten. Isoleringen av antistoffer som var spesifike for analytten, krevde affinitetsrensing på

en grunnmasse hvor analytten var kovalent bundet. Igjen ville en slik utførelsesform være fullstendig uegnet for ene analytt som i seg selv ikke kan erholdes i tilstrekkelig mengde eller renhet til å fremstille både et immunigen og en effektiv affinitetsabsorbent. Ved oppbryting av resulterende antigen-antistoff komplekser på affinitetskolonnen for å frembringe fritt antistoff for merking, ville dessuten de sterkere bindende, mer "glupske" antistoffene som er de mest ønskverdige for bruk i analysen, være de vanske-ligste å frigjøre. Følgelig ville det forventes at det eluerte antistoffet i overveiende grad ville ha en lavere reaksjonsbegjærlighet eller kanskje til og med være dena-turert antistoff. Med mindre komplekment fjernes fra antiserumet før affinitetsrensing kunne dertil komplementet bindes til antigen-antistoff komplekset dannet på affinitetskolonnen, og ville elueres sammen med antistoff og bli et potensielt ikke-spesifikt merket protein som ville øke bakgrunhssignalet.

For å overvinne ulempene ved de tidligere kjente, homogene immunologiske analysene som har forsøkt på å anvende merkede antistoffer, har forskere på området tydd til stadig mere kompliserte reagenssystemer som omfatter ytterligere og mere komplekse reagenser. Dette demonstreres gjennom den immunologiske analyseteknikken basert på en enzymforsterkning som er tilveiebragt av Gibbons et al., Clin. Chem. 27:

1602 ( 1981). Se også US patentskrift nr. 4.287.300.

Ved denne teknikken merkes igjen to populasjoner av antistoffer, det ene settet modifiseres kjemisk til å bli negativt ladet, og det andre merkes med et enzym. Prøven, som inneholder analytten blandes med et reagenssystem som omfatter det negativt ladede antistoff, det enzym-merkede antistoff og et makromolekylært, positivt ladet substratkompleks. Binding av de to forskjellig merkede antistoffene til analytt gir en øket reaksjonshastighet på grunn av den sted-bestemte tiltrekning av de ladede reagensene.

Andre like komplekse utførelsesformer som er foreslått for

å bruke merkede antistoffer i homogene immunologiske analyser, er beskrevet i US patentskrift nr. 4.208.479 og 4.256.834. Ved disse utførelsesformene, kreves det et markørmodifiserende makromolekyl i tillegg til det signal-genererende system for at responsen fra markøren skal moduleres som en funksjon av analytt.

Et formål ved den foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en mohogen immunologisk analysefremgangsmåte hvor det anvendes merkede antistoffer som overvinner ulempene ved den tidligere kjente teknikk. En slik fremgangsmåte vil beholde de vesentlige fordelene ved å bruke merkede antistoffer, sammenlignet med bruken av merkede analyttkonjugater, men overvinne tapene av følsomhet på grunn av nærvær av ikke-spesifike merkede proteiner og gi en svært forenklet analyseprotokoll som omfatter et enkelt bindings-reagens, nemlig merket antistoff.

En aktuell, alminnelig oversikt over anvendelsen av monoklonale antistoffer i kliniske immunologi; er g^-tt i Clin. Chem 27:1797 (1981). Oversikten regner opp flere fordeler ved å bruke, merkede antistoffer i immunologiske analyser, og drøfter noen få potensielle fremtidige an-vendelser av merkede monoklonale antistoffer i analysesystemer basert på proksimal binding av merkede antistoff-par. Forslaget er å erstatte vanlig brukte polyvalente antistof fer med merkede monoklonale antistoffer i de kjente analyse-systemene hvor det anvendes to forskjellige populasjoner av merkede antistoffer, slike som regnet opp ovenfor, f.eks. enzymkanaliserende og energioverførende systemer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en homogen immunologisk analyse hvor det anvendes et enkelt merket antistoff-reagens. En prøve som mistenkes å inneholde den analytten som er av interesse, kombineres med et merket monoklonalt antistoffpreparat hvor antistoff til analytten i det alt vesentlige er den eneste merkede bestanddel. Eventuelt kombineres prøven også med et makromolekylært konjugat omfattende epitoper som er istand til å bindes til den merkede monoklonale antianalytten. Markøren som anvendes velges slik at en påvisbar respons er ulikt målbar på en kvalitativ eller kvantitativ måte når den merkede anti-analytten bindes til analytten sammenlignet med når den ikke bindes slik, eller, når det makromolekylære konjugatet også er tilstede, er ulikt målbar når den merkede anti-analytten er bundet til konjugatet sammenlignet med når den ikke er bundet slik eller når den er bundet til analytten. Den resulterende påvisbare respons er derfor en funksjon av analytten i prøven. I fravær av konjugatet, er der en forøket binding av merket anti-analytt ved forøket analyttkonsentrasjon, og følgelig forøket modulasjon av den påvisbare respons hos markøren.

Når konjugatet er tilstede, modulerer binding av merket anti-analytt til konjugatet den påvisbare respons hos mar-køren. Med forøket analyttkonsentrasjon blir det mindre binding av merked anti-analytt til konjugatet, og følgelig avtar modulasjonen av den påvisbare respons hos markøren.

Anti-analytten er et immunologisk avledet, spesifikt bindende stoff, f.eks. et antistoff eller fragment derav.

Ved den foretrukne utførelsesform forårsakes modulasjon av markørresponsen etter binding av merket anti-analytt av steriske virkninger. Markøren utvelges for å tilveiebringe den påvisbare respons ved gjensidig påvirkning mellom et medlem av et reagenspåvisningssystem med overskudd av nevnte medlem, og markøren som hindres sterisk ved binding av analytt, eller eventuelt konjugatet, til den merkede antianalytt. Foretrukne markører omfatter deltagere i enzymkata-lyserte reaksjoner, slik som substrater, koenzymer, prostetiske grupper, inhibitorer og enzymer selv.

Et grunnleggende trekk ved foreliggende fremgangsmåte er fremstillingen av merket antianalytt hvor antianalytten i det alt vesentlige er den eneste merkede bestanddel. Ved å ha hovedsakelig ren, merket anti-analytt, er bakgrunns-respons på grunn av markør koblet til ikke-spesifikt materiale praktisk talt fraværende. Anvendelsen av monoklonale teknikker for å oppnå antianalytt, tilveiebringer en ny og svært fordelaktig fremgangsmåte for å fremstille slike rene merkede antianalyttpreparater.

Fremstillingsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter det første trinnet med å erholde et monoklonalt

antianalyttpreparat ved somatisk sellehybridisering. Ikke-spesif ike proteiner fjernes lett og effektivt ved å utsette det monoklonale preparatet for en separasjonsteknikk som er selektiv for immunglobuliner. Ettersom praktisk talt alle immunglobuliner i preparatet vil være monoklonale, dvs. kjemisk identiske, vil den fraskilte immunglobulinfraksjonen hovedsakelig være fri for ikke-spesifike bestanddeler.

Det utvalgte markørstoffet kobles deretter kjemisk, f.eks. ved dannelse av kovalente bindinger, til antianalytt i det rensede preparatet ved hjelp av en hvilken som helst vanlig brukt teknikk for modifikasjon av protein.

Flere bestemte analyttiske og fremgangsmåtetekniske fordeler karakteriserer den foreliggende immunologiske analysefremgangsmåte og reagenssystem. Viktigst blant dem er kravet på kun et enkelt merket antistoff-reagens. For å bestemme en analytt, behøver reagenssystemet kun å bestå av den merkede antianalytten, og bestanddelene i et hvilket som helst nødvendig påvisningssystem for reagens til gjensidig påvirkning med markøren for å tilveiebringe en påvisbar analyserespons. Ved å anvende merket antianalytt eliminieres nødvendigheten av å fremstille et særskilt analyttmerket konjugat for hver forskjellig analytt som man måtte ønske å bestemme. Ved oppbyggingen av en serie analyser for en gruppe forskjellige analytter i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, velger man vanligvis en bestemt type antianalytt som skal brukes i alle de enkelte analysene, f.eks. et antistoff av IgG-klassen. Antistoffer til de mange forskjellige analyttene vil ha den samme grunnleggende IgG-struktur for hvilken en enkelt merkingsteknikk kan brukes for å fremstille de krevede, merkede antianalytt-reagensene. Dette er en betydelig syntetisk fordel ved oppbyggingen av en familie av analyser.

En annen betydelig fordel ved den foreliggende oppfinnelse, er elimineringen av behovet for nøye å rense analytten for å fremstille det merkede konjugatet. I de tidligere kjente teknikker hvor det anvendes analytt-merkede konjugater, kreves det ren analytt dersom betydelig ikke-spesifik merking skal unngås. Ved den foreliggende oppfinnelse erholdes sterkt spesifik antianalytt naturlig ved hjelp av somatisk selv-hybridisering, selv når forholdsvis urene analyttpreparater brukes til dyreinjeksjoner for å stimulere produksjon av anti-analytt. Videre er en beslektet fordel at forholdsvis små mengder analytt kreves for å få store mengder anti-analytt til merking og bruk som et analysereagens ettersom analytt kreves til fremstilling av analysereagenserie bare for å stimulere den innledended anti-analytt produk-sjonen. Fortsatt anti-analytt produksjon er mulig^uten behovet for noen ytterligere analytt ved hjelp av kjente monoklonale fremgangsmåter for antistoff-formering.

Når analytt er et spesielt sjeldent eller vanskelig materiale å erholde, tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse en ytterligere svært fordelaktig fremgangsmåte for å frem stille den merkede anti-analytt. Hovedsakelig rene, merkede anti-analyttpreparater erholdes ved hjelp av kromatografi-teknikker som ikke krever analytt som en affinitetsbinder. Gjennom bruken av monoklonale antistoffteknikker, erholdes anti-analytt preparater som inneholder homogent immunglobulin. Ikke-spesifikt materiale kan fjernes ganske enkelt ved kromatografi med selektive bindere av immunglobulinklasse. Alle de merkede antistoffene vil ha like stor reaksjonsevne i motsetning til den tidligere teknikkens forsøk på

å komme frem til en praktisk og følsom analyse ved å bruke merkede, vanlige antistoffer. Ved bruk av den tidligere kjente teknikk, vil alle anti-analytt merkes uten hensyn til reaksjonsevne eller spesifisitet, noe som tjener til ytterligere å øke bakgrunnsresponsen.

Fig. 1 viser sammenlignende diagrammer for de respektive prinsippene ved vanlig homogen immunologisk analyse basert på konkurrerende binding som krever analytt-markør konjugater og ved den foreliggende oppfinnelse hvor det anvendes merket anti-analytt. Fig. 2-4 er grafiske fremstillinger av resultater angitt i eksempel 1 for bestemmelsen av human IgG i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse. Fig. 5 er en grafisk fremstilling av resultater angitt i eksempel 2 for bestemmelse av gentamycin i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelse.

I sammenheng med denne beskrivelsen skal de følgende uttrykk defineres på følgende måte, med mindre annet er angitt: Analytt - forbindelsen, eller klassen av beslektede forbind elser, hvis nærvær eller mengde i en prøve skal

bestemmes.

Anti-analytt - et immunologisk avledet bindingsstoff som er spesifikt for analytten, vanligvis bestående av

hele antistoffer eller antistoff-deler.

Homogen immunologisk analyse - en analyse basert på den spesifike binding mellom analytt og antianalytt,

hvor markørresponsen måles uten fysisk adskillelse av den bundne, merkede typen fra den frie merkede

typen.

Reagens-system - et preparat, en prøveinnretning eller et apparat, et prøvesett eller andre fysiske arrange-menter, midler eller kombinasjon av reagenser for bruk ved utførelse av den foreliggende analyse.

Ved en foretrukket utførelsesform er den foreliggende analyse basert på modulasjon av responsen fra en markør konjugert til anti-analytt etter binding av analytt til en slik merket' anti-analytt. Angående fig. 1, så benyttes det ved homogene immunologiske analyser for bestemmelse av en analytt (An) basert på:konkurrerende binding, et analytt-markør-konjugat (An<*>) og anti-analytt (anti-An). An og An<*>plas-seres sammen i konkurranse om bindinger til en begrenset mengde anti-An. Komplekser av henholdsvis An og An<*>bundet av anti-An dannes, og etterlater et eller annet overskudd ubundet An<*>. Det ubundne An<*>uttrykker et eller annet signal som modifiseres eller moduleres i (An<*>:Anti-An) komplekset. I motsetning til dette, kan den foreliggende analyse utføres ved enkel tilsetning av merket anti-analytt (anti-An<*>) resulterende i komplekser av An og anti-An , dvs. (An:anti-An<*>) som uttrykker et modifisert eller modulert signal. Modifikasjon eller modulasjon av markørresponsen kan være resultatet av en lang rekke mulige virkninger som skyldes binding av analytt til den merkede anti-analytt. F.eks.

kan markørresponsen være utsendelsen av et signal f. eks.

et elektromagnetisk signal, som modifiseres på en eller annen målbar måte ved nærheten mellom analytten eller bestemte grupper på analytten og markøren i det resulterende kompleks. Et slikt tilfelle ville gjelde for analysen av proteinholdige analytter under anvendelse av en fotogen markør, f.eks. et fluorescerende eller kjemiluminiserende

stoff. Passende utvelgelse av markøren vil resultere i slukking eller forsterking av markørsignalet på grunn av nærhets-virkninger med kjemiske grupper i proteinanalytten som enten er felles for proteiner generelt eller særskilte for det

bestemte proteinet som analyseres, f.eks. grupper som absor-berer markørutstrålingen eller hydrofobe grupper.

En særlig foretrukket mekanisme for modulering av markør-responsen er sterisk hindring. Binding av analyse til merket antianalytt vil ufravikelig skape en eller annen sterisk endring i markørens omgivelse. Passende utvelgelse av betingelser vil forårsake at slike steriske virkninger blir tilstrekkelig store til målbart å påvirke markørens mulig-heter til å gi sin normale respons. Fortrinnsvis velges markøren for å tilveiebringe den påvisbare analyserespons etter gjensidig påvirkning, f.éks. kjemisk omsetning, med et medlem av et påvisningssystem av reagenser som omfatter en eller flere stoffer som samvirker med markøren for å frembringe det målte signal. I slike analysesystemer velges mengden av det merkede antianalyttkonjugatet slik at det økes betydelig etter binding av analytten. Etter hvert som mengden av analytten blir relativt større, blir de steriske virkningene i markørens omgivelser mer tydelige.

I tilfeller som omfatter sterisk hindring, er markøren

selv fortrinnsvis liten, f.eks. med molekylvekt mindre enn 50 000, vanligvis mindre enn 10 000, mer vanlig mindre enn

4000, og fortrinnsvis mindre enn 2000, og påvisningssyste-mets medlem eller medlemmer som den samvirker med, er fortrinnsvis betydelig større, f.eks. mer enn 3 ganger større, mer vanlig 10 ganger større og fortrinnsvis 20 til 100 ganger eller mer større enn markøren. I de mest foretrukne systemer med markører som har masser i størrelsesorden 100 til 2000 dalton, vil følgelig minst et medlem av påvisningssystemet, som markøren må samvirke med for å tilveiebringe det påvisbare signal, være i størrelsesorden 10 000 til 200 000 dalton eller større. Et slikt størrelsesfor-

hold mellom markøren og medlemmet i påvisningssystemet, øker muligheten for en bestemt sterisk virkning etter binding av analytt til den merkede antianalytt. Foretrukne markører til dette er deltagere i en enzymkatalysert reaksjon, slik som enzymsubstrater, koenzymer, protetiske grupper i enzymer og enzyminhibitorer, etter som det er tilgjengelig en lang rekke enzymreaksjoner hvorfra det kan velges analysebestand-deler. Mange små substrater, koenzymer og inhibitorer er kjente for enzymer med tilstrekkelig stor molekylvekt til å ha det foretrukne størrelsesforhold mellom markør og dens samvirkende medlem fra påvisningssystemet. Dette gjelder

på samme måte for prostetiske grupper og deres tilsvarende apoenzymer. På samme måte er mange enzymer kjent som har betydelig større substrater eller for hvilke det kunstig kan fremstilles store substrater, koenzymer eller inhibitorer ved å koble små substrater, koenzymer og inhibitorer til bærermaterialer med høy molekylvekt, slik som vannoppløse-lige polymerer.

De steriske virkninger av analytt/anti-analyttbinding forsterkes også ved å velge antianalytter med masser som vil bli betydelig økt ved kompleksdannelse med analytt. Vanligvis vil anti-analytten fortrinnsvis være mindre enn 10 ganger massen av analytten, mer vanlig mindre enn den absolutte massen av analytten, og mer foretrukket mindre enn 0,25 ganger massen av analytten. Anti-analyttens masse kan minskes ved å velge antistoffer av en immunglobulinklasse som har lave molekylvekter, f.eks. har IgG antistoffer molekylvekter rundt 15 0 000 mens de av IgM klassen har molekylvekter rundt 900 000. Man kan også selektivt spalte antistoffer til fragmenter med lavere molekylvekt som beholder sin spesifike bindingsaffinitet til analytt, f.eks. kan forskjellige fragmenter av IgG antistoffer fremstilles slik som Fab (50 000 dalton), F(ab<1>) (53 000 dalton), og F(ab')2d06 000 dalton).

Følgelig er det ved bestemmelse av analytter basert på sterisk hindring av markøren etter binding av merket anti-analytt foretrukket å arbeide med store analytter, f.eks. molekylvekter større enn ca. 10 000, mer vanlig større enn ca. 50 000, og fortrinnsvis større enn ca. 100 000, og å velge forholdsvis små anti-analytt typer, f.eks. hele IgG antdstoffer eller deler derav. På samme måte er det i slike systemer foretrukket å velge forholdsvis små markører og forholdsvis store medlemmer av påvisningssystemet som markør-ene samvirker med.

Når analytten ikke er tilstrekkelig stor til å forårsake

en sterisk hindring av markøren i den merkede analytten etter binding, som er stor nok til å gi en signifikant målbar endring i påvisningsresponsen til markøren, kan en ytterligere bestanddel tilsettes til systemet for å gjøre det analyttisk brukbart. En slik tilleggsbestanddel er et makromolekylært konjugat som omfatter epitoper (dvs. antigeniske determinanter eller bindingsseter for antistoffer) som lar seg binde av den merkede monoklonale antianalytten hvorved binding av et slikt konjugat med merket anti-analytt forårsaker en målbar endring i markørresponsen sammenlignet med ubundet, merket anti-analytt og sammenlignet med merket anti-analytt bundet i konkurranse til analytt. Denne alternative teknikken er basert på konkurranse mellom analytt og det analytt-analoge makromolekylære konjugatet om binding til merket monoklonal anti-analytt. De samme para-metere gjelder her som ved den foretrukne direkte bindings-teknikk med.hensyn til størrelsesvalg for antianalytt,

markør og det samvirkende medlem eller medlemmer av påvisningssystemet. Videre er det makromolekylære analyttkonjugatet fortrinnsvis stort i forhold til antianalytt for å

øke steriske virkninger. Fortrinnsvis er molekylvekten til det makromolekylære konjugatet større enn 0,1 ganger, mer vanlig større enn og mest foretrukket 4 ganger større enn molekylvekten til den utvalgte anti-analytt. Relativt sett er analytten mye mindre enn anti-analytten, vanligvis mindre enn 10 ganger dens molekylvekt, og er vanligvis av

en størrelse på ca. 5000 dalton eller mindre, fortrinnsvis mindre enn ca. 1000 dalton.

I denne alternative teknikken kan det makromolekylære konjugatet være oppbygd på en lang rekke forskjellige måter for å tilveiebringe et makromolekyl med bindingsseter som gjenkjennes av den merkede anti-analytt. F.eks. kan analytten selv eller en spesifik bindingsanalog derav (dvs. en forbindelse som strukturelt er analog med analytten og som vil bli gjenkjent og bindes til anti-analytten), polymeri-seres eller kryssbindes til en makromolekylær enhet. Vanligvis vil konjugatet bestå av et materiale med høy molekylvekt, f.eks. en vannoppløselig polymer, til hvilken det er bundet vanligvis ved hjelp av kovalente bindinger, et antall rester'som enten er analytten eller en bindingsanalog til analytten. Bærermaterialet har vanligvis en molekylvekt større enn ca. 10 000, men kan varieres etter ønske for analyseutførelse. Koblingen av analytt eller analytt-analog til slike makromolekylære matriser utføres ved hjelp av teknikker som er tilgjengelig for gjennomsnittsfagmannen. Bærermaterialet kan være et naturprodukt, modifisert naturprodukt eller et syntetisk materiale. Nyttige "ryggrads"- eller bærer-polymerer omfatter proteiner, polypeptider, polysakkarider og lignende, i det bestemte eksempler omfatter albumin, dextran, stivelse og agarose. Bæreren kan være kryssbundet eller på annen måte kjemisk modifisert.

Den foreliggende oppfinnelse kan anvendes for analysen av

en hvilken som helst analytt som antianalytt er tilgjengelig for eller kan fremstilles for. I de fleste tilfeller er analytten et peptid, polypeptid, protein, karbohydrat, glykoprotein, steroid eller annet organisk molekyl som det kan fremstilles anti-analytt for. Analytten er med funksjonell betegnelse vanligvis valgt fra gruppen omfattende antigener og antistoffer til disse, haptener og antistoffer til disse,, og hormoner, vitaminer, metabolitter og farmako-logiske midler, og deres bindingsmotparter. Vanligvis er

analytten et immunologisk antivt polypeptid eller protein,

som vanligvis har en molekylvekt på mellom ca. 1000 og ca.

10 000 000, slik som et antistoff eller antigenpolypeptid eller -protein, eller et hapten med en molekylvekt på mindre enn ca. 100 og vanligvis mindre enn ca. 1500.

Den foretrukne direkte bindingsteknikken ifølge den foreliggende oppfinnelse, hvor binding av analytt til merket anti-analytt gir modulasjon av markørresponsen, er særlig fordelaktig når den anvendes til bestemmelsen av materialer med forholdsvis høy molekylvekt, slik som polypeptider, proteiner, polysakkarider, polynukleinsyrer og lignende.

En særlig fordel fåsi. når. analytten er et spesielt sjeldent materiale slik det er tilfelle med mange høymolekylære bestanddeler i prøver av analyttisk interesse, f.eks. biologiske prøver, slik som serum, plasma, blod, urin og spytt. Den foreliggende oppfinnelse kan bygges opp med en absolutt minimal mengde renset analytt-materiale.

Representative polypeptid-analytter er angiotensin I og II, C-peptid, oxytocin, vasopressin, neurofysin, gastrin, sekre-tin, bradykinin og glukagon.

Representative proteinanalytter omfatter følgende typer: protaminer, mucoproteiner, glykoproteiner, globuliner, albu-miner, scleroproteiner, fosfoproteiner, histoner, lopoprotei-ner, kromoproteiner og nukleoproteiner. Eksempler på bestemte proteiner er prealbumin, cx-^-lipoprotein, human serum albumin, a-^-syre glukoprotein, a-^-antitrypsin, ct-^-glukoprotein, transkortin, tyroxinbindende globulin, haptoglobin, hemoglobin, myoglobin, ceruloplasmin, o^-lipoprotein, o^-makroglobulin, 3-lipoprotein, erytroprotein, transferin, hemopexin, fibrinogen, immunglobulinene slik som IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, og deres bestanddeler, f.eks. Fc og F^, komplementfaktorer, prolaktin, blodlevringsfaktorer, slik som fibrinogen, probin osv., insulin, melanotropin, soma-totropin, tyrotropin, follikelstimulerende hormon, lautini- serende hormon, chorionisk gonadotropin, skjoldkjertelstimu-lerende hormon, morkakelaktogen, intrinsik faktor, transko-balamin, serumenzymer, slik som alkalisk fosfatase, laktisk dehydrogenase, amylase, lipase, fosfataser, cholinesterase, glutaminsyre-oxan eddiksyre-transaminase, glutaminsyre-pyrodruesyre-transaminase og uropepsin, endorfiner, enkefa-liner, protamin, leivantigener, bakterielle antigener og virale antigener slik som hepatitis forbundne antigener

(f.eks. HB Ag, HB Ag og HB Ag).

SOQ

Hapten-analytter kan likeså bestemmes, særlig ved å bruke den alternative konkurrerende teknikk omtalt ovenfor, som omfatter anvendelsen av et makromolekylært analyttkonjugat. Representative haptenanalytter omfatter de generelle typene som legemidler, metabolitter,1 hormoner, vitaminer og lignende organiske forbindelser. Haptenhormoner omfatter jod-thyroniner slik som thyroxin og trijodthyronin. Vitaminer omfatter vitaminene A, B, f.eks. B12/c/D/E°9K»folin-syre og thiamin. Legemidler omfatter antibiotika, slik som aminoglukosider, f.eks. gentamycin, tobramycin, amikacin, sisomicin, kanamycin og netilmicin, penicillin, tetracyklin, terramycin, klormycetin og aktinomycetin; nucleosider og nucleotider, slik som adenosin difosfat (ADP) adenosin trifosfat (ATP), falvin mononucleotid (FMN), flavin adenin dinucleotid (FAD), nikotinamid adenin dinucleotid (NAD) og dens fosfatderivat (NADP), thymidin, guanosin og adenosin; prostaglandinerfsteroider, slik som østrogener, f.eks. estriol og estradiol, sterogener, androgener, digoxin, digitoxin og adrenokortikale steroider; og andre slik som fenobarbital, fenytoin, primidon, etosuximid, karbamazepin, valproat, theophyllin, kaffein, propranolol, quinidin, ami-triptylin, cortiso:!, desipramin, disopyramid, doxepin, doxorubicin, nortriptylin, metotrexat, imipramin, lidocain, procainamid, N-acetylprocainamid, amfetaminer, catekolaminer og antihistaminer.

Anti-analytt bestanden ifølge foreliggende oppfinnelse kan være et hvilket som helst immunologisk avledet monoklonat bindingsstoff som er spesifikt eller selektivt for binding av analytten. Når den er i form av helt monoklonalt antistoff, kan anti-analytten tilhøre en hvilken som helst under-type av de kjente typene immunglobuliner, f.eks. IgG,

IgM, IgE o<sv. Det kari også anvendes et hvilket som helst fragment av et slikt antistoff som beholder spesifik bindingsaffinitet for analytt, f.eks. fragmentene av IgG som vanligvis er kjent som Fab, F(ab<1>) og F(ab')2** tillegg kan det, når det passer slik, anvendes aggregater, polymerer og konjugater av immunglobuliner eller fragmenter som anti-analytt. Slike poly(anti-analytter) kan fremstilles på en hvilken som helst tilgjengelig måte for å opprettholde spesifik bindingsaffinitet for analytten. Andre former anti-analytt kan anvendes så lenge materialet som utvelges eller fremstilles, har monoklonal opprinnelse, og har en spesifik bindingsaffinitet for analytt.

Immunglobulinkilden for anti-analytten ifølge foreliggende oppfinnelse erholdes ved hjelp av hybridiseringsteknikker som somatiske celler, vanligvis referert til som monoklonale antistoff-teknikker. Slike teknikker er nå velkjente som generelle redskaper for fremstilling av kjemisk homogene antistoffer (se den generelle oversikt "Lymphocyte Hybridomas", utgitt hos Melchers et al., Springer Verlag (New York 1978), og "Methods in Enzymology" 73, (del B): 3-46 (1981)).

Generelt sett fremstilles monoklonalt antianalytt immunglobulin ved å smelte sammen lymfocytter som produserer slikt antistoff med myelomaceller hvorved det dannes hybridoma, isomere en hybridomaklon som utskiller det ønskede-antistoff til den aktuelle analytten, og samle opp det utskilte monoklonale antistoffet. Lymfocyttene involvert i hybridiseringen er vanligvis miltceller fjernet fra et dyr, slik som en mus eller rotte som er blitt immunisert mot analytten.Fortrinns-vis er både lymfocytt- og myelomacellene av gnager-opprinnelse.

Dannede hybridomas som utskiller det ønskede antistoff isoleres, vanligvis ved å klone på dyrkningsmedia som er selektive for de sammensmeltede céllehybridomas, og bestemmer ved hjelp av passende fremgangsmåter en isolert hybridomas som utskiller detønskede antistoff. Ensartetheten av hybri-domacellelinjen sikres deretter fortrinnsvis ved underkloning av de hybridimas som er utvalgt på grunn av sin forønskede antistoffutskillelse. Oppsamling av de utskilte monoklonale antistoffene utføres ved hjelp av vanlig kjente teknikker. Formering av antistoffer kan utføres ved å dyrke hybridomas in vitro eller in vivo, f.eks. ved å innføre hybridomaen i et.dyr, slik som en mus, og fjerne antistoffrike væsker fra bukhulen.

Forskjellige typer markører er nyttige ved foreliggende oppfinnelse, det eneste kravet er at binding av den merkede anti-analytt modulerer dens påvisbare respons. Som angitt ovenfor, kan det anvendes forskjellige fotogene markører, slik som fluorescerende stoffer og kjemiluminiserende stoffer, hvor binding av merket antianalytt frembringer en forstyrrelse i deres lysutsendelse. Fortrinnsvis er sterisk hindring det forårsakende element ved modulasjon av markør-respons. Det følgende er bestemte eksempler, uten begrens-ning, på forskjellige typer markører som kan anvendes ved foreliggende fremgangsmåte.

1. Enzymsubstrat-markør.

I dette systemet velges markøren slik at det merkede anti-analytt-konjugatet er et substrat for et enzym og muligheten for enzymet til å virke på det substratmerkede konjugatet påvirkes, enten i en positiv eller negativ betydning, men vanligvis på en inhiberende måte ved binding av det merkede konjugatet til analytt. Virkning av enzymet på det substratmerkede konjugatet gir et produkt som lar seg skille ut ved et eller annet trekk, vanligvis et kjemisk eller fysisk trekk, slik som kjemisk reaktivitet i en indikatorreaksjon eller slik som en fotometrisk egenskap, f.eks. fluorescens eller lysabsorbsjon (farge). Markører av denne type er generelt beskrevet i US patentsøknad nr. 894.836, inngitt 10. april 1978 (svarende til GB patentskrift nr. 1.552 607); og i "Anal. Chem" 48:1933 (1976), "Anal. Biochem." 77:55 (1977) og "Clin. Chem" 23:1402 (1977). I slike enzymsubstrat-merkede teknikker vil det merkede konjugatet, f.eks. et substrat-anti-analytt konjugat, ha den egenskap at det kan påvirkes av et enzym, ved spalting eller modifikasjon, til å fremstille et produkt med en påvisbar egenskap, som adskiller det fra konjugatet. F.eks. kan konjugatet være ikke-fluorescerende under analysebetingelser, men etter omsetning med enzym, kan et fluorescerende produkt fremstilles.

Forskjellige fluoregene substratmerkede konjugater er iøyen-fallende for bruk ved slike teknikker. F.eks. kan det merkede konjugatet ha formelen:

hvor G er en avspaltbar gruppe, slik som fosfat, karboksylat, sulfat eller glykon, D er en fluorogen fargestoffrest som etter fjerning av G gir et fluorescerende produkt, f.eks.

kan det være umbelliferon, fluorescein, rhodamin og deres derivater, R er en sammenbindende gruppe, Ab er anti-analytt, og n er det gjennomsnittlige antall markører pr. molekyl antianalytt, f.eks. mellom 1 og 50. Enzymatisk avspalting (f.eks. ved hjelp av fosfatase, karboksylase, sulfatase, glykosydase, etc.) av det merkede konjugatet påvirkes ved binding av analytt til anti-analytt Ab delen av konjugatet.

Se US patentskrift nr. 4.279.992. Ved et særlig-foretrukket substratmerket analysemønster anvendes et merket konjugat av typen:

hvor R, Ab og N er som definert ovenfor, hvorved muligheten til enzymet (3-ga.laktosidase til å spalte konjugatet og gi et produkt som lar seg adskille ved hjelp av sin fluorescens, inhiberes ved binding av konjugatet til analytt.

Andre nyttige substratmerkede konjugater er de med formelen: hvor R' er en sammenbindende gruppe som lar seg spalte med enzym, f.eks. fosfat, karboksylat o.l., Ab og n er som definert ovenfor, og D er en fluorogén fargestoffrest definert som ovenfor, som etter spalting av R frigir en fluorescerende indikator. Ved en særlig foretrukket teknikk, anvendes et merket konjugat av typen:

hvor R"1" er en binding eller en kjede som knytter sammen den merkede bestanddel Ab med den spaltbare fosfatgruppe og R2

er hydrogen eller en substituentgruppe, slik som lavere alkyl, f.eks. metyl og etyl, N-alkylamido eller N-(hydroksysubstitu-

ert lavere alkyl)amido, f.eks. -CONH-(CH2) -0H hvor m = 2-6 (se US patentskrift nr. 4.273 715). Umbelliferonresten bære andre eller ytterligere substituenter (se "Anal. Chem" 4 0:803

(1968)). Spalting ved hjelp av fosfodiesterase påvirkes

ved binding av analytt til anti-analytt Ab delen i konjugatet.

2. Koenzym-markører.

Det merkede konjugatet i dette systemet er i sin markørdel satt sammen av en koenzym-virksom funksjonell gruppe, og muligheten til en slik konenzym-markør til å delta i en enzymatisk reaksjon, påvirkes ved binding av det merkede anti-analytt-konjugatet til analytten. Hastigheten til den resulterende enzymatiske reaksjon er målbar ved hjelp av vanlig brukte påvisningssystemer hvorved man får et endelig påvisbart signal. Markører av denne typen er beskrevet i US patentsøknad nr. 894.836, inngitt 10. april 1978 (svarende til GB patentskrift nr. 1.552.6 07), og i "Anal. Biochem" 72:271 (1976), "Anal.Biochem". 72:283 (1976) og "Anal. Biochem." 76:95 (1976).

3. Markører som utgjøres av en prostetisk gruppe.

I dette systemet er markøren en prostetisk gruppe i et enzym, og evnen til et katalyttisk inaktivt apoenzym til å kombineres med markøren i form av en prostetisk gruppe til et aktivt enzym (holoenzym) påvirkes ved binding av det merkede antianalytt-konjugatet til analytten. Resulterende holoenzymvirkning er målbar ved hjelp av vanlig brukte påvisningssystemer som gir et endelig påvisbart signal. Markører av denne type er beskrevet i US patentskrift nr. 4.238.565. Ved et særlig foretrukket prostetisk gruppemerket analyseskjerna, anvendes flavin adenin dinucleotid (FAD) som markøren og apoglukoseoksydase som apoenzymet. Resulterende glukoseoksydaseaktivitet er målbar ved hjelp av et kolo-rimetrisk påvisningssystem omfattende glukose, peroksydase og et indikatorsystem som gir en fargeendring som respons på hydrogenperoksyd. Fluorometrisk påvisning av hydrogenperoksyd er også mulig under anvendelse av et passende fluorogent substrat.

4. Markører som utgjøres av en enzymmodulator.

Det merkede konjugatet i dette systemet er i sin markørdel sammensatt av en enzymmodulerende funksjonell gruppe, slik som en enzyminhibitor eller stimulator, og evnen til en slik modulatormarkør til å modulere aktiviteten til et enzym påvirkes ved binding av det merkede antianalytt-konjugatet til analytten. Hastigheten til den resulterende enzymatiske reaksjon er målbar ved hjelp av vanlig brukte påvisningssystemer ,' hvorved man får et endelig påvisbart signal. Markører av denne typen er beskrevet i US patentskrift nr. 4.174.7 92 og 4.273.866. Særlig foretrukket er bruken av metotrexat som markøren med dihydrofolat reduktase som det modulerende enzymet. Når markøren er en. enzyminhibitor, kan den samvirke med enzymet kovalent eller ikke-kovalent, og kan være et lite molekyl, f.eks. metotrexat, eller et stort molekyl, f.eks. antistoff til enzym (se US patentskrift nr. 4.273.866 samt US patentsøknad nr. 285.605, inngitt 21. juli 1981).

5. Enzymmarkører.

I dette systemet er markøren et enzym og aktiviteten til enzymmarkørén påvirkes ved binding av det merkede antianalytt-kon jugatet til analytten. Resulterende enzymaktivitet er målbar ved hjelp av vanlig brukte påvisningssystemer, hvorved man får et endelig påvisbart signal, f .eks*-- absorb-sjon eller fluorescens. Markører av denne type er beskrevet i US patentskrift nr. 3.817.837 og 4.043.872.

6. Kjemisk exiterte fluorescensmarkører.

I dette systemet er markøren igjen et fluorescerende stoff, evnen til fluorescensmarkøren til å bli kjemisk exitert til et energinivå hvor den fluorescerer, påvirkes imidlertid ved binding av det merkede antianalytt-konjugatet til analytten. Kjemisk exitering av markøren utføres vanligvis ved eksponer-ing av fluorescensmarkøren mot en høyenergi-forbindelse dannet in situ. Markører av denne type er beskrevet i US patentskrift nr. 4.238.195.

7. Epitopmarkører.

I dette systemet omfatter markøren en epitop, dvs. et anti-stof f bindende sted, for et annet antistoff, dvs. antimarkør, eller del derav. Antimarkørens evne til å bindes til mar-kør i det merkede antianalytt-konjugatet påvirkes ved binding av'slik merket antianalytt til analytten. Flere over-våknings- eller påvisningssystemer er mulige. I ett tilfelle er epitopmarkøren også et fluorescerende stoff hvis lysutsendelse endres, f.eks. reduseres, ved binding til anti-fluorescerende stoff. Merket antianalytt bundet til analytt forhindrer tilgjengelighet for fluorescensmarkøren til det slukkende anti-fluorescerende stoff (se US patentskrift nr. 3.998.943). Ved en annen utførelse anvendes det et ytterligere påvisningsmolekyl som omfatter epitopmarkøren koblet til et enzym. Binding av antimarkør til dette épitopenzym-konjugatet resulterer i inhibering av enzymaktivitet. Dess mere antimarkør som forhindres fra binding til markør på den epitopmerkede anti-analytten ved analytt-binding, dess mer antimarkør er tilgjengelig til å bindes til å inhibere enzymaktivitet hos epitop-enzym reagenset (se US patentskrift nr. 3.935.074.

Rensing og merking av anti:-analytt.

Så snart det er erholdt et monoklonalt anti-analytt preparat (bukhulsvæske eller vevskulturvæske) adskilles det en fraksjon som i det vesentlige inneholder bare immunglobulin fra de andre proteinene som kan være tilstede. Slik separasjon kan utføres på en hvilken som helst tilgjengelig måte. For denne oppgaven anvendes fortrinnsvis affinitetskromatografi-teknikker. Som affinitetsbindende partner på kromatografi-kolonnen, kan det anvendes anti-(anti-analytt) som vanligvis vil være et antistoff til typen immunglobulin som den ønskede anti-analytten tilhører, f.eks. anti-IgG, eller en del derav. Selv om det ikke er en foretrukken fremgangsmåte, kan man også bruke analytt som affinitetsbindende deltaker. Ved en foretrukket affinitetskromatografiteknikk, anvendes det stoffet som vanligvis refereres til som protein A, et protein som utskilles av staphylococcus aureus og som har den ene-stående egenskap at det bindes spesifikt til IgG immunglobuliner (J. Immunol. 97:822 (1966) og Immunol. 103:828 (1969)). Protein A er tilgjengelig i handelen som det isolerte proteinet' eller knyttet til gelpartikler som egner seg for bruk som en affinitetskromatografi kolonnematrise (protein A-Sepharose, Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, USA). Bruken av protein A for å utskille anti-analytt fra

det monoklonale preparatet gir den foreliggende oppfinnelse en betydelig fordel. Analytten behøver ikke selv å være renset, og knyttet til et kolonnematrisemateriale for å rense anti-analytt. Ettersom det eneste immunglobulinet som er tilstede i det monoklonale preparatet, er anti-analytt, behø-ver man bare å anvende teknikken som adskiller immunglobuliner og man er sikret at kun antianalytt isoleres.

Det rensede anti-analytt-preparatet merkes så i henhold til det bestemte påvisningssystemet som er ønsket. Markøren, som beskrevet ovenfor, er bundet til antianalytt på en hvilken som helst tilgjengelig måte. Ettersom det eneste protein som er tilstede i noen vesentlig grad i det rensede anti-analytt-preparatet, er anti-analytt, kan markørstoffet knyttes effektivt og spesifikt til anti-analytt deri ved omsetning under betingelser som danner kovalente bindinger mellom markørstof-fet og proteiner generelt. Denne muligheten til å bruke standard proteinmodifikasjonsreaksjoner for å merke anti-analytt uten omsyn til ikke-spesifik merking av proteiner, er en ytterligere betydelig fordel ved den foreliggende oppfinnelse.

Som i konjugatet som er merket på vanlig måte, er markøren knyttet kovalent til bestanddelen som skal merkes, her anti-analytt, ved hjelp av én kjemisk binding, f.eks. en enkel-binding, eller ved hjelp av en kjede som omfatter fra 1 til 50 atomer, mere vanlig 1 til 30 atomer, og vanligvis 1 til 2 0 atomer, med unntak av hydrogen, i det vesentlige satt sammen av karbon- og heteroatomer valgt fra nitrogen, oksy-gen, fosfor og svovel. Vanlig brukte sammenbindingsgrupper er utførlig beskrevet i litteraturen. Se f.eks. US patentskrift nr. 4.230.797, 4.279.992, 3.817.837, 3.935.074 og 3.996.345. Den sammenbindende gruppe kan omfatte en side-kjedegruppe som er satt på markøren for det formål å gi rom og/eller funksjonalisere markøren for sammenbinding med proteiner, og/eller resten fra et bifunksjonelt sammenbinddngs-middel brukt ved sammenbinding av markøren eller et derivat av markøren med anti-analytten som har protein-natur.

De foreliggende merkede anti-analytt konjugatene fremstilles vanligvis ved å danne peptid- eller amidbindinger mellom en amino- eller karboksylgruppe som inneholder markør eller mar-kørderivat, og tilsvarende karboksyl- eller aminogrupper i anti-analytt proteinet. Slike kondensasjonsreaksjoner kan utføres ved hjelp av vanlig brukte fremgangsmåter for danning av peptidbinding, slik som karbodiimidreaksjonen (Science 144:1344 (1974)), den blandede anhydridreaksjon (Erlanger et al., Methods in Immunology and Immuno-chemistry, utgitt Williams og Chase, Academic Press (New York 1967) side 149), og syreazid- og aktiv esterreaksjonene (Kopple, Peptides and Amino Acids, W.A. Benjamin, Inc., (New York 1966)). For en generell oversikt, vises det også til Clin. Chem. 22:726

(1976).

Det er også tilgjengelig andre velkjente fremgangsmåter for kobling av markøren eller et derivat derav til antianalytten. Især kan det brukes vanlig brukte bifunksjonelle koblings-midler til kobling av en markør eller dens derivat, som inneholder en karboksylsyre- eller aminogruppe, til aminogrupper i anti-analytten. F.eks. kan det brukes amin-amin koblings-midler slik som bis-isocyanater, bis-imidoestere og glutar-aldehyd (Immunochem. 6:53 (1969)). Passende koblingsreaksjoner er også velkjente for innføring av en brugruppe ved kobling av et amin til en karboksylsyre. Koblingsreaksjoner av denne type er grundig diskutert i litteraturen, f.eks. i den ovenfor nevnte Kopple-monografen og i Lowe & Dean, Affinity Chromatography, John Wiley&Sons (New York 1974). Selvfølge-lig er også mange andre måter tilgjengelige for kobling av markøren eller markørderivatene til de forskjellige andre funksjonelle gruppene i anti-analyttproteinstrukturen, slik som beskrevet i litteraturen som vedrører proteinmodifika-sjon, inkludert uten begrensninger, litteraturreferansene nevnt ovenfor, Means og Feeney, Chemical Modification of Proteins, Holden-Day (San Francisco (1971); og Glazet et al., Chemical Modification of Proteins, Elsevier (New York 1975). Det bør tas rimelige omsyn, slik at det ikke velges fremgangsmåter som denaturerer anti-analytt, slik at merkings-trinnet ikke fører til dannelsen av merket inaktiv antianalytt som vil øke bakgrunnssignalet.

En eller flere markører kan knyttes til et enkelt anti-analyttmolekyl og, i de tilfeller hvor markørens egenskaper tillater det, vice versa. Vanligvis vil anti-analytten bære mellom 1 og 30, mere vanlig mellom 1 og 20, markører pr. molekyl antianalytt. Mens det er ønskelig å ha flere markører pr. anti-analytt for å bedre følsomheten, kan en for høy merkingstetthet påvirke evnen til anti-analytten til effektivt å binde analytt. I tilfellet hvor markøren er forholdsvis stor og flerfunksjonen, slik som hos et enzym, kan flere anti-analytter bindes til en enkelt markør. Binding til analytt fører til dannelsen av gittere på grunn av binding av et enkelt merket anti-analytt konjugat til flere analytt-molekyler, hvorav hvert enkelt igjen kan bindes av merket anti-analytt som fører til øket gjensidig påvirkning, f.eks. sterisk hindring, på eller nær markøren.

Reaksjonsblanding og -betingelser.

Prøven som skal analyseres kan være en naturlig forekommende eller kunstig fremstilt væske som mistenkes for å inneholde analytten, og er vanligvis en biologisk væske eller en fortynning derav. Biologiske væsker som kan analyseres omfatter serum, plasma, urin, spytt, melk og fostervann og cerebrospinal væsker.

Bindingsreaksjonen vil i de fleste tilfeller få fortsette under milde betingelser. Reaksjonsblandingen vil vanligvis være et vandig medium med hvilke som helst ønskede organiske samvirkende oppløsningsmidler tilstede i mindre mengder. Temperaturen under reaksjonen vil bli holdt på et konstant nivå under normale omstendigheter gjennom inkubasjonsperioden og målingstrinnet. Temperaturen vil vanligvis være mellom 5 og 5 0°C, mer vanlig mellom 2 0 Og 4 0°C. Fortrinnsvis vil reaksjonen skje ved værelsestemperatur. Reaksjonsblandingens pH vil variere mellom 5 og 10, mer vanlig mellom 6 og 9. Konsentrasjonen av de forskjellige reagensene vil avhenge

av det forventede analyttnivået i prøvemediet, idet slike nivåer vanligvis vil være mellom 10 -3 og 10 —12M. Som i tilfellet med de tidligere beskrevne reaksjonsparametrene, er utvelgelsen primært basert på empirisk utledet optimalisering balansert mot det som foretrekkes av og behovene til teknikken som til sist skal utføre analysen på en rutinebasis. Ingen av parametrene for reaksjonen er av kritisk natur for foreliggende oppfinnelse, de er alle heller innenfor det som kan betraktes som fagmessig.

Reagenssystemci

Reagenssystemet, dvs. kombinasjonen av reagensmidler, ifølge foreliggende oppfinnelse, omfatter alle de vesentlig kjemiske elementene som krevet for å utføre den ønskede analysefremgangsmåte innenfor den foreliggende oppfinnelse. Reagenssystemet frembys i en pakke-form for salg, som en sammenset-ning eller blanding hvor forenligheten mellom reagensene tillater en pakket kombinasjon av en eller flere beholdere som inneholder de nødvendige reagensene, i en prøveinnretning eller som et prøvefelt. Inkludert i reagenssystemet er reagensene som passer for det ønskede bindingsreaksjonssystemet, og som alltid krever et merket anti-analytt konjugat som definert ovenfor. Slike bindingsreaksjons-reagenser kan omfatte i tillegg til det merkede konjugatet, et hvilket som helst annet nødvendig eller eventuelt reagens for utførelse av den bestemte, aktuelle analyseteknikken. Selvfølgelig kan reagenssystemet omfatte andre reagenser som er kjente innen teknikken, og som kan være ønskelig ut fra et handels-eller brukersynspunkt, slik som buffere, fortynningsmidler, standardløsninger osv. Også foretrukket er en prøveinnretning som omfatter reagenssystemet og et fast bærermedlem inkorpo-rert i dette. De forskjellige former for slike prøveinnret-ninger er beskrevet i US søknad nr. 202.378, inngitt 30. oktober 1980, som det herved refereres til.

Den foreliggende oppfinnelse illustreres, men er ikke ment

å begrenses, av de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Bestemmelse av humant IgG.

A. Rensing av monoklonalt antistoff til humant IgG.

Bukhulevæske fra mus som inneholder monoklonalt antistoff

til humant IgG (F spesifikt, Bethesda Research Laboratories, Rockville, Maryland, USA) ble renset ved hjelp av affinitetskromatografi, enten på humant IgG-Sepharose eller staphylococ-cusprotein A-sepharose.

(1) Fremstilling av humant IgG-sepharose.

Humant IgG-sepharose ble fremstilt på følgende måte. Sepharose 4B (Pharamia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, USA) ble vasket med destillert vann og lagret ved 4°C over natten. Sepharosen ble samlet opp på en grov glassfritte og tørket inntil det kom til syne sprekker i gelen. Den tørk-ede sepharose 4B ble veid, og 20 g ble plassert i et plast-beger sammen med 2 0 ml kaldt vann og en magnetisk rørestav. Begeret ble plassert i en utkrystalliseringsskål av glass sammen med is på en magnetisk omrører. Det ble innført en pH-elektrode og termometer, pH ble justert til ca. pH 11,5 med en dråpe 10 N natriumhydroksyd (NaOH) og deretter ble 8 g nymalt cyanbromid (CNBr) tilsatt. pH ble holdt ved pH 11,0 til 11,5 ved den dråpevise tilsetningen av 10 N NaOH

og temperaturen ble holdt ved 5-10°C ved tilsetning av isbiter. Etter 17 minutter ble reaksjonen avsluttet ved å dekantere gelen over på en gros glassfritte. Noe uomsatt CNBr forble tilbake i begeret.

Gelen ble vasket med 10 volum-deler (200 ml) kaldt, destillert vann etterfulgt av 0,1 M natriumkarbonat, pH 9,0.

Gelen ble tørket inntil det kom tilsyne sprekker i den, og deretter ble den overført til en 12 5 ml Erhlenmeyer-kolbe. Humant IgG (150 mg, Research Products Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA) oppløst i 10 ml 0,1M natriumkarbonatbuffer, pH 9,0, ble tilsatt sammen med ytterligere 5 ml skyllevæske av karbonatbuffer. Blandingen ble plassert i kjølerommet på en "see-saw"-blander. Etter 96 timer ble gelen dekantert over på en grov glassfritte og skylt med 10 ml kaldt, destillert vann. Filtratet ble tatt vare på til senere analyse for å bestemme omfanget av for-skjell i substitusjonen. Gelen ble på nytt suspendert i 5 0 ml 0,2 M etanolamin-HCl, pH 8,0 og inkubert ved 4°C i

30 minutter på "see-saw"-blanderen. Tilslutt ble gelen dekantert over på den grove glassfritten og vasket med 1 liter vann, etterfulgt av 20 mM Bicin (N,N-bis-(2-hydroksy-etyDglycin) , pH 8,2, 0,1 M glycin-HCl, pH 3,0 og 20 mM Bicin, pH 8,2. (2) Rensing på humant IgG-sepharose. Bukhulevæske fra mus som inneholder monoklonalt antistoff til humant IgG ble lagret i frossen tilstand ved -2 0°C før bruk. Bukhulevæsken ble anvendt direkte på en 3 ml (1 cm x 3,8 cm) kolonne av humant IgG-sepharose som var ekvilli-brert med 2 0 mM Bicin, pH 8,2. Kolonnen ble vasket med 15 ml 20 mM Bicin, pH 8,2. Kolonnen ble vasket med 15 ml 20 mM Bicin, pH 8,2, deretter med 15 ml 20 mM Bicine, pH 8,2, inneholdt med 0,1 M natriumklorid (NaCl) og tilslutt med 15 ml 20 mM Bicine, pH 8,2. Antistoffet ble eluert fra kolonnen med 15 ml 0,1 M glycin-HCl, pH 2,5, etterfulgt av 15 ml 0,1 M glycin-HCl, pH 2,5, med 2 0% p-dioxan. Prøverør som mottok eluatet med lav pH inneholdt 100 mikroliter IM Bicine, pH 8,5, for å øke pH'en umiddelbart. Absorbansen ved 280 namometer (-^qq) for eluatet ble målt og fraksjoner som inneholdt antistoffet ble samlet opp og konsentrert til ca. 1 ml ved å bruke en "Millipore CX-10" nedsenkbar ultra-filtreringsinnretning (molekylvekter som fjernes mindre enn eller lik 10 000 dalton, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts, USA).

Den konsentrerte antistoffoppløsningen ble anvendt til en

80 ml (1,5 cm x 45 cm) kolonne av Sephadex G-25 (ublandet, Pharmacia) for å fjerne glycin. Fraksjoner som inneholdt antistoffet ble konsentrert ved å bruke "Millipore CX-10"-innretningen. (3) Rensing på protein A-sepharose.

Bukhulevæske (1 ml), lagret ved -2 0°C før bruk ble- anvendt til en 4 ml (1 cm x 5 cm) kolonne av protein A-sepharose-4B (Pharmacia Fine Chemicals) ekvilibrert med 2 0 mM Bicine, pH 8,2, som inneholdt 0,04% natriumacid ved værelsestemperatur, kolonnen ble vasket med 15 ml av denne Bicine-buffer, etterfulgt av 15 ml av den samme Bicine-buffer som inneholdt 0,1 M NaCl, og deretter 15 ml Bicine-buffer uten NaCl. Antistoffet ble eluert ved å vaske kolonnen med 0,1 M glycin-HCl-buffer, pH 3,0. Prøverør som mottok dette syreeluatet inneholdt 100 mikroliterlM Bicine, pH 8,5, for å øke pH'en umiddelbart. Kolonnen ble nøye vasket med 15 ml Bicine-buf fer for å bringe den tilbake til pH 8,2. A„ori for de

z o u

100 dråper store fraksjonene ble målt og fraksjonene som inneholdt antistoffet ble slått sammen og konsentrert til ca. 1 ml ved å bruke en "Millipore CX-10" nedsenkbar ultrafil-treringsinnretning.

Den konsentrerte antistoffoppløsning ble kromatografert på Sephacex G25 (ublandet) for å fjerne glycin. Antistoffopp-løsningen (ca. 1 ml) ble anvendt på en 80 ml (1,5 cm x 45

cm) Sephadec G-25 (ublandet) kolonne, ekvilibrert med 2 0 mM Bicine, pH 8,2, som inneholdt 0,04% natriumazid ved værelsestemperatur. A28 0 for ^e 100 dråper store fraksjonene ble målt og fraksjoner som inneholdt antistoffet ble slått sammen og konsentrert som ovenfor til 2 ml.

B. Merking av renset monoklonalt antistoff.

Det rensede monoklonale antistoffpreparat (2,8 mg/ml) ble merket med 3-galaktosyl-umbelliferon ved å bruke den homo-bifunksjonelle kryssbinder dimetyladipimidat (DMA).

10 mikromol (5 mg) N-6(6-aminoheksyl)-7-3-galaktosylcoumarin-3-karboksamid (AH-GU) (US patentskrift nr. 4.259.233) ble oppløst i 2 00 ml H20 og blandet med en ekvimolar del DMA

(10 mikromol, 2,5 mg) oppløst i 1 M trietylammoniumbikarbonat, pH 9,6, TEAB). Den gule oppløsningen ble inkubert ved værelsestemperatur i 5 minutter, og deretter ble 1 ml (2,8 mg) antistoff oppløsning i 20 mM Bicine, pH 8,2, tilsatt og reaksjonsblandingen ble inkubert ved værelsestemperatur i 60 minutter. Omsetningen ble avsluttet ved tilsetning av 2 00 mikroliter IM glycin-NaOH, pH 9,6. Oppløsningen ble anvendt på protein-A-sepharosekolonnen og det merkede antistoffet ble isolert som beskrevet ovenfor i del A(3) av dette eksempel.

Det merkede antistoffet blekarakterisert vedå undersøke absorbansen ved 34 3 nm (A_.._) forå mengdebestemme AH-GU

ImM

grupper som er tilstede (e _._ = ^1) f absrobans ved 4 00 nm (A4qq) etter behandling med overskudd 3-galaktosidase for å bestemme AH-GU gruppene som er tilgjengelige for enzymet ( e^<n>™g 35), og fluorescensen for det hydrolyserte GU-antistoff-konjugatet ble undersøkt for å bestemme utstrekningen av slukking.

C. Analyseprotokoller.

(1) Virkning av polyetylenglykol på analyse-reaksjon.

En aliquot (50 yl, 0,013 A343<e>nheter) GU-anti-IgG ble plassert i en kuvette som inneholdt 1,25 ml 20 mM Bicine,

pH 8,2, enten sammen med eller uten 6% polyetylenglykol 6000 (Sigma Chemical CO., St. Louis, Missouri, USA) og forskjellig mengder (0-200yl) normalt humant IgG (2 mg/ml). Proteinkonsentrasjonen ble opprettholdt ved å kompensere

med okse-serumalbumin (BSA). Reaksjonsblandingen ble inkubert ved værelsestemperatur i 15 minutter, og deretter ble 10yl 0,61 enheter/ml 3-galaktosidase tilsatt. Flourescens (exitasjon - 4 00 nm, emisjon = 4 50 nm) ble avlest etter ytterligere 10 og 20 minutter med inkubasjon ved værelsestemperatur. Blindprøver ble ikke tilført 3-galaktosidase, men var ellers fullstendige.

(2) IgG analyser i nærvær av IgA og IgM.

En aliquot (50 yl, 0,013 ^343enheter) merket antistoff til IgG ble tilsatt til 1,45 ml 20 mM Bicine, pH 8,2, sammen med 6% polyetylenglukol 6000 og varierende mengder humant IgG (eller IgA eller IgM) (proteinkonsentrasjonene ble opprettholdt ved å kompensere avtagende lg-nivåer med BSA). Reaksjonsblandingene ble inkubert ved værelsestemperatur i 15 minutter og deretter ble 10 mikroliter 3-galaktosidase (0,61 U/ml) tilsatt. Etter sammenblanding, ble reaksjonsblandingene inkubert en annen gang i 20 minutter, og deretter ble fluorescens avlest som ovenfor.

D. Resultater.

Det merkede monoklonale antistoffpreparatet ble funnet å ha 1,35 AH-GU substituent per antistoffmolekyl. Når markøren ble inkubert med overskudd 3-galaktosidase, ble 0,61 substituenter pr. antistoffmolekyl (45%) hydrolysert og 0,06 substituenter pr. antistoffmolekyl (9,8% hydrolyserte grupper) ble påvist ved hjelp av fluorescens. Virkningen av polyetylenglykol 6000 på inhiberingen av hydrolysen av det merkede antistoff ved økende konsentrasjoner humant IgG

er vist i fig. 2 på tegningene. Polyetylenglukolet økte inhiberingen med 10-20%. Inhiberingen av GU-anti-IgG hydrolysen ved hjelp av IgG, IgM og IgA er vist i fig. 3 og 4 på tegningene. Inhiberingen av GU-IgG nådde 50% ved 3,8

Ug IgG (0,06 IgG/antistoff). Kryssreaktiviteten med IgM

(ved 2 0% inhibering) var 15% og med IgA, var den 16,4%.

Dataene fastslår at en IgG-analyse kan utføres ved hjelp av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Det påvisbare signalet som genereres ved hjelp av et merket monoklonalt anti-IgG preparat, som inneholder i det vesentlige ikke noe ikke-spesifikt merket protein, modifiseres målbart etter binding til analytt (IgG).

EKSEMPEL 2.

Bestemmelse av gentamycin.

A. Rensing av monoklonalt antistoff til gentamycin.

Bukhulevæske fra mus som inneholdt monoklonalt antistoff

til gentamycin (Scripps-Miles, Inc., LaJolla, California, USA) ble renset ved hjelp av affinitetskromatografi på

protein A-sepharose ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1.

B. Merking av renset monoklonalt•antistoff.

AH-GU, nevnt ovenfor, (5 mg, 10 ymol) ble oppløst i 200

yl ^0. Dimetyladipimidat (5 mg, 20 ymol) ble oppløst i 400 yl IM trietylammoniumbikarbonat (TEAB), pH 9,6, og 100 yl av denne oppløsningen ble inkubert med 100 yl av AH-GU oppløsningen ved værelsestemperatur i ca. 5 minutter. Anti-stof f oppløsningen [2 ml, 2,4 mg protein som bestemt ved hjelp av Lowry fremgangsmåten, J. Biol. Chem. 193:265

(1951)] ble så tilsatt og reaksjonsblandingen ble inkubert ved værelsestemperatur i ca. 1 time. På dette tidspunkt ble 100 yl IM glycin-NaOH, pH 9,6, tilsatt for å stoppe reaksjonen. Den gule oppløsningen ble overført til protein-A sepharosekolonnen og det GU-merkede antistoff til gentamycin ble isolert som beskrevet ovenfor. GU-antistoffet blekarakterisert vedå måle A_.-, for å bestemme konsentra-ImM S]onen av GU substituenter som er tilstede (e ^43 = 21) ; A4 00 etter hydrolyse med 3-galaktositase for å bestemme hvor mange GU substituenter som kunne hydrolyseres (e '^400<=>'fluorescensen ble målt for å bestemme hvor mange av de hydrolyserte GU substituentene som ble slukket. C. Fremstilling av gentamyein-makromolekylært konjugat.

Okse-serum albumin (BSA, 300 mg) ble oppløst i 1,5 ml vann.

En aliquot (1,0 ml) ble tilsatt til 2,0 ml vandig oppløsning av gentamycinsulfat (Schering Corp., Bloomfield, New Jersey, USA) med en pH som var blitt justert til ca. 4,5 ved tilsetning av 2 N saltsyre (HC1) eller 2N natriumhydroksyd (NaOH)

etter hva som trengtes. pH'en i blandingen ble justert på samme måte til 4,5. Vann ble tilsatt, hvorved man fikk et sluttvolum på ca. 8 ml, og pH'en ble igjen justert til 4,5. Etter avkjøling i et isbad i 15 minutter, ble 600 mg 1-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid hydroklorid (Pierce

Chemical Co., Rockford, Illionois, USA) tilsatt til oppløs-ningen og blandet i isbadet i 2 timer. Etter inkubasjon over natten ved 4°C, fikk oppløsningen komme til værelsestemperatur og deretter ble den overført til en kolonne (2,5

x 55 cm) med G-25 (ublandet) Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals) ekvilibrert med 50 mM Bicine-0,1% azid, pH 8,5. 7 ml store fraksjoner ble samlet opp og undersøkt for nærvær av BSA-gentamycinkonjugat ved hjelp av positiv ninhydrin-reaksjon og absorbans ved 280 nm. Fraksjoner som inneholdt BSA-gentamycin ble slått sammen.

D. Analyseprotokoll.

Merket monoklonalt antistoff (10 yl, 0,0014 enheter) ble tilsatt til 1,48 ml 20 mM Bicine, pH 8,2, som inneholdt 0-8 0 yg gentamycin-BSA eller 0-8 0 g gentamycin-BSA og 0,6 yg fritt gentamycin. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved værelsestemperatur i 15 minutter, og deretter ble 10

yl 0,61 U/ml 3-galaktosidase tilsatt (unntatt til blindprøv-ene) og reaksjonsblandingene ble inkubert i ytterligere 20 minutter før fluorescensen ble avlest.

E. Resultater.

Det merkede monoklonale antistoffpreparatet ble funnet å

ha 0,97 AH-GU substituenter pr. antistoffmolekyl. Når markøren ble inkubert med overskudd 3-galaktosidase, ble bare 0,22. substituenter pr. antistoffmolekyl (23%) hydrolysert, og 0,023 substituenter pr. antistoffmolekyl (10%)

av hydrolyserte grupper) ble påvist ved hjelp av fluorescens. Inhiberingen av GU-anti-gentamycinhydrolyse av gentamycin-BSA og lettelse av inhibering med fritt gentamycin er vist

i fig. 5 på tegningene.

Dataene fastslår at en gentamycinanalyse kan utføres ved hjelp av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Det påvisbare signalet som frembringes ved hjelp av et merket monoklonalt anti-gentamycin preparat, som i det vesentlige ikke inneholder noe ikke-spesifikt merket protein, modifiseres målbart etter binding med gentamycin-makromolekylkonju-gatet. Slik signalmodulasjon minskes ved nærværet av fritt gentamycin.

EKSEMPEL 3.

Bestemmelse av humant choriongonadotropin.

A. Fremstilling av merket monoklonalt antistoff.

Bukhulevæske fra mus som inneholder monoklonale antistoffer til humant choriont gonadotropin (hCG) ble levert fra Meloy Laboratories, Inc., Springfield, VA. Antistoffet ble renset ved kromatografering på protein A-sepharose CL-4B (Pharmacia Fine Chemicals), etterfulgt av kromatografi på Sephadex G.25.

Det rensede monoklonale antistoffet ble merket med AH-GU under anvendelse av DMA som i eksempel 1 ovenfor. Det merkede antistoffet blekarakterisert vedhjelp av absorbans, hydrolyse med 3-galaktosidase og fluorescens. Disse analysene viste at det merkede antistoffet hadde 0,7 9 AH-GU markører pr. antistoffmolekyl, 0,32 av disse markørene pr. antistoff ble hydrolysert ved hjelp av 3-galaktosidase og 0,14 hydrolyserte rester pr. antistoff molekyl ble påvist ved fluorescens.

B. Analyseprotokoll.

Aliquoter (2 0 yl, 0,002 00343enheter) merket monoklonalt

anti-hCG ble tilsatt til en 1,42 ml volumer av 20 mM Bicine-buf f er, pH 8,2, som inneholder 0,1% BSA og varierende nivåer hCG (erholdt fra Roussel Corp., New York, NY). Oppløsningene ble inkubert i 15 minutter ved værelsestemperatur og deretter ble 10 yl 3-galaktosidase (0,61 U/ml) i 20 mM Bicin, pH 8,2,

tilsatt til hver. Blindprøver inneholdt alle bestanddeler unntatt enzymet. Flourescens ble avlest etter ytterligere 20 minutter inkubasjon ved værelsestemperatur.

C. Resultater.

Resultatene er vist i tabell A nedenunder:

Dataene viser at en hCG analyse kan utføres ved hjelp av den foreliggende fremgangsmåte. Økende nivåer hCG reduserer tilveiebringelsen av fluorescens fra spalting av det merkede anti-hCG med enzymet 3-galaktosidase.

EKSEMPEL 4.

Bestemmelse av humant IgA^.

A. Fremstilling av merket monoklonalt antistoff.

Renset monoklonalt antistoff fra mus til humant IgA^ble levert fra Bectin Dickinson, Sunnyvale, CA. Gelatinet som ble brukt for å stabilisere antistoffet ble fjernet ved affinitetskromatografi på protein A-Sepharose CL-4B, etterfulgt av kromatografi på Sephacex G-25.

Det rensede monoklonale antistoffet ble merket med AH-GU under anvendelse av DMA som i eksempel 1 ovenfor. Det merk ede antistoffet ble analysert som i eksempel 3 ovenfor, og ble funnet å ha 2,15 AH-GU markører pr. antistoff og 0,095 hydrolyserte rester pr. antistoff ble påvist ved fluorescens.

B. Analyseprotokoll.

Aliquoter (50 yl, 0,0015 OD343<e>nheter) med merket monoklonalt anti-humant IgA1ble tilsatt til 1,2 5 ml store -volumer med 2 0 mM Bicine buffer, pH 8,2, som inneholdt 6% polyetylenglukol 6000 og varierende nivåer med humant IgA^(erholdt fra rensing av Cohen fraksjon III i normalt humant plasma-protein, konsentrasjonen ble holdt ved å kompensere for avtagende IgA^nivåer med BSA). Oppløsningene ble inkubert i 15 minutter ved værelsestemperatur og deretter ble 10

yl 0,61 U/ml 3-galaktosidase i 20 mM bicine buffer, pH 8,2, tilsatt til hver. Blindprøver inneholdt alle bestanddeler unntatt enzymet. Fluorescens ble avlest etter ytterligere 20 minutter inkubasjon ved værelsestemperatur.

C. Resultater.

Resultatene er vist i tabell B nedenunder:

Dataene viser at en IgA^analyse kan utføres ved hjelp av en foreliggende fremgnagsmåte. Økende nivåer med IgA^reduserer frembringelsen av fluorescens fra spalting av det merkede anti-IgA^med enzymet 3-galaktosidase.

Claims (10)

1. Homogen immunologisk analysefremgangsmåte for bestemmelse av en analytt i en prøve, karakterisert ved ved følgende trinn:

   (a) å kombinere prøven med:

   (1) et merket monoklonalt anti-analytt preparat hvori den monoklonale antianalytten i det vesentlige er den eneste merkede bestanddel, idet markøren som omfattes av den merkede monoklonale anti-analytten tilveiebringer en påvisbar respons som er ulikt målbar når den merkede antianalytten er bundet til analytten sammenlignet med når den ikke er bundet slik, eller

   (2) et merket monoklonalt antianalyttpreparat hvori den monoklonale anti-analytten i det vesentlige er den eneste merkede bestanddel, og et makromolekylært konjugat som omfatter epitoper som lar seg binde til den merkede monoklonalt antianalytten, idet markøren som omfattes av den merkede anti-analytten tilveiebringer en påvisbar respons som er ulikt målbar når den merkede anti-analytten er bundet til det makromolekylære konjugatet sammenlignet med når den ikke er bundet slik, eller når den er bundet til analytten, og (b) måle den påvisbare respons' som en funksjon av analytten i prøven.
2. 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det monoklonale anti-analytt preparat omfatter hele antistoffer.
3. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det monoklonale anti-analytt preparatet omfatter antistoff-fragmenter.
4. 4. Homogen immunologisk'analysefremgangsmåte for bestemmelse av en analytt i en prøve, karakterisert ved følgende trinn:

   (a) å kombinere prøven med (1) et merket monoklonalt anti-analytt preparat hvori den monoklonale ariti-analytten i det vesentlige er den eneste merkede bestanddel og (2) et reagenspåvisningssystem for den markøren som omfattes av den merkede monoklonale anti-analytten, idet markøren samvirker med et medlem av påvisningssystemet og gir en påvisbar respons som er ulikt målbar når den merkede anti-analytten er bundet til analytten sammenlignet med når den ikke er bundet slik på grunn av sterisk hindring av adgangen for medlemmet i påvisningssystemet til mar-køren, og

   (b) måle den påvisbare responsen som en funksjon av analytten i prøven.
5. 5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at markøren er et enzymsubstrat, et koenzym, en prostetisk gruppe i et enzym, en enzyminhibitor, eller et enzym eller en deltager i en enzym-katalysert reaksjon som omfattes av påvisningssystemet.
6. 6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at analytten har en molekylvekt som er større enn ca. 10 000.
7. 7. Reagenspreparat for anvendelse ved den homogene immunologiske analysebestemmelsen av en analytt i en prøve, karakterisert ved at det omfatter en merket monoklonal anti-analytt, idet markøren som omfattes av den merkede monoklonale anti-analytten, gir en påvisbar respons som er ulikt målbar når den merkede anti-analytten er bundet til analytten sammenlignet med når den ikke er bundet slik, idet den monoklonale anti-analytten i det vesentlige er den eneste merkede bestanddelen i preparatet.
8. 8. Reagenssystem for den homogene immunologiske ana-lysebestemmelse av en analytt i en prøve, karakterisert ved at det omfatter (1) et merket monoklonalt anti-analytt preparat hvori den monoklonale anti-analytten i det vesentlige er den eneste merkede bestanddel, og (2) et makromolekylært konjugat som omfatter epitoper som lar seg binde til den merkede monoklonale anti-analytten, idet markøren som omfattes av den merkede anti-analytten gir en påvisbar respons som er ulikt målbar når den merkede anti-analytten er bundet til det makromolekylære konjugatet sammenlignet med når den ikke er bundet slik, eller når den er bundet til analytten.
9. 9. Fremgangsmåte for å fremstille et merket anti-analytt-reagens for bruk ved homogene immunologiske analyser for å bestemme en analytt i en prøve, hvor anti-analytten i det vesentlige er den eneste merkede bestanddelen, karakterisert ved følgende trinn:

   (a) å tilveiebringe et monoklonalt anti-analytt preparat ved somatisk cellehybridisering,

   (b) å fraseparere en fraksjon av et slikt preparat som inneholder immunglobulinet fra andre proteiner, og

   (c) å merke proteinet i den fraseparerte immunglobulinfraksjonen med et materiale som deltar i en enzymkatalysert reaksjon.
10. 10. Merket anti-analytt preparat, karakterisert ved at det omfatter en monoklonal anti-analytt merket med et materiale som deltar i en enzymkatalysertrreak-sjon, idet den merkede monoklonale anti-analytt i det vesentlige er. den eneste merkede bestanddel i preparatet.