NO774240L - Fremgangsmaate ved paavisning og bestemmelse av antigener - Google Patents
Fremgangsmaate ved paavisning og bestemmelse av antigenerInfo
- Publication number
- NO774240L NO774240L NO774240A NO774240A NO774240L NO 774240 L NO774240 L NO 774240L NO 774240 A NO774240 A NO 774240A NO 774240 A NO774240 A NO 774240A NO 774240 L NO774240 L NO 774240L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- antibody
- antigen
- sample
- enzyme
- insoluble
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 76
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 75
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 75
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 60
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 60
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 20
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 12
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 9
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000002195 soluble material Substances 0.000 claims description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 55
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 28
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 5,5-diethylbarbituric acid Chemical compound CCC1(CC)C(=O)NC(=O)NC1=O FTOAOBMCPZCFFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229960002319 barbital Drugs 0.000 description 20
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 18
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 18
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 17
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 17
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 14
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 10
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 8
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 8
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 7
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 7
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 6
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 5
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 5
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(oxiran-2-ylmethoxy)butoxymethyl]oxirane Chemical compound C1OC1COCCCCOCC1CO1 SHKUUQIDMUMQQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 4
- 239000003463 adsorbent Substances 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 3
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 3
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 4-ethylmorpholine Chemical compound CCN1CCOCC1 HVCNXQOWACZAFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 description 2
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- -1 barbiturates Chemical compound 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- DFTAZNAEBRBBKP-UHFFFAOYSA-N methyl 4-sulfanylbutanimidate Chemical compound COC(=N)CCCS DFTAZNAEBRBBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N (+)-estrone Natural products OC1=CC=C2C3CCC(C)(C(CC4)=O)C4C3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N (S)-amphetamine Chemical compound C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- UFFVWIGGYXLXPC-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1C=CC(=O)N1C1=CC=CC=C1N1C(=O)C=CC1=O UFFVWIGGYXLXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMBMWXHVTXYPQN-UHFFFAOYSA-N 1-[3-[(1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidin-3-yl)methyl]phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1CC1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 RMBMWXHVTXYPQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- VXPSQDAMFATNNG-UHFFFAOYSA-N 3-[2-(2,5-dioxopyrrol-3-yl)phenyl]pyrrole-2,5-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C=2C(=CC=CC=2)C=2C(NC(=O)C=2)=O)=C1 VXPSQDAMFATNNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- WDPFQABQVGJEBZ-MAKOZQESSA-N Bothermon Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1.O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 WDPFQABQVGJEBZ-MAKOZQESSA-N 0.000 description 1
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N D-thyroxine Chemical compound IC1=CC(C[C@@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-GFCCVEGCSA-N 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N Estrone Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 DNXHEGUUPJUMQT-CBZIJGRNSA-N 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000013460 Malate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010026217 Malate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-N'-(2-(4-morpholinyl)ethyl)carbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NCCN1CCOCC1 XNPOFXIBHOVFFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 229960003399 estrone Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700041430 link Proteins 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 description 1
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 125000000466 oxiranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N periodic acid Chemical compound OI(=O)(=O)=O KHIWWQKSHDUIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 235000020004 porter Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N pyridoxal 5'-phosphate Chemical compound CC1=NC=C(COP(O)(O)=O)C(C=O)=C1O NGVDGCNFYWLIFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000007682 pyridoxal 5'-phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011589 pyridoxal 5'-phosphate Substances 0.000 description 1
- 229960001327 pyridoxal phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000002901 radioactive waste Substances 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 229940034208 thyroxine Drugs 0.000 description 1
- XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N thyroxine-binding globulin Natural products IC1=CC(CC([NH3+])C([O-])=O)=CC(I)=C1OC1=CC(I)=C(O)C(I)=C1 XUIIKFGFIJCVMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007039 two-step reaction Methods 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000019195 vitamin supplement Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører enzymforbundet immunobestemmelse og gir en ny fremgangsmåte for påvisning og måling av antigener, og reagenser for bruk i denne. Uttrykket "antigen" som her brukt betyr ikke bare substanser som i seg selv kan fremkalle produksjonen av antistoffer i dyr, dvs. immunogener, men.også substanser, noen ganger kalt haptener, som etter konjugering med et bæremolekyl blir i stand til å frembringe produksjonen av og reaksjon med spesifikke antistoffer.
Det er en betydelig teoretisk og praktisk interesse for å kunne påvise og måle nærvær av antigener. Da slike substanser ofte har en kompleks og hyppig ukjent kjemisk struktur og opptrer i meget lave konsentrasjoner i biologiske og andre materialer,
er det ikke mulig å anvende konvensjonelle analyseteknikker. Følgelig har i de siste få årene en rekke teknikker blitt ut-viklet basert på antigen-antistoff-reaksjonen, hvori en reak-sjonskomponent markeres med en radio-aktiv "tracer" eller f.eks. med et enzym, slik at reaksjonsproduktene eller i noen. tilfeller det ubrukte reagenset kan påvises og/eller måles. Skjønt metoder basert på bruken av radioaktive markeringer
har visse teoretiske fordeler, særlig det faktum at visse typer markering, spesielt sådanne som anvender tritium eller 14
C, interfererer den radioaktive traceren selv ikke med antigen-antistof f reaks j onen , er det visse ulemper forbundet med bruken av denne teknikken, særlig behovet for å tilveiebringe den nødvendige apparatur for å måle radioaktiv tracer, å beskytte operatøren for mulige skadelige virkninger fra radioak-tiviteten og å plassere det radioaktive avfallet etter bruk. Mange radioaktive markeringer må kastes med jevne mellomrom p.g.a. den radiokjemiske dekomponering av den radioaktive isotopen. Videre kan det være vanskelig å radiomarkere anti gener med liten molekylvekt og bibeholde deres viktige antigen-egenskaper. Det er derfor vært vist betydelig interesse for metoder, hvori antigen-antistoffreaksjonen følges ved bruk av et reagens, hvori et enzym virker som tracer. Slike metoder er enkle å utføre og trenger relativt enkelt utstyr, og omfatter ingen helsemessige risiko. Ikke desto mindre har mange av de hittil foreslåtte systemer lidd av den ulempe at det er nødvendig for god funksjonering å fremstille et konjugat mellom det anvendte enzymet som tracer og antigenet som skal påvises. Fremstillingen av disse konjugatene er ikke. alltid lett p.g.a. behovet for å bevare enzymaktiviteten til enzym-delen i konjugatet, og det er særlig tungvint å måtte frem-stillle et separat konjugat for hvert individuelt antigen som er tilsiktet påvist. Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan på den annen side et enkelt enzymholdig konjugat brukes på et stort antall antigener. Prinsipielt kan faktisk et enkelt sådant konjugat brukes på alle'antigener.
I et tidligere forslag (Engvall et. a_l, J. Immunology 109
(1972) page 129) er antistoffer bestemt ved reaksjon med antigener på et uløselig underlag etterfulgt av reaksjon av antigen-antistoff-konjugat på underlaget med et enzymmarkert anti-immunoglobulin som var kjent for å kunne reagere med antistoffet på konjugatet. Med denne metoden avhenger mengden av enzym som til slutt er knyttet til underlaget av mengden antistoff i prøven som er under behandling da enzymet blir bundet til underlaget ved en kjede, hvorved antistoffet som skal bestemmes utgjør et avgrenset og essensielt ledd.
Fremgangsmåte ved foreliggende oppfinnelse for enzymbundet immunobestemmelse består av å bringe i kontakt, samtidig
eller trinnvis og i et flytende medium,(1) et antigen (som forut definert) på et uløselig underlag eller i form av et uløselig aggregat, (2) et første antistoff (som i det føl-gende definert)og (3) et enzymmarkert annet antistoff (som
i det følgende definert), adskille de uløselige og løselige materialene og måle enzymaktiviteten for én eller flere av dem.
Oppfinnelsen erkarakterisert vedat nevnte første antistoff (2) også bringes i kontakt med en prøve som inneholder antigenet som skal påvises eller måles som kan være det samme eller forskjellig fra antigenet (1), det andre antistoff (3) knyttes derved til det uløselige materialet i motsatt forhold til mengden av antigenet i prøven som skal påvises eller måles for å bestemme nærværet eller mengden av antigenet i.prøven. Uttrykket "første antistoff" slik det her er brukt, betyr et antistoff som kan binde både antigenet på det uløselige underlaget og antigenet som skal påvises. Uttrykket "annet antistoff" betyr antistoff som er spesifikt for alle antilegemer i immunoglobulihklassen som det første antistoffet tilhører, f.eks. alle saue IgG, kanin IgG eller kanin IgM. Hvis f.eks. det. første antistoffet er et immunoglobulin som dannes i et spesielt dyr, f.eks. en sau, er det andre antistoffet et antistoff mot immunoglobuliner fra denne arten, uavhengig av deres antistoffspesifisiteter, som dannes i et forskjellig dyr, f.eks. et esel.
Den nye metoden kan lett tilpasses for påvisning og måling
av en rekke antigener. Foruten antigener kan serum med passende innhold og vevsproteiner som a^-foetoprotein, c^-haptoglobulin og karsinoembryonisk antigen, haptener som hormoner, f.eks. trijodtyronin norepinefrin, tyroid-stimulerende hormon, follikel-stimulerende hormon, luteniserende hormon, insulin og tyroksin, steroider, f.eks. kortisol, pro-gesteron, østron, østradiol og testosteron, droger, f.eks. morfin, amfetamin, barbiturater, difenylhydantoin, meto-treksat og gentamycin, vitaminer og næringsmiddeltilset-ninger, f.eks. pyridoksal-5-fosfat og aflotoksin, herbici-der, insekticider og nitrosourinstoffer også brukes. I hvert tilfelle må antigenet først bindes enten kjemisk eller mindre gjerne fysikalsk til et egnet underlag, f.eks. på den måten som nærmere beskrives i det følgende.
Det må bemerkes at det enzymmarkerte andre antistoffets natur på ingen måte avhenger av antigenet som skal påvises. Det er bare nødvendig å fremkalle det første antistoffet i et dyr av samme art som det som fremkalte immunoglobulinet som brukes til å stimulere produksjonen i andre arter av det andre
antistoffet. Det er derfor ikke noe behov for å frembringé
et stort spektrum av enzymmarkerte antistoffer, og vanskelig-hetene som ligger -i å knytte enzymene til antistoffene må derfor bare løses en gang.
Ethvert enzym kunne anvendes som en markering på det andre antistoffet. Oksydaser som pepperrot-peroksydase, hydrolytiske enzymer som alkalisk fosfatase eller dehydrogenaser som glykose-6-fosfat-dehydrogenase er særlig egnet. Ideelt bør et enzym som bruks som markering ha de følgende egenskaper: (1) det er relativt billig tilgjengelig i høy renhet, (2) det har en høy aktivitet pr. vektenhet, (3) det er lett vannløselig og stabilt under normale lagringsbetingelser, (4) det gjør det mulig å bruke en målemetode som er enkel, rask, sensibel og billig, (5) det bør være fritt for biologiske væsker og (6) biologiske væsker bør ikke inneholde noen substratinhibitorer eller aktivatorer for det, (7) det bør inneholde egnede, kjemiske grupper for konjugering til et annet antistoff som gjør det mulig at konjugering bare har en minimal virkning på både enzym og antistoffaktivitet. 3-galaktosidase tilfreds-stiller disse kravene. Andre mulige, men mindre foretrukne enzymer er glukoseoksydase, acetylcholinesterase-glukoamylase, lysozym, glukose-6-fosfat-dehydrogenase og malatdehydrogenase..
Det brukte enzymet' kobles fortrinnsvis til det andre antistoffet ved å bruke koblingsmetoden som nedenfor er beskrevet,
som kan anvendes på enhver kombinasjon av antistoff og enzym forutsatt at sistnevnte inneholder en merkaptogruppe eller kan modifiseres slik at det vil inneholde en slik gruppe. Imidlertid kan om nødvendig andre koblingsmetoder brukes. Disse innbefatter
a) Ett-trinns glutaraldehydbinding hvori glutaraldehydet brukes til å knytte proteiner i en komplisert reaksjon som gir
heterogene konjugater med høy molekylvekt, (se Avrameas, S., Immunochemistry 6^43 (1969)).
b) To-trinns glutaraldehydbinding hvori enzymet pepperrot-peroksydase reagerer med bare ett molekyl glutaraldehyd. Dette begrenser enzym-enzymkonjugering og er enforbedring av én-trinns-metoden. Imidlertid kan denne metoden sannsynligvis ikke anvendes på mange enzymer foruten pepperrot-peroksydase, da disse vil reagere med mer enn ett molekyl-glutaraldehyd.
(se Avrameas. S and Ternynck, Immunochemistry £5 1175 (1971)). c) Oksydasjon av sakkaridrester i enzymet fulgt av Schiff-basedannelse. Pepperrot-peroksydase har flere oligosakkaraid-grupper, og oksydasjonen av dem til aldehydgrupper (ved bruk av perjodat) som kan reagere med aminogrupper er basert på denne bindingsmetoden. Andre enzymer kan også inneholde oligo-sakkaridgrupper og kan i prinsippet også brukes. Imidlertid, dannes konjugater med høy molekylvekt ved denne fremgangsmåten. (Nakane P.K. + Kawaoki, A. J. Histochem. Cytochem. 2_2 108.4 (1974)). d) Dimaleimid-binding ved bruk av N,N<1->o-fenylendimaleimid etter innføring av -SH-grupper i antistoffet ved bruk av 2-merkaptoetylamin som reduserer forut eksisterende -S-S- broer til to -SH-grupper. (Kato et .al European J. Biochem. 6_2 285
(1976)). e) Andre bifunksjonelle reagenser som kan brukes omfatter toluen-2 , 4-diisocyanat, p_' ,p-dif luor-m,m' -dinitrof enylsulfon, l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid, men disse gir generelt dårligere resultater enn de foran beskrevne. f) Binding kan også oppnås med hetero-bifunksjonelle reagenser, dvs. reagenser som inneholder to forskjellige funksjo-nelle ' grupper i hvert molekyl, f.eks. m-maleimidobenzyl N-hydroksy-succinimidester, som har vært brukt i en to-trinns reaksjon for å koble insulin til 3-galaktosidase. (T. Kita-gawa + T. Aikawa J. Biochem. 1_ 9 233 - 236 (1976)). g) Ikke-kovalent kryssbinding ved f.eks. å koble antistoffer til pepperrot-peroksydase for å danne et konjugat som er ikke-kovalent, men relativt stabilt av natur. Denne metoden har de ulemper at (i) Ved lagring kan enzymantistoffkonjugatet dissosiere lang-<!>somt.
(ii) Antistoffene kan inhibere enzymene de er fremkalt mot.
(ii) Det tar flere måneder å fremstille antistoffene og antistoffer som er frembrakt av forskjellige fremstillere har forskjellige egenskaper.
Grunnet større hastighet og letthet som er forbundet med
arbeid med relativt store mengder antistoffer, er det ofte lettere hvis de første og andre antistoffer fremstilles i relativt store dyr som hest, esel eller sau fremfor små dyr som rotte, mus, guinea-gris eller hamstere selv om bruk av sådanne ikke er utelukket. Som allerede antydet må det første og andre antistoff frembringes i forskjellige typer dyr. Man har funnet det lett å frembringe det første antistoffet hos sau og det andre antistoffet hos et esel, men et hvilket som helst annet par forskjellig typer kan anvendes om ønsket.
Muligheten for interferens ved det andre stoffet i antigen-, første-antistoffreaksjonen nedsettes hvis det andre antistoff ikke frembringes mot alt av det første antistoffet, men bare mot Fc-fragmentet av immunoglobulinet som utgjør det første antistoffet.
De andre antistoffene kan hovedsakelig fremstilles på kjent
måte, men den foretrukne metoden er å 'prime" dyrene etter-
fulgt av fremstilling av antistoffer og å gi"booster-dose-ringer når serum-antistoffnivåene har passert toppen. Blodet inneholder normalt maksimale antistoffnivåer kort.etter"boos-ting. Når et passende høyt nivå (eller et maksimalt nivå)
av anti-immunoglobulin har akkumulert i blodstrømmen hos dyret tappes sistnevnte for blod og serumet som inneholder anti-immunoglobulinet fraskilles.
Det andre antistoffet renses fortrinnsvis ved å inkubere esel-antiserum med en egnet immunoadsorbent, f.eks. sefarose eller annen uløselig bærer som har blitt aktivert først ved reaksjon \
i med et egnet bifunksjonelt reagens, eksempelvis l,4-bis(2,3-epoksypropoksy)butan og så med en løsning av immunoglobulinet . (eller Fc-fragment av dette) som brukes for å fremkalle det andre antistoffet. Dette gir en immuno-adsorbent som er spesifikk for det andre antistoffet, og sistnevnte kan renses ved adsorpsjon på immunoadsorbenten fulgt av eluering, før eller etter markering med et enzym.
For å fremstille det markerte andre antistoffet foretrekkes det å behandle immunoadsorbenten med det andre antistoffet adsorbert på dette med et reagens som metylmerkaptobutyrimidathydroklorid for å modifisere aminogruppene i antistoffet og innføre fra 3-5 'tiolgrupper i hvert antistoffmolekyl. Det andre antistoffet med innebygde merkaptogrupper elueres så fra immunoab-sorbenten og. behandles slik at enzymet bindes til dette. Fortrinnsvis behandles det med N,N'-o-fenylen-bis-maleimid og omsettes så med renset (3-galaktosidase som normalt stammer fra Escherichia coil. Enzym-sekundær-antistoffkonjugatet renses
så til slutt ved kromatografi på en dietylaminoetylagarose-gel eller annen egnet adsorbent for å adskille konjugatet fra uomsatt enzym og uomsatt annet antistoff.
Det første antistoffet fremkalles i et egnet dyr ved hjelp av kjente teknikker. Der hvor, som ofte tilfellet er, antigenet som skal påvises eller måles er et hapten med relativt enkel kjemisk struktur f.eks. trijodtyronin, østradiol, gentamycin, fenytoin eller morfin, er det ikke i stand til i seg selv å frembringe dannelsen av det første antistoffet. Det er derfor nødvendig å konjugere antigenet med et bæremolekyl for å
gi et konjugert molekyl som er i stand til å frembringe produksjonen av antistoffet. For dette formål er det hensikts-messig å konjugere antigenet med et lett tilgjengelig protein som er fremmed for dyret som det første antistoffet skal fremkalles i,' f.eks. bovinserumalbumin (BSA). Konjugeringen kan utføres ved omsetning av albuminet eller annet protein med f.eks. l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid, fulgt av omsetning av produktet med antigenet som for denne reaksjonen må inneholde en amino eller karboksylgruppe. Andre kjente konjugasjonsmetoder kan brukes om ønsket, og ideelt
sett skulle ca. 3-30 antigenmolekyler innebygges i hvert albuminmolekyl eller andre proteiner med høy molekylvekt.
Det første antistoffet kan frembringes ved å injisere antigenet eller antigen-konjugatet i et egnet dyr, f.eks. en sau, gjentatt
over en periode på uker eller måneder inntil et tilstrekkelig høyt antistoffinnhold med de ønskede bindingsegenskaper har akkumulert seg i dyrets blodstrøm. Dyret tappes så for blod og antiserumet fraskilles.
Det første antistoffet renses 'Så fortrinnsvis ved kontakt med antigenet som antistoffet ble fremstilt mot eller en beslektet forbindelse på en uløselig bærer. Etter absorpsjon kan antistoffene elueres, f.eks. med guanidinhydrokloridløsning ved høy eller lav pH med løsninger med høy saltkonsentrasjon eller med ikke-vandige løsningsmidler og deretter dialyseres mot en passende puffer for å fjerne elueringsmidlet.
Den uløselige bæreren som brukes for å holde antigenet eller den beslektede forbindelse både i rensingsprosessen som nett-opp er nevnt og i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være ethvert egnet vann-uløselig materiale som antigenet eller den beslektede forbindelse lett kan bindes tilstrekkelig til for å sikre at det forblir knyttet til dette under reaksjo-nene som inngår i rense- eller prøve-metoden som kommer på tale. Selv om det er mulig å bruke en bærer som ganske enkelt adsorberer antigenet slik tilfellet er i systemet som er beskrevet av Engvall et al i allerede nevnte publikasjon, ' foretrekkes det å binde antigenet kjemisk til bæreren, og dette betyr at det er nødvendig at bæreren inneholder funk-sjonelle grupper som de nødvendige reaksjoner kan finne sted ,med. Bærere bestående av glass, nylon, polyakrylamid, cel-lulose eller dekstran kan brukes. Visse typer immunoadsor-benter som inneholder hydroksylgrupper kan omsettes med 1,4-bis(2,3-epoksypropoksy)butan og produktet omsettes med antigenet. Denne metoden er funnet å være enkel, sikker, effek-tiv og gi en stabil kovalent binding forutsatt at antigenet eller den beslektede forbindelsen inneholder hydroksyl, amino eller tiolgrupper. Kravene til en immunoadsorbent for rensing av antistoffer er ikke nødvendigvis de samme som sådanne for.
I I
immunoadsorbenten i den virkelige prøven.
Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres på
mange forskjellige måter. Mengden av første antistoff og derfor markeringen som er knyttet til det uløselige antigenet står i et inverst forhold til mengden av antigen i prøven som skal bestemmes. Enzymaktiviteten, enten fri eller knyttet til det uløselige eller bårede antigenet måles. Noen av de spesifikke måter.for å utføre den nye fremgangsmåten er som følger.
I en første metode inkuberes det første antistoffét med en prøve som inneholder- antigenet som skal bestemmes. Etter at reaksjonen er fullstendig tilsettes det bårede antigenet og blandingen inkuberes igjen. Den faste fasen separeres så fra væskefasen, vaskes og blandes med overskudd av det enzymmarkerte andre antistoffet. Etter inkubering separeres igjen den faste fasen og vaskes. Aktivitetsmengden som ble funnet i den uløselige fraksjonen (faste fase) er omvendt proporsjonal med mengden av antigen som foreligger i prøven, dvs. supernatanten er direkte proporsjonal med den. Begge fraksjonene kan måles.
I en annen metode omsettes det første antistoffet med det enzymmarkerte andre antstoff for å danne et kompleks som så settes til overskudd av prøven som inneholder antigenet som skal bestemmes og inkuberes. Den uløselige bæreren som bærer antigenet tilsettes så, og etter inkubering separeres de faste og flytende fasene. Bestemmelsen av enzymaktiviteten til den flytende fase gir et resultat som er direkte proporsjonalt med mengden av antigen i prøven.
I en tredje metode inkuberes komplekset av første og andre antistoffer, prøven som inneholder antigenet som skal bestemmes, og bæreren som bærer antigenet simultant, og etter separasjon av den faste fasen, bestemmes enzymaktiviten i den flytende fasen. Igjen er resultatet direkte proporsjonalt med konsentrasjonen av antigen i prøven.
Som allerede antydet må for en kvantitativ bestemmelse ved den;
første og andre metoden ovenfor, mengden av første brukte antistoff være i overskudd av hva som kreves for å omsette alt antigenet i prøven, og bæreren som bærer antigenet må tilsettes i et tilstrekkelig overskudd for å sikre fullstendig adsorpsjon av alt det første antistoffet som ikke har reagert med antigenet i prøven. I praksis er den letteste måten å sikre dette å utføre en serie bestemmelser med forskjellige konsentrasjoner av første antistoff i geometriske eller aritmetiske serier. Hvis dette gjøres er det en enkel sak å finne en passende konsentrasjon av det første antistoffet som muliggjør utførelsen av en nøyaktig bestemmelse.
De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.
i i Eksempel 1
1. Fremstilling og markering av annet antistoff
(a) Fremstilling av Fc~fragment av saueimmunoglpbulin
( IgG)
Fremgangsmåten som anvendes for fremstilling av sau Fc-fragment er basert påPorters (R.R. Porter, 1959 , Biochem J. 7_3, 119).
320 ml serum ble samlet fra 28 sauer. 150 ml serum ble inkubert under røring i et isbad med 30 g fuktig dietylaminoetyl (DEAE) - A 50 Sephadex som forut var ekvilibrert med 10 mM fosfatpuffer ved pH 6,5. Etter 1 time ble gelen filtrert på en grov sintret glasstrakt og vasket med 50 ml av 10 mM fosfatpuffer pH 6,5. Filtratet pluss vask ble inkubert en gang til med 30 g fuktig DEAE-Sephadex, filtrert og vasket med 100 ml fosfatpuffer. Filtrat og vask (300 ml) ble behandlet med 150 ml mettet (NH^^ S0^-løsning som langsomt ble tilsatt den kontinuerlige rørte løsningen. Fellingen ble oppsamlet og vasket med 100 ml 20% (NH^) ^SO^-l.øsning. Den endelige fellingen ble oppløst i 50 ml 50 mM fosfatpuffer ved pH 8,0
og dialysert natten over ved 4°C mot 5 1 destillert vann. Løsningen ble så frysetørket.
1,, 50 g frysetørket sau IgG som var oppnådd slik ble oppløst i
50 ml 0,1M tris-HCl-puffer ved pH 7,2 som inneholdt 10 mM cystein og 2 mM EDTA. Pufferen ble fremstilt umiddelbart
før bruk. 0,6 ml av en krystallinsk suspensjon av Papain (Sigma.to ganger krystallisert) i 50 mM-acetat-puffer ved pH 4,5 ble tilsatt. Løsningen ble inkubert ved 37°C i 4 timer under leilighetsvis rysting. 0,222 g jodacetamid ble så tilsatt og løsningen umiddelbart satt på en kolonne (80 x 5 cm) G.100 Sephadex ekvilibrert med 10 mM-acetat-puffer ved pH 5,6 ved 4°C.
Den andre toppen som ble eluert fra kolonnen med 10 mM-acetat-puf f er ved pH 5,6 inneholder en blanding av Fc"og F tø-fragmenter. Den første toppen inneholder ubrukt IgG.. Den andre toppen ble satt på en kolonne (40 x 2,5 cm) av karboksymetylcellulose (Whatman CM 32) som var ekvilibrert med 10 mM-acetat-puffer ved pH 5,6 ved 4°C. En topp ble eluert fra kolonnen ved vasking med 10 mM-acetat-puffer pH 5,6 og flere små topper og en hovedtopp ble eluert når en gradient fra 10 mM-til 500 mM-acetat pH 5,6 ble påført (1000 ml i hvert rom av en gradientblander). Hovedtoppen ble oppsamlet og rekromato-grafert på karboksymetyl-cellulosekolonnen. Denne gangen ble en gradient fra 10 mM- til 300 mM-acetat-puffer ved pH 5,6
med 1000 ml i et blandekar påført. Én enkelt topp ble eluert.. Denne ble oppsamlet, fullstendig dialysert mot destillert vann og frysetørket.
b) Fremstilling av annet antistoff (esel-antisau-immunoglobulin)
En stabil emulsjon ble fremstilt ved å blande 1 del saltløs-ning som inneholdt sau Fc~fragment (0,7 5 mg/ml) og Bacillus Calmette-Buerin (1,5 mg/ml) med 2 deler Marcol 52 hjelpestoff. 6 intramuskulære injeksjoner (1 ml) av emulsjonen ble gitt i nedre legg. Fremstillingen av esel-antisau-antistoffer ble regulert og dyret var klart for forsterkning etter 2 måneder. En emulsjon bestående av 2 deler hjelpestoff til 1 del salt-løsning (sau Fc 0,75 mg/ml) ble injisert intramuskulært på 6 steder (0,5 ml) i de nedre leggene. Bloduttakene 10 dager senere og i den neste måned inneholdt store mengder antistoffer.
c) Fremstilling av immunoadsorbent for rensing av esel-anti- sau- immunoglobulin
Sepharose 4B ble aktivertmed 1,4-bis-(2,3-epoksypropoksy)-butan ved å inkubere like volumer av gelen, bisepoksydet og 0,6M NaOH som inneholdt 2 mg pr. ml natriumborhydrid under kontinuerlig røring ved 25°Ci 8 timer og så vasket. Sau IgG ble fremstilt fra et forråd av normalt serum ved felling med 33% ammnoiumsulfatløsning. En løsning av sau IgG i 0,1M NaHCO^-puffer ved pH 10 ble tilsatt ved bruk av 10 mg sau
IgG pr. ml gel. Den aktiverte gelen ble inkubert med IgG i 48 timer og immunoadsorbenten til slutt vasket og behandlet
I
med 0,1M etanolamin ved pH 10 i 24 timer.
(d) Rensing og markering av esel- anti- sau annet antistoff
Esel-anti-sau-immunoglobulin ble renset ved å inkubere esel-anti-serum (fremstilt som ovenfor beskrevet) med immunoadsorbenten. Tiolgrupper ble innført i immunoglobulinet' mens det var adsorbert i immunoadsorbenten ved bruk av metyl-4-merkapto-butyr.imidat/HCl for å modifsere immunoglobulinets aminogrupper. Innføringsgraden ble begrenset til å gi mellom 3 og 5 tiolgrupper pr. globulinmolekyl.
Immunoadsorbent-atnistoffkomplekset ble vasket og supenderti 0,1M N-etylmorfolin/HC1 ved pH 7,5 ved en konsentrasjon på 1 ml. immunoadsorbent i et totalvolum på 10 ml. En løsning av metyl-4-merkaptobutyrimidat/HCl i 0,2M Na2C03(10 mg/ml) ble fremstilt umiddelbart før bruk. 0,1 ml av denne løsning ble så tilsatt for hver 10 ml av suspensjonen. Suspensjonen ble rørt 30 min. ved romtemperatur og så vasket med 0,1M N-etylmor-folin/HCl ved pH 7,5 som inneholdt 1 mg ditiotreitol pr. 10 ml puffer. Gelen ble så grundig vasket med HC1 som inneholdt 0,1M NaCl til pH 3,5..
Immunoglobulinet som inneholdt innebygde tiolgrupper som var fremstilt slik ble. eluert med HC1 som inneholdt 0,1M NaCl ved pH 2,5. Den greieste metoden for å oppnå dette var å pakke immunoadsorbenten i en liten kolonne og samle effluenten i rør som inneholdt puffer. Da det neste fremstillingstrinnet utføres i 0,1M acetatpuffer ved pH 5,0, ble effluenten oppsamlet i tilstrekkelig 0,1M acetat ved pH 6,0 til "å gi en endelig pH på 5,0.
2 ml av 0,1M acetatpuffer ved pH 5,0 som * inneholdt 2,5 mg av immunoglobulinet som var modifsert med tiolgrupper ble kjølt i et isbad. Denne løsning ble så langsomt satt dråpe for dråpe til en 1 ml mettet løsning av N,N<1->o-fenylen-bis-maleimid i 0,1M acetatpuffer ved pH 5,0 på et isbad. Blandingen ble deretter inkubert ved 30°C i 20 min.. Immunoglobulinet ble så adskilt fra overskuddet N,N-o-fenylen-bis-
I
maleimid ved å føre løsningen gjennom en kolonne (20 x 1,5 cm) '• med G. 25 Sephadex ekvilibrert ved romtemperatur med 0,01M fosfatpuffer som inneholdt 0,01 MgCl2ved pH 6,0.
5,0 mg ammoniumsulfat felt 3-galaktosidase fra Escherichia coli ble oppløst i deri rensede aktiverte immunoglobulinløsning og inkubert ved 30°C i 4 timer. Tilstrekkelig. N NaOH til å ju-stere pH i reaksjonsblandingen til 7,5 og tilstrekkelig 2M 2-merkapto-etanol til å gi en endelig konsentrasjon på 10 mM ble tilsatt.
Immunoglobulin-enzymkonjugatløsningen ble satt på en kolonne (60 x 0,9 cm) av DEAE-Agarose (Biogel) ekvilibrert ved 4°C med 10 mM tris-HCl-puffer ved pH 7,5 som inneholdt 10 mM 2-merkapto-etanpl, 10 mM MgCl2og 50 mM natriumklorid. Løsningen ble vasket på kolonnen med den ekvilibrerende puffer. En gradient fra 50 mM til 200 mM natriumklorid i den samme puffer ble på-ført med 250 ml i blandekarene. Immunoglobulinet som ikke er konjugert med enzymet adsorberer ikke på kolonnen og elueres før gradient pålegges. Når gradienten er pålagt elueres immunoglobulinet som er markert med enzym før fritt enzym. Den eluerte fraksjonen som inneholder det markerte immunoglobulinet frysetørkes og gir det enzym-markerte andre antistoffet for bruk ifølge oppfinnelsen.
2. Fremstilling av første antistoff
(a) Fremstilling av tri jodtyronin ( T^ )- kon jugat
250 mg bovinserumalbumin (BSA) ble oppløst i 25 ml destillert vann og 1000 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (EDC) ble oppløst i 50 ml destillert vann. Begge løsninger ble kjølt til 4°C og 2/3 av EDC-løsningen langsomt blandet med BSA-løsningen. 150 mg renset T3ble oppløst i 25 ml etanol:2M-NH40H (25:1, vol./vol.) og løsningen kjølt til 4°C ble satt dråpevis til blandingen under kontinuerlig røring mens pH ble holdt ved 7,0 ved dråpevis tilsetning av 0/25M-HC1. Reaksjonsblandingen ble rørt ytterligere 10 min. og den øvrige EDC-løsningen tilsatt dråpevis mens pH ble holdt på 7,0.
Blandingen ble rørt natten over ved 4°C. Om morgenen ble løs-ningen sentrifugert og supernatanten dialysert mot 3 satser 0,1M_Na C03/NaHC03 ved pH 11,0 og deretter.destillert vann. Produktet ble til slutt frysetørket. Innføringen av T3i BSA ble funnet å være 4,3 mol T3 pr., mol BSA.
(b) Fremstilling av første antistoff (T3~antistoffer)
En stabil emulsjon ble fremstilt ved å blande 1 del saltløsning inneholdende Tween 80 (50%), T3-bovinserumalbumin (2 mg/ml)
og Bacillus Calmette-Guerin (BCG 1 mg/ml) med 2 deler mareol S2 hjelpestoff. 6 doser (1 ml hver) av emulsjonen ble injisert subkutant i ryggen og 4 intramuskulære injeksjoner (0,75 ml) ble gitt i leggene. Antistofftitrene ble regulert og etter 36 uker ble dyrene forsterket. For forsterkning ble 6 intramuskulære injeksjoner (0,5 ml) gitt i leggene. Emulsjonen bestod av deler hjelpestoff til 1 del saltløsning inneholdende T3~BSA konjugat (2 mg/ml). Bloduttakene 10 dager etter forsterkning og de neste 2 måneder inneholdt store mengder T3~antistoffer.
Ce) Fremstilling av immunoadsorbent for rensing av første
antistoff
Sepharose 4B ble aktivert med 1,4-bis-(2,3-epoksypropoksy)-butan som forut beskrevet. Den aktiverte Sepharose (4 ml)
ble satt til fosfatpuffer (pH 12,0, 0,025M, 20 ml) inneholdende T3(50 mg). Pufferen ble rørt i 45 timer ved romtemperatur. Gelen ble så vasket med fosfatpuffer (pH 12,0, 0,025M, 250 ml), natriumkloridløsning (150 ml, 0,1M) og destillert vann (100 ml). 9 mg T3 ble tilført pr.. ml av svellet gel. Alle gjenværende oksirangrupper ble blokkert ved å suspendere gelen i 4 ganger volumet vandig etanolåmin (IM,
pH 11) og ryste i 4 timer. Gelen ble så uttømmende vasket
med destillert vann for å fjerne overskudd etanolåmin.
l i
(d) Rensing av første antistoff
Anti-T^-serum (fremstilt som ovenfor beskrevet, 20 ml) ble blandet 1 time ved romtemperatur med T^-substituert Sepharose (1 ml). Ikke-spesifikt adsorberte proteiner ble fjernet fra immunoadsorbenten ved grundig vask med fosfatpufret saltløs-ning (0,05M, pH 7,0, 0,2H NaCl). Gelen ble pakket i en sprøyte som tidligere beskrevet og vasket med saltsyre (pH 3) for å fjerne fosfatpufferen. T^-antistoffer ble eluert ved å vaske med guanidinhydroklorid (4 ml, 6M,, pH 2) og oppsamlet i barbitonpuf f er (1 ml, 0,0511, pH 8,6, 0,1% bovinserumalbumin) . T^-antistoffene ble uttømmende dialysert mot denne puffer for
å fjerne guanidinhydrokloridet.
3. Fremstilling av påført antigen ( T-,) for bruk i målingen
Fremgangsmåten er som beskrevet i fremstillingen av immuno-adsorbent for rensingen av det første antistoffet (2 c ovenfor) med unntagelse av at konsentrasjonen av T., er mindre. Dette nedsetter konsentrasjonen av substituert i gelen.
Måling av T-. som bruker reagenser hvis fremstilling er beskrevet ovenfor utføres på den allerede beskrevne måte.
"Universal Reagens" kan brukes i flere forskjellige etiketter for å bestemme antigener. Disse omfatter:
Etikett la
Inkubering av første antistoff og fritt antigen fulgt av tilsetning av immunoadsorbent, og etter vask tilsetning av markeringen.
Etikett lb
En samtidig inkubering av første antistoff, fritt antigen
og immunoadsorbent. Markeringen tilsettes til den vaskede immunoadsorbenten.
i
Etikett 2a
En inkubering av det første antistoff, fritt antigen og markering. Denne følges etter en passende tid av tilsetningen av immunoadsorbenten.
Etikett 2a kan modifiseres ved å inkubere det første antistoffet med enzymmarkeringen før tilsetning av fritt antigen (Etikett 2b) .
Etikett 3
Etikett 3 innbefatter samtidig tilsetning av første antistoff, markering, fritt antigen og immunoadsorbent. Denne etiketten kan også modifiseres noe ved forutdannelse av markering-første antistoffkompleks.
De følgende eksempler beskriver resultatene av prøvene som utføres ved å bruke "Universal Reagens" fulgt av ovenfor beskrevne etiketter.
Enzym- immunomåling av trijodtyronin ( T3) ved bruk av Universal Reagens
Målingen av T3"ble utført ved bruk av flere forskjellige metoder.
Eksempel 2
Etikett la
T3 antiserum (sau, 1:2000 fortynning) i barbitonpuffer
(0,1 ml, 0,05M, pH 8,6, 0,1% vekt/volum) ble blandet med T3-standarder fremstilt i barbitonpuffer (0,1 ml) og holdt ved 4°C i 24 timer. Barbitonpuffer (0,1 ml, 0,3% vekt/volum Tween 80) som inneholdt T3 immunoadsorbent (50 ug) ble tilsatt, blandet, holdt ved 4°C i 1 time, vasket to ganger med barbitonpufret saltløsning (5% vekt/volum NaCl) og én gang med barbitonpuffer. Enzymmarkering (100 ul, esel-anti-sau IgG-galaktosidase) ble blandet med den vaskede immunoadsor-
I I
I
bent, holdt ved 4°C i 24 timer, vasket som forut beskrevet og enzymaktiviteten som var knyttet til immunoadsorbenten ble målt ved vanlige metoder.
Resultater
Ikke-spesifikk binding av markering til immunoadsorbent = 0,05<x>Binding beregnet etter subtrahering av NSB.
En lignende måling ble utført ved å bruke esel-antisau Fc-galaktosidase som markering. Fremgangsmåten var som ovenfor beskrevet med unntagelse av at (1) antiserumet og standardene ble holdt sammen i 8 timer, (2) antiserumfortynningen var 1:1600.
Eksempel 3
Etikett 2a
Renset T3 antiserum (sau, 1:1500 fortynning, 0,1 ml) og T3-standarder (0,1 ml) i barbitonpuffer (0,05M, pH 8,6, 0,1% vekt/volum BSA) ble blandet med markering (25 ul, esel-anti-sau IgG-enzym) og holdig ved 4°C i 24 timer,. Barbitonpuf f er I
I I
(0,1 ml, 0,3% vekt/volum Tween 80) som inneholdt T3-immuno-\adsorbent (50 ug) ble tilsatt under blanding cg holdt ved 4°C i 1 time. Immunoadsorbenten ble vasket og den bundne enzymaktivitet ble målt som beskrevet i eksempel 2.
Resultater
Eksempel 4 -
Etikett 2b
Rensede T3-antistoffer (1:1500 fortynning) i barbitonpuffer (0,05M, pH 8,6, 0,1% vekt/volum BSA, 8,5 ml) ble blandet med enzymmarkeringen (esel-anti-sau IgG-galaktosidasekonjugat, 5,1 ml) og lagret ved 4°C til bruk.
T3-standarder i barbitonpuffer (50 ul) ble blandet med markering-første antistoffkomplekset (200 ul) og ytterligere barbitonpuffer (0,5 ul), og deretter holdt ved 4°C i 4 timer. T3-immunoadsorbent (50 ug) i barbitonpuffer som inneholdt Tween 80 (0,4%) ble satt til rørene og inkubert ved 4°C i 1 time. Immunoadsorbenten ble vasket igjen med barbitonpuffer som inneholdt 5%, deretter 1% natriumklorid. Enzymaktiviteten knyttet til immunoadsorbenten bie målt ved de vanlige metoder.
I i Resultater
Dette eksperimentet ble gjentatt med en esel-antisau F - enzymmarkering. Resultatene lignet dem som er vist ovenfor.
Eksempel 5
Etikett 3
T3-stadarder i barbitonpuffer (100 ul) ble blandet med markering-første antistoff komplekset (200 ul) og T3-immuno-adsorbent (25 ug) i barbitonpuffer (100 ul) som inneholdt Tween 80 (0,4% vekt/volum), og inkubert ved 4°C i 2 timer. Immunoadsorbenten ble vasket og det bundne enzym ble målt som beskrevet for eksempel 4.
Resultater
Eksempel 6
Etikett 2b
Fremgangsmåten var som forut beskrevet for eksempel 4 bortsett fra at standardene ble fremstilt i strippet plasma. Tyroid-bindende globulin ble ødelagt ved å varme opp plasmaprøvene i et vannbad ved 70°C i 1 time. De erholdte resultater var lignende det som forut er beskrevet i eksempel 4.
Eksempel 7
Enzym- immunomåling av humant veksthormon ( HGH) ved bruk av Universal- reagens
Etikett la
HGH-antiserum (kanin, 1:20000 fortynning) i barbitonpuffer (0,1 ml, 0,05M, pH 8.,6, 0,65M NaCl, 0,5% vekt/volum BSA) ble blandet med HGH-standarder oppløst i barbitonpuffer (0,1 ml) og holdt ved 4°C i 24 timer. HGH-immunoadsorbent i barbitonpuf f er (0,1 ml, 10 ug) ble. så tilsatt, blandet, holdt ved 4°C i 1 time og vasket én gang med barbitonpuffer (2 ml, 0,05M, pH 8,6) som inneholdt 5% NaCl og én gang med puffer som inneholdt 1% NaCl. Enzymmarkering (50 pl, esel-anti-kanin F c-galaktosidase) ble tilsatt den vaskede immunoadsorbenten, blandet, holdt ved romtemperatur i 2 4 timer, vasket som ovenfor beskrevet, og enzymaktiviteten som var knyttet til immunoadsorbenten ble målt ved de vanlige metoder.
Ikke-spesifikk markeringsbinding til immunoadsorbent =
0,08
<x>Binding beregnet etter subtrahering av NSB.
Eksempel 8
Enzym- immunomåling for insulin ved bruk av Universal- reagens Etikett la
Insulin-antiserum (guinea-gris, 1:10000 eller 1:40000 fortynning) i fosfatpuffer (0,1 ml, 0,0411, pH 7,4, 0,5% vekt/ volum BSA) ble blandet med bovininsulinstandarder fremstilt i fosfatpuffer (0,1 ml) og holdt ved 4°C i 24 timer. Insulin-immunoadsorbent i fosfatpuffer (0,1 ml, 25 pg) ble tilsatt, blandet og rørene holdt ved 4°C i 30 min.. Immunoadsorbenten ble så vasket med fosfatpuffer (2 ml) som inneholdt 5% og så 1% natriumklorid. Enzymmarkering (50 pl, esel-anti-guinea-gris IgG-galaktosidasekonjugat) ble tilsatt rørene, blandet og holdt ved romtemperatur i 24 timer. Immunoadsorbenten ble vasket som forut beskrevet og galaktosidasaktiviteten som var knyttet til immunoadsorbenten ble målt ved de vanlige metoder.
i
I
I
i Resultater
Antiserumfortynning 1:10000.
Ikke-spesifikk binding =0,05 av enzymmarkering i immuno-adsorbent.
Eksempel 9
Enzymimmunomåling av kortisol ved bruk av Universal- reagens Etikett la
Kortisolantiserum (sau, 1:20000 fortynning) i fosfatpuffer (0,1 ml, 0,1M, pH 7,4, 0,1% vekt/volum gelatin, 0,83% vekt/ volum NaCl, 0,1% tiomersal) ble blandet med kortisolstan-darder fremstilt i fosfatpuffer (0,1 ml), og holdt ved 4°C
i 24.timer. Fosfatpuffer (0,3% vekt/volum Tween 80) som inneholdt kortisol-immunoadsorbent (0,1 ml, 25 pg) ble
så tilsatt, blandet, holdt ved 4°C i 1 time, vasket én gang med fosfatpuffer-saltløsning (3% vekt/volum) og én gang med fosfatpuffer. Enzymmarkering (25 pl, esel-anti-sau IgG-galaktosidasekonjugat, 0,5% vekt/volum Tween 80) ble satt til den vaskede immunoadsorbent, blandet, holdt ved 4°C i 24 timer, vasket som ovenfor og målt (som vanlig) for enzymaktivitet bundet til den faste fasen.
Resultater
Det er greit å bruke sett av materialer ved utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse på spesielle antigener som et sett omfattende en uløselig bærer hvortil er bundet et antigen som kan være samme eller forskjellig .
fra det som settet er ment for å påvise eller måle, et egnet første antistoff, og et egnet enzymmarkert annet antistoff,
og midler for å påvise enzymaktivitene som kreves i utførelsen av metoden, og fortrinnsvis for kalibreringsformål innbefattet en løsning som inneholder en kjent mengde av antigenet som settet er ment for å påvise eller måle..
Det kan være fordelaktig å ha den faste fasen knyttet til
en stav som kan innføres i og fjernes fra de andre kompo-nentene i måleblandingen. Dette ville lette vasking av den faste fasen og øke målingens nøyaktighet.
F.eks. kan et sett for T^-måling bestå av de følgende kompo-nenter: 1. en uløselig bærer, enten som en suspensjon i en puffer (f.eks. barbiton) eller i en lyofilisert. form med dertil bundet antigen .
I
2. det første antistoffet (anti-T^ frembrakt i sau) sammen med det andre antistoffet (frembarkt i esel-anti-sau IgG Fc, det andre antistoffet markert med 3-galaktosidase, idet denne komponenten fortrinnsvis foreligger i en lyofilisert form. 3. et substrat (f.eks. nitrofenyl-galaktosid) ved en slutt-konsentrasjon på ca. 10-3 Mi en puffer (f.eks. barbiton) fortrinnsvis med en pH fra 7 - 9 og en molaritet på 0,010 - 0,200, idet denne komponenten fortrinnsvis foreligger i en lyofilisert form. 4. en løsning som inneholder en kjent mengde antigen T_.
(f.eks. 10 nanomol pr. liter), idet denne komponenten fortrinnsvis foreligger i en lyofilisert form.
Claims (1)
- Fremgangsmåte ved enzym-bundet immunomåling omfattende at i et flytende kontaktmedium bringes samtidig eller trinnvis (1). et antigen (som forut definert) på en uløselig bærer eller i form av et uløselig aggregat, (2) et første antistoff (som i det foregående definert), og (3) et enzymmarkert annet antistoff (som forut definert) i kontakt, uløselige og løselige materialer separeres, og enzymaktiviteten bestemmes enten i de løselige eller i de uløselige separerte materialene, karakterisert ved at nevnte første antistoff (2) også bringes i kontakt med en prøve som inneholder antigenet som skal påvises eller måles som kan være det samme som eller forskjellig fra antigenet(1), idet det andre antistoffet (3) derved blir knyttet til det uløselige materialet i motsatt forhold til mengden av antigenet i prøven som skal påvises eller måles, hvorved nærværet eller mengden av antigenet i prøven bestemmes. j 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakter i- sert ved at det første antistoff (2) omsettes med (1) og prøven, den faste fase separeres fra den flytende fase, og alt det første antistoffet som er knyttet til den separerte faste fasen omsettes deretter med det andre antistoffet (3) i et annet flytende medium fritt for (2) og prøven, fulgt av separasjon av den faste fasen fra det andre flytende medium og påvisning eller måling av enzymaktiviteten i den faste fasen. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det andre antistoff (3) omsettes med det første antistoffet (2) for å danne et kompleks av de to antistoffene og komplekset omsettes så med antigenet med (1) og prøven. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte første antistoff eller kompleks omsettes med prøven og deretter med (1). 5. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte første antistoff eller kompleks omsettes med (1) og prøven samtidig. 6. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1 - 5, karakterisert ved at mengden av nevnte første antistoff er mer enn tilstrekkelig til å reagere med alt det foreliggende antigen i prøven, men ikke mer enn tilstrekkelig til å reagere med alt antigenet i prøven pluss alt antigenet i (1). 7. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-6, karakterisert ved at antigenet i (1) er det samme som antigenet i prøven og bæres av nevnte uløselige bærer. 8. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 3-7, karakterisert ved at enzymaktiviteten bestemmes i den flytende separerte fasen for å bestemme nærværet eller mengden av antigenet i prøven. 9. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-8, karakterisert ved at det første antistoffet (2) er hvilket som helst av de heri forut angitte. 10. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-8, karakterisert ved at det andre antistoffet (3) er ethvert av de her forut angitte. 11. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-10, karakterisert ved at det andre antistoffet (3) markeres med ethvert av de her forut angitte enzymer. 12. Materialsett for anvendelse ved utførelse av fremgangsmåten ifølge hvert av kravene 1 -11, karakterisert ved at det omfatter en uløselig bærer (1). hvortil er bundet et antigen som kan være samme som eller forskjellig fra den typen som settet er ment for å påvise eller måle eller inneholder nevnte antigen (1) i form av nevnte uløselige aggregat, et passende første antistoff (2),. et passende enzymmarkert annet antistoff (3) og midler for å påvise enzymaktiviteten som krevet ved utførelse av nevnte frem gangsmåte. 13. Sett ifølge krav 12, karakterisert ved at det omfatter en løsning som inneholder en. kjent mengde av antigenet som settet er ment for å påvise eller måle.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB51709/76A GB1549069A (en) | 1976-12-10 | 1976-12-10 | Enzyme linked immunoassay |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO774240L true NO774240L (no) | 1978-06-13 |
Family
ID=10461077
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO774240A NO774240L (no) | 1976-12-10 | 1977-12-09 | Fremgangsmaate ved paavisning og bestemmelse av antigener |
Country Status (26)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS53101522A (no) |
AR (1) | AR226805A1 (no) |
AU (1) | AU517266B2 (no) |
BE (1) | BE861711A (no) |
BR (1) | BR7708181A (no) |
CA (1) | CA1110165A (no) |
CH (1) | CH628739A5 (no) |
CS (1) | CS208739B2 (no) |
DE (1) | DE2755008A1 (no) |
DK (1) | DK550077A (no) |
ES (2) | ES464929A1 (no) |
FI (1) | FI773718A (no) |
FR (1) | FR2373795A1 (no) |
GB (1) | GB1549069A (no) |
GR (1) | GR63580B (no) |
HK (1) | HK13881A (no) |
HU (1) | HU179956B (no) |
IL (1) | IL53576A (no) |
IT (1) | IT1109485B (no) |
MY (1) | MY8100367A (no) |
NL (1) | NL7713692A (no) |
NO (1) | NO774240L (no) |
NZ (1) | NZ185927A (no) |
PT (1) | PT67384B (no) |
SE (1) | SE7714034L (no) |
TR (1) | TR20650A (no) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS576363A (en) * | 1980-06-13 | 1982-01-13 | Takeda Chem Ind Ltd | Production of specific antibody |
CA1160566A (en) * | 1980-04-25 | 1984-01-17 | Harald Gallati | Immunological determination method |
ES8307897A1 (es) * | 1981-04-13 | 1983-08-01 | Hoechst Co American | Un metodo de determinar la presencia de un antigeno en un medio liquido sospechoso de contenerlo. |
US4588680A (en) * | 1981-07-31 | 1986-05-13 | Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York | Assay for viruses |
EP0072902B1 (de) * | 1981-08-21 | 1985-04-24 | F. HOFFMANN-LA ROCHE & CO. Aktiengesellschaft | Verfahren zur Bestimmung von carcinoembryonalem Antigen (CEA) und zur Bestimmung geeignete Antikörperlösung |
JPS58151559A (ja) * | 1982-03-05 | 1983-09-08 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒト絨毛性ゴナドトロピンの免疫化学的測定法 |
US4704356A (en) * | 1984-03-27 | 1987-11-03 | Rush-Presbyterian-St. Luke's Medical Center | Method of diagnosing cartilage tissue abnormalities |
US4734362A (en) * | 1986-02-03 | 1988-03-29 | Cambridge Bioscience Corporation | Process for purifying recombinant proteins, and products thereof |
CH670709A5 (no) * | 1986-04-24 | 1989-06-30 | Univ Moskovsk | |
AT388618B (de) * | 1987-05-05 | 1989-08-10 | Binder Bernd Dr | Verfahren zur quantitativen bestimmung von funktion und antigener konzentration einer in einer biologischen fluessigkeit enthaltenen substanz |
DE3807440A1 (de) * | 1988-03-07 | 1989-09-21 | Progen Biotechnik Gmbh | Verfahren zum immunologischen nachweis von substanzen sowie eine derartige zusammensetzung und ein testkit |
DE19508264C1 (de) * | 1995-03-08 | 1996-02-01 | Klose Werner Dipl Ing Fh | Verfahren und Vorrichtung zum Vermessen von Konturen, insbesondere des Straßenverlaufs |
US6808902B1 (en) | 1999-11-12 | 2004-10-26 | Amgen Inc. | Process for correction of a disulfide misfold in IL-1Ra Fc fusion molecules |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL154600B (nl) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
NL154599B (nl) * | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
US4002532A (en) * | 1974-10-21 | 1977-01-11 | Weltman Joel K | Enzyme conjugates |
US3951748A (en) * | 1974-11-11 | 1976-04-20 | Medical Products, Inc. | Sensitized matrix for detection of disease |
DK140815B (da) * | 1975-06-10 | 1979-11-19 | Weeke Bengt | Fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af antistoffer i legemsvæsker ved hjælp af kendte antigener eller til bestemmelse af antigener ved hjælp af kendte antistoffer fra legemsvæsker samt et middel til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden. |
-
1976
- 1976-12-10 GB GB51709/76A patent/GB1549069A/en not_active Expired
-
1977
- 1977-12-09 ES ES464929A patent/ES464929A1/es not_active Expired
- 1977-12-09 NO NO774240A patent/NO774240L/no unknown
- 1977-12-09 AU AU31395/77A patent/AU517266B2/en not_active Expired
- 1977-12-09 CH CH1516677A patent/CH628739A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1977-12-09 TR TR20650A patent/TR20650A/xx unknown
- 1977-12-09 GR GR54943A patent/GR63580B/el unknown
- 1977-12-09 HU HU77EA179A patent/HU179956B/hu unknown
- 1977-12-09 CS CS778265A patent/CS208739B2/cs unknown
- 1977-12-09 FR FR7737194A patent/FR2373795A1/fr active Granted
- 1977-12-09 DE DE19772755008 patent/DE2755008A1/de not_active Ceased
- 1977-12-09 AR AR270301A patent/AR226805A1/es active
- 1977-12-09 IL IL53576A patent/IL53576A/xx unknown
- 1977-12-09 NZ NZ185927A patent/NZ185927A/xx unknown
- 1977-12-09 FI FI773718A patent/FI773718A/fi not_active Application Discontinuation
- 1977-12-09 CA CA292,743A patent/CA1110165A/en not_active Expired
- 1977-12-09 NL NL7713692A patent/NL7713692A/xx not_active Application Discontinuation
- 1977-12-09 BR BR7708181A patent/BR7708181A/pt unknown
- 1977-12-09 JP JP14733977A patent/JPS53101522A/ja active Pending
- 1977-12-09 SE SE7714034A patent/SE7714034L/ not_active Application Discontinuation
- 1977-12-09 IT IT30554/77A patent/IT1109485B/it active
- 1977-12-09 BE BE183341A patent/BE861711A/xx not_active IP Right Cessation
- 1977-12-09 PT PT67384A patent/PT67384B/pt unknown
- 1977-12-09 DK DK550077A patent/DK550077A/da not_active Application Discontinuation
-
1978
- 1978-04-19 ES ES468934A patent/ES468934A1/es not_active Expired
-
1981
- 1981-04-09 HK HK138/81A patent/HK13881A/xx unknown
- 1981-12-30 MY MY367/81A patent/MY8100367A/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BE861711A (fr) | 1978-03-31 |
BR7708181A (pt) | 1978-07-11 |
AU517266B2 (en) | 1981-07-16 |
IL53576A0 (en) | 1978-03-10 |
AR226805A1 (es) | 1982-08-31 |
NL7713692A (nl) | 1978-06-13 |
DK550077A (da) | 1978-06-11 |
GB1549069A (en) | 1979-08-01 |
TR20650A (tr) | 1982-03-24 |
AU3139577A (en) | 1979-06-14 |
PT67384B (en) | 1979-05-18 |
CH628739A5 (en) | 1982-03-15 |
ES468934A1 (es) | 1978-12-16 |
ES464929A1 (es) | 1979-01-01 |
FR2373795A1 (fr) | 1978-07-07 |
HU179956B (en) | 1983-01-28 |
IT1109485B (it) | 1985-12-16 |
DE2755008A1 (de) | 1978-06-15 |
PT67384A (en) | 1978-01-01 |
CA1110165A (en) | 1981-10-06 |
FI773718A (fi) | 1978-06-11 |
SE7714034L (sv) | 1978-06-11 |
NZ185927A (en) | 1980-02-21 |
JPS53101522A (en) | 1978-09-05 |
GR63580B (en) | 1979-11-22 |
IL53576A (en) | 1981-07-31 |
FR2373795B1 (no) | 1982-09-10 |
CS208739B2 (en) | 1981-09-15 |
HK13881A (en) | 1981-04-16 |
MY8100367A (en) | 1981-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Steinbrecher et al. | Immunogenicity of homologous low density lipoprotein after methylation, ethylation, acetylation, or carbamylation: generation of antibodies specific for derivatized lysine. | |
CA1341592C (en) | Ion capture reagents and methods for performing binding assays | |
US4298685A (en) | Diagnostic reagent | |
US4629692A (en) | Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments an index of glycemia | |
NO774240L (no) | Fremgangsmaate ved paavisning og bestemmelse av antigener | |
JPS6343711B2 (no) | ||
Kabakoff | Chemical aspects of enzyme-immunoassay | |
NO155968B (no) | Fremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk virksomme immunosuppressive konjugater av d-glutaminsyre-d-lysin-kopolymerer med antigen. | |
JP3103379B2 (ja) | レセプター:遊離リガンド(リランド)複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット | |
Stalla et al. | The development of a direct homologous radioimmunoassay for serum cortisol | |
CN103421072A (zh) | 地塞米松半抗原及其制备方法和应用 | |
EP1425578A2 (en) | Materials and methods for the determination of an analyte | |
CN103376316B (zh) | 一种检测链霉素的试纸条及方法 | |
NO790252L (no) | Spesifikke bindings-proevings teknikker | |
CN100476439C (zh) | 一种检测动物源性食品中氟喹酮类药物的酶联免疫试剂盒 | |
Wilkinson et al. | Immunological analysis of mycotoxins | |
EP0088974A2 (en) | Homogeneous immunoassay with labelled monoclonal anti-analyte | |
US4801726A (en) | Repetitive hit-and-run immunoassay and stable support-analyte conjugates; applied to T-2 toxin | |
WO1997016727A1 (en) | Assay background reduction using glycoproteins with oxidized carbohydrates | |
GB1591204A (en) | Preparation of immobilised antigens and antibodies | |
JPH038512B2 (no) | ||
GB2109931A (en) | Enzyme immunoassay | |
US4486534A (en) | Process for the preparation of immunologically active enzyme tagged conjugates | |
MATSUOKA et al. | Fluorophotometric enzyme immunoassay of neocarzinostatin using peroxidase as a label | |
Haagsma et al. | Immunochemical methods in the analysis of veterinary drug residues |