NO774240L - Fremgangsmaate ved paavisning og bestemmelse av antigener - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører enzymforbundet immunobestemmelse og gir en ny fremgangsmåte for påvisning og måling av antigener, og reagenser for bruk i denne. Uttrykket "antigen" som her brukt betyr ikke bare substanser som i seg selv kan fremkalle produksjonen av antistoffer i dyr, dvs. immunogener, men.også substanser, noen ganger kalt haptener, som etter konjugering med et bæremolekyl blir i stand til å frembringe produksjonen av og reaksjon med spesifikke antistoffer.

Det er en betydelig teoretisk og praktisk interesse for å kunne påvise og måle nærvær av antigener. Da slike substanser ofte har en kompleks og hyppig ukjent kjemisk struktur og opptrer i meget lave konsentrasjoner i biologiske og andre materialer,

er det ikke mulig å anvende konvensjonelle analyseteknikker. Følgelig har i de siste få årene en rekke teknikker blitt ut-viklet basert på antigen-antistoff-reaksjonen, hvori en reak-sjonskomponent markeres med en radio-aktiv "tracer" eller f.eks. med et enzym, slik at reaksjonsproduktene eller i noen. tilfeller det ubrukte reagenset kan påvises og/eller måles. Skjønt metoder basert på bruken av radioaktive markeringer

har visse teoretiske fordeler, særlig det faktum at visse typer markering, spesielt sådanne som anvender tritium eller 14

C, interfererer den radioaktive traceren selv ikke med antigen-antistof f reaks j onen , er det visse ulemper forbundet med bruken av denne teknikken, særlig behovet for å tilveiebringe den nødvendige apparatur for å måle radioaktiv tracer, å beskytte operatøren for mulige skadelige virkninger fra radioak-tiviteten og å plassere det radioaktive avfallet etter bruk. Mange radioaktive markeringer må kastes med jevne mellomrom p.g.a. den radiokjemiske dekomponering av den radioaktive isotopen. Videre kan det være vanskelig å radiomarkere anti gener med liten molekylvekt og bibeholde deres viktige antigen-egenskaper. Det er derfor vært vist betydelig interesse for metoder, hvori antigen-antistoffreaksjonen følges ved bruk av et reagens, hvori et enzym virker som tracer. Slike metoder er enkle å utføre og trenger relativt enkelt utstyr, og omfatter ingen helsemessige risiko. Ikke desto mindre har mange av de hittil foreslåtte systemer lidd av den ulempe at det er nødvendig for god funksjonering å fremstille et konjugat mellom det anvendte enzymet som tracer og antigenet som skal påvises. Fremstillingen av disse konjugatene er ikke. alltid lett p.g.a. behovet for å bevare enzymaktiviteten til enzym-delen i konjugatet, og det er særlig tungvint å måtte frem-stillle et separat konjugat for hvert individuelt antigen som er tilsiktet påvist. Ved fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan på den annen side et enkelt enzymholdig konjugat brukes på et stort antall antigener. Prinsipielt kan faktisk et enkelt sådant konjugat brukes på alle'antigener.

I et tidligere forslag (Engvall et. a_l, J. Immunology 109

(1972) page 129) er antistoffer bestemt ved reaksjon med antigener på et uløselig underlag etterfulgt av reaksjon av antigen-antistoff-konjugat på underlaget med et enzymmarkert anti-immunoglobulin som var kjent for å kunne reagere med antistoffet på konjugatet. Med denne metoden avhenger mengden av enzym som til slutt er knyttet til underlaget av mengden antistoff i prøven som er under behandling da enzymet blir bundet til underlaget ved en kjede, hvorved antistoffet som skal bestemmes utgjør et avgrenset og essensielt ledd.

Fremgangsmåte ved foreliggende oppfinnelse for enzymbundet immunobestemmelse består av å bringe i kontakt, samtidig

eller trinnvis og i et flytende medium,(1) et antigen (som forut definert) på et uløselig underlag eller i form av et uløselig aggregat, (2) et første antistoff (som i det føl-gende definert)og (3) et enzymmarkert annet antistoff (som

i det følgende definert), adskille de uløselige og løselige materialene og måle enzymaktiviteten for én eller flere av dem.

Oppfinnelsen erkarakterisert vedat nevnte første antistoff (2) også bringes i kontakt med en prøve som inneholder antigenet som skal påvises eller måles som kan være det samme eller forskjellig fra antigenet (1), det andre antistoff (3) knyttes derved til det uløselige materialet i motsatt forhold til mengden av antigenet i prøven som skal påvises eller måles for å bestemme nærværet eller mengden av antigenet i.prøven. Uttrykket "første antistoff" slik det her er brukt, betyr et antistoff som kan binde både antigenet på det uløselige underlaget og antigenet som skal påvises. Uttrykket "annet antistoff" betyr antistoff som er spesifikt for alle antilegemer i immunoglobulihklassen som det første antistoffet tilhører, f.eks. alle saue IgG, kanin IgG eller kanin IgM. Hvis f.eks. det. første antistoffet er et immunoglobulin som dannes i et spesielt dyr, f.eks. en sau, er det andre antistoffet et antistoff mot immunoglobuliner fra denne arten, uavhengig av deres antistoffspesifisiteter, som dannes i et forskjellig dyr, f.eks. et esel.

Den nye metoden kan lett tilpasses for påvisning og måling

av en rekke antigener. Foruten antigener kan serum med passende innhold og vevsproteiner som a^-foetoprotein, c^-haptoglobulin og karsinoembryonisk antigen, haptener som hormoner, f.eks. trijodtyronin norepinefrin, tyroid-stimulerende hormon, follikel-stimulerende hormon, luteniserende hormon, insulin og tyroksin, steroider, f.eks. kortisol, pro-gesteron, østron, østradiol og testosteron, droger, f.eks. morfin, amfetamin, barbiturater, difenylhydantoin, meto-treksat og gentamycin, vitaminer og næringsmiddeltilset-ninger, f.eks. pyridoksal-5-fosfat og aflotoksin, herbici-der, insekticider og nitrosourinstoffer også brukes. I hvert tilfelle må antigenet først bindes enten kjemisk eller mindre gjerne fysikalsk til et egnet underlag, f.eks. på den måten som nærmere beskrives i det følgende.

Det må bemerkes at det enzymmarkerte andre antistoffets natur på ingen måte avhenger av antigenet som skal påvises. Det er bare nødvendig å fremkalle det første antistoffet i et dyr av samme art som det som fremkalte immunoglobulinet som brukes til å stimulere produksjonen i andre arter av det andre

antistoffet. Det er derfor ikke noe behov for å frembringé

et stort spektrum av enzymmarkerte antistoffer, og vanskelig-hetene som ligger -i å knytte enzymene til antistoffene må derfor bare løses en gang.

Ethvert enzym kunne anvendes som en markering på det andre antistoffet. Oksydaser som pepperrot-peroksydase, hydrolytiske enzymer som alkalisk fosfatase eller dehydrogenaser som glykose-6-fosfat-dehydrogenase er særlig egnet. Ideelt bør et enzym som bruks som markering ha de følgende egenskaper: (1) det er relativt billig tilgjengelig i høy renhet, (2) det har en høy aktivitet pr. vektenhet, (3) det er lett vannløselig og stabilt under normale lagringsbetingelser, (4) det gjør det mulig å bruke en målemetode som er enkel, rask, sensibel og billig, (5) det bør være fritt for biologiske væsker og (6) biologiske væsker bør ikke inneholde noen substratinhibitorer eller aktivatorer for det, (7) det bør inneholde egnede, kjemiske grupper for konjugering til et annet antistoff som gjør det mulig at konjugering bare har en minimal virkning på både enzym og antistoffaktivitet. 3-galaktosidase tilfreds-stiller disse kravene. Andre mulige, men mindre foretrukne enzymer er glukoseoksydase, acetylcholinesterase-glukoamylase, lysozym, glukose-6-fosfat-dehydrogenase og malatdehydrogenase..

Det brukte enzymet' kobles fortrinnsvis til det andre antistoffet ved å bruke koblingsmetoden som nedenfor er beskrevet,

som kan anvendes på enhver kombinasjon av antistoff og enzym forutsatt at sistnevnte inneholder en merkaptogruppe eller kan modifiseres slik at det vil inneholde en slik gruppe. Imidlertid kan om nødvendig andre koblingsmetoder brukes. Disse innbefatter

a) Ett-trinns glutaraldehydbinding hvori glutaraldehydet brukes til å knytte proteiner i en komplisert reaksjon som gir

heterogene konjugater med høy molekylvekt, (se Avrameas, S., Immunochemistry 6^43 (1969)).

b) To-trinns glutaraldehydbinding hvori enzymet pepperrot-peroksydase reagerer med bare ett molekyl glutaraldehyd. Dette begrenser enzym-enzymkonjugering og er enforbedring av én-trinns-metoden. Imidlertid kan denne metoden sannsynligvis ikke anvendes på mange enzymer foruten pepperrot-peroksydase, da disse vil reagere med mer enn ett molekyl-glutaraldehyd.

(se Avrameas. S and Ternynck, Immunochemistry £5 1175 (1971)). c) Oksydasjon av sakkaridrester i enzymet fulgt av Schiff-basedannelse. Pepperrot-peroksydase har flere oligosakkaraid-grupper, og oksydasjonen av dem til aldehydgrupper (ved bruk av perjodat) som kan reagere med aminogrupper er basert på denne bindingsmetoden. Andre enzymer kan også inneholde oligo-sakkaridgrupper og kan i prinsippet også brukes. Imidlertid, dannes konjugater med høy molekylvekt ved denne fremgangsmåten. (Nakane P.K. + Kawaoki, A. J. Histochem. Cytochem. 2_2 108.4 (1974)). d) Dimaleimid-binding ved bruk av N,N<1->o-fenylendimaleimid etter innføring av -SH-grupper i antistoffet ved bruk av 2-merkaptoetylamin som reduserer forut eksisterende -S-S- broer til to -SH-grupper. (Kato et .al European J. Biochem. 6_2 285

(1976)). e) Andre bifunksjonelle reagenser som kan brukes omfatter toluen-2 , 4-diisocyanat, p_' ,p-dif luor-m,m' -dinitrof enylsulfon, l-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)-karbodiimid, men disse gir generelt dårligere resultater enn de foran beskrevne. f) Binding kan også oppnås med hetero-bifunksjonelle reagenser, dvs. reagenser som inneholder to forskjellige funksjo-nelle ' grupper i hvert molekyl, f.eks. m-maleimidobenzyl N-hydroksy-succinimidester, som har vært brukt i en to-trinns reaksjon for å koble insulin til 3-galaktosidase. (T. Kita-gawa + T. Aikawa J. Biochem. 1_ 9 233 - 236 (1976)). g) Ikke-kovalent kryssbinding ved f.eks. å koble antistoffer til pepperrot-peroksydase for å danne et konjugat som er ikke-kovalent, men relativt stabilt av natur. Denne metoden har de ulemper at (i) Ved lagring kan enzymantistoffkonjugatet dissosiere lang-<!>somt.

(ii) Antistoffene kan inhibere enzymene de er fremkalt mot.

(ii) Det tar flere måneder å fremstille antistoffene og antistoffer som er frembrakt av forskjellige fremstillere har forskjellige egenskaper.

Grunnet større hastighet og letthet som er forbundet med

arbeid med relativt store mengder antistoffer, er det ofte lettere hvis de første og andre antistoffer fremstilles i relativt store dyr som hest, esel eller sau fremfor små dyr som rotte, mus, guinea-gris eller hamstere selv om bruk av sådanne ikke er utelukket. Som allerede antydet må det første og andre antistoff frembringes i forskjellige typer dyr. Man har funnet det lett å frembringe det første antistoffet hos sau og det andre antistoffet hos et esel, men et hvilket som helst annet par forskjellig typer kan anvendes om ønsket.

Muligheten for interferens ved det andre stoffet i antigen-, første-antistoffreaksjonen nedsettes hvis det andre antistoff ikke frembringes mot alt av det første antistoffet, men bare mot Fc-fragmentet av immunoglobulinet som utgjør det første antistoffet.

De andre antistoffene kan hovedsakelig fremstilles på kjent

måte, men den foretrukne metoden er å 'prime" dyrene etter-

fulgt av fremstilling av antistoffer og å gi"booster-dose-ringer når serum-antistoffnivåene har passert toppen. Blodet inneholder normalt maksimale antistoffnivåer kort.etter"boos-ting. Når et passende høyt nivå (eller et maksimalt nivå)

av anti-immunoglobulin har akkumulert i blodstrømmen hos dyret tappes sistnevnte for blod og serumet som inneholder anti-immunoglobulinet fraskilles.

Det andre antistoffet renses fortrinnsvis ved å inkubere esel-antiserum med en egnet immunoadsorbent, f.eks. sefarose eller annen uløselig bærer som har blitt aktivert først ved reaksjon \

i med et egnet bifunksjonelt reagens, eksempelvis l,4-bis(2,3-epoksypropoksy)butan og så med en løsning av immunoglobulinet . (eller Fc-fragment av dette) som brukes for å fremkalle det andre antistoffet. Dette gir en immuno-adsorbent som er spesifikk for det andre antistoffet, og sistnevnte kan renses ved adsorpsjon på immunoadsorbenten fulgt av eluering, før eller etter markering med et enzym.

For å fremstille det markerte andre antistoffet foretrekkes det å behandle immunoadsorbenten med det andre antistoffet adsorbert på dette med et reagens som metylmerkaptobutyrimidathydroklorid for å modifisere aminogruppene i antistoffet og innføre fra 3-5 'tiolgrupper i hvert antistoffmolekyl. Det andre antistoffet med innebygde merkaptogrupper elueres så fra immunoab-sorbenten og. behandles slik at enzymet bindes til dette. Fortrinnsvis behandles det med N,N'-o-fenylen-bis-maleimid og omsettes så med renset (3-galaktosidase som normalt stammer fra Escherichia coil. Enzym-sekundær-antistoffkonjugatet renses

så til slutt ved kromatografi på en dietylaminoetylagarose-gel eller annen egnet adsorbent for å adskille konjugatet fra uomsatt enzym og uomsatt annet antistoff.

Det første antistoffet fremkalles i et egnet dyr ved hjelp av kjente teknikker. Der hvor, som ofte tilfellet er, antigenet som skal påvises eller måles er et hapten med relativt enkel kjemisk struktur f.eks. trijodtyronin, østradiol, gentamycin, fenytoin eller morfin, er det ikke i stand til i seg selv å frembringe dannelsen av det første antistoffet. Det er derfor nødvendig å konjugere antigenet med et bæremolekyl for å

gi et konjugert molekyl som er i stand til å frembringe produksjonen av antistoffet. For dette formål er det hensikts-messig å konjugere antigenet med et lett tilgjengelig protein som er fremmed for dyret som det første antistoffet skal fremkalles i,' f.eks. bovinserumalbumin (BSA). Konjugeringen kan utføres ved omsetning av albuminet eller annet protein med f.eks. l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid, fulgt av omsetning av produktet med antigenet som for denne reaksjonen må inneholde en amino eller karboksylgruppe. Andre kjente konjugasjonsmetoder kan brukes om ønsket, og ideelt

sett skulle ca. 3-30 antigenmolekyler innebygges i hvert albuminmolekyl eller andre proteiner med høy molekylvekt.

Det første antistoffet kan frembringes ved å injisere antigenet eller antigen-konjugatet i et egnet dyr, f.eks. en sau, gjentatt

over en periode på uker eller måneder inntil et tilstrekkelig høyt antistoffinnhold med de ønskede bindingsegenskaper har akkumulert seg i dyrets blodstrøm. Dyret tappes så for blod og antiserumet fraskilles.

Det første antistoffet renses 'Så fortrinnsvis ved kontakt med antigenet som antistoffet ble fremstilt mot eller en beslektet forbindelse på en uløselig bærer. Etter absorpsjon kan antistoffene elueres, f.eks. med guanidinhydrokloridløsning ved høy eller lav pH med løsninger med høy saltkonsentrasjon eller med ikke-vandige løsningsmidler og deretter dialyseres mot en passende puffer for å fjerne elueringsmidlet.

Den uløselige bæreren som brukes for å holde antigenet eller den beslektede forbindelse både i rensingsprosessen som nett-opp er nevnt og i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan være ethvert egnet vann-uløselig materiale som antigenet eller den beslektede forbindelse lett kan bindes tilstrekkelig til for å sikre at det forblir knyttet til dette under reaksjo-nene som inngår i rense- eller prøve-metoden som kommer på tale. Selv om det er mulig å bruke en bærer som ganske enkelt adsorberer antigenet slik tilfellet er i systemet som er beskrevet av Engvall et al i allerede nevnte publikasjon, ' foretrekkes det å binde antigenet kjemisk til bæreren, og dette betyr at det er nødvendig at bæreren inneholder funk-sjonelle grupper som de nødvendige reaksjoner kan finne sted ,med. Bærere bestående av glass, nylon, polyakrylamid, cel-lulose eller dekstran kan brukes. Visse typer immunoadsor-benter som inneholder hydroksylgrupper kan omsettes med 1,4-bis(2,3-epoksypropoksy)butan og produktet omsettes med antigenet. Denne metoden er funnet å være enkel, sikker, effek-tiv og gi en stabil kovalent binding forutsatt at antigenet eller den beslektede forbindelsen inneholder hydroksyl, amino eller tiolgrupper. Kravene til en immunoadsorbent for rensing av antistoffer er ikke nødvendigvis de samme som sådanne for.

I I

immunoadsorbenten i den virkelige prøven.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan utføres på

mange forskjellige måter. Mengden av første antistoff og derfor markeringen som er knyttet til det uløselige antigenet står i et inverst forhold til mengden av antigen i prøven som skal bestemmes. Enzymaktiviteten, enten fri eller knyttet til det uløselige eller bårede antigenet måles. Noen av de spesifikke måter.for å utføre den nye fremgangsmåten er som følger.

I en første metode inkuberes det første antistoffét med en prøve som inneholder- antigenet som skal bestemmes. Etter at reaksjonen er fullstendig tilsettes det bårede antigenet og blandingen inkuberes igjen. Den faste fasen separeres så fra væskefasen, vaskes og blandes med overskudd av det enzymmarkerte andre antistoffet. Etter inkubering separeres igjen den faste fasen og vaskes. Aktivitetsmengden som ble funnet i den uløselige fraksjonen (faste fase) er omvendt proporsjonal med mengden av antigen som foreligger i prøven, dvs. supernatanten er direkte proporsjonal med den. Begge fraksjonene kan måles.

I en annen metode omsettes det første antistoffet med det enzymmarkerte andre antstoff for å danne et kompleks som så settes til overskudd av prøven som inneholder antigenet som skal bestemmes og inkuberes. Den uløselige bæreren som bærer antigenet tilsettes så, og etter inkubering separeres de faste og flytende fasene. Bestemmelsen av enzymaktiviteten til den flytende fase gir et resultat som er direkte proporsjonalt med mengden av antigen i prøven.

I en tredje metode inkuberes komplekset av første og andre antistoffer, prøven som inneholder antigenet som skal bestemmes, og bæreren som bærer antigenet simultant, og etter separasjon av den faste fasen, bestemmes enzymaktiviten i den flytende fasen. Igjen er resultatet direkte proporsjonalt med konsentrasjonen av antigen i prøven.

Som allerede antydet må for en kvantitativ bestemmelse ved den;

første og andre metoden ovenfor, mengden av første brukte antistoff være i overskudd av hva som kreves for å omsette alt antigenet i prøven, og bæreren som bærer antigenet må tilsettes i et tilstrekkelig overskudd for å sikre fullstendig adsorpsjon av alt det første antistoffet som ikke har reagert med antigenet i prøven. I praksis er den letteste måten å sikre dette å utføre en serie bestemmelser med forskjellige konsentrasjoner av første antistoff i geometriske eller aritmetiske serier. Hvis dette gjøres er det en enkel sak å finne en passende konsentrasjon av det første antistoffet som muliggjør utførelsen av en nøyaktig bestemmelse.

De følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

i i Eksempel 1

1. Fremstilling og markering av annet antistoff

(a) Fremstilling av Fc~fragment av saueimmunoglpbulin

( IgG)

Fremgangsmåten som anvendes for fremstilling av sau Fc-fragment er basert påPorters (R.R. Porter, 1959 , Biochem J. 7_3, 119).

320 ml serum ble samlet fra 28 sauer. 150 ml serum ble inkubert under røring i et isbad med 30 g fuktig dietylaminoetyl (DEAE) - A 50 Sephadex som forut var ekvilibrert med 10 mM fosfatpuffer ved pH 6,5. Etter 1 time ble gelen filtrert på en grov sintret glasstrakt og vasket med 50 ml av 10 mM fosfatpuffer pH 6,5. Filtratet pluss vask ble inkubert en gang til med 30 g fuktig DEAE-Sephadex, filtrert og vasket med 100 ml fosfatpuffer. Filtrat og vask (300 ml) ble behandlet med 150 ml mettet (NH^^ S0^-løsning som langsomt ble tilsatt den kontinuerlige rørte løsningen. Fellingen ble oppsamlet og vasket med 100 ml 20% (NH^) ^SO^-l.øsning. Den endelige fellingen ble oppløst i 50 ml 50 mM fosfatpuffer ved pH 8,0

og dialysert natten over ved 4°C mot 5 1 destillert vann. Løsningen ble så frysetørket.

1,, 50 g frysetørket sau IgG som var oppnådd slik ble oppløst i

50 ml 0,1M tris-HCl-puffer ved pH 7,2 som inneholdt 10 mM cystein og 2 mM EDTA. Pufferen ble fremstilt umiddelbart

før bruk. 0,6 ml av en krystallinsk suspensjon av Papain (Sigma.to ganger krystallisert) i 50 mM-acetat-puffer ved pH 4,5 ble tilsatt. Løsningen ble inkubert ved 37°C i 4 timer under leilighetsvis rysting. 0,222 g jodacetamid ble så tilsatt og løsningen umiddelbart satt på en kolonne (80 x 5 cm) G.100 Sephadex ekvilibrert med 10 mM-acetat-puffer ved pH 5,6 ved 4°C.

Den andre toppen som ble eluert fra kolonnen med 10 mM-acetat-puf f er ved pH 5,6 inneholder en blanding av Fc"og F tø-fragmenter. Den første toppen inneholder ubrukt IgG.. Den andre toppen ble satt på en kolonne (40 x 2,5 cm) av karboksymetylcellulose (Whatman CM 32) som var ekvilibrert med 10 mM-acetat-puffer ved pH 5,6 ved 4°C. En topp ble eluert fra kolonnen ved vasking med 10 mM-acetat-puffer pH 5,6 og flere små topper og en hovedtopp ble eluert når en gradient fra 10 mM-til 500 mM-acetat pH 5,6 ble påført (1000 ml i hvert rom av en gradientblander). Hovedtoppen ble oppsamlet og rekromato-grafert på karboksymetyl-cellulosekolonnen. Denne gangen ble en gradient fra 10 mM- til 300 mM-acetat-puffer ved pH 5,6

med 1000 ml i et blandekar påført. Én enkelt topp ble eluert.. Denne ble oppsamlet, fullstendig dialysert mot destillert vann og frysetørket.

b) Fremstilling av annet antistoff (esel-antisau-immunoglobulin)

En stabil emulsjon ble fremstilt ved å blande 1 del saltløs-ning som inneholdt sau Fc~fragment (0,7 5 mg/ml) og Bacillus Calmette-Buerin (1,5 mg/ml) med 2 deler Marcol 52 hjelpestoff. 6 intramuskulære injeksjoner (1 ml) av emulsjonen ble gitt i nedre legg. Fremstillingen av esel-antisau-antistoffer ble regulert og dyret var klart for forsterkning etter 2 måneder. En emulsjon bestående av 2 deler hjelpestoff til 1 del salt-løsning (sau Fc 0,75 mg/ml) ble injisert intramuskulært på 6 steder (0,5 ml) i de nedre leggene. Bloduttakene 10 dager senere og i den neste måned inneholdt store mengder antistoffer.

c) Fremstilling av immunoadsorbent for rensing av esel-anti- sau- immunoglobulin

Sepharose 4B ble aktivertmed 1,4-bis-(2,3-epoksypropoksy)-butan ved å inkubere like volumer av gelen, bisepoksydet og 0,6M NaOH som inneholdt 2 mg pr. ml natriumborhydrid under kontinuerlig røring ved 25°Ci 8 timer og så vasket. Sau IgG ble fremstilt fra et forråd av normalt serum ved felling med 33% ammnoiumsulfatløsning. En løsning av sau IgG i 0,1M NaHCO^-puffer ved pH 10 ble tilsatt ved bruk av 10 mg sau

IgG pr. ml gel. Den aktiverte gelen ble inkubert med IgG i 48 timer og immunoadsorbenten til slutt vasket og behandlet

I

med 0,1M etanolamin ved pH 10 i 24 timer.

(d) Rensing og markering av esel- anti- sau annet antistoff

Esel-anti-sau-immunoglobulin ble renset ved å inkubere esel-anti-serum (fremstilt som ovenfor beskrevet) med immunoadsorbenten. Tiolgrupper ble innført i immunoglobulinet' mens det var adsorbert i immunoadsorbenten ved bruk av metyl-4-merkapto-butyr.imidat/HCl for å modifsere immunoglobulinets aminogrupper. Innføringsgraden ble begrenset til å gi mellom 3 og 5 tiolgrupper pr. globulinmolekyl.

Immunoadsorbent-atnistoffkomplekset ble vasket og supenderti 0,1M N-etylmorfolin/HC1 ved pH 7,5 ved en konsentrasjon på 1 ml. immunoadsorbent i et totalvolum på 10 ml. En løsning av metyl-4-merkaptobutyrimidat/HCl i 0,2M Na2C03(10 mg/ml) ble fremstilt umiddelbart før bruk. 0,1 ml av denne løsning ble så tilsatt for hver 10 ml av suspensjonen. Suspensjonen ble rørt 30 min. ved romtemperatur og så vasket med 0,1M N-etylmor-folin/HCl ved pH 7,5 som inneholdt 1 mg ditiotreitol pr. 10 ml puffer. Gelen ble så grundig vasket med HC1 som inneholdt 0,1M NaCl til pH 3,5..

Immunoglobulinet som inneholdt innebygde tiolgrupper som var fremstilt slik ble. eluert med HC1 som inneholdt 0,1M NaCl ved pH 2,5. Den greieste metoden for å oppnå dette var å pakke immunoadsorbenten i en liten kolonne og samle effluenten i rør som inneholdt puffer. Da det neste fremstillingstrinnet utføres i 0,1M acetatpuffer ved pH 5,0, ble effluenten oppsamlet i tilstrekkelig 0,1M acetat ved pH 6,0 til "å gi en endelig pH på 5,0.

2 ml av 0,1M acetatpuffer ved pH 5,0 som * inneholdt 2,5 mg av immunoglobulinet som var modifsert med tiolgrupper ble kjølt i et isbad. Denne løsning ble så langsomt satt dråpe for dråpe til en 1 ml mettet løsning av N,N<1->o-fenylen-bis-maleimid i 0,1M acetatpuffer ved pH 5,0 på et isbad. Blandingen ble deretter inkubert ved 30°C i 20 min.. Immunoglobulinet ble så adskilt fra overskuddet N,N-o-fenylen-bis-

I

maleimid ved å føre løsningen gjennom en kolonne (20 x 1,5 cm) '• med G. 25 Sephadex ekvilibrert ved romtemperatur med 0,01M fosfatpuffer som inneholdt 0,01 MgCl2ved pH 6,0.

5,0 mg ammoniumsulfat felt 3-galaktosidase fra Escherichia coli ble oppløst i deri rensede aktiverte immunoglobulinløsning og inkubert ved 30°C i 4 timer. Tilstrekkelig. N NaOH til å ju-stere pH i reaksjonsblandingen til 7,5 og tilstrekkelig 2M 2-merkapto-etanol til å gi en endelig konsentrasjon på 10 mM ble tilsatt.

Immunoglobulin-enzymkonjugatløsningen ble satt på en kolonne (60 x 0,9 cm) av DEAE-Agarose (Biogel) ekvilibrert ved 4°C med 10 mM tris-HCl-puffer ved pH 7,5 som inneholdt 10 mM 2-merkapto-etanpl, 10 mM MgCl2og 50 mM natriumklorid. Løsningen ble vasket på kolonnen med den ekvilibrerende puffer. En gradient fra 50 mM til 200 mM natriumklorid i den samme puffer ble på-ført med 250 ml i blandekarene. Immunoglobulinet som ikke er konjugert med enzymet adsorberer ikke på kolonnen og elueres før gradient pålegges. Når gradienten er pålagt elueres immunoglobulinet som er markert med enzym før fritt enzym. Den eluerte fraksjonen som inneholder det markerte immunoglobulinet frysetørkes og gir det enzym-markerte andre antistoffet for bruk ifølge oppfinnelsen.

2. Fremstilling av første antistoff

(a) Fremstilling av tri jodtyronin ( T^ )- kon jugat

250 mg bovinserumalbumin (BSA) ble oppløst i 25 ml destillert vann og 1000 mg l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid (EDC) ble oppløst i 50 ml destillert vann. Begge løsninger ble kjølt til 4°C og 2/3 av EDC-løsningen langsomt blandet med BSA-løsningen. 150 mg renset T3ble oppløst i 25 ml etanol:2M-NH40H (25:1, vol./vol.) og løsningen kjølt til 4°C ble satt dråpevis til blandingen under kontinuerlig røring mens pH ble holdt ved 7,0 ved dråpevis tilsetning av 0/25M-HC1. Reaksjonsblandingen ble rørt ytterligere 10 min. og den øvrige EDC-løsningen tilsatt dråpevis mens pH ble holdt på 7,0.

Blandingen ble rørt natten over ved 4°C. Om morgenen ble løs-ningen sentrifugert og supernatanten dialysert mot 3 satser 0,1M_Na C03/NaHC03 ved pH 11,0 og deretter.destillert vann. Produktet ble til slutt frysetørket. Innføringen av T3i BSA ble funnet å være 4,3 mol T3 pr., mol BSA.

(b) Fremstilling av første antistoff (T3~antistoffer)

En stabil emulsjon ble fremstilt ved å blande 1 del saltløsning inneholdende Tween 80 (50%), T3-bovinserumalbumin (2 mg/ml)

og Bacillus Calmette-Guerin (BCG 1 mg/ml) med 2 deler mareol S2 hjelpestoff. 6 doser (1 ml hver) av emulsjonen ble injisert subkutant i ryggen og 4 intramuskulære injeksjoner (0,75 ml) ble gitt i leggene. Antistofftitrene ble regulert og etter 36 uker ble dyrene forsterket. For forsterkning ble 6 intramuskulære injeksjoner (0,5 ml) gitt i leggene. Emulsjonen bestod av deler hjelpestoff til 1 del saltløsning inneholdende T3~BSA konjugat (2 mg/ml). Bloduttakene 10 dager etter forsterkning og de neste 2 måneder inneholdt store mengder T3~antistoffer.

Ce) Fremstilling av immunoadsorbent for rensing av første

antistoff

Sepharose 4B ble aktivert med 1,4-bis-(2,3-epoksypropoksy)-butan som forut beskrevet. Den aktiverte Sepharose (4 ml)

ble satt til fosfatpuffer (pH 12,0, 0,025M, 20 ml) inneholdende T3(50 mg). Pufferen ble rørt i 45 timer ved romtemperatur. Gelen ble så vasket med fosfatpuffer (pH 12,0, 0,025M, 250 ml), natriumkloridløsning (150 ml, 0,1M) og destillert vann (100 ml). 9 mg T3 ble tilført pr.. ml av svellet gel. Alle gjenværende oksirangrupper ble blokkert ved å suspendere gelen i 4 ganger volumet vandig etanolåmin (IM,

pH 11) og ryste i 4 timer. Gelen ble så uttømmende vasket

med destillert vann for å fjerne overskudd etanolåmin.

l i

(d) Rensing av første antistoff

Anti-T^-serum (fremstilt som ovenfor beskrevet, 20 ml) ble blandet 1 time ved romtemperatur med T^-substituert Sepharose (1 ml). Ikke-spesifikt adsorberte proteiner ble fjernet fra immunoadsorbenten ved grundig vask med fosfatpufret saltløs-ning (0,05M, pH 7,0, 0,2H NaCl). Gelen ble pakket i en sprøyte som tidligere beskrevet og vasket med saltsyre (pH 3) for å fjerne fosfatpufferen. T^-antistoffer ble eluert ved å vaske med guanidinhydroklorid (4 ml, 6M,, pH 2) og oppsamlet i barbitonpuf f er (1 ml, 0,0511, pH 8,6, 0,1% bovinserumalbumin) . T^-antistoffene ble uttømmende dialysert mot denne puffer for

å fjerne guanidinhydrokloridet.

3. Fremstilling av påført antigen ( T-,) for bruk i målingen

Fremgangsmåten er som beskrevet i fremstillingen av immuno-adsorbent for rensingen av det første antistoffet (2 c ovenfor) med unntagelse av at konsentrasjonen av T., er mindre. Dette nedsetter konsentrasjonen av substituert i gelen.

Måling av T-. som bruker reagenser hvis fremstilling er beskrevet ovenfor utføres på den allerede beskrevne måte.

"Universal Reagens" kan brukes i flere forskjellige etiketter for å bestemme antigener. Disse omfatter:

Etikett la

Inkubering av første antistoff og fritt antigen fulgt av tilsetning av immunoadsorbent, og etter vask tilsetning av markeringen.

Etikett lb

En samtidig inkubering av første antistoff, fritt antigen

og immunoadsorbent. Markeringen tilsettes til den vaskede immunoadsorbenten.

i

Etikett 2a

En inkubering av det første antistoff, fritt antigen og markering. Denne følges etter en passende tid av tilsetningen av immunoadsorbenten.

Etikett 2a kan modifiseres ved å inkubere det første antistoffet med enzymmarkeringen før tilsetning av fritt antigen (Etikett 2b) .

Etikett 3

Etikett 3 innbefatter samtidig tilsetning av første antistoff, markering, fritt antigen og immunoadsorbent. Denne etiketten kan også modifiseres noe ved forutdannelse av markering-første antistoffkompleks.

De følgende eksempler beskriver resultatene av prøvene som utføres ved å bruke "Universal Reagens" fulgt av ovenfor beskrevne etiketter.

Enzym- immunomåling av trijodtyronin ( T3) ved bruk av Universal Reagens

Målingen av T3"ble utført ved bruk av flere forskjellige metoder.

Eksempel 2

Etikett la

T3 antiserum (sau, 1:2000 fortynning) i barbitonpuffer

(0,1 ml, 0,05M, pH 8,6, 0,1% vekt/volum) ble blandet med T3-standarder fremstilt i barbitonpuffer (0,1 ml) og holdt ved 4°C i 24 timer. Barbitonpuffer (0,1 ml, 0,3% vekt/volum Tween 80) som inneholdt T3 immunoadsorbent (50 ug) ble tilsatt, blandet, holdt ved 4°C i 1 time, vasket to ganger med barbitonpufret saltløsning (5% vekt/volum NaCl) og én gang med barbitonpuffer. Enzymmarkering (100 ul, esel-anti-sau IgG-galaktosidase) ble blandet med den vaskede immunoadsor-

I I

I

bent, holdt ved 4°C i 24 timer, vasket som forut beskrevet og enzymaktiviteten som var knyttet til immunoadsorbenten ble målt ved vanlige metoder.

Resultater

Ikke-spesifikk binding av markering til immunoadsorbent = 0,05<x>Binding beregnet etter subtrahering av NSB.

En lignende måling ble utført ved å bruke esel-antisau Fc-galaktosidase som markering. Fremgangsmåten var som ovenfor beskrevet med unntagelse av at (1) antiserumet og standardene ble holdt sammen i 8 timer, (2) antiserumfortynningen var 1:1600.

Eksempel 3

Etikett 2a

Renset T3 antiserum (sau, 1:1500 fortynning, 0,1 ml) og T3-standarder (0,1 ml) i barbitonpuffer (0,05M, pH 8,6, 0,1% vekt/volum BSA) ble blandet med markering (25 ul, esel-anti-sau IgG-enzym) og holdig ved 4°C i 24 timer,. Barbitonpuf f er I

I I

(0,1 ml, 0,3% vekt/volum Tween 80) som inneholdt T3-immuno-\adsorbent (50 ug) ble tilsatt under blanding cg holdt ved 4°C i 1 time. Immunoadsorbenten ble vasket og den bundne enzymaktivitet ble målt som beskrevet i eksempel 2.

Resultater

Eksempel 4 -

Etikett 2b

Rensede T3-antistoffer (1:1500 fortynning) i barbitonpuffer (0,05M, pH 8,6, 0,1% vekt/volum BSA, 8,5 ml) ble blandet med enzymmarkeringen (esel-anti-sau IgG-galaktosidasekonjugat, 5,1 ml) og lagret ved 4°C til bruk.

T3-standarder i barbitonpuffer (50 ul) ble blandet med markering-første antistoffkomplekset (200 ul) og ytterligere barbitonpuffer (0,5 ul), og deretter holdt ved 4°C i 4 timer. T3-immunoadsorbent (50 ug) i barbitonpuffer som inneholdt Tween 80 (0,4%) ble satt til rørene og inkubert ved 4°C i 1 time. Immunoadsorbenten ble vasket igjen med barbitonpuffer som inneholdt 5%, deretter 1% natriumklorid. Enzymaktiviteten knyttet til immunoadsorbenten bie målt ved de vanlige metoder.

I i Resultater

Dette eksperimentet ble gjentatt med en esel-antisau F - enzymmarkering. Resultatene lignet dem som er vist ovenfor.

Eksempel 5

Etikett 3

T3-stadarder i barbitonpuffer (100 ul) ble blandet med markering-første antistoff komplekset (200 ul) og T3-immuno-adsorbent (25 ug) i barbitonpuffer (100 ul) som inneholdt Tween 80 (0,4% vekt/volum), og inkubert ved 4°C i 2 timer. Immunoadsorbenten ble vasket og det bundne enzym ble målt som beskrevet for eksempel 4.

Resultater

Eksempel 6

Etikett 2b

Fremgangsmåten var som forut beskrevet for eksempel 4 bortsett fra at standardene ble fremstilt i strippet plasma. Tyroid-bindende globulin ble ødelagt ved å varme opp plasmaprøvene i et vannbad ved 70°C i 1 time. De erholdte resultater var lignende det som forut er beskrevet i eksempel 4.

Eksempel 7

Enzym- immunomåling av humant veksthormon ( HGH) ved bruk av Universal- reagens

Etikett la

HGH-antiserum (kanin, 1:20000 fortynning) i barbitonpuffer (0,1 ml, 0,05M, pH 8.,6, 0,65M NaCl, 0,5% vekt/volum BSA) ble blandet med HGH-standarder oppløst i barbitonpuffer (0,1 ml) og holdt ved 4°C i 24 timer. HGH-immunoadsorbent i barbitonpuf f er (0,1 ml, 10 ug) ble. så tilsatt, blandet, holdt ved 4°C i 1 time og vasket én gang med barbitonpuffer (2 ml, 0,05M, pH 8,6) som inneholdt 5% NaCl og én gang med puffer som inneholdt 1% NaCl. Enzymmarkering (50 pl, esel-anti-kanin F c-galaktosidase) ble tilsatt den vaskede immunoadsorbenten, blandet, holdt ved romtemperatur i 2 4 timer, vasket som ovenfor beskrevet, og enzymaktiviteten som var knyttet til immunoadsorbenten ble målt ved de vanlige metoder.

Ikke-spesifikk markeringsbinding til immunoadsorbent =

0,08

<x>Binding beregnet etter subtrahering av NSB.

Eksempel 8

Enzym- immunomåling for insulin ved bruk av Universal- reagens Etikett la

Insulin-antiserum (guinea-gris, 1:10000 eller 1:40000 fortynning) i fosfatpuffer (0,1 ml, 0,0411, pH 7,4, 0,5% vekt/ volum BSA) ble blandet med bovininsulinstandarder fremstilt i fosfatpuffer (0,1 ml) og holdt ved 4°C i 24 timer. Insulin-immunoadsorbent i fosfatpuffer (0,1 ml, 25 pg) ble tilsatt, blandet og rørene holdt ved 4°C i 30 min.. Immunoadsorbenten ble så vasket med fosfatpuffer (2 ml) som inneholdt 5% og så 1% natriumklorid. Enzymmarkering (50 pl, esel-anti-guinea-gris IgG-galaktosidasekonjugat) ble tilsatt rørene, blandet og holdt ved romtemperatur i 24 timer. Immunoadsorbenten ble vasket som forut beskrevet og galaktosidasaktiviteten som var knyttet til immunoadsorbenten ble målt ved de vanlige metoder.

i

I

I

i Resultater

Antiserumfortynning 1:10000.

Ikke-spesifikk binding =0,05 av enzymmarkering i immuno-adsorbent.

Eksempel 9

Enzymimmunomåling av kortisol ved bruk av Universal- reagens Etikett la

Kortisolantiserum (sau, 1:20000 fortynning) i fosfatpuffer (0,1 ml, 0,1M, pH 7,4, 0,1% vekt/volum gelatin, 0,83% vekt/ volum NaCl, 0,1% tiomersal) ble blandet med kortisolstan-darder fremstilt i fosfatpuffer (0,1 ml), og holdt ved 4°C

i 24.timer. Fosfatpuffer (0,3% vekt/volum Tween 80) som inneholdt kortisol-immunoadsorbent (0,1 ml, 25 pg) ble

så tilsatt, blandet, holdt ved 4°C i 1 time, vasket én gang med fosfatpuffer-saltløsning (3% vekt/volum) og én gang med fosfatpuffer. Enzymmarkering (25 pl, esel-anti-sau IgG-galaktosidasekonjugat, 0,5% vekt/volum Tween 80) ble satt til den vaskede immunoadsorbent, blandet, holdt ved 4°C i 24 timer, vasket som ovenfor og målt (som vanlig) for enzymaktivitet bundet til den faste fasen.

Resultater

Det er greit å bruke sett av materialer ved utførelse av fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse på spesielle antigener som et sett omfattende en uløselig bærer hvortil er bundet et antigen som kan være samme eller forskjellig .

fra det som settet er ment for å påvise eller måle, et egnet første antistoff, og et egnet enzymmarkert annet antistoff,

og midler for å påvise enzymaktivitene som kreves i utførelsen av metoden, og fortrinnsvis for kalibreringsformål innbefattet en løsning som inneholder en kjent mengde av antigenet som settet er ment for å påvise eller måle..

Det kan være fordelaktig å ha den faste fasen knyttet til

en stav som kan innføres i og fjernes fra de andre kompo-nentene i måleblandingen. Dette ville lette vasking av den faste fasen og øke målingens nøyaktighet.

F.eks. kan et sett for T^-måling bestå av de følgende kompo-nenter: 1. en uløselig bærer, enten som en suspensjon i en puffer (f.eks. barbiton) eller i en lyofilisert. form med dertil bundet antigen .

I

2. det første antistoffet (anti-T^ frembrakt i sau) sammen med det andre antistoffet (frembarkt i esel-anti-sau IgG Fc, det andre antistoffet markert med 3-galaktosidase, idet denne komponenten fortrinnsvis foreligger i en lyofilisert form. 3. et substrat (f.eks. nitrofenyl-galaktosid) ved en slutt-konsentrasjon på ca. 10-3 Mi en puffer (f.eks. barbiton) fortrinnsvis med en pH fra 7 - 9 og en molaritet på 0,010 - 0,200, idet denne komponenten fortrinnsvis foreligger i en lyofilisert form. 4. en løsning som inneholder en kjent mengde antigen T_.

(f.eks. 10 nanomol pr. liter), idet denne komponenten fortrinnsvis foreligger i en lyofilisert form.

Claims (1)

1. Fremgangsmåte ved enzym-bundet immunomåling omfattende at i et flytende kontaktmedium bringes samtidig eller trinnvis (1). et antigen (som forut definert) på en uløselig bærer eller i form av et uløselig aggregat, (2) et første antistoff (som i det foregående definert), og (3) et enzymmarkert annet antistoff (som forut definert) i kontakt, uløselige og løselige materialer separeres, og enzymaktiviteten bestemmes enten i de løselige eller i de uløselige separerte materialene, karakterisert ved at nevnte første antistoff (2) også bringes i kontakt med en prøve som inneholder antigenet som skal påvises eller måles som kan være det samme som eller forskjellig fra antigenet

   (1), idet det andre antistoffet (3) derved blir knyttet til det uløselige materialet i motsatt forhold til mengden av antigenet i prøven som skal påvises eller måles, hvorved nærværet eller mengden av antigenet i prøven bestemmes. j 2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakter i- sert ved at det første antistoff (2) omsettes med (1) og prøven, den faste fase separeres fra den flytende fase, og alt det første antistoffet som er knyttet til den separerte faste fasen omsettes deretter med det andre antistoffet (3) i et annet flytende medium fritt for (2) og prøven, fulgt av separasjon av den faste fasen fra det andre flytende medium og påvisning eller måling av enzymaktiviteten i den faste fasen. 3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det andre antistoff (3) omsettes med det første antistoffet (2) for å danne et kompleks av de to antistoffene og komplekset omsettes så med antigenet med (1) og prøven. 4. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte første antistoff eller kompleks omsettes med prøven og deretter med (1). 5. Fremgangsmåte ifølge krav 2 eller 3, karakterisert ved at nevnte første antistoff eller kompleks omsettes med (1) og prøven samtidig. 6. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1 - 5, karakterisert ved at mengden av nevnte første antistoff er mer enn tilstrekkelig til å reagere med alt det foreliggende antigen i prøven, men ikke mer enn tilstrekkelig til å reagere med alt antigenet i prøven pluss alt antigenet i (1). 7. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-6, karakterisert ved at antigenet i (1) er det samme som antigenet i prøven og bæres av nevnte uløselige bærer. 8. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 3-7, karakterisert ved at enzymaktiviteten bestemmes i den flytende separerte fasen for å bestemme nærværet eller mengden av antigenet i prøven. 9. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-8, karakterisert ved at det første antistoffet (2) er hvilket som helst av de heri forut angitte. 10. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-8, karakterisert ved at det andre antistoffet (3) er ethvert av de her forut angitte. 11. Fremgangsmåte ifølge hvert av kravene 1-10, karakterisert ved at det andre antistoffet (3) markeres med ethvert av de her forut angitte enzymer. 12. Materialsett for anvendelse ved utførelse av fremgangsmåten ifølge hvert av kravene 1 -11, karakterisert ved at det omfatter en uløselig bærer (1). hvortil er bundet et antigen som kan være samme som eller forskjellig fra den typen som settet er ment for å påvise eller måle eller inneholder nevnte antigen (1) i form av nevnte uløselige aggregat, et passende første antistoff (2),. et passende enzymmarkert annet antistoff (3) og midler for å påvise enzymaktiviteten som krevet ved utførelse av nevnte frem gangsmåte. 13. Sett ifølge krav 12, karakterisert ved at det omfatter en løsning som inneholder en. kjent mengde av antigenet som settet er ment for å påvise eller måle.