JP3103379B2 - レセプター：遊離リガンド（リランド）複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット - Google Patents

レセプター：遊離リガンド（リランド）複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット

Info

Publication number
JP3103379B2
JP3103379B2 JP09503915A JP50391597A JP3103379B2 JP 3103379 B2 JP3103379 B2 JP 3103379B2 JP 09503915 A JP09503915 A JP 09503915A JP 50391597 A JP50391597 A JP 50391597A JP 3103379 B2 JP3103379 B2 JP 3103379B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
receptor
analyte
reland
complex
free ligand
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP09503915A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH10511776A (ja
Inventor
ジュディス フィッツパトリック，
レジーナ レンダ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mizuho Medy Co Ltd
Original Assignee
Mizuho Medy Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mizuho Medy Co Ltd filed Critical Mizuho Medy Co Ltd
Publication of JPH10511776A publication Critical patent/JPH10511776A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP3103379B2 publication Critical patent/JP3103379B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/536—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with immune complex formed in liquid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 関連出願 本願すなわち1995年６月22日出願の米国特許出願第08
/493,420号は、1994年２月17日出願の米国特許出願第08
/196,092号の継続出願である。米国特許出願第08/196,0
92号は、1992年７月29日出願の国際特許出願第PCT/US92
/06249号の国内段階出願である。国際特許出願PCT/US92
/06249号は、現在は放棄されている1991年７月29日出願
の米国特許出願第07/737,526号に基づき優先権主張する
出願であり、同出願の継続出願である。本願は、米国特
許法第120条および第365条に基づき米国特許出願第08/1
96,092号の出願日を優先日として主張する。上記出願の
各々の全体を、本願において援用する。
発明の分野 本発明は、新規な安定なレセプター：遊離リガンド
（本明細書中では以下に定義したように「リランド」と
呼ぶ）複合体、それらを生産する方法、およびそれらを
使用する方法に関する。さらに本願は、サンプル中の分
析物の存在を測定するための方法に関する。より詳細に
は、本願は、高い特異性および感度を有する均一な液相
アッセイおよび不均一な液相／固相遊離アッセイに関す
る。本発明の方法及びキットは、分析物に対するアッセ
イの感度、特異性、およびダイナミックレンジを大きく
増加し、そのようなアッセイの時間および複雑さを減少
させる。
発明の背景 イムノアッセイは、サンプル中の標的分子の存在を検
出するために、抗体または抗原の特異的結合能力を利用
する。この一般的原則は幅広い範囲の問題に適用可能で
あるが、主な商業的関心は、血液、唾液、および尿など
の生物学的液体中の広範囲の分析物のための、医療診断
的適用に集中している。
異なる適用に対して有用ないくつかのタイプのイムノ
アッセイが、既に存在する。このような各アッセイタイ
プは、抗体上の結合部位が専有されているか空いている
かを区別するための方法を必要とする。代表的にはこれ
は、抗体、または分析物もしくは分析物のアナログのい
ずれかに永久的に接合した原子、分子、酵素、または粒
子のような標識の手段により達成される。
感度および特異性は、イムノアッセイの重要なパラメ
ーターである。特異性は主に、抗体の抗原結合部位に関
連し、これは、可変領域遺伝子セグメントの選択に対し
て固有のものであり、アッセイ構成には依存しない。感
度は主に、抗体のリガンドに対する親和性および、標識
固有の検出性に関連する。例えば、ラジオイムノアッセ
イに用いられる放射性同位体は、蛍光分子よりもかなり
低い濃度で検出され得る。酵素標識は、蛍光標識と類似
の濃度で検出可能である。蛍光または化学発光産物を生
成する基質を酵素標識とともに用いる場合、得られるイ
ムノアッセイの感度は、放射性同位体標識と同等である
かそれ以上である。
今日まで、診断用イムノアッセイは、２つの基本的カ
テゴリーに分類されている：サンドイッチイムノアッセ
イ（分析物を２つの抗体の間に「捕捉する」ことによ
り、分析物の存在を直接測定する）、および競合的イム
ノアッセイ（分析物を抗体との結合に関して分析物が標
識リガンドと競合させる）である。しかし、これらのア
ッセイ技術は欠点を有する。サンドイッチイムノアッセ
イは、２つの抗体への結合を受け入れる程度に十分に分
析物が大きいことを必要とし、そのためタンパク質のよ
うな、より大きな分析物により適している。分析物およ
びリガンドが抗体に対して同等な結合親和性を有する競
合的アッセイは、主に質量作用に動くため、そしてそれ
ゆえ感度またはダイナミックレンジ、あるいはその両方
を欠く。分析物およびリガンドの抗体に対する親和性が
有意に異なる場合、アッセイはマトリクス効果に対して
感度が高くなりすぎる。なぜなら、結合相互作用の親和
性が低いほど、温度、pH、塩濃度、および変性剤（例え
ば尿中）の存在のような変数によってより影響されやす
いためである。
分析物および標識成分が、抗体結合部位に対して同等
な親和性を有するという点において、多くの従来のアッ
セイ技術が競合的と考えられる。そのような競合的方法
の一例は、分析物および酵素：リガンド結合物が、抗体
結合部位に関して競合する技術を記載しているRubenste
inおよびUllmanの米国特許第3,817,837号に見出され
る。抗体の酵素：リガンド結合物への結合は、その酵素
活性を変えるため、そのような混合物が基質を生成物に
変換する速度を測定することによって、存在する分析物
の濃度を推定し得る。
競合的アッセイの変法の１つは、解離的アッセイ（di
ssociative assay）である。解離的アッセイは、高い解
離定数（dissociation constant）を有する予め作成さ
れた抗体：リガンド複合体を利用し、そしてそのアッセ
イにおいて、競合は、抗体からのリガンドの解離後に起
こる。このタイプのアッセイは、従来の競合的アッセイ
に対して何ら有意な利点を有することも報告されてはい
ない。いくつかの蛍光分極アッセイ（fluorescence pol
arization assay）のような現在の解離的アッセイは、
安定な予め形成された免疫複合体を提供しないが、分析
物の添加数分前に、リガンドを抗体を添加しコンプレキ
シティー（comlpexity）を増大させることが必要であ
る。
イムノアッセイは、さらに均一または不均一として特
徴付けられ得る。均一法においては、標識は結合状態に
おいても非結合状態においても等しく検出可能である。
意味のあるアッセイ結果を得るためには、結合された抗
体を非結合の抗体から物理的に分離することが必要であ
る。この分離を達成するための通常用いられる方策は、
検出工程前に、標識を液相から物理的に分離可能な固相
に結合させることを包含する。代表的な不均一アッセイ
は、Serex,Inc.,Maywood,New Jerseyから入手可能な、
尿中のコチニン検出用CotiTraq Elisa Kitである。
均一法においては、標識の検出可能な特性は、抗体に
結合しているか結合していないかに依存して固有に異な
る。結合状態においては、その標識は、より大きなまた
はより小さなシグナル強度を有する。通常、抗体の標識
リガンドに対する結合は、シグナル強度の減少をもたら
す（例えば、標識が酵素である場合）。このカテゴリー
における代表的な製品として、Syva Company,Palo Alt
o,Californiaから入射可能な、EMIT 系列の酵素イムノ
アッセイおよび、Abbot Diagnostics,Chicago,Illinois
から入手可能な、TDX系列の蛍光分極イムノアッセイが
挙げられる。
イムノアッセイのさらなる２つの特徴が、特記に値す
る。これらは、分析物の最小検出可能濃度および、検出
のダイナミックレンジである。ダイナミックレンジと
は、分析物濃度の、標識由来のシグナルが、ゼロから最
大に変化するまでの範囲である。サンプル、抗体、およ
び標識成分が混ぜ合わされる順序は、標識成分の結合の
度合いに影響することにより（そして引き続いて標識検
出に影響することによって）、これらキーパラメータの
両方に、有意に影響し得る。
ある種の公知のアッセイ法においては、標識成分の添
加前に抗体および分析物を混ぜ合わせる。他の種の公知
のアッセイ法においては、抗体の添加前に分析物および
標識成分とを混ぜ合わせる。これらの各場合において、
分析物を含有するサンプルと混ぜ合わせる。２つの異な
る試薬を提供することが必要である。２つのこのような
別々の試薬を必要とすることは不便であり、より手間が
かかり複雑な方法となりかねない。また、良好なアッセ
イ成績のためには各試薬の正確な用量測定が欠かせない
ため、２つの測定工程の必要性は、ゆがめられた結果に
至り得る誤差を生じかねない。
アッセイ精度を改善しそれによってアッセイ感度を高
めるための一方法は、抗体および標識成分の予め混合さ
れた複合体を提供することである。しかし、結合反応
は、ほとんどの試験条件下において、実質的に不可逆的
であることが見出されるため、これは問題を有する。従
って、予め形成された標識分析物および抗体の複合体
を、分析物を含有する溶液と混ぜ合わせた場合、意味の
ある時間フレーム（分）において、結合した標識の検知
可能な排出（displacement）は起こらない。
発明の要旨 本発明により、新規なレセプター：リランド複合体が
提供される。用語リランドは、遊離リガンドを意味する
造語である。本発明は、本発明に従って選択されたリラ
ンドをレセプターと複合体形成させることにより、先行
技術に記載されていない特性をレセプター：リガンド複
合体に付与し得るという発見に基づいている。この新規
な複合体は安定、すなわち分析物の非存在下では実質的
に不可逆的であるが、驚くべきことに、分析物と接触さ
せたときには、実質的に完全に不安定となり、リランド
の急速な遊離が起こる。分析物の存在下での安定なレセ
プター：リランド複合体由来のリランドの遊離が、本発
明の本質である。以下に詳述するように、リランドは、
モノマーあるいはマルチマー形態であり得る。
本発明はまた、リランドのレセプターとの新規な、安
定な複合体を、分析物に対して用いる方法に関する。こ
こで、レセプター：リランド複合体は、分析物の存在下
においてリランドを遊離し得る。リランドは、適切に標
識されば検出可能であるため、本方法を診断アッセイフ
ォーマットに用いた際、試験サンプル中の分析物の存在
を明確に示す。このような複合体を設計、調製、使用、
および安定化するための方法を提供する。本方法は、広
範囲のタイプおよびサイズを含む分析物のための、均一
アッセイおよび不均一アッセイの両方に適用可能であ
る。本発明のアッセイおよび複合体は、例えば、以前単
一のアッセイデザインにおいて可能であったよりもより
短い時間、より高い感度、かつより大きなダイナミック
レンジで、分析物の存在を検出することによって、従来
技術の診断アッセイの不利な点や欠点を克服する。
本発明はまた、インビボ診断アッセイおよび治療的処
置方法の両方に適用可能である。例えば、広範な局面に
おいて、本発明は、身体中の特定の部位に到達して反応
するための新規方法において有用な新規な複合体を提供
する。この方法は、レセプター：リランド複合体を、身
体中のある部位に送達して、複合体からのリランドの遊
離後の、その部位へのレセプターの結合を検出すること
を包含する。この場合、「標識」あるいは検出システム
の全体または一部を、レセプターまたは治療薬剤中にの
取り込ませることによって、検出は容易になる。
本発明は、本明細書中で教示される不均一および均一
アッセイ法、あるいはインビボ診断的もしくは治療的処
置法に使用するための、予め形成されたレセプター：リ
ランド複合体、または各薬剤を別々に含むキットを提供
する。レセプター：リランド複合体は、適切な時間、レ
セプターをリランドとインキュベートすることにより、
サンプルを複合体と接触させる前に形成され得る。
本発明の本質的な局面は、先行技術の競合的または解
離的アッセイに記載のリガンド：レセプター複合体の特
性とは実質的に異なる特性を有する複合体を形成するリ
ガンドの選択にである。適切なレセプター：リランド複
合体の形成は、リランドの特性に依存するため、これら
の特徴のうちのいくつかをここで挙げておくことが適切
である。さらなるそしてより具体的な詳細を下記に示
す。
リランドは、分析物に構造的に関連し、そしてレセプ
ターに対する結合の１％未満の交差反応性（安定な複合
体を形成する能力と矛盾しているような効果である）を
示すモノマー形態である。先行技術のアッセイおよび複
合体とはまったく対照的に、本リランドはレセプターに
対する結合に関して分析物と検出可能に競合することが
ない。本複合体の調製において、本発明者らは、モノマ
ー性リランドは、リランドが高濃度である場合において
のみ（リランドがマルチマーとして提供される場合は低
濃度が用い得られ得る）レセプターに会合し、そしてこ
れが遅いキネティックスで起こり、かつ分析物の非存在
下でのみ起こることを見いだした。リガンドは、分析物
のレセプターに対する本質的に完全な結合には検出可能
に影響を与えないばかりか、分析物の存在下においても
レセプターに結合することはない。特定の局面におい
て、モノマー性リランドのレセプターに対する会合定数
は、約105M以下であり、好ましくは103から105Mであ
り、そして最も好ましくは約104Mである。マルチマーと
してレセプターに複合体化されたとき、例えば、リラン
ドがダイマー、トリマー、あるいはより高次マーである
とき、あるいはペプチドのようなキャリアに結合された
ときには（なお本明細書中で用いられるようなマルチマ
ー）、会合定数が劇的に増大する。しかし、至適遊離性
が目的であるならば、リランドは全分子量が5,000ダル
トンを越えることは好ましくない。これは、分子サイズ
が大きくなればなるほど、レセプターと不可逆的複合体
を形成する傾向があり、且つ分析物との交差反応性が高
くなる傾向があるためである。しかし、アッセイを行う
時点あるいはその付近で複合体を形成する場合（複合体
の不可逆的がファクターでなくなるような）、交差反応
性パラメーターが受容可能であるとするならば、より大
きな分子量のマルチマー（例えば、BSZ、BCT、G6PHなど
から得られる）によっても、適切に遊離可能な複合体が
得られた。
本発明の非常に好適な局面において、リランドの分子
量は5000ダルトン未満であり、より好ましくは、2000ダ
ルトン未満である。本発明の目的のための分子量は、レ
セプターとの結合を指向するエピトープ、ならびに、あ
らゆるリンカー、標識、またはリランドの補助的構造物
を包む。小さいサイズのリランドを提供することによ
り、本発明は、リランドとレセプターとの間における不
可逆的複合体の形成の回避を助ける。これは、キット中
における予め形成された複合体の供給を制限していたた
め、特に重要である。その場であるいは使用直前に調製
された複合体は、遊離可能な複合体として依然として適
切に作用する。
理論的には、複合体の設計において、リランドまたは
レセプターの結合部位のいずれかを修飾することを選び
得る。しかし、実際には、リランドを修飾する方がずっ
と実用的である。後述するように、本発明において利用
可能な、様々な種類のレセプターが存在する。
これらの新規な複合体を用いる本発明の診断方法は、
例えば、Freytagの米国特許第4,551,426号に記載された
従来の会合アッセイまたは競合的解離アッセイに比べ
て、驚くほど、より高い感度、特異性、精度、および検
出レンジを提供する。
分析物は、本明細書に記載された任意の抗原または標
的分子であり得、治療薬物、およびその代謝物、違法薬
物、およびその代謝物、ステロイド、ペプチドホルモ
ン、ホルモン（例えば、インスリン）、ウイルス抗原、
細菌抗原、血清蛋白、抗体、毒素、殺虫剤、環境生成
物、癌抗原、遺伝マーカー、または迅速、特異的、かつ
高感度なアッセイにおいて分析物の存在（あるいは非存
在）を検出することが所望される場合のあらゆる目的抗
原を含む。
定義 分析物−−アッセイにおけるまたは身体中のある部位
における目的の分子；また、レセプターの標的。
リランド−−用語「遊離リガンド」からの造語であ
り、複合体化された際のリガンドの遊離特性を表し；レ
セプターに結合可能し得、以下の特性を示す分子であ
る： −リランドは、モノマー形態または、モノマー分子のダ
イマー、トリマー、４マー、５マー、６マーもしくはよ
り高次マーのようなマルチマー形態であり得；「マルチ
マー」はまた、ペプチド、糖、ポリマーなどのようなキ
ャリアへのリランドの結合物を含む。
−リランドとレセプターとの解離定数は、そのレセプタ
ーに対する分析物の非存在下において、リランドの検知
可能な遊離が起こらないような解離定数である。
−リランド−レセプター複合体の解離定数は極端に低
く、分析物によって誘導されるリランドの遊離が、安定
な複合体の解離速度に依存しないかあるいは無関係であ
るようなものである。
−リランドは、モノマー形態の分析物に構造的に関連し
ているが、１％未満のレセプターとの交差反応性を有
し、そしてより好ましくは、レセプターとの結合に関し
て、分析物と検出可能に交差反応あるいは競合しない。
−レセプター：リランド複合体からのリランド遊離は、
分析物によって誘導される。
−分析物の非存在下では、リランドは、緩慢なキネティ
クスでレセプターと結合する。
−複合体を予め形成する際には、モノマーリランドのレ
セプターへの検出可能な結合は、リランドの濃度が、約
10-5M、好ましくは10-3から10-4Mまでは起こらず、ある
いは少なくとも例えば、リランドがマルチマー形態の場
合は、10-5およびそれ未満（10-6〜10-8またはそれより
高い）の濃度になるまでは起こらない。レセプター濃度
は通常、10-6から10-1OMの範囲内であるが、範囲外の値
も用い得る。
−モノマー（またはマルチマー）リランドは、レセプタ
ーに結合する分析物の親和性よりも実質的に低い親和性
でレセプターに結合するが、レセプター：リランド複合
体は、レセプター：分析物複合体の解離定数と類似の解
離定数を有する。
レセプター−−分析物の特異的結合パートナー；そし
て分析物または本明細書中に記載のリランドに特異的に
結合し得る分子。各場合で、安定な複合体が形成される
が、分析物の会合定数は、リランドの会合定数よりも高
い。好適なレセプターは抗体であるが、後述するその他
の特異的結合パートナーもまた本発明により意図され
る。
図面の簡単な説明 図１。分子式。図（Ａ）はニコチン、（Ｂ）はコチニ
ン、（Ｃ）はＮ−イソプロピル−４−カルボキシル−ノ
ルコチニン、そして（Ｄ）はＮ−プロピル−４−カルボ
キシル−ノルコチニンである。
図２。コチニンについてのELISAフォーマット遊離ア
ッセイは、固定化されたシス−ヒドロキシコチニンＧ−
６−PDH（アスタリスク）;N−イソプロピル−ノルコチ
ニンＧ−６−PDH（＋記号）;N−プロピル−ノルコチニ
ンＧ−６−PDH［白四角］からの遊離を示す。
図３。コチニンについての従来技術による均一放射ア
ッセイ型フォーマット（homogeneous Emit assay type
format）（＋記号）と、コチニンについての本発明によ
る遊離アッセイ（四角）との用量反応曲線の比較。
図４。コチニンについての本発明の遊離均一アッセイ
の用量反応曲線。
図５。従来のElisaアッセイにおいて、糖化ヘモグロ
ビンに対するモノクローナル抗体は、非糖化ヘモグロビ
ンおよび糖化ヘモグロビン（HbGlc）に結合する。
図６。非糖化ヘモグロビン（HbAo）および糖化ヘモグ
ロビン（HbGlc）の、糖化ヘモグロビンに対するモノク
ローナル抗体からリランド（reland）を遊離する能力の
比較。
図７。糖化ヘモグロビンに対するモノクローナル抗体
の糖化ヘモグロビン（HbGlc）と非糖化ヘモグロビン（H
bAo）とを区別する能力に関する、従来型と遊離アッセ
イフォーマットとの比較。
図８（図8A、図8B、図8C）。ビオチンに結合したテオ
フィリン−リガンド（カルボキシプロピル−ジメチルキ
サンチン−ビオチン）およびテオフィリンリランド−ビ
オチン（テオブロミン−１−酢酸−ビオチン）に結合す
るモノクローナル抗テオフィリンのキネティクス。
図９。リガンド−ビオチンの遊離キネティクス。図9
A:カルボキシプロピルジメチルキサンチン−ビオチンお
よびリランド−ビオチン。図9B:（テオブロミン−１−
酢酸−ビオチン）。
図10。テオフィリンについての、競合Elisaにおけ
る、テオブロミンおよびテオブロミン−１−酢酸の交差
反応性。
図11。テオフィリンリガンド（カルボキシプロピルジ
メチルキサンチン）レセプター形成（菱形）と比較し
た、テオフィリンリランド（テオブロミン−１−酢酸−
ビオチン）レセプター形成（四角）の濃度依存性。
図12。Elisaフォーマットにおいて、ピリジノリンリ
ランド候補（即ち、ピリジンアナログ）の抗ピリジノリ
ンに結合する能力の評価。
図13。Elisaフォーマット。ピリジノリンによる抗ピ
リジノリンからのビオチン化（biotinolated）ピリドキ
サール（ピリジノリンリランド）の遊離。
発明の詳細の説明 本発明をインビトロ診断に適用すると、新規なレセプ
ター：リランド複合体およびそのためのキットを用い
て、サンプル中における分析物の存在を検出する方法が
提供される。試験サンプルは、乳液、水、尿、血液、血
清、唾液、体浸出液（bodily exudate）等のような標的
分析物を含有していると思われるあらゆる体液、ならび
に、土壌、食物、化学薬品、身体組織等の目的の固形物
由来の液体であり得る。本発明の遊離アッセイ方法は、
試験サンプルをレセプター：リランド複合体に接触させ
る工程、および分析物が存在する場合には、複合体から
のリランドの遊離（もしくは遊離されたレセプター）を
検出する工程あるいは適切な場合には分析物へのレセプ
ターの結合を検出する工程を包含する。
分析物がレセプター：リランド複合体に接触して推定
上の三分子複合体を形成するときに、遊離反応が起こる
と考えられている。レセプターとの会合定数が108M以上
（例えば、109等）である分析物の存在は、レセプタ
ー：リランド複合体の変化を引き起こし、これにより複
合体の解離定数が変化して、リランドの遊離が可能にな
る。この分析物とレセプターとの相互作用は、リランド
の結合部位あるいはアロステリック結合部位において生
じ得る。リランドの遊離後、分析物およびレセプターの
複合体は、遊離リランドの存在によって、検出可能な程
の影響を受けない。リランドあるいはレセプターのいず
れかが、その最初の複合体からの遊離後に検出され得、
これにより、サンプル中における分析物の存在が示され
る。本発明のアッセイ方法は、均一フォーマットあるい
は不均一フォーマットのいずれにおいても行うことがで
きる。各フォーマットの具体的な詳細を以下に示す。
本発明の遊離アッセイによって、レセプターおよびリ
ランド上の結合部位（単数または複数）がほぼ等しい濃
度で存在する複合体の調製、すなわち、定量的複合体形
成が可能になる。但し、これは必要不可欠なものではな
い。各要素が等しい濃度で存在することによって、感度
が高まる。なぜなら、レセプターが過剰に存在する場
合、複合体からリランドを遊離することなくレセプター
が分析物に結合し得るからである。
各要素の結合部位の数が実質的に等モル量で存在する
レセプター：リランド複合体を達成するために、サンプ
ルへの暴露前にレセプターおよびリランドを少なくとも
１時間インキュベートする。但し、一方の試薬が他方に
比べて大過剰に存在する場合には、これよりも短いイン
キュベーション時間が可能である。好ましくは、インキ
ュベーション時間は、約12時間よりも長い。レセプター
あるいはリランドいずれか一方の要素が過剰に存在する
場合、長いインキュベーション時間は、遊離および結合
反応が繰り返される間に最も安定な複合体の形成を可能
にする。この低親和性結合反応が平衡状態に達した後、
長時間のインキュベーション後に安定になったレセプタ
ー：リランド複合体を過剰試薬（リランドまたはレセプ
ターのいずれか）から単離する。複合体の単離は、沈
澱、サイズ排除クロマトグラフィー、密度勾配遠心分
離、精密濾過、あるいは複合体をその成分から分離する
他の技術によって達成され得る。あるいは、分離工程を
回避するために、レセプターおよびリランドを、等しい
結合部位濃度で、あるいは若干のリランド過剰（約１〜
２倍）で混合し、そして、安定な複合体としての実質的
に定量的な結合を可能にするようなリランドの濃度に依
存する時間の間インキュベートすることが可能である。
例えば、0.25μg/mlのリランド濃度で（図8C）、一週間
以上のインキュベーションが必要であった。試薬：リラ
ンド複合体の形成を、以下でより完全に説明する。高い
濃度でリランド標識を提供し、その後、結合物と遊離物
とを分離するコストを克服するために、リランドをポリ
マー化してマルチマー形態にすることが可能である。こ
のような形態の場合、レセプターとリランドとの化学量
論的レベルで結合が完了する。
本発明の方法は、分析物の存在下における、レセプタ
ーおよびリランドの複合体からのリランドの遊離が分析
物に含まれるという発見に基づいている。遊離されたリ
ランドはレセプターに再結合しないので、レセプター上
の結合部位に対して分析物と競合しない。この結果は、
少なくとも部分的には、モノマーリランドの場合約10
5M、好ましくは104〜103Mである、レセプターへのリラ
ンドの結合における会合定数の結果として引き起こされ
ると考えられる。
本明細書中において、分析物の存在下におけるレセプ
ター：リランド複合体からのリランドの遊離を遊離反応
と呼ぶ。この遊離は、分析物が複合体に接触してから数
秒〜数分以内に実質的に完了する（つまり、本質的に全
てのリランドが遊離される）ことに留意することが重要
である。分析、試験あるいは方法の時間枠内で、遊離リ
ランドはレセプターと再結合しない。遊離レセプターが
分析物と結合して安定な複合体を形成することは、リラ
ンド遊離に対する当然の結果であるとみなされてきた
が、これが起こる必要は本発明にはない。遊離されるリ
ランドの量は、リランド：レセプター複合体が出くわし
た分析物の量に正比例するので、遊離されたリランドの
量の測定値は、存在する分析物の量の測定値である。
遊離反応の機構についてのいかなる特定の仮説にも限
定される意図はないが、レセプター：リランド複合体の
安定性とは相反する速い遊離反応キネティクス、ならび
にレセプター：リランド複合体の解離速度に対するリラ
ンド遊離の得られた非依存性とに基づいて、分析物が存
在する場合にレセプター、分析物およびリランド間の三
分子複合体が形成すると考えられる。レセプターに対す
る分析物の高い親和性と、三分子複合体の相対的な不安
定性とに起因して、リランドが遊離され、これにより、
分析物のレセプターとの複合体形成が可能になる。リラ
ンドがレセプターへの結合について分析物と検出可能な
程には競合しないので、分析物およびレセプターの複合
体は、リランドの存在によって顕著に影響を受けない。
この仮定は、レセプター上の二重結合部位の存在とも一
貫性を有する。
好ましくは、モノマーリランドへのレセプターの結合
の会合定数は、分析物へのレセプターの結合の会合定数
の約１％未満、より好ましくは約0.2％未満である。こ
れは、相対的な結合として定性的に、例えば、アッセイ
中の見かけの活性によって観察され得る。
遊離反応は、レセプターおよび分析物の高親和性結合
に依存するので、敏感かつ特異的である。つまり、レセ
プターは低濃度の分析物に結合する。差別的親和性結合
に対する遊離反応の依存性は、特異性をさらに高める。
レセプターが解離して、分析物の交差反応性アナログに
結合することは、その会合定数がレセプターおよびリラ
ンドの会合定数よりも大幅に高くない限り起こらない。
本発明における分析物とリランドとの関係の重大な利
点の１つは、遊離反応を伴うための分析物のリランドに
対する有効比が100:1未満、好ましくは10:1未満、そし
てより好ましくは約1:1であることである。実際、1:2の
比は、実質的に完全かつ化学量論的な遊離を誘導する。
本発明のアッセイのこの特性は、レセプターリガンドの
Kdに依存するために、（分析物と交差反応性である）分
析物のアナログを遊離するのに必要な分析物比が実質的
に100:1よりも大きい従来技術の解離方法とは有意に異
なる。
レセプター：リランド複合体の有効部分が分析物の存
在下で遊離され、極微量が分析物の非存在下で遊離しな
ければならないか、または系の中のバックグラウンド
「雑音」（“noise"）が重大な要素になることを強調す
ることが重要である。例えば、レセプター：リランド複
合体の１％のみが遊離されるとすると、その系の99％は
影響を受けない。測定の標準偏差が、免疫アッセイ系に
おいては優れた変動係数を表す１％（99±１％と等価）
であるとすると、１％の遊離の効果は１％±１％とな
り、いかなる有意性も無効になる。本発明のアッセイ
は、レセプター：リランド複合体の有意な解離、すなわ
ち、ベースラインレベルより高い遊離を提供する。
リランドの化学量論的な遊離はまた、分析物が検出さ
れ得る広い濃度範囲の機会を提供する。従来技術の競合
系の場合、アッセイ設計は、サンプル中の少量の分析物
を検出するために、制限的な量のリガンドの使用を必要
とする。このような構成は、大量の分析物によって圧倒
される（swamped out）が、逆に、高レベルの分析物が
予想される場合、より多量の分析物アナログが必要とさ
れる。これらの条件下においては、ベースライン解離
は、少量の分析物の存在下における解離におおよそ等し
くなるか、あるいはそれを上回りさえする。従って、本
発明は、分析物の非存在下において安定であり、分析物
の存在下においては潜在的に定量的に遊離可能な予備形
成されたレセプター：リランド複合体を提供することに
よって、従来技術のこれらの欠点を克服する。
遊離されるリランドの量は、潜在的に定量的である
が、系による影響を受け得る。例えば、不均一系におい
て、固相への結合を促進するためにキャリアタンパク質
（例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）
に結合させた、レセプターとしてのコチニンに対する西
洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体およびリランドとし
てのイソプロピルノルコチニンの固相複合体を、サンプ
ルと反応させた場合、全抗体の５〜10％が分析物によっ
て遊離される。固相における酵素活性は液相における酵
素活性より少ないであることが知られているので、正確
な割合を突き止めるのは困難である。同じ試薬を用いる
均一遊離アッセイの場合、コチニンを含有するサンプル
は、酵素阻害の100％の逆転（reversal）（これは100％
の遊離を示す）を誘導する。これは、固相系において見
られるより低い遊離が、そのシステムの関数であって、
リランド：抗体複合体の関数ではないことを示してい
る。
本発明のその他の利点は、当業者には容易に理解され
得る。遊離反応は比較的即効性であり、一般に、５分未
満で終了点に達する。試薬の拡散が、アッセイに必要な
時間に関する支配的な要素である。従って、試薬の濃度
を高めることによって、これらの時間を短縮することが
できる。最も有利なことに、遊離反応は、感度の高い検
出システムを必要としない。このことは、本発明が、高
感度の発蛍光団ではなく、補助因子、染料等の低感度検
出可能化合物を用いた簡便なアッセイを提供し、そして
これにより、従来技術の競合解離アッセイにおいて必要
とされるような煩雑な−−そして高価な−−検出装置の
必要性を回避することを意味している。
レセプター：リランド複合体 有効な遊離アッセイには、安定なレセプター：リラン
ド複合体を使用することが必要である。この複合体は、
従来の複合体、例えば、レセプター：分析物複合体、あ
るいは抗体：抗原複合体等よりもゆっくりと形成される
（図8A、図8B、図8C）。この複合体は、試薬濃度に依存
する時間でのリランドおよびレセプターのインキュベー
ションによって、水性液体媒体中で調製される。モル農
度が高い程、必要な時間は短かくなる。複合体の遊離
は、最初のレセプター：リランド複合体形成の間に容易
に起こる。適切なインキュベーション期間（但し、これ
は通常１時間を越え、そして、しばしば123時間を越え
る）後には、レセプター：リランド複合体は安定にな
る。通常、４℃〜40℃の温度が適切であり、４度〜室温
が好ましい。
複合体の安定性は部分的には、リランドの設計、リラ
ンドおよびレセプターのインキュベーション時間の関数
である。レセプターとリランドの組み合わせのそれぞれ
について、適切なインキュベーション時間は容易に決定
される。但し、一般には、レセプターおよびリランド
を、分析物に暴露する前に、少なくとも１時間、好まし
くは12時間よりも長くインキュベートするべきである。
適切な条件下、例えば、塩化ナトリウムのような塩、
または、タンパク質もしくはグルコースのような安定化
剤、あるいは、その両方の存在下において、安定なレセ
プター：リランド複合体は、長期間−−数日間、数週間
以上−−にわたって遊離可能であり続ける。本発明によ
れば、安定なレセプター：リランド複合体は、溶液中に
あってもよいし、あるいは乾燥されてもよい。５％の塩
化ナトリウムの存在下で形成された複合体は、レセプタ
ー：リランド複合体を調製した後６日間使用できた。タ
ンパク質、糖、あるいは他の公知の安定化剤を用いて
も、乾燥レセプター：リランド複合体を安定化すること
ができる。
本発明はいかなる理論あるいは仮説にも縛られない
が、安定なレセプター：リランド複合体の形成は、リラ
ンドとレセプターとの間の分子適応（molecular accomm
odation）のモデルを裏付けるものであると考えられて
いる。この結合の平衡は、それを安定化する複合体の構
成に有利に働き、これは、複合体の有効な親和性が、最
初の複合体中よりも成熟複合体中において高いかもしれ
ず、おそらく高いにちがいないことを意味している。こ
のことは、複合体の非常に低い解離速度に反映されてい
る。
本発明によれば、リランドは好ましくは検出システム
あるいはその一部によって標識される。あるいは、標識
は、レセプター内に組み込まれ得る。本発明により、標
識システムの一部をリランドに与えて、その標識システ
ムの残りを試験環境中に提供することも意図される。標
識されたリランドの遊離後にこの２つの部分を組み合わ
せて、指標検出システムを形成する。例えば、リランド
は、グルコースオキシダーゼ酵素に活性を与える部分で
あるFADで標識され得る。FAD−リランドがレセプターと
複合体を形成する際、FADは（FADが無い場合には、「ア
ポグルコースオキシダーゼ（apoglucose oxidase）」あ
るいはapoGOと呼ばれる）グルコースオキシダーゼに対
して容易には利用可能でない。適切な分析物との接触に
よってFAD−リランドが遊離されると、FADは容易に、試
験システム中に提供されたアポグルコースオキシダーゼ
中に組み込まれ、これを活性化し、そして、ある量の分
析物の存在の測定値として検出される。
レセプター レセプター：リランド複合体の要素の１つは、分析物
に特異的に結合し得る１つ以上の結合部位を有するレセ
プターであり、ここで、結合の会合定数は高い。会合定
数は、好ましくは108Mよりも大きく、より好ましくは10
10Mよりも大きい。このレセプターは、分析物に結合す
るレセプターの定数と比べて比較的低い結合の会合定数
で、モノマーリランドに結合することもできる。本発明
の遊離アッセイに使用する適切なレセプターは、抗体、
または、分析物およびリランドに対する結合部位を含む
抗体のフラグメント、あるいはリランドおよび分析物の
両方と特異的に結合し、安定な複合体を形成し得る他の
あらゆる分子もしくは高分子を含む。抗体および細胞表
面レセプターが好ましく、抗体の方がより好ましい。最
も好ましいのは、特異的なエピドープに対して生成され
る抗体、即ち、タンパク質、ポリアミノ酸（例えば、ポ
リリジン）アガロースもしくは他のポリマー誘導体のよ
うな免疫原性分子に結合した、薬物もしくは小ペプチド
である。好適な実施態様において、レセプターは、分析
物上で最も独特のエピトープに対して特異的であるよう
に生成されるか、または選択される。
レセプターが抗体である以下の具体的な実施態様にお
いて、その抗体は、分析物上の独特のエピトープ、例え
ば、糖化ヘモグロビンの糖化部位、あるいは、タンパク
質もしくはポリペプチドの独特の配列に対する特異性に
ついて選択される。
当該分野において公知である様々な手順が、目的の分
析物に対する抗体の産生に使用され得る。このような抗
体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単
鎖、FabフラグメントおよびFab発現ライブラリーを含む
が、これらに限定されない。抗体の産生のために、様々
な宿主動物（ウサギ、マウス、ラット等を含むが、これ
らに限定されない）が、特定の分析物、または免疫原性
キャリアに結合した分析物を用いた注射によって免疫さ
れ得る。宿主の種に依存して、様々なアジュバントを用
いて免疫応答を高めることができる。このアジュバント
には、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミ
ニウムのようなミネラルゲル、リゾレシチンのような表
面活性物質、プルロニックポリオール（pluronic polyo
l）、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キー
ホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、
およびBCG（ウシ型弱毒結核菌ワクチン（bacilli Calme
tte−Guerin））およびCorynebacterium parvumのよう
な潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれるが、これ
らに限定されない。
分析物に対するモノクローナル抗体は、培養またはイ
ンビボでの連続する細胞株により抗体分子の生成を提供
する任意の技術を用いて調製され得る。これらは、最初
にKohlerおよびMilstein（Nature、1975、256:495−49
7）に記載されたハイブリドーマ技術、より最近のヒト
Ｂ−細胞ハイブリドーマ技術（Kosborら、1983、Immuno
logy Today、4:72）、およびEBV−ハイブリドーマ技術
（Coleら、1985、Monoclonal Antibodies and Cancer T
herapy、Alan R.Liss,Inc.、77−96頁）を含むが、これ
らに限定されない。本発明のさらなる実施態様におい
て、分析物に対して特異的なモノクローナル抗体が、最
近の技術（PCT/US90/02545）を用いて無菌動物内で産生
され得る。本発明によると、ヒト抗体は、ヒトハイブリ
ドーマを用いること（Coteら、1983、Proc.Natl.Acad.S
ci.、80:2026−2030）、またはインビトロでEBVウイル
スでヒトＢ細胞を形質転換すること（Coleら、1985、Mo
noclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Lis
s、77−96頁）により用いられ得、そして得られ得る。
実際、本発明によると、適切な抗原特異性を有するマウ
ス抗体分子由来の遺伝子を、適切な生物活性を有するヒ
ト抗体分子由来の遺伝子と共にスプライシングすること
により「キメラ抗体」を生成するために開発された技術
（Morrisonら、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.、81:6851−
6855;Neubergerら、1984、Nature、312:604−608;Taked
aら、1985、Nature、312:452−454）が用いられ得る。
このような抗体は、本発明の範囲内である。
本発明によると、単鎖抗体の生成のために記載された
技術（米国特許第4,946,778号）が、分析物特異的単鎖
抗体を生成するために適合され得る。本発明のさらなる
実施態様は、Fab発現ライブラリーの構築に関して記載
された技術（Huseら、1989、Science、246:1275−128
1）を利用して、分析物に対する所望の特異性を有する
モノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定
を可能にする。
分析物に対して特異的な部位を含む抗体フラグメント
は、公知の技術により生成され得る。例えば、このよう
なフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成
され得るＦ（ab′）２フラグメント、およびＦ（ab′）
２フラグメントのジスルフィド架橋を減少させることに
より生成され得るFabフラグメントを含むが、これらに
限定されない。
あるいは、目的の分析物に対して特異的なポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体は、商業的供給源か
ら得られ得る。
分析物を結合するためのレセプターは、例えば、アフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。モ
ノクローナル抗体はまた、プロテインＡまたは抗−Igク
ロマトグラフィーにより精製され得る。ポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体を精製するための技術
は、当該分野において周知である。ポリクローナル抗体
のような不均一レセプターの調製物はまた、低濃度（例
えば、レセプター濃度の１％）のリランドで吸着され得
て、高アフィニティーでリランドを結合させ得る任意の
レセプターを除去する。
リランド 定義の項に記載した特性をさらに解明すると、本明細
書において使用される用語「リランド」は、レセプター
との結合に関して分析物との限定された交差反応性を有
する分子を含む。用語「リランド」は、本明細書におい
て、遊離リガンドと相互転換可能に用いられる。なぜな
ら、リランドは、遊離リガンドを示すために本発明の共
同発明者らが作った用語だからである。遊離リガンドま
たはリランドは、低会合定数でレセプターと結合し、そ
して分析物：レセプター複合体の安定性に影響を与えな
い。従って、リランドは、構造的にその同族の分析物と
関連して、特異的結合相互作用を可能にするが、またア
フィニティーを低下させて不可逆的に結合した複合体の
形成を防止するのに十分な構造上の相違を含む。従っ
て、リランドは、分析物のエピトープ、分析物の誘導
体、修飾された分析物、または分析物の異性体を含む、
分析物のアナログであり得る。好適には、リランドは、
エピトープにおけるまたはエピトープ近傍の位置におい
て分析物とは構造的に異なる。これらの相違は、化学的
修飾、立体的、形状的、構造的、またはイオン的変化を
含み得る。好適には、イオン基が、中性極性基に置き換
わる。なぜなら、イオン相互作用は、特に強く、そして
遊離を干渉し得るからである。
構造的に分析物を模倣するために調製された分子もま
た、リランドとして用いられるアナログである。このよ
うな構造的模倣物は、エピトープが化学的に類似である
限り、分析物と同一の化学的性質を有し得るが、必ずし
もその必要はない。従って、例えば、以下の特定の実施
例に示すように、ペプチドは、タンパク質のアナログで
あり得る。研究用の分析物／レセプター対が一旦選択さ
れると、潜在的リランドが分析物のアナログから選択さ
れる。分析物のアナログは、分析物に類似の構造を同定
し、本明細書により教示するように修飾された分子の異
なるいくつかの部分を選択し、そして上述したように分
析物に対する競合的アッセイにおいて、そのような構造
の交差反応性を見ることにより、選択され得る。修飾
は、いくつかの状況においては、一工程の解離またはポ
リペプチド鎖内の単一のアミノ酸の置換のような、構造
の簡単な変化または置換のみであり得る。10-6Mの濃度
において、１％未満の交差反応性を有し、好適には0.1
％未満の交差反応性を有し、そして最も好適には交差反
応性を有さないこれらのモノマー化合物から、いくつか
が、レセプターに安定的に結合する能力をスクリーニン
グするために選択される。安定的結合を評価するため
に、好適な方法は、潜在的リランドをビオチンに結合さ
せ、Elisaプレート上でレセプターを固定化し、そして
アビジンに結合した西洋ワサビペルオキシダーゼを用い
て、リランド−ビオチンの、レセプターへの結合能力を
テストすることである。安定的結合を示すもののうち、
いくつかを、いずれが遊離されて経時的に安定であるか
を決定するために選択する。
アナログが市販されていない場合、修飾基を分析物に
添加するかまたは分析物から削除することにより、誘導
体が調製され得る。誘導体はまた、天然の代謝産物また
は分析物であり得る。本明細書において提示する情報を
有する当業者は、本発明において用いるための分析物の
誘導体を調製するかまたは同定する方法を容易に知る。
分析物の分子構造の変化が、レセプターの、リランドに
対する結合アフィニティーを変化させ得るか、またはか
さ高い基（bulky group）が、リランドを遊離する長期
間の能力を増強させ得る。
修飾された分析物は、立体的な干渉基に結合されてい
る分析物を含む。分析物またはペプチドに対する、脂肪
族、芳香族、環状分子または糖のようなかさ高い基、も
しくはイオン基の添加、または好適にはイオン基の非イ
オン基への置換は、立体的および／または電荷の干渉の
ためにレセプターに対する結合アフィニティーが減少す
る結果となり得る。あるいは、かさ高い基との結合は、
リランドのエピトープ内における、レセプターへの結合
アフィニティーを減少させる構造の変化を起こし得る。
有機分子の化学的修飾は、当該分野において周知であ
り、そしてリランドを修飾するために用いられ得る。例
えば、分析物であるコチニンは、６個までの炭素原子を
有するアルキル基、そして最も好適にはＮ−イソプロピ
ルまたはＮ−プロピル基の存在により修飾され得、コチ
ニンについてのアッセイにおいて好適なリランドを供給
する（図１）。
分析物の異性体は、同一の組成を有するが形状は異な
る分子である。代表的には、異性体は特定の炭素中心、
例えば、シス対トランス、Ｄ対Ｌにおいて、異なる形状
を有する。異性体は、１以上のキラル中心において逆の
形状を有するジアステレオマーを含み、そして分析物の
エナンチオマーを含む。生物学的結合相互作用は、形状
ならびに構造および組成に依存するため、リランドとし
ての異性体の使用は、レセプターに対する結合アフィニ
ティーがはるかに低下する結果となり得る。通常、異性
体のみの間のアフィニティーの低下は、リランドを作製
するために十分ではないが、異性体は、他の変化の効果
を増強させ得る。
分析物がタンパク質である場合、エピトープ（これに
対して、レセプターが特異性を有する）のペプチドアナ
ログを合成することによってリランドが調製され得る。
タンパク質のアミノ酸配列を変化させるために部位特異
的または他の変異誘発技術を用いる組換えDNA方法もま
た用いられ得る。これらの技術は、当業者に周知である
（例えば、ZollerおよびSmith、1984、DNA3:479−488;O
liphantら、1986、Gene44:177;Hutchingsonら、1986、P
roc.Nat′l.Acad.Sci.U.S.A.83:710を参照のこと）。部
位特異的変異誘発のためには、ポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）技術が好適である（Higuchi、1989、“DNA操作
のためのPCTの使用"PCR Technology:Principles and Ap
plications for DNA Amplification,H.Erlich編、Stock
ton Press,第６章、61−70頁を参照のこと）。好適に
は、このような組換え発現したタンパク質は、例えば、
ペプチダーゼでの消化により断片化されて、最も好適に
は約5000ダルトン未満の分子量のリランドフラグメント
を生じる。最も好適には、タンパク質に対するリランド
は、合成的に調製される2000未満の分子量を有するペプ
チドであり得る。
リランドはまた、連結基を含み得る。連結基は、標識
をリランドに結合するために用いられ得、例えば、リラ
ンドの官能基および標識が直接結合を許容しないリラン
ドへの標識の結合を容易にするための二官能性架橋剤で
ある。連結基の例は、アミノカプロン酸である。また、
かさ高い連結基は、レセプターへのリランドの結合を立
体的に妨げるために用いられ得る。かさ高い連結基の例
は、ｐ−アミノ安息香酸である。連結基および標識の両
方が会合定数および／または解離定数を減少または増加
させ得る。そのため、リランドの選択は、連結基および
標識を含むリランド全体の評価を必要とする。
リランドは遊離アッセイに用いる場合の適性を示すた
めに評価され得る。リランド評価アッセイは、競合アッ
セイ、結合増強アッセイ、直接アッセイ、およびマイク
ロタイタープレート遊離アッセイ、ならびに意図されて
いる遊離アッセイ自体を含む。このようなアッセイの終
点（enc point）は、リランドがレセプターと安定した
複合体を形成し得ること、リランドが分析物とレセプタ
ーとの複合体に検出可能な程度に影響を与えないこと、
分析物が分析物とレセプターとの安定した複合体からの
リランドの遊離を誘導すること、リランドがリランドと
レセプターとの安定した複合体の遊離を有意に誘導しな
いこと、リランドがレセプターへの結合について分析物
と有意にそして好適には検出可能な程度に競合しないこ
とを実証することである。リランドのこれらの特徴は、
遊離のパーセンテージ、アフィニティー定数などを測定
することにより定量的に示され得るか、または検出可能
な遊離および相対的な結合活性を測定することにより定
性的に示され得る。
潜在的リランドを評価するために有用な競合アッセイ
は、ELISAフォーマットで行われ得るが、競合アッセイ
技術が用いられ得る。例えば、リランドは、固相上で分
析物へのレセプターの結合を阻害するためには、分析物
よりもはるかに非効果的である。分析物に対する良好で
ない競合インヒビターである分子は、リランドとして用
いるためには良好な選択であり得る。
低濃度の適切なリランドは、実際、競合アッセイにお
いて分析物へのレセプターの結合を増強させるように見
え得る。従って、競合タイプのアッセイにおいて、低濃
度のリランド候補物の存在下で増加した絶対シグナル
は、その候補物が適切なリランドであり得ることを示す
（図10を参照のこと）。
直接アッセイが潜在的リランドを評価するために用い
られる場合、レセプターとリランドとの結合は、レセプ
ターと分析物との結合と比較される。ELISAフォーマッ
トがこのタイプのアッセイによく適しているが、他のア
ッセイフォーマットもまた用いられ得る。モノマーのリ
ランドは、分析物の結合活性の約１％以下、好適には約
0.2％未満を示す。代表的には、ELISA試験において、結
合活性は、力価、すなわち、特定の結合活性を有するレ
セプターの希釈または濃度によって表される。あるい
は、同一のレセプター濃度における比活性が比較され得
る。
リランドを評価するマイクロタイタープレート方法
は、マルチマーのリランド構造の、増加した会合定数を
示す能力を利用する。マイクロタイタープレートを、タ
ンパク質に結合した潜在的リランド候補物でコーティン
グする場合、相補的な標識抗体を添加して複合体の形成
を可能にする。リランドが適切である場合、複合体から
の、標識された抗体の遊離が起こり、そして分析物を含
むサンプルが添加された後にサンプル上清中で検出され
得る。マイクロタイタープレートフォーマットは、その
容易さのために、潜在的リランドをスクリーニングする
ために用いられる。潜在的リランドを迅速かつ容易にス
クリーニングするために、マイクロタイタープレート
は、２μg/mlの濃度のアルブミンで予めコーティングさ
れる。−COOHまたは−NH2基を有する様々なリランド候
補物を、カルボジイミドと共にウェルに添加して、一晩
アルブミンと相互作用させる。洗浄後、リランドでコー
ティングされたプレートが、まず抗体に結合する能力を
評価するために、次いで遊離する能力を評価するため
に、テストされ得る。このフォーマットにおいて、多数
のリランド候補物を迅速かつ簡単に１日ほどでスクリー
ニングすることが可能である。
遊離アッセイフォーマット レセプター、リランド、および遊離されたリランドま
たはレセプターの検出手段（遊離されたレセプターを検
出することが望ましい場合）を含む遊離アッセイは、分
析物を検出する迅速、簡易、かつ安価な方法を提供す
る。
分析物は、本明細書において先に概して記載したもの
であり得る。特定の実施態様は、骨粗鬆症をモニターす
るのに特に適した、テオフィリン、糖化されたヘモグロ
ビン、代謝産物またはコチニンのようなニコチン、なら
びにテロペプチドおよびピリジノリンのような骨および
コラーゲン代謝回転のＣ−およびＮ−末端ぺプチドマー
カーに関する。
本発明の方法は、レセプター：リランド複合体の解離
を検出した際に陽性の結果を生じる点で直接的なアッセ
イである。すなわち、レセプターに対する分析物が存在
することによって、先行技術によるアッセイにおけるよ
うな無事象または陰性事象の代わりに陽性事象として標
識された成分の遊離が生じる。陽性の相関（correlatio
n）は、シグナルの存在またはシグナル強度の増大がサ
ンプル中の分析物の存在を示す点で心理的に納得できる
ため有利である。分析物が存在するとシグナルの検出が
低下するアッセイ法によって得られた結果は、誤った解
釈を生じやすい。陽性の結果のみがシグナルを生成する
本発明のアッセイのようなアッセイを使用することが望
ましい。本発明のアッセイは、技術者によって研究室内
で、ならびに技術者および非技術者の両方によって研究
室外での両方においての使用に同等に適切である。
不均一な遊離アッセイにおいては、分析物の存在下で
の遊離の際にリランド標識が反応生成物と分離して標識
が検出されるように、好ましくはリランドは標識されて
いる。均一な遊離アッセイにおいては、リランドが標識
されていることが好ましいが、特定の状況下ではレセプ
ターが代わりに標識され得る。例えば、蛍光標識をレセ
プター上で用いることができ、この場合はリランドは蛍
光クエンチャーを含み得る。従って、レセプター：リラ
ンド複合体において、蛍光シグナルがクエンチされ、そ
して分析物の存在下でリランドの遊離が起こるまでは検
出可能な蛍光は存在しない。適切な標識には、酵素、酵
素インヒビター、蛍光体、補因子、発色団、コロイド
金、色素および化学発光剤、ならびに放射性標識が含ま
れ、これらは全て当該分野において周知である。レセプ
ター：リランド複合体の解離を検出するための特定手段
は、アッセイが均一であるか不均一であるかに部分的に
依存する。
一旦適切なレセプター、リランド、および検出手段が
選択されたら、アッセイ系を、特定のサンプルマトリク
スとともに使用するために最適化するべきである。尿サ
ンプルは、水溶性緩衝液中のサンプルとは異なる固有の
特性を有する。同様のことが、唾液、血液、血漿もしく
は血清、またはあらゆる体液由来のサンプルに当てはま
る。アッセイは、試薬濃度、緩衝液組成、遊離時間、検
出時間、ベースラインコントロール、および他の変数を
変えることによって最適化され得る。これらの変数は、
当該分野において周知であり、そして特定のアッセイマ
トリクスに対する最適なアッセイ特異性および感度のた
めのこれらの調整は当業者に容易に理解される。
均一遊離アッセイ 遊離アッセイは、均一液相中で行われ得る。そのよう
なアッセイは、単一の反応容器中で行われ得、そのため
自動分析器または膜上での使用に非常に適しており、従
ってオンサイトでの試験（on−site testing）に適して
いるために好ましい。
均一遊離アッセイにおけるレセプター：リランド複合
体は、好ましくは標識活性がリランドの遊離前には測定
できる程度に検出可能ではない検出手段として、適切な
標識系を含む。この検出性の欠乏は、通常、標識および
複合体の特性の結果であり、これらの性質は検出系の弱
化、阻害、または活性化のような活性調節の形態となっ
て現れる。標識からのシグナルの強度は、複合体の形成
もしくは解離の際に、増大もしくは減少する。標識に
は、例えば、リランドに付着した蛍光、化学蛍光、また
は酵素標識、およびレセプターに付着した適切なクエン
チャーが含まれ得る。レセプターは、それ自体がクエン
チャーであり得る。シグナルはクエンチされ、そしてい
かなるシグナルも認められない。しかし、レセプター：
リランド複合体の解離、および分析物の存在下でのレセ
プターおよびリランドの遊離の際には、調節の効果は逆
転し、そして標識が測定できる程度に検出可能になる。
蛍光分極（fluorescence polarization）のような他の
近接−依存性（proximty−dependent）シグナルアテニ
ュエーターは、当該分野において公知であり、そして遊
離アッセイでの使用に適合され得る。あるいは、リラン
ドは、本明細書において先に記載した、補因子標識、色
素＝標識、酵素インヒビター、またはグルコースオキシ
ダーゼのFAD成分のような遊離後に検出される他のタイ
プの標識で標識され得る。標識はレセプター上に存在し
得、そしてクエンチャーはリランド上に存在し得ること
がさらに理解される。
不均一遊離アッセイ 別の実施態様において、不均一固相／液相遊離アッセ
イが提供される。このようなアッセイにおいて、レセプ
ターが固相支持体に不可逆的に吸着される。本明細書に
おいて用いられる用語「不可逆的に吸着される」は、共
有的会合、非共有的会合、およびイオン的会合を包含す
る。固相支持体は、プラスティック、ポリマービーズ、
ガラスビーズ、ガラス、シリカゲル、およびプラスティ
ックマイクロタイタープレートウェルならびにナイロン
メンブレンおよびニトロセルロースメンブレンのような
メンブレンを包含する。しかし、遊離アッセイは固相支
持体の特定の選択に限定されず、そして当該分野におい
て公知の任意の固相支持体が使用され得る。
リランドが標識され、そして標識されたエレメントと
固相エレメント上のレセプターとを含む安定な複合体が
形成される。一旦安定なレセプター：リランド複合体が
形成されると、これはサンプルに曝され得る。目的の分
析物がサンプル中に存在する場合、遊離反応が生じ、そ
してその標識由来のシグナルが液相において検出され
る。遊離の程度、および従って液相におけるシグナル強
度は、サンプル中の分析物の量と正に相関する。実際の
濃度は、当業者に周知の技術に従って得られるまたは調
製される標準曲線から得ることができる。固相のシグナ
ル強度は、サンプル中の分析物の量とは逆に減少する。
多くの標識が不均一遊離アッセイにおいて使用され得
る。標識（例えば、補因子（例えば、FAD）、インヒビ
ター 発色団、発蛍光団、化学ルミネセンス剤、放射性
同位元素、キレート複合体、色素、金コロイド、二次標
識（例えば、ビオチンまたはハプテン）、などが、液相
において遊離反応後に、それぞれ、増加した酵素活性、
光学濃度、蛍光、ルミネセンス、放射能、色（色素につ
いて）、二次標識の検出（例えば、ビオチンを検出する
ためにはアビジンまたはストレプトアビジン、あるいは
ハプテンを検出するためにはハプテン特異的抗体を使用
する）、ならびに濁度（金コロイドについて）として検
出され得る。レセプター：リランド複合体において結合
したままの標識由来のシグナルが検出され得ない場合、
アッセイは分離工程なしに（例えば、単一容器中で）実
施され得る。
非実験室環境のために好ましい特定の実施態様におい
て、分析物の存在は、固相支持体上の反応場におけるフ
ォーマット（すなわち、文字）の出現により示される。
従って、インディケーターゾーンおよびコントロールゾ
ーンを含む反応場が、固相支持体上に調製される。イン
ディケーターゾーンは不均一アッセイ形式により提供さ
れるような固定化レセプターを含む。インディケーター
ゾーンにおけるレセプター：リランド複合体は遊離反応
に対して感受性である。コントロールゾーンは異なるレ
セプター：リガンドを含むか、またはコントロールゾー
ンにおけるリランド複合体は特異的な遊離反応に感受性
ではないが、条件が非特異的遊離を生じさせるような条
件である場合、非特異的遊離を示し得る。
実際上、目的の分析物を含有するサンプルの反応場へ
の接触は、インディケーターゾーンにおける検出可能な
遊離反応を生じ、そしてコントロールゾーンにおいて反
応を生じない。遊離反応は、インディケーターゾーンに
対応するコントラストのあるゾーンの形成として検出さ
れる。これを達成するために、遊離複合体およびコント
ロール複合体の両方のための標識が、固体支持体とコン
トラストをなすように選択される。
コントラストゾーンの発色が存在しない場合、サンプ
ルはネガティブである。インディケーターゾーンおよび
コントロールゾーンの両方の「退色」（すなわち、両方
の複合体からの標識の遊離）は、偽陽性反応、不適切な
反応条件、またはサンプルの可能な不純物を示す。これ
により、コントロールゾーンは正確なアッセイ結果のた
めのコントロールを提供する。別の実施態様において、
青色のレセプター：リランド複合体がその上に固定化さ
れる反応ゾーンは黄色である。もとは黄色を覆い隠すリ
ランド（青色）の遊離は、青色（ネガティブ）〜緑色
（弱くポジティブ）〜黄色（強くポジティブ）の色の変
化を生じさせる。
好ましくは、異なる文字または記号が、目的の分析物
に依存してインディケーターとして使用される。例え
ば、コカイン使用に特異的なインディケーターゾーンは
文字「Ｃ」のように形づけられ得；マリファナ使用のた
めのインディケーターゾーンは文字「Ｍ」のように形づ
けられ（「Ｔ」についてはテトラヒドロカナビノールの
ため）、そしてニコチン使用を示すためのゾーンは文字
「Ｎ」のように形づけられる。
他のレセプター：リランドの組み合わせがコントロー
ル複合体として同等に良好に作動することは明らかであ
る。単一の固相支持体が１つより多い検出場を含み得る
ことがさらに意図される。なぜなら、単一の形式におい
て、各々の検出場は、特定の分析物に特異的であり、そ
していかなる他の分析物（例えば、テトラヒドロカナビ
ノール、ベンゾイルエクゴニン、およびコチニン）にも
非感受性であるからである。
このアッセイにおける使用に適切な標識としては、色
素、金コロイドなどが挙げられるが、これに限定されな
い。また、任意の固相支持体がこの実施態様において使
用され得るが、プラスティックおよびメンブレン（例え
ば、ニトロセルロースまたはナイロン）が好ましい。さ
らに、固体支持体（例えば、メンブレン）は、バーコー
ド形式で整列される一連の標識されたリランド：レセプ
ター複合体の列（各々の列／バーが異なる分析物に特異
的である）を有し得る。このような部材を例えば試験リ
ガンド（例えば、乳汁、唾液、尿、血液、環境サンプル
など）中に浸すと、バーに特異的な分析物の存在は、こ
のバーからの標識されたリランドの消失を生じさせ、こ
れはバーコードリーダーにより読みとり得る変化を生じ
る。
別の実施態様において、FADがリランドに結合され
る。ストリップは、FAD−リランド：レセプター複合
体、アポグルコースオキシダーゼ、グルコース、西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（HRP）、および色素原であるテ
トラメチルベンジジン（TMB）を含むメンブレンであ
る。一緒に見なして、FAD、apoGO、グルコース、および
HRPは、遊離を検出するための手段を構成する。分析物
を含有するサンプルとメンブレンとの接触は、リランド
/FADの遊離を生じ、これは次いで、グルコースを酸化し
てH2O2を生成するapoGOを自由に活性化し、H2O2は次い
でTMBにより還元されて、TMBの青色酸化型を生じる。こ
のシステムは、血液グルコースを測定するためのストリ
ップを製造するために使用される様式と同じ様式で製造
され得る。
さらに別の実施態様において、レセプター：リランド
/FAD複合体は、温度計型メンブレンの基部または「球」
において固定化される。基部より上のストリップは固定
化されたapoGOおよびペルオキシダーゼを含む。分析物
によるFAD/リランドの遊離は、FAD/リランドを浸透され
たApoGOの長さに沿って移動させ、そしてapoGOに結合さ
せる。ここでapoGOは活性な酵素に変換され、次いでこ
れは先の段階において言及した色生成反応を開始する。
遊離されるFAD/リランドの量に比例して活性化されるス
トリップの長さまたはカラムの高さの部分は、色を変化
させ、そして温度計が読まれるように視覚的に読まれ得
る。例えば、濃度に対応する数字の目盛りが、ストリッ
プの長さに沿って提供され得る。あるいは、数字を付し
た目盛りの代わりに、読みとり領域が色ゾーンに分割さ
れ得、半定量的な読みとりを示す。例えば、特定の色
が、低い、中位の、高い、非常に高い濃度に割り当てら
れ得る。別の好ましい実施態様において、上記の「温度
計」型ストリップは、Serexの係属中の米国特許出願第0
8/047,156号（1993年４月13日出願、Lee OwnおよびFitz
patrickによる係属中特許）に記載の積層デバイス中に
存在する。
本発明は、以下の実施例によりさらに例証される。こ
の実施例は、純粋に本発明の特定の実施態様であると意
図される。事実、本明細書において示されそして記載さ
れるものに加えての本発明の種々の改変は、記載および
添付の図面から当業者に明らかとなる。このような改変
は、添付の請求の範囲の範囲内にあると意図される。
実施例1:コチニンについての遊離アッセイ コチニンおよびトランス−３′−ヒドロキシコチニン
は、ニコチンの主要な代謝物である（Langoneら、1973,
Biochem.12:5025−30;Jacobら、1991 J.Chromatography
222:61−70;Neurathら、1987,Int.Arch.Occup.Environ.
Health59:199−201）。これらは、尿中に1:3の比率で出
現する（Neurathら、前出）。尿、血清または唾液中の
コチニンの検出は、ニコチンへの曝露のレベルを測定す
るために最も一般的に使用されている生化学的方法であ
る（Fitzpatrick,1991,Clinical chemistry News,第11
巻）。他の乱用の薬物とは異なり、コチニンは、受動的
喫煙に起因して非使用者の体液において見出される。コ
チニンアッセイについての目的の範囲は、唾液および血
液試験のために必要な0.010μg/mlから、タバコ使用者
の尿のための10μg/mlまでである（Greenbergら、1984,
N.Engl.J.Med.301:1075−78;Matsukuraら、1984,N.Eng
l.J.Med.311:828−31;Sepkovicら、1986,J.A.M.A.256:8
63;Jarvisら、1987,Am.J.Public Health77:1435−8;Sch
epersおよびWalk,1988,Arch.Toxicol.62:395−7;Langon
eら、1988,J.I.M.114:73−８）。
この実施例において、非常に低親和性のリランドとし
てＮ−プロピルカルボキシルノルコチニンおよびＮ−イ
ソプロピルカルボキシルノルコチニンを使用するコチニ
ン遊離アッセイが記載される。シス３′−ヒドロキシコ
チニンもまた評価した。遊離アッセイを、EMITRアッセ
イに類似の均一形式および不均一形式（マイクロタイタ
ープレート、ELISA形式）において実施し、そしてコチ
ニンについての従来の競合アッセイと比較した。結果
は、本発明の遊離アッセイがより正確であり、そして公
知のアッセイよりも少ない交差反応性からの干渉を示す
ことを実証した。さらに、本発明の遊離アッセイは、直
線的である（ｒ＝0.999（図４を参照のこと））標準曲
線および現在公知の競合、あるいは解離またはサンドイ
ッチアッセイよりも約3log高いダイナミックレンジを有
する。
以下の材料および方法の節は、アッセイにおいて調節
および使用される試薬、ならびに用いられる方法の一般
的な説明を記載する。
材料および方法 機器は、SLT Lab Instruments 340ATTC Microtiter P
late Reader、およびCOBAS MIRE Autoanalyzerを含ん
だ。尿サンプルはコチニンについて以前に分析された一
般的な集団に由来した。サンプルを−20℃で保存した。
全ての化学薬品は、他に記載しない限りSigma Aldric
hに由来した。シスおよびトランス−ヒドロキシコチニ
ンは、George Neurath（Neurathら、前出を参照のこ
と）の研究室から購入した。グルコース−６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（G6PD）はBeckmanに由来した。Nicotin
e Metabolite Assay Kit、NiMA AutoMates 、およびEL
ISA Kits、Tobacco Screen 、およびCotinine Trace Q
uantities CotiTraq テスト、TMB色素原システム、抗
コチニン抗血清、ペルオキシダーゼ標識抗コチニン、お
よびニコチン尿標準品は、Serex,Inc.（Maywood,NJ）か
ら市販されている。
レセプター カルボキシルコチニンに対する抗血清を、以下のよう
に得た:320mgのキーホールリンペットヘモシアニン（KL
H）を40mlの脱イオン水中に溶解した。これに300mgのト
ランス−４−カルボキシルコチニンを、溶解されるまで
混合しながら添加した、300mgの１−エチル−３−ジメ
チルアミノプロピルカルボジイミド（EDC）を撹拌しな
がら反応混合物に添加し、そして室温で一晩撹拌した。
KLH−カルボキシコチニン結合物（免疫原）を、８時間
２〜８℃でリン酸緩衝化生理食塩水に対して透析した。
透析液を４時間後に１回交換した。
ウサギをフロイントアジュバント中の免疫原で、数ヶ
月にわたって複数の注射で、標準的なプロトコルに従っ
て免疫した。試験採血を規定された間隔で行い、そして
抗体力価の増加をコチニンについての酵素免疫検定法を
用いて測定した。抗体の親和性および交差反応性の測定
もまた実施した、これらのアッセイが満足な抗体性能を
示した場合、ウサギを放血し、そして血清を単離および
プールした。高血清を−40℃で保存した。
IgG画分を硫酸アンモニウム沈澱により血清から分離
した。イムノアフィニティークロマトグラフィーカラム
を、スクニシル化ヒドロキシコチニンをそのカルボキシ
基を介してアミノ−セファロース4Bに結合することによ
り調製した。アフィニティー精製した抗体を、メタ過ヨ
ウ素酸ナトリウム法を用いて西洋ワサビペルオキシダー
ゼで標識した。
リランドの調製 １−イソプロピル−４−カルボキシル−５−（３−ピ
リジル）−２−ピロリジノン、（以後、Ｎ−イソプロピ
ルノルコチニン）および１−プロピル−４−カルボキシ
ル−５（３−ピリジル）−２−ピロリジノン（以後、Ｎ
−プロピルノルコチニン）（図1Cおよび1D）をCushman
およびCastagnoli（1972,J.Org.Chem37:1268）の方法に
従って調製した。簡潔に記載すると、50mlベンゼン中の
17gピリジン−３−カルボキシル−アルデヒドの溶液
に、8gイソプロピルアミン（または8gプロピルアミン）
および12gモレキュラーシーブペレットのベンゼン溶液
を添加した。その混合物を、フラスコ内で20℃で一晩撹
拌した。その溶液を２層のWhatman No.2濾紙で濾過し、
そして減圧下で蒸発させ、黄色の油としてイミンを得
た。この産物の構造をNMRにより確認した。
Ｎ−イソプロピルノルコチニンおよびＮ−プロピルノ
ルコチニンを以下のように調製した。12gのＮ−３−ピ
リジリデンイソプロピルイミンまたはＮ−３−ピリジリ
デンプロピルイミン、および15gの無水コハク酸を100ml
のキシレン中で24時間還流した。混合物を冷却後、上層
をデカントしそして廃棄した。残った褐色の油を300ml
の５％重炭酸ナトリウム溶液に溶解し、250mlのクロロ
ホルムで２回洗浄し、そして1gの活性炭を用いる吸着に
より脱色した。懸濁液を濾過し、そして黄色の濾過液を
蒸気バス上で加熱し痕跡量のクロロホルムを除去した。
pHをpholsporic酸で4.7に調整しその産物を沈澱させ
た。粗製のカルボン酸を濾過によって回収しそして沸騰
しているエタノールから再結晶化させ4gの白色結晶を得
た。各化合物の構造はNMRによって確認した。
グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）結合
物の調製 Ｎ−イソプロピルノルコチニン、Ｎ−プロピルノルコ
チニン、およびシス３′−ヒドロキシコチニンのグルコ
ース−６−リン酸への結合をRubensteinおよびUllman
（1975、米国特許第3,875,011号）に記載の方法を用い
て調製した。簡潔に記載すると、1mlの0.1M炭酸ナトリ
ウム緩衝液（pH9.0）に、0.43mlのグルコース−６−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ（2.8mg）、20mgのNADH（二ナト
リウム塩）、10mgのグルコース−６−リン酸、および30
0μｌのカルビタールを添加した。この溶液（「酵素溶
液」）を４℃に冷却して保存した。
空の試験管に26mgのＮ−プロピルまたはＮ−イソプロ
ピルノルコチニン、12mgのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド、21mgのジシクロヘキシル−カルボジイミド、および
1.0mlのジメチルホルムアミドを添加した。この混合物
を室温に１時間放置し、活性化されたコチニンエステル
を形成させた。１時間後、10μｌの反応混合物を、その
冷酵素溶液に、15分の間隔で、合計70μｌを添加するま
で（合計90分）加えた。反応混合物の最後の添加15分後
に、その修飾した酵素を、0.055M Tris−HCl緩衝液（pH
7.9）１リットルに対し少なくとも各３時間透析し、緩
衝液は５回交換した。
このG6PDは、リランドに結合させそして均一系で用い
る場合には、標識としての使用する。結合されたリラン
ドを不均一系で用いる場合には、そのG6PDは標識として
用いるのではなく、固相へのハプテンの結合を増強する
ためのキャリアタンパク質として用いる。G6PDに結合し
た場合、マルチマー形態のリランドは、モノマー形態の
ものよりも5logより高い会合係数である。この形態のリ
ランドは、もし（６カ月までの）長期の安定性を有する
複合体が、この複合体がキットにおいて供給される場合
に必要とされるように、必要とされる場合には好まし
い。このような目的のために、5,000ダルトン以下のリ
ランドが一般的に用いられる。
均一遊離アッセイ用の試薬 コチニンの均一遊離アッセイ用の試薬溶液を、３つの
別々の溶液（試薬Ａ、Ａ＋、およびＢ）として調製し
た。試薬Ａは、0.74μg/mlのタンパク質濃度のグルコー
ス−６−リン酸デヒドロゲナーゼリランド結合物、0.05
M Tris緩衝液、5mM MgCl2、0.5mM EDTA、1.75mg/mlグル
コース−６−燐酸、0.5％BSA、および防腐剤（pH7.9）
からなる。試薬Ａ＋は、試薬Ａ緩衝液中の抗血清からな
る。
試薬ＡおよびＡ＋を使用前に混合し、４℃で１週間安
定なワーキング溶液を作製した。
試薬Ｂは、0.02M Tris緩衝液（pH7.0）中3.3mg/mlのN
ADからなる。
交差反応性を以下のように調製したコチニンおよび／
またはトランス−３−ヒドロキシコチニン溶液を用いて
試験した。10mlの陰性の尿プールに100μｇのコチニン
またはトランス−３′−ヒドロキシコチニンを加え、同
陰性尿標準品にし、５、2.5、1.25、0.62、0.31、およ
び0.16μg/mlのコチニンまたはトランス−３′−ヒドロ
キシコチニンの溶液を作製した。
1:3のコチニン：トランス−３′−ヒドロキシコチニ
ン溶液を調製するために、陰性の尿標準品の10mlのアリ
コートに、100μｇのコチニンおよび300μｇのトランス
−３′−ヒドロキシコチニンを添加した。この溶液をポ
ルテックスし、そして同じ陰性の尿標準品中に連続的に
希釈し、５（15）、2.5（7.5）、1.25（3.75）、0.62
（1.87）、0.62（1.87）、0.31（0.94）、0.16（0.48）
μg/mlのコチニン（ヒドロキシコチニン）の希釈を形成
した。
交差反応性を以下の式を用いて算出した； ELISA（不均一）フォーマットにおける遊離アッセイ コーニングのマイクロタイタープレートを、1mlのPBS
当たり１μｇのタンパク質で、Ｎ−プロピルノルコチニ
ンに結合したグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
またはＮ−イソプロピルノルコチニンに結合したグルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼいずれか100μｌを
用いて一晩コートし；ウエルを空にし、乾燥し、そして
使用するまで乾燥剤とともに保管した。遊離用に活性化
するため、100μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識
し、アフィニティー精製した。抗コチニン抗体ととも
に、そのプレートを１時間インキュベートした。過剰の
抗体を、0.05％のTween20を含むPBSで２回洗浄すること
により除いた。
上述で調製した抗体：リランド複合体でコートしたマ
イクロタイタープレートの各ウエルに、10μｌの尿標準
品（０、0.5、２、および８μg/ml）および90μｌの蒸
留水を加えた。２分後に、50μｌの上清を100μｌのTMB
を含む非コートウエルに移し、そして10分間インキュベ
ートした。反応は、2N H2SO4で停止させ、そしてA450nm
で読んだ。
このアッセイの結果を図２に示す。遊離のコチニンが
サンプル中に存在するとき、固相に複合体化した標識抗
体の遊離が、上清中に検出された。従来の競合イムノア
ッセイとは異なり、吸光度またはシグナルは、分析物濃
度に直接的に比例した。最大遊離特性は、シス−ヒドロ
キシ−コチニン（曲線１）により示され、イソプロピル
コチニン（曲線２）が続き、Ｎ−プロピル化合物（曲線
３）は最少遊離を示した。ヒドロキシコチニン結合物の
優れた遊離にもかかわらず、ヒドロキシコチニン化合物
は、経時的に遊離不可能になる複合体を形成する傾向の
ために、この系における適切なリランドであるとはみな
されない。ELISAフォーマットにおいては、終点遊離ア
ッセイ（end−point release assay）は、従来のコチニ
ンELISAフォーマットにおいて通常必要とされる１〜２
時間を15分未満（遊離反応に２分そしてTMB発色に10
分）に短縮させる。本アッセイの時間は、例えば、アッ
セイ工程を自動化することにより（例えば、自動機器で
反応速度アッセイを行うことにより）さらに短縮し得
る。またこの遊離アッセイは、アッセイ工程の数を少な
くとも半分減少する。さらなる利点は、この遊離が分析
物の存在下で陽性のシグナルを与えることである。
従来の均一アッセイ． NiMA AutoMatesR（Serex,Inc.
の登録商標、Maywood、New Jersey）のフォーマット
は、Tubenstein,Schneider,およびUllman（1972、前
掲）に記載のように、均一、競合的、またはEMIT−型ア
ッセイである。免疫反応に対する２つの工程がある： Ab＋分析物→Ab:分析物＋Ab Ab:分析物＋Ab＋リガンド：酵素→Ab:リガンド：酵素
＋Ab:分析物 簡潔に記載すると、サンプルを抗血清と数分間プレイ
ンキュベートした。この反応混合物に、コチニンリガン
ドに結合したグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
（酵素）を添加した。サンプル中のコチニンと相互作用
しなかった抗体は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ上のコチニンに結合する。酵素結合リガンドへの
抗体の結合は、酵素活性を阻害し、それゆえ、その酵素
活性は、直接的にサンプル中の分析物の濃度に直接関連
付けられる。グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
の酵素活性を、NADHの形式をA340nmでモニターすること
により測定した。NADHは、この酵素がグルコース−６−
リン酸をグルコノ−ラクトン−６−リン酸に酸化し且つ
NADをNADHに還元するときに形成する。
従来の均一アッセイは、以下のように、NiMA AutoMat
es 適用シートパラメーターに従ってCOBAS MIRAでおこ
なった： 200μｌの試薬Ａを、37℃で75秒間10μｌのサンプル
とともにインキュベートした。50μｌの試薬Ｂを添加
し、そしてその混合物を25秒間インキュベートした。そ
の吸光度を最後の250秒間にわたって読んだ。アッセイ
の合計の時間は5.83分であった。
均一フォーマットにおける遊離アッセイ． 本発明の均
一アッセイを、従来の均一アッセイと（リランド以外
は）同じ酵素系および同じ試薬を利用して、AutoMates
（Serex,Inc.の登録商標、Maywood、New Jersey）フ
ォーマットにおいてCobas Miraで実施したが、遊離反応
になるように以下のように改変した。
Ab:リランド−酵素＋分析物→Ab:分析物＋リランド−
酵素 Ab:酵素産物を作製するために、緩衝液中のリラン
ド：酵素結合物および緩衝液中の抗血清（Ab）を、最低
１時間混合し、４℃で１週間安定なワーキング試薬Ａを
形成した。サンプル（25μｌ）およびNAD（10μｌ−試
薬Ｂ）を、200μｌのワーキング試薬Ａに添加すること
により開始した（25秒間インキュベートした）。吸光度
を最後200秒間にわたって読んだ。アッセイの合計時間
は5.0分間であった。従来の競合アッセイにおけるよう
に、酵素活性をA340nmでNADHの形成をモニターすること
により測定した。酵素活性は、サンプル中の分析物の濃
度に直接比例する。
従来のアッセイ（NiMA ）（曲線２）および遊離均一
アッセイ（曲線１）の用量応答曲線は、遊離アッセイの
範囲が大いに増加していることを示す（図３）。図３か
ら理解され得るように、従来の競合的EMIT−型のアッセ
イを用いて測定され得る最大量は２μg/mlである。さら
に、遊離アッセイの下点感度は、従来のアッセイが50ng
/mlであるのとは対照的に、10ng/mlである（表１を参照
のこと）。遊離アッセイの範囲は、その遊離アッセイが
競合的ではなく、そしてそれが平行で始まる系であるた
めに、拡大される。従って、下点感度を失わせるノイズ
を増大させることなしに、酵素複合体のより高い開始濃
度を用いることが可能である。従来の競合的イムノアッ
セイにおいては、より多い試薬の添加は、最終平衡状態
をシフトさせることにより、アッセイの感度を変化させ
る。遊離アッセイを示すために用いられる酵素濃度は、
従来の均一（結合）アッセイの0.03μg/mlに比較して、
0.50μg/mlであった。しかし、従来型のアッセイは、遊
離アッセイよりも酵素分子当たり約８倍より多い抗体を
有した。酵素に対する抗体の比がアッセイ感度を決め
る。
競合および遊離フォーマットの比較を、他の変量を示
すために、以下表１に提示する。
表1.コチニンに対する均一遊離アッセイおよびコチニン
に対する従来の均一EMITの比較 遊離 NiMA−EMIT 最終抗血清希釈 4.8×10-3 2.4×10-3 最終結合物濃度 0.51μg/ml 0.03μg/mL 抗血清希釈物／μｇ結合物 9.6×10-3 80×10-3 検出の下限界 0.01μg/ml 0.05μg/mL 検出の上限界 1000μg/ml ２μg/mL 時間 ５分 5.8分 表１は、遊離アッセイが競合アッセイより17倍多い酵
素および２倍多い抗体を利用することを示す。しかし、
酵素および抗体の増加は、それらが競合イムノアッセイ
におけるようには感度の減少をもたらさない：（より少
量の全反応物がこの遊離アッセイで利用され得るが、こ
れはこのアッセイの上限を制限しない）。図４は、0.01
〜1000μg/mlのこのアッセイの特別の範囲を示す。示し
た実施例では、反応物の17倍の増加はこのアッセイの範
囲の1,000倍以上の増加を生じ、曲線の下点における感
度および精度を損なわない。この処方は、10ng/mlに対
して感受性であり、そして唾液サンプルの定量に用い得
る。従来のアッセイの酵素に対する抗体の比は、遊離ア
ッセイよりも、酵素分子に対して８倍多い抗体を使用す
る。遊離アッセイでは、全抗体分子が、酵素に結合した
リランドに結合し得、そして分析物により遊離され得
る。従来のアッセイでは、大過剰の抗体が存在し、これ
は反応時間を短縮するが、感度を低下させる。反応混合
物中の非常により多いパーセントの抗体の活性をモニタ
ーする遊離アッセイの能力は、感度を増加させ、そして
バックグラウンドノイズおよび反応時間を減少させる。
ここで遊離は、マルチマーからであり、そして100％ま
でであり、それはマルチマーが実質的に競合能のないこ
とを示す。
交差反応性：トランスヒドロキシコチニン 従来のアッセイに比較したこの遊離アッセイのより高
い特異性を、トランス−３′−ヒドロキシコチニン（コ
チニンの代謝産物）が、従来の競合アッセイにおけるよ
りもこの遊離アッセイにおいて、非常に少なく干渉（交
差反応）することを実証することにより（表２）確認し
た。このことは、トランス−３′−ヒドロキシコチニン
および他の代謝産物がイムノアッセイにおけるコチニン
についての検出システムにおいて干渉するので重要であ
る。
遊離アッセイは、従来のアッセイの1/4のヒドロキシ
コチニンとの交差反応性を示した（shoed）が、曲線の
低限（すなわち、臨床試験における濃度が重要なとこ
ろ）での交差反応性はなかった。重要なことに、従来の
アッセイにおける最も大きい干渉量は、曲線の低限（す
なわち、交差反応性が所望されないまさにそのアッセイ
部分）で観察された。
Ｎ−イソプロピルノルコチニンの交差反応性 抗体−リランド複合体の安定性および遊離能力をさら
に試験するために、本発明者らは種々のSerexコチニン
アッセイ（これらはすべて同一の抗体を用いた）におけ
るＮ−イソプロピルノルコチニンの干渉能を特徴づけ
た。結果を表３に示す。
リランドであるＮ−イソプロピルコチニンは、100μg
/mlという高い濃度（十分に生理学的範囲外の点）でさ
え、検出抗体（すべてのアッセイについて同一）との0.
4％未満の交差反応性しか示さなかった。100μg/mlまで
のリランドは、Ｇ−６−Ｐ−DH上でこれと複合体を形成
した抗体との交差反応性を示さない。
臨床データ 遊離アッセイは、106の臨床サンプルを喫煙者として
正確に同定した（0.5μg/mlより多いコチニン）。遊離
均一アッセイであるNiMA AutoMates およびTobacco Sc
reen （尿サンプルにおけるコチニンについてのアッセ
イのため、Serexにより販売されるElisaテスト）を、0.
5μg/mlコチニンのカットオフを用いて比較した。表５
は、本発明の遊離均一アッセイが両方のテスト方法と10
0％相関することを示す（Tobacco Screen は、HPLCの
結果と100％相関する）。
本発明の遊離アッセイで観察される精度における２倍
より多い改善は、おそらく多元的であり：開始システム
は平衡であり;1つの反応、解離のみが生じ；そしてより
低い交差反応性で証明されるように、マトリックスはお
そらく、反応においてより低い効果を有する。
実施例2:骨粗鬆症マーカーについての遊離アッセイ 以下に示す骨粗鬆症アッセイのためのマーカーは、骨
および軟骨の周知の分解産物である遊離のピリジノリン
である。このマーカーは、Akiba K.およびNakamura N.,
1977,B.B.R.C.,76:1124の方法に従って調製され得る。
リランドについての候補物を、Aldrichカタログから
選択されるピリジンアナログから選択した。２つのアナ
ログ、ピリドキサミンおよびピリドキサールを、以下の
ようにビオチンで標識した： ピリドキサール−ビオチン結合物の合成 DMF（1mL）中のピリドキサールの塩化水素塩（5.7m
g、0.028mmol）およびビオチンヒドラジド（7.9mg、0.0
31mmol）の混合物に、トリエチルアミン（4.7μＬ、0.0
33mmol）を添加した。この混合物を４℃で一晩撹拌し、
そして溶媒を減圧下で除去した。残査をH2O中の0.1％ト
リフルオロ酢酸で処理し、そして溶媒を減圧下で除去し
た。次いで、残査をメタノールから再結晶化して灰色が
かった白い粉末として5.0mgのピリドキサール−ビオチ
ン結合物を得た。
ピリドキサミン−ビオチン結合物の合成 1.5mLのDMF中の塩酸ピリドキサミン（11.8mg、0.049m
mol）の懸濁液に、トリエチルアミン（Et3N）（20.5μ
Ｌ、0.15mmol）を添加した。次いで、上記の透明な溶液
に、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンアミド−ビオチン（18m
g、0.054mmol）を添加し、そして得られた溶液を室温で
２時間攪拌した。反応混合物を濃縮し、そして残査を分
取TLC（CH2Cl2中の１％Et3N−10％MeOH）によって精製
して、10.1mgのピリドキサミン−ビオチン結合物を桃色
がかった粉末として得た。
抗ピリジノリンモノクローナル抗体へのビオチン化アナ
ログの結合 ビオチン化したピリドキサミンおよびビオチン化した
ピリドキサールを、以下のように抗ピリジノリン抗体に
結合させた： 抗ピリジノリン（CaliforniaのMetra,Inc.によって生
産されたPYRALINKS KITからのモノクローナル抗体）
を、PBS1mlあたり4.6μｇの濃度で、RTで一晩、マイク
ロタイタープレートにコーティングした。抗体をコーテ
ィングしたプレートを種々の濃度のビオチン化したリラ
ンド候補物（10μｌリランド＋90μl PBS0/6％Tween2
0、pH7.4）とともに４℃で一晩インキュベートした。次
いで、プレートを洗浄し、そしてPBS（pH7.4）1mlあた
り1mgのウシ血清アルブミン、0.06％Tween20中の0.1μg
/mlのアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合物（J
ackson Immuno Research Lab.,PA）とともに30分間イン
キュベートした。洗浄後、結合したペルオキシダーゼを
TMBを用いて測定した。結合したペルオキシダーゼの量
は、抗体固相に結合したビオチン化したアナログの量と
正比例した。ピリドキサール−ビオチンの結果を、図12
に示す。観察され得るように、ビオチン−ピリドキサー
ル結合物は、抗体に対するより高い結合をもたらした。
遊離のピリジノリンによる抗体との複合体からのビオチ
ン化したピリドキサールの遊離 抗ピリジノリン抗体を、上記のようにマイクロタイタ
ープレートにコーティングした。抗体をコーティングし
たプレートを、PBS（pH7.4）中の終濃度200μg/mlでの
ビオチン化したピリドキサール溶液100μｌとともに、
室温で２時間インキュベートした。洗浄後、プレートを
洗浄緩衝液（pH7.4）中の1mg/mlのウシ血清アルブミン
中で、0.1μg/mlでのアビジン−ペルオキシダーゼ結合
物（Jackson Imm.Res.Lab.から）とともに、室温で30分
間インキュベートした。過剰のアビジン−ペルオキシダ
ーゼ結合物を洗浄した後、遊離のピリジノリン（METR
A、前出）での遊離を行った。PBS中の100μｌの異なる
レベルのピリジノリン（０、0.09μl/ml、0.9μl/ml）
を、プレートに室温で10分間添加した。次いで、75μｌ
の液相を、別のマイクロタイタープレートに移し、そし
て脱イオン水中に1/10希釈した75μｌのSerex TMB溶液
に添加した。遊離したペルオキシダーゼの量は、抗体と
の複合体から遊離されたビオチン化したリランド量を反
映した。結果を図13に示す。
実施例3:糖化（glycated）ヘモグロビンについての遊離
アッセイ この実施例は、タンパク質である糖化ヘモグロビン
（Hb Glc）についての遊離アッセイの実施可能性を実証
する。このような形式は、従来の競合アッセイまたはサ
ンドイッチアッセイと比較して、増大した実施の容易さ
および増大した精度をもたらす。詳細には、本発明のHb
Glcアッセイは、ヘモグロビン（Hb）の糖化形態と非糖
化形態との間を識別する能力において、従来のアッセイ
よりも非常に優れているようである。
Hb Glcは、正常なサンプルにおいて、ヘモグロビンの
４％までを構成する。このレベルは、糖尿病患者におい
て２〜３倍高くなり得る。従って、Hb Glcは、先の１ヶ
月間の血糖制御の有用な前兆の指標である。ヘモグロビ
ンAlc（Hc Alc）の糖化修飾特性に加えて、１つ以上の
任意の遊離のイプシロンアミノ基でのヘモグロビンの３
つのインビボの糖化部位が存在する。ヘモグロビンAlc
は、ヘモグロビンのβ鎖のアミノ末端のバリンで糖化さ
れたヘモグロビンである。この分子上の他の３つの糖化
部位は、Hb Alc中で糖化されてもよく、またはされなく
てもよい。正常なサンプルにおいて、２〜４％のヘモグ
ロビンがHb Alcであり得、そしてこのレベルはまた、糖
尿病患者において２〜３倍高くなり得る。
ヒトの糖ヘモグロビンに対して特異的な２つのモノク
ローナル抗体（クローンA1.58mg/ml E85.1Aロット94H
4.142、クローンB2mg/ml E85−1Bロット94C 3.01）を、
Exocell（Philadelphia、PA）から得た。HbAo（糖化さ
れていないHb）およびHbGlcを、Exocellから得た。抗体
を、糖化したHbおよび糖化していないHb（両方ともExoc
ellから得た）に対してそれぞれ以下のように力価測定
した。
評価に使用した従来のアッセイ。マイクロタイタープレ
ートを、PBS中のHb AoまたはHvGlcを用いて10μg/mlの
濃度でコーティングした。クローンＡおよびクローンＢ
をPBS中に1:20希釈し、そして各ウェルに100μｌを添加
し、そして１時間インキュベーションした。プレートを
PBSで洗浄し、そしてアルカリホスファターゼで標識し
た抗マウス（Sigma A3688）と１時間相互作用させた。
洗浄後、アルカリホスファターゼを、ｐ−ニトロ−フェ
ニルホスフェート（PNPP）（KirkegaardおよびPerry La
bs,Maryland）を60分間用いて検出した（図５）。両方
のクローンが糖化したより暗いパターンおよび糖化して
いないHbの両方と相互作用した。クローンＢは、より反
応性であるようであった。
糖化していないHbに対する反応性は、糖化したHbで観
察される反応性の50％〜70％の間であった。従って、90
〜98％の糖化していないHb＋２〜10％の糖化したHbが存
在する従来のアッセイ形式において、この抗体は、糖化
したヘモグロビンに高度に特異ではない。
Exocellモノクローナル抗体を用いて観察される糖化
したヘモグロビンと糖化していないヘモグロビンとの間
の交差反応性が予想された。糖化していないヘモグロビ
ンとHb Glcとの間に１つの小さな差異のみが存在し、こ
れはリジンの糖化であり、各分子中のエピトープの残り
は同じままである。
両方の抗体が指向するヘモグロビンの配列は、β17
（リジン）部位として同定されているが、β66部位（こ
れは、非常に類似している（両方の部位はgly−lys−va
l配列を共有する））との交差反応性が存在するようで
ある。さらに、抗体は糖化したHbとインビボおよびイン
ビトロの両方で反応することが報告されている。推定の
糖化部位の配列を、以下に示す： βLys−17 WGKVNVD βLys−66 KAHGKVLGA この配列を有するペプチドであるアセチル化したアミ
ノ（Ac−）Trp Gly Lys Val Leu Gly Ala Gly Glyを、
潜在的なリランドとして調製した。上記の配列の両方か
ら構築されたハイブリッドであるこのペプチドを、PBS
（pH7.4）中で0.5mg/mlの濃度で、室温での0.5％グルコ
ースでの６日間の処置に用いて、糖化を達成した。糖化
したペプチドを、アルブミンに結合し、そして以下のよ
うに、ELISAアッセイにおける固相試薬として用いた： マイクロタイタープレートを、PBS緩衝液中で、pH7.4
で、５μg/mlのアルブミンで一晩コートした。次いで、
プレートを、10μg/mlの濃度でのカルボジイミド（Sigm
a E6383）で処理し、そして100μｌの糖化したペプチド
を10μg/mlで添加し、そして一晩反応させた。クローン
ＡおよびクローンＢの両方がこのペプチドに結合し、そ
していずれも糖化したヘモグロビンによる結合を阻害さ
れなかった。このことは、糖化したペプチドが抗体に非
常に良好に結合し、それゆえリランドとして適任でない
ことを実証した。
ペプチドの糖化は結合とともに、抗体に対して非常に
高い親和性を有する産物を生成するので、糖化していな
いペプチドをリランドとして選択した。リランドを、評
価の目的のためにビオチンへの結合させ、リランド−ビ
オチン結合物を形成することによって標識した。この産
物をTLCによって精製し、そして抗Hb Glcモノクローナ
ル抗体を結合する能力についてテストした。
詳細には、HbおよびHb Glcによって遊離されるリラン
ド−ビオチン結合物の能力をテストした。クローンＢは
より高い力価を有したので、抗体：リランド複合体を、
クローンＢを用いて形成した。リランド−ビオチンを、
各モノクローナル抗Hb Glc抗体とともに別々にインキュ
ベートした。４℃で72時間のインキュベーション後、複
合体化していないリランド−ビオチン結合物を、30,000
のメンブレンカットオフを有するAmicon CENTRICON−30
を用いる限外濾過によって除去した。
糖化したHbによるリランドの遊離をテストした：予め
形成した抗体：リランド複合体に、Hb Ao（Sigma）また
はHb Glcのいずれかを添加し、その後、30分間インキュ
ベーションした。Hb Ao（Sigma）はHb Alcを除去されて
いた。糖化したHbを、pH7.4のPBSで0.5％グルコースと
ともに７日間インキュベーションすることによって、Hb
Ao（Sigma）から調製した。遊離量を、以下のように測
定した： 分析物との複合体のインキュベーション後、混合物全
体をアビジンでコートしたプレートに移した。ここで
は、すべてのビオチン標識（すなわち、遊離されたビオ
チン−リランドおよび遊離されていないビオチン−リラ
ンド抗体複合体の両方）が結合するはずである。HRP抗
体で検出される、プレートに結合した抗体の量は、抗体
となお複合体化している遊離されていないビチオン−リ
ランド結合物の量に比例した。従って、低い吸光度は高
い程度の遊離に等しい。データを図６に示す。これらの
データは、Hb AoよりもHb Glcによる遊離が多いことを
明らかに示す。
糖化ヘモグロビンは、かなりの量のリランドに結合し
た抗体を遊離し得た。糖化していない形態と糖化した形
態との間を識別するこの能力は、図７に示すように、従
来のアッセイにおいてこの２つの形態の間を識別する、
これらのクローンの能力より有意に優れていた。
実施例4:テオフィリンについての遊離アッセイ 本実施例は、テオフィリンの遊離アッセイについての
開発を報告する。テオフィリンは喘息の処置に使用され
る。これは予防的に余りに無効であり過ぎ、そして余り
に毒性であり過ぎ、非常に狭い治療的範囲を有する。従
って、テオフィリンレベルは、特に子供およびテオフィ
リンの代謝に影響を与え得る他の物質を摂取する者にお
いて注意深くモニターされなければならない。
リランドの候補を、抗体供給者より提供される交差反
応物のリストから化合物を選択することにより選択し
た。0.6％の報告された交差反応性を有するテオブロミ
ンを改変して（下記を参照のこと）標識への結合を可能
にし、そして以下のようにテオフィリンについての競合
Elisaにおけるその交差反応性について評価した： １−アセチル−テオブロミン（ThBr−１−Ac）を、従
来の競合Elisaフォーマットにおいて抗体でコートした
プレートへの結合について分析物（この場合、ビオチン
化テオフィリン（Th））と競合する能力について、テオ
ブロミン（ThBr）と比較した（図10）： 抗テオフィリンモノクローナル抗体（テオフィリン
８）（OEM Concepts,Toms River,NJ）をマイクロタイタ
ープレート上に８μg/mLの濃度でコートした。抗体でコ
ートしたマイクロウェルを、０、１、10、100、1000μg
/mLのテオブロミンおよび１−アセチル−テオブロミン
ならびに1:500希釈のテオフィリン−ペルオキシダーゼ
（BiosPacific,Inc.Cat ＃V57520より）と接触させた。
反応物を１時間室温でインキュベートし、そして洗浄後
に、結合したペルオキシダーゼ活性の量を脱イオン水で
1:20希釈したSerex TMBを用いて検出した。図10に示す
ように、テオブロミンはテオフィリンの抗体への結合を
阻害し得たが、テオブロミン−１−酢酸は阻害し得なか
った。従って、テオブロミン−１−酢酸は抗体への結合
について分析物と有意に競合し得なかった。このこと
は、テオフィリンについての本発明の遊離アッセイにお
けるリランドとしてのその潜在的な適性を示す。また、
吸光度の20％の増大が１および10μg/mlのリランド濃度
において見られたことに留意のこと。これは、リランド
に共通に伴われる特性である。
競合テオフィリンリガンドのビオチン結合物である８
−カルボキシプロピルジメチルキサンチン；（８−CP−
テオフィリン）およびテオフィリンリランド（テオブロ
ミン−１−酢酸）を以下のように合成した： 19mgの8 CP−テオフィリン（Sigma C4041）および18m
gのThBr−１−AC（WolfesおよびKornick、独国特許第35
2980号、1920年４月25日に従って合成した）を、Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンアミドおよびジシクロヘキシルカルボ
ジイミド（dicylcohexylcarbodiimide）（両方ともSigm
aによる）によりそれらの活性なエステルに転換した。
活性化したエステルを、重炭酸ナトリウムでpH7に調整
した蒸留水0.6mlに溶解した10mgの５−（ビオチンアミ
ド）フェニルアミン（penylamine）（Pierce,No.2134
5）と相互作用させた。両方のビオチン結合物を分取薄
層クロマトグラフィーにより精製して均一な産物を得
た。
モノクローナル抗体テオフィリン抗体（O.E.M.Concep
ts,Toms River,NJ）とのそれぞれのビオチン結合物の時
間依存性複合体形成を評価した。PBS（pH7.4）中の８μ
g/mLの抗テオフィリンモノクローナル抗体で予めコート
したマイクロタイタープレートに、40μg/mL、１μg/m
L、および0.25μg/mLのビオチン化リガンドまたはリラ
ンドの溶液の10μＬ、および90μＬの洗浄緩衝液（PBS
＋0.06％Tween20）を添加した。プレートを０、５、6
0、120、240、360、および5400分間（90時間）インキュ
ベートし、それぞれの時間の後にプレートを洗浄した。
複合体形成の量を、アビジン−ペルオキシダーゼ（2.2m
g/mL、BSA−洗浄緩衝液で1:80,000に希釈した）を添加
し、そして30分間インキュベートすることにより測定し
た。アビジン−ペルオキシダーゼを除去し、プレートを
PBSで洗浄し、そしてペルオキシダーゼ標識の量を、１
ウェルあたり150μＬのTMBを添加することにより検出し
た。酵素反応を15分間進行させ、その後、50μＬの2N H
2SO4で停止した。450nmでの吸光度を測定した。
結果を図8A、8B、および8Cに示す。図8A（40μg/mlの
リガンドおよびリランドの結合）は、リガンド−ビオチ
ン結合物の結合が約５分後に本質的に完全であったこと
を示す。しかし、リランドの結合は360分を必要とし
た。低濃度（図8B（１μg/ml）および図8C（0.25mcg/m
l））において、CP−テオフィリンの結合は本質的に５
分間後で完全であったが、テオブロミン−１−酢酸リラ
ンドの安定な結合は約１週間のインキュベーションを必
要とした。時間がより低い濃度を完全には補い得ないこ
とに留意のこと。
リランドレセプター形成の濃度依存性 マイクロタイタープレートを記載のように抗テオフィ
リンでコートし、そしてビチオン−リランド（テオブロ
ミン−１−酢酸）およびビオチン：リガンド、0.0005μ
g/ml〜500μg/mlの濃度の８−CPテオフィリン（10μｌ
のビオチン結合物＋90μｌのPBS）とともに１時間室温
でインキュベートした。結合したビオチンを、PBS、0.1
％のBSA、0.06％のTween中1:80,000のアビジンペルオキ
シダーゼ（Jackson,PA）とともに30分間室温でインキュ
ベーションすることにより検出した。酵素活性を、脱イ
オン水中1:20のSerexTMBを用いて15分間測定し、そして
反応を2NのH2SO4を用いて停止した。結果を図11に示
す。リガンド−ビオチンの結合は１μg/mlまたは10-7M
で起こるが、リランドは＞200倍高い濃度の＞250μg/ml
（すなわち4.6×10-4）を必要とする。本発明者らは、
リランドが10-8〜10-3Mの範囲、最も好ましくは0.5〜５
×10-4の範囲の濃度で提供されない限り効率的には結合
しないことを一貫して観察した。
複合体の遊離反応速度および安定性。 遊離反応速度を
これらのビオチン結合物について評価した、図9Aおよび
9B。遊離複合体を以下のように形成した： マイクロタイタープレート上でコートした（上記のよ
うに）抗体に対して、８−CP−テオフィリン（リガン
ド）については１μg/mlおよびThBr（リランド）につい
ては100μg/mlの濃度の各ビオチン結合物10μｌを、90
μｌのPBS、0.06％のTween20（pH7.4）とともにプレー
ト上で１時間室温でインキュベートした。プレートの洗
浄後、１μg/mlのテオフィリン標準品またはPBSコント
ロールを添加した。５分から90時間の示した時間で、75
μｌのサンプルを取り出し、そして遊離についてアッセ
イした。遊離されたビオチン−リガンドまたはビオチン
−リランドの量を、遊離されたビオチンが一晩PBS（pH
7.4）中10μg/mlでコートしたアビジン（Sigma）で予め
コートしたプレート上のPBS中1:40,000のビチオン−西
洋ワサビペルオキシダーゼ（Jackson Immuno Research,
PA）の結合を阻害する能力を検出することにより検出し
た。酵素反応を15分間行い、そして2N H2SO4で停止し
た。吸光度を450nmで読みとった。
PBSコントロールは、リガンドおよびリランドの両方
について最初の30分間に結合が損なわれるが、残りの90
時間の間は損なわれないことを示す。その間に自発的な
損失が存在するこの30分間は、その間に抗体：リガンド
または抗体：リランドが最初の免疫複合体よりも低い解
離速度を有してより安定なコンフォメーションをとって
いる時間を示し得る。このことは、リランドおよびリガ
ンドの解離定数（Kd）が類似しており、そしてKdにおけ
る差異を特定するFreytagとは対照的に両方とも非常に
低いことを示す。
リガンドの複合体である80−CP−テオフィリンを１μ
g/mlのテオフィリンと接触させた場合、90時間を通じた
さらなる遊離を伴って、顕著な遊離は30分間かかった
（図9A）。対照的に、ThBrの完全な遊離はほとんど即時
的であり、そして５分未満を必要とし；さらなる遊離は
起こらず、このことはThBr（リランド）の遊離はKdとは
独立していることを確認した。
実施例5:遊離アッセイのための検出システムにおいてAP
Oグルコースオキシダーゼを用いるテオフィリンの検出 使用したテオフィリンランドは、以下のようにFADに
結合させたテオブロミン−１−酢酸であった： 1mlのジメチルホルムアミドに溶解した24mgのテオブ
ロミン−１−酢酸に、13mgのＮ−ヒドロキシスクシンア
ミドおよび25mgのジシクロヘキシルカルボジイミドを添
加した。室温での１時間のインキュベーション後、活性
化したテオブロミン−１−酢酸を、0.1M炭酸緩衝液（pH
9）中のCarricoおよびJohnson（米国特許第4,255,566
号）の方法に従って合成したN6アミノヘキシル−FADと
混合した。一晩の反応後、粗調製物を、エタノール/1M
重炭酸トリエチルアンモニウム（9:1）の溶媒系におい
て分取TLCにより精製した。リランド−FAD結合物の最終
濃度をA450nmでのFADのモル吸光係数を用いてFAD分光光
学的に測定した。
0.01％より少ないテオブロミン−１−酢酸−FADとの
交差反応性を有する抗テオフィリン（Biodesign,ME）
を、４℃で一晩ロッカー上で反転させてゆるやかな混合
によりプロテインＧアガロースゲル上で固定化し（0.4m
lのプロテインＧアガロースに対して1mg Ab）、続いて
遠心分離により２回洗浄した。
リランド結合の条件 30μｌのゲルを、以下の濃度でMillipore Filtration
デバイスのウェルに分配した。3.35×10-6M抗体／ウェ
ル（6.7×10-6M結合部位）を2.9×10-4M、38×10-5M、
または3.8×10-6Mのリランド濃度にした。リランド−FA
Dを室温で２時間結合させ、次いでゲルを十分に洗浄
し、続いて結合していないリランド−FADを除去するた
めに吸引した。
Abにより結合されるリランド/FADの検出 A.抗体：リランド−FAD複合体を1mg/mlのApoGoを40μｌ
添加し、振盪しながら室温で15分間インキュベートする
ことにより検出した。ApoGOは複合体のFADに結合した。
結合していないApoGOを吸引により除去した。結合したA
poGOの量を、20usの西洋ワサビペルオキシダーゼ（2.5
μg/ml）および50μｌのTMB/グルコース（w0.5mg TMB/m
l＋500mg gluc/ml）のウェルへの添加により測定した。
２分で液体を吸引し、そしてA620nmでの吸光度をSLTマ
イクロタイターリーダー中で読みとった。50μｌの2N H
2SO4を添加し、そしてA450nmでの吸光度を読んだ： リランド.FADのモル濃度 450nmでの吸光度 ０ 0.09 3.8×10-6M 0.09 3.8×10-5M 0.15 2.9×10-4M 0.83 2.9×10-4モル濃度において、顕著な結合が起こる。1
0-4より下では、実施例４に記載したように有意な結合
は起こらない。
B.FAD−リランドについてのApoGO検出システムのダイナ
ミックレンジの限界を決定するために、60μｌのリラン
ド−FADをApoGO検出溶液に直接添加し、そして３分間反
応させた後、上記のように酸で停止させ、そして450nm
での吸光度を読んだ：リランド:FABのＭ濃度 A450nm 2.4×10-6 ＞2.0 2.4×10-7 0.959 2.4×10-8 0.204 2.4×10-9 0.140 ０ 0.126 バックグラウンドは非常に低い。アッセイの検出範囲
はオンサイトアッセイ（on−site assay）について使用
可能な時間内（すなわち10分間以内）で10-9〜10-6Mで
ある。
C.遊離を評価するために、免疫複合体を以下のように行
った： リランド−FADを、1.9×10-4Mのリランド濃度および
5.15×10-6Mの抗体濃度を用いて、上記のように抗テオ
フィリンコートしたアガロースと相互作用させた。過剰
のリランド−FADを遠心分離により、そして十分な洗浄
を用いて取り除いた。免疫複合体でコートしたアガロー
スビーズを上記の濾過プレートの８ウェルに分配し、そ
して吸引した。遊離アッセイを、PBS（pH7.4）中のテオ
フィリン標準品（テオフィリン、Sigma T−1633d）60μ
ｌをビーズに添加し、そして10分間振盪しながらインキ
ュベートすることにより行った。遊離されたリランドを
吸引し、次いで以下のようにApoGOを活性化するその能
力を測定した： 60μｌの吸引物に、1.5mg/mlのApoGO 30μｌ、2.5μg
/mlの西洋ワサビペルオキシダーゼ25μｌ、およびTMB/
グルコース（1ml当たり0.5mgのTMB＋1dlあたり500mgの
グルコース）50μｌを添加した。反応を、50μｌの2Nの
H2SO4を用いて３分間で停止し、そしてA450nmでの吸光
度を読んだ。
遊離結果テオフィリンの濃度 A450nm 10μg/ml（5.4×10-5M） 1.571 １μg/ml（5.4×10-6M） 1.425 0.5μg/ml（2.7×10-6M） 1.324 ０ 0.548 完全な遊離が0.5μg/mlで見られることに留意のこ
と。試験の感度は10-7と10-6Mとの間であり、そして最
大の遊離は約10-6Mで達成される。このことは、2.7×10
-6Mで全てのFAD−リランドが遊離されたことを示す。反
応混合物中の30μｌのコートしたビーズが最大5.5×10
-6MのAbを有し、従って最大のリランド収容能力は約10
×10-6となることが評価された、このことは遊離が完全
であること、すなわちリランドが100％遊離されたこと
をさらに示す。上記の複合体は反応性を変化することな
く数日間保存され得る。
同じ試薬システムを、Pall Biodyne Bナイロン膜上で
使用し、そして視覚により読みとって類似の結果を得
た。膜フォーマットにおいて、免疫複合体はいずれも同
じ膜表面での物理的な分離により、または反対側の表面
にいくつかの試薬を配置することにより、ApoGOから分
離される。例えば、本発明者らは、Pallバイオメンブレ
ンが他方の側に貫通することなく両側で浸透させ得、従
って第２の膜を第１の膜と接触させて使用することによ
り物理的な分離が提供されることを示した。FAD−リラ
ンドが分析物により遊離されるときに、それはApoGOお
よび他の検出試薬に対して移動し、そして遊離されたリ
ランド/FADおよび分析物の濃度に直接比例する色を産生
する。
考察 不均一フォーマット 予め形成された抗体−リガンド複合体の解離を含むア
ッセイシステム（Cocolaら、1979、Analytical Bioche
m.99:121−8;Hindsら、1984、Chin.Chem 30:1174−8;Hi
ndsら、1985、Chin.Chem.Acta 149:10−15）は結合パー
トナーとして競合リガンドを利用したが、本発明の遊離
アッセイは非競合システムである。これは表４（前出）
に示される。ここでリランドが競合しないことが示され
る。本発明の遊離アッセイとは異なり、Cocolaら、Hind
sら（1984）、およびHindsら（1968）（前出）に記載さ
れる競合的解離アッセイは、他の免疫アッセイの競合的
な方法を超える顕著な利点を有するとは示されないこと
はまた注目に値する。本発明はいかなる特定の理論にも
結びつけられないが、本発明者らは、抗体が非常に低い
親和性相互作用を介して遊離リガンドに結合し、そして
より高い親和性を有する結合パートナーの非存在下で、
抗体は遊離され得る準安定性の複合体へのコンフォメー
ション変化を経るという仮説を立てる。複合体は、従来
のリガンド結合物で観察されたように安定になり過ぎ得
る。例えば、Ｎ−イソプロピル−ノルコチニンは、安定
な複合体の形成後の遊離を可能にするように免疫学的に
重要でない部位で巨大な官能基（bulky group）を提供
するように設計された。
結論 本発明者らは、それに対して非常に低い親和性を有す
る結合パートナー（すなわち、遊離リガンドまたはリラ
ンド）と誘導される適合状態をとるレセプターの能力を
利用するアッセイ方法を開発した。遊離アッセイは、安
定な予め形成されたレセプター：リランド複合体を提供
し、これは分析物の存在下で迅速に解離され得る。遊離
システムは全ての免疫アッセイフォーマットで使用され
得る。遊離アッセイは従来のアッセイまたは会合アッセ
イを超える固有の利点を有する； 1.免疫反応における１つの工程を削除することにより、
遊離は１つの工程の時間および誤差の供給源の可能性を
減じ、それによりアッセイ時間を短くしそしてアッセイ
技術を簡単にする。
2.遊離（すなわち解離）は本来干渉を受けにくく、この
ことはそれをより正確にする。
3.アッセイにおける全ての抗体をモニターする能力はノ
イズを減少し、そして1000〜10,000倍の感度の範囲を可
能にする。より感度の高いマーカーを用いるこの方法
は、従来のアッセイフォーマットにおいて利用可能な範
囲の上および下の両方に理論的範囲を拡大する。より多
い反応物の添加は従来の免疫アッセイにおけるように感
度を低下させないが、感度の上の範囲を拡大する。
4.遊離の重要な利点は、そこで解離が起こる穏やかな条
件である。
5.システムの大きな範囲、分析物の存在との正の相関、
および低いノイズは、遊離アッセイフォーマットが１つ
の反応混合物において多くの分析物についてスクリーニ
ングするために使用され得ることを示す。
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施態様に
より範囲が制限されない。実際に、本明細書中に記載さ
れるものに加えて本発明の種々の改変が、上記の記載お
よび添付の図面から当業者に明らかとなる。このような
改変は添付の請求の範囲の範囲内であると意図される。
種々の参考文献が本明細書を通じて引用され、それら
のそれぞれがその全体として本明細書中で参考として特
に援用される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 米国特許4434236（ＵＳ，Ａ) 米国特許3817837（ＵＳ，Ａ) 今堀和友他監修「生化学辞典第２版」 （1990）東京化学同人発行、「会合定 数」の項 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/543 G01N 33/531

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】モノマーまたはポリマーの遊離リガンドに
    結合したレセプターを含むレセプター−遊離リガンド複
    合体であって、該レセプターは分析物に結合し得、該モ
    ノマー形態の遊離リガンドは、該レセプターに、該分析
    物の該レセプターに対する会合定数の１％またはそれ未
    満の会合定数で結合し、そして該遊離リガンドは、該レ
    セプターへの結合について該分析物と検出可能には競合
    しない、レセプター−遊離リガンド複合体。
  2. 【請求項２】前記モノマー遊離リガンドの前記レセプタ
    ーに対する会合定数が、約105M未満かまたはそれに等し
    い、請求項１に記載の複合体。
  3. 【請求項３】前記モノマー遊離リガンドの会合定数が、
    103Mと105Mとの間未満かまたはそれに等しい、請求項２
    に記載の複合体。
  4. 【請求項４】前記モノマー形態の遊離リガンドが、前記
    レセプターに、前記分析物の該レセプターに対する会合
    定数の0.2％またはそれ未満の会合定数で結合する、請
    求項２に記載の複合体。
  5. 【請求項５】前記遊離リガンドが、前記レセプターから
    の該遊離リガンドの遊離の後に検出可能となる標識で標
    識されている、請求項２に記載の複合体。
  6. 【請求項６】前記レセプターが抗体または抗体フラグメ
    ントである、請求項２に記載の複合体。
  7. 【請求項７】前記レセプターが固定化されている、請求
    項２に記載の複合体。
  8. 【請求項８】前記遊離リガンドが、5,000ダルトン未満
    の分子量を有する、請求項２に記載の複合体。
  9. 【請求項９】サンプル中の分析物の存在または量をアッ
    セイするための方法であって、以下： ａ）モノマーまたはポリマーの遊離リガンドに結合した
    レセプターを含むレセプター−遊離リガンド複合体を、
    検出されるべき該分析物を含有すると考えられるサンプ
    ルと接触させる工程であって、ここで該レセプターは、
    該分析物に結合し得、ここで該モノマー形態の該遊離リ
    ガンドは、該レセプターに、該分析物の該レセプターに
    対する会合定数の１％またはそれ未満の会合定数で結合
    し、そしてここで該遊離リガンドは、該レセプターに対
    する結合について分析物と検出可能には競合しない、工
    程；および ｂ）該サンプル中の該分析物の存在または量の測定とし
    て、該遊離リガンドの該レセプター複合体からの解離を
    検出する工程、 を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】前記レセプターに対する前記モノマー遊
    離リガンドの会合定数が、約105M未満かまたはそれに等
    しい、請求項９に記載の方法。
  11. 【請求項１１】前記モノマー遊離リガンドの会合定数
    が、103Mと105Mとの間未満かまたはそれに等しい、請求
    項９に記載の方法。
  12. 【請求項１２】前記モノマー形態の遊離リガンドが、前
    記レセプターに、前記分析物の該レセプターに対する会
    合定数の0.2％またはそれ未満の会合定数で結合する、
    請求項９に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記遊離リガンドが、前記レセプターか
    らの該遊離リガンドの遊離の後に検出可能である標識で
    標識されており、ここで結合した分析物の量が、検出さ
    れた標識の量に比例する、請求項９に記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記レセプターが抗体または抗体フラグ
    メントである、請求項９に記載の方法。
  15. 【請求項１５】前記レセプターが固定化されている、請
    求項９に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記遊離リガンドが、5,000ダルトン未
    満の分子量を有する、請求項９に記載の方法。
  17. 【請求項１７】前記工程ａ）の前に、前記遊離リガンド
    を、前記分析物の非存在下で前記レセプターと接触させ
    る工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
  18. 【請求項１８】アッセイキットであって、以下： モノマーまたはポリマーの遊離リガンドに結合したレセ
    プターを含むレセプター−遊離リガンド複合体であっ
    て、ここで該レセプターは、分析物に結合し得、ここで
    該モノマー形態の遊離リガンドは、該レセプターに、該
    分析物の該レセプターに対する会合定数の１％またはそ
    れ未満の会合定数で結合し、そしてここで該遊離リガン
    ドは、該レセプターへの結合について該分析物と検出可
    能には競合せず、ここで該複合体は、固体支持体相に固
    定化されている、複合体、および 該遊離リガンド−レセプター複合体からの解離の際の該
    レセプターまたは遊離リガンドの存在または量を示すた
    めの検出手段、 を含む、キット。
  19. 【請求項１９】前記複合体が固定化されている前記固相
    が、インディケーターゾーンを含む反応場を含むメンブ
    レンを含み、ここで前記レセプター−遊離リガンド複合
    体が、該反応場に配置され、そして前記検出手段の少な
    くとも一部が、該インディケーターゾーンに配置され
    る、請求項18に記載のキット。
  20. 【請求項２０】複数の分析物についての遊離リガンド−
    レセプター複合体を含む、請求項18に記載のキット。
  21. 【請求項２１】アッセイにおける使用のための遊離リガ
    ンドを得るための方法であって、該遊離リガンドは、検
    出されるべき分析物に結合するレセプターと複合体を形
    成し、該方法は、以下： 該検出されるべき分析物に構造的に類似するか、または
    該分析物の一部を形成する化合物を同定する工程、 該レセプターに結合する化合物を同定するために該化合
    物をスクリーニングする工程、および 分析物の該レセプターに対する１％またはそれ未満の会
    合定数で該レセプターに結合し、そして該レセプターに
    対する結合について該分析物と検出可能には競合しない
    化合物を選択するために、該分析物の存在下および非存
    在下で該レセプターに結合する該化合物を同定する工
    程、 を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】前記化合物が、化学構造における１つ以
    上の置換を有する分析物を合成することによって調製さ
    れる、請求項21に記載の方法。
  23. 【請求項２３】前記化合物が、前記レセプターが結合し
    た前記分析物のエピトープを単離し、そして該エピトー
    プを改変して結合特性を変化させることによって調製さ
    れる、請求項21に記載の方法。
JP09503915A 1995-06-22 1996-06-19 レセプター：遊離リガンド（リランド）複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット Expired - Fee Related JP3103379B2 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/493,420 US5710009A (en) 1994-02-17 1995-06-22 Receptor:release ligand (reland) complexes and release assays using said reland and methods and kits based thereon
US493,420 1995-06-22
US08/493,420 1995-06-22
PCT/US1996/010566 WO1997001097A1 (en) 1995-06-22 1996-06-19 Receptor:release ligand (reland) complexes and assays and kits based thereon

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH10511776A JPH10511776A (ja) 1998-11-10
JP3103379B2 true JP3103379B2 (ja) 2000-10-30

Family

ID=23960154

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP09503915A Expired - Fee Related JP3103379B2 (ja) 1995-06-22 1996-06-19 レセプター：遊離リガンド（リランド）複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5710009A (ja)
EP (1) EP0840895B1 (ja)
JP (1) JP3103379B2 (ja)
AT (1) ATE322685T1 (ja)
AU (1) AU6387596A (ja)
CA (1) CA2225210C (ja)
DE (1) DE69636013T2 (ja)
ES (1) ES2265646T3 (ja)
WO (1) WO1997001097A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01155293U (ja) * 1988-04-15 1989-10-25
CN102126862B (zh) * 2010-01-12 2012-10-10 宝山钢铁股份有限公司 一种焦炉炭化室炉墙涂层材料及其使用方法

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI100276B (fi) * 1996-02-06 1997-10-31 Orion Yhtymae Oy Menetelmä analyyttien ei-kilpailevaa määritystä varten
US20020131972A1 (en) * 1998-05-21 2002-09-19 Daniel Sem Multi-partite ligands and methods of identifying and using same
WO1999063346A1 (en) 1998-06-01 1999-12-09 Roche Diagnostics Corporation Method and device for electrochemical immunoassay of multiple analytes
US7166475B2 (en) * 1999-02-26 2007-01-23 Cyclacel Ltd. Compositions and methods for monitoring the modification state of a pair of polypeptides
AU762931B2 (en) * 1999-03-16 2003-07-10 Serex, Inc. Method and device for detection of Apo A, Apo B and the ratio thereof in saliva
US6699722B2 (en) 2000-04-14 2004-03-02 A-Fem Medical Corporation Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes
AU2002355846A1 (en) * 2001-08-01 2003-02-17 Anil K. Chauhan Immune complexes
US7653490B2 (en) * 2001-09-10 2010-01-26 Triad Liquidating Company LLC Nuclear magnetic resonance assembly of chemical entities
US20030180797A1 (en) * 2002-03-20 2003-09-25 Lin Yu Identification of ligands for a receptor family and related methods
WO2004071446A2 (en) * 2003-02-12 2004-08-26 Chauhan Anil K Immune complexes
WO2010009459A1 (en) * 2008-07-18 2010-01-21 Bayer Healthcare Llc Methods, devices, and systems for glycated hemoglobin analysis
US8709830B2 (en) 2011-03-18 2014-04-29 Biotium, Inc. Fluorescent dyes, fluorescent dye kits, and methods of preparing labeled molecules
AU2018351349A1 (en) * 2017-10-19 2020-04-23 Idexx Laboratories, Inc. Detection of symmetrical dimethylarginine

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3817837A (en) * 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US4069105A (en) * 1977-03-03 1978-01-17 Syva Company Lidocaine antigens and antibodies
US4318707A (en) * 1978-11-24 1982-03-09 Syva Company Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays
US4323507A (en) * 1979-02-12 1982-04-06 Syva Company Valproate conjugation using dicarbonyls
US4341866A (en) * 1980-06-02 1982-07-27 Syva Company Antienzyme termination in enzyme immunoassays
GB2078370A (en) * 1980-06-13 1982-01-06 Nat Res Dev Binding assays
US4590278A (en) * 1981-01-29 1986-05-20 Philip Morris Incorporated Nicotine analogs
US4533493A (en) * 1981-08-27 1985-08-06 Miles Laboratories, Inc. Theophylline immunogens, antibodies, labeled conjugates, and related derivatives
US4480042A (en) * 1981-10-28 1984-10-30 E. I. Du Pont De Nemours And Company Covalently bonded high refractive index particle reagents and their use in light scattering immunoassays
US4434236A (en) * 1982-10-20 1984-02-28 E. I. Du Pont De Nemours & Co. Immunoassay wherein labeled antibody is displaced from immobilized analyte-analogue
US4504412A (en) * 1983-02-07 1985-03-12 National Distillers And Chemical Corporation Cyclohexane derivatives in fragrance compositions
US4551426A (en) * 1983-10-03 1985-11-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Heterogeneous immunoassay for digoxin using ouabain as a separation means
US4766064A (en) * 1984-05-07 1988-08-23 Allied Corporation Displacement polynucleotide assay employing polyether and diagnostic kit
US4977077A (en) * 1984-10-24 1990-12-11 Bioprobe International Integrated solid-phase immunoassay
JPH0750114B2 (ja) * 1986-03-17 1995-05-31 富士写真フイルム株式会社 免疫分析器具を用いる分析方法
US5137808A (en) * 1987-04-07 1992-08-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Immunoassay device
US5009998A (en) * 1987-06-26 1991-04-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for performing heterogeneous immunoassay
DE3922960A1 (de) * 1989-07-12 1991-01-17 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur bestimmung eines analyten
US5183740A (en) * 1990-02-23 1993-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Flow immunosensor method and apparatus
US5164504A (en) * 1991-01-16 1992-11-17 Abbott Laboratories Haptens, tracers, immunogens and antibodies for immunoassays for cotinine derivatives
AU2402292A (en) * 1991-07-29 1993-03-02 Serex, Inc. Differential binding affinities and dissociation assays based thereon
AU1186695A (en) * 1993-12-10 1995-06-27 Abbott Laboratories Reagents and methods for the detection of methotrexate

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
今堀和友他監修「生化学辞典第２版」（１９９０）東京化学同人発行、「会合定数」の項

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH01155293U (ja) * 1988-04-15 1989-10-25
CN102126862B (zh) * 2010-01-12 2012-10-10 宝山钢铁股份有限公司 一种焦炉炭化室炉墙涂层材料及其使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP0840895A4 (en) 2000-04-26
DE69636013T2 (de) 2007-04-12
ES2265646T3 (es) 2007-02-16
JPH10511776A (ja) 1998-11-10
EP0840895B1 (en) 2006-04-05
EP0840895A1 (en) 1998-05-13
CA2225210A1 (en) 1997-01-09
ATE322685T1 (de) 2006-04-15
WO1997001097A1 (en) 1997-01-09
US5710009A (en) 1998-01-20
AU6387596A (en) 1997-01-22
CA2225210C (en) 2004-02-17
DE69636013D1 (de) 2006-05-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0600936B1 (en) Differential binding affinities and dissociation assays based thereon
US4629692A (en) Immunoassay for nonenzymatically glucosylated proteins and protein fragments an index of glycemia
US5451504A (en) Method and device for detecting the presence of analyte in a sample
JP3103379B2 (ja) レセプター：遊離リガンド（リランド）複合体ならびにそれに基づくアッセイおよびキット
US4298685A (en) Diagnostic reagent
WO1998057172A1 (en) Non-competitive threshold ligand-receptor assays
JPH068822B2 (ja) 保護結合検定法
US4686181A (en) Specific binding assay employing anti-G6PDH as label
JPH05501922A (ja) リガンド類似体に対する抗体及びリガンド―レセプター検定におけるそれらの用途
EP0455225B1 (en) Method for measuring the percentage of glycation of a particular protein
CA2148971A1 (en) Calibrator matrix
EP0338045B1 (en) Solid-phase non-separation enzyme assay
AU739280B2 (en) Receptor: release ligand (reland) complexes and assays and kits based thereon
JPH0587809A (ja) 特定タンパク質の糖化割合の測定方法
CA2114440C (en) Differential binding affinities and dissociation assays based thereon
JPH08509064A (ja) 化学的に架橋したタンパクの固相支持体上の固定化
JPH06105252B2 (ja) 遊離型サイロキシンの酵素免疫測定法
JPS62233761A (ja) カテコ−ルアミン酸性代謝物の酵素標識体
JP2985224B2 (ja) アルカリ性フォスファターゼの測定方法
Arakawa et al. Fluorescent enzyme immunoassay of free thyroxin using glucose oxidase as enzyme label
JP3194446B2 (ja) 電子伝達体を標識物質とする免疫学的検出方法
JPH06181762A (ja) 標識抗体組成物
JPH08114594A (ja) 酵素免疫測定法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090825

Year of fee payment: 9

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090825

Year of fee payment: 9

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees