NO155968B - Fremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk virksomme immunosuppressive konjugater av d-glutaminsyre-d-lysin-kopolymerer med antigen. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk virksomme, immunosuppressive konjugater av D-glutaminsyre-D-lysin-kopolymer og et antigen eller protein.

De følgende forkortelser er brukt i den etterfølgende tekst: D-GL: en syntetisk kopolymer av D-glutaminsyre og D-lysin, poly (D Gly^ D Lys^)

(J. Biol. Chem. 247, 323 (1972)), og

ekvivalente kopolymerer.

OVA: ovalbumin.

MBS: m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimid.

SHA: s-acetylmerkaptoravsyreanhydrid

MB-OVA (eller -D-GL): m-maleimidobenzoyl-OVA (-D-GL).

SH-D-GL (eller -OVA): merkaptosuccinyl-D-GL (-OVA).

MB-In (eller AgE): m-maleimidobenzoyl-insulin (-ambrosia-antigen E).

SH-In (eller AgE): merkaptosuccinyl-insulin (-ambrosia-antigen E).

MB-antigen: m-maleimidobenzoyl-antigen.

SH-antigen: merkaptosuccinyl-antigen.

PBS: fosfatbufret saltoppløsning: 0,01 molar natriumfosfatbuffer, pH 7,2, 0,15 molar

NaCl.

HPP: 3-(4-hydroksyfenyl)propionyl.

2-ME: 2-merkaptoetanol.

D-GL-antigen: konjugat av D-GL og et antigen.

AgE: ambrosia-antigen E.

AgE-D-GL: konjugat av ambrosia-antigen E med D-GL. Sephadex: epiklorhydrid tverrbundet dekstrangel

av standardisert kvalitet og egenskaper, fremstilt av Pharmacia Fine Chemicals AB. SEPHADEX er et varemerke. Sephadex G-25 har en vanninnvinningsverdi på 2,5, og Sephadex G-100 har en vanninnvinnings-

verdi på 10. (SEPHADEX PROPERTIES,

Pharmacia Fine Chemicals).

Sefarose: Agarose modifisert ved hjelp av den fremgangsmåte som er beskrevet av Hjerten, Pharmacia Fine Chemicals AB. Sefarose

er et varemerke. (PREPARATION OF SEPHAROSE, Pharmacia Fine Chemicals).

Konjugater av lavmolekylære haptener og en syntetisk kopolymer av D-glutaminsyre og D-lysin (D-GL) har vist seg å være meget effektive ved indusering i eksperimentdyr enn hapten-spesifikk immunologisk toleranse som er meget spesi-

fikk og langvarig (se Katz, 1974; Katz og Benacerraf, 1974). Nevnte toleransetilstand er under slike omstendigheter 1) begrenset til benmarg-avledede lymfocyter (B-celler) som er for-løpere for antistoffutskillende celler, 2) fulgt av en betydelig senkning av hapten-spesifikke antigen-bindende B-celler, og 3) resulterer i en preferensiell senkning av den høyaffinitetsanti-hapten-antistoffreaksjon. Antistoffreaksjoner av alle typer immunoglobulinklasser, heri inngår reaginiske(IgE) antistoffer som er ansvarlige for lokale og systemiske allergiske reaksjoner, blir opphevet ved hjelp av hapten-D-GL-konjugater. Et meget viktig trekk ved dette system er videre at slike D-GL-konjugater er meget effektive for å dempe pågående antistoffreaksjoner i individer som tidligere er blitt sensitivert.

Dette system er blitt meget godt karakterisert med 2,4-dinitrofenyl (DNP-D-GL (Katz, 1974; Katz og Benacerraf,

1974) og er blitt utvidet til å indusere toleranse overfor nukleosidkonjugater av D-GL (Eshhar et al., 1975) som har en klinisk evne til å oppheve den anti-kjerne-antistoffproduksjon som opptrer i pasienter med systemisk lupus erythematosus. Induksjon av toleranse overfor den viktigste allergeniske determinat for penicillin, dvs. benzylpenicilloy1 (BPO) haptenet, er også vist ved å tilføre BPO-D-GL til eksperimentdyr (Chiorazzi et al., 1976), og det er innlysende at det sistnevnte system har store kliniske muligheter ved behandling av pasienter med penicillinallergi. Basert på tidligere kjent kunnskap med hensyn til toleransesystemer hvor man bruker

hapten-D-GL-konjugater, så har det vært innlysende at større makromolekyler koblet til D-GL vil ha lignende toleranse-induserende egenskaper så snart de er bundet til spesifikke immunoglobulinreseptorer på nevnte B-lymfocyter. Man har derfor prøvd å utvikle en fremgangsmåte for fremstilling av stabile konjugater av komplekse proteiner koblet til D-GL

for terapeutisk anvendelse.

Det er to viktige hensyn man må ta ved fremstillingen av protein-D-GL-konjugater som skal prøves på eksperimentdyr for deres biologiske aktivitet og kliniske muligheter. 1) Konjugeringsreaksjonen bør bære så mild som mulig slik at man får en maksimal tilbakeholdelse av de antigeniske determinanter som finnes for det protein som undersøkes. 2) Konjugatet bør være fritt for ikke-konjugert protein, da spesielt proteindimerer eller oligomerer som måtte kunne bli fremstilt under konjugeringstilstandende og som ikke lett lar seg skille fra konjugatet ved vanlig kjent kromatografisk teknikk.

For alle de fremstilte protein-D-GL-konjugater, bør det være en fremgangsmåte som klart kan vise et fravær av ikke-konjugert protein, ettersom en forurensning av slike molekyler i preparatet ville sterkt skade den effektivitet man ønsker å oppnå ved toleranseinduksjon, og mer viktig, vil kunne utgjøre en livstruende risiko hvis slike preparater brukes klinisk.

De mest vanlige brukte koblingsreagenser, som glutaraldehyd, bisimidoestere, toluendiisocyanat og karbodiimider, er ikke egnet for det foreliggende formål, ettersom de i alt vesentlig reagerer ved å koble en aminogruppe med amino eller karboksylgruppe og kan resultere i en betydelig selv-kobling av proteiner. D-GL som har en rekke amino- og karboksyl-grupper, er spesielt følsomt overfor denne prosess. Den ideelle koblingsmetoden innbefatter at man innfører en funksjonell gruppe i proteinet (eller D-GL) som bare reagerer med en annen funksjonell gruppe innført i D-GL (eller proteinet). Den nylig rapporterte koblingsreagensen m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester (MBS), Kitagawa og Aikawa, 1976) synes nettopp å være en slik reagens. Sulfhydrylgrupper som ellers er en nødvendig reaktiv komponent, kan inkorporeres i D-GL (eller protein) på kjent måte.

I foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk virksomme, immunosuppressive konjugater av D-glutaminsyre-D-lysin-kopolymer og et antigen eller protein, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved følgende trinn: (a) innføring av biotin i D-glutaminsyre-D-lysin-ko-polymermolekylet for dannelse av D-GL(biotin); (b) omsetning av D-GL(biotin) med enten m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester for dannelse av MB-D-GL-(biotin) eller med S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid for dannelse av SH-D-GL(biotin); (c) omsetning av antigen eller protein med enten m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuksinimidester for dannelse av MB-antigen eller -protein med S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid for dannelse av SH-antigen eller -protein; (d) omsetning av MB-D-GL(biotin) med SH-antigen eller -protein, eller omsetning av SH-D-GL(biotin) med MB-antigen eller -protein for dannelse av konjugater av D-glutaminsyre-D-lysin(biotin) med antigen eller protein; og (e) separering av nevnte D-glutaminsyre-D-lysin(biotin)-antigen- eller -proteinkonjugat fra ikke-konjugert antigen eller protein, fortrinnsvis ved hjelp av en affinitetskromatografi på en adivin-sefarose-kromatografikolonne.

I en foretrukken utførelse blir MB-antigen og SH-D-GL omsatt til dannelse av D-GL-antigenkonjugat, eller omvendt SH-antigen og MB-D-GL omsettes til dannelse av samme type D-GL-antigen-konjugat. Fremgangsmåten omfatter fremstilling av MB-protein, SH-protein, MB-D-GL og SH-D-GL og omsetning av MB-protein med SH-D-GL eller SH-protein med MB-D-GL til D-GL-protein-konjugatet. Man kan spesielt fremstille MSB-modifiserte antigener, slik som MB-In, og MB-E, SHA-modifiserte antigener slik som SH-In og SH-E, og MBD-GL eller SH-D-GL fulgt av en reaksjon mellom et av de nevnte MB-antigener med SH-D-GL eller et av de nevnte SH-antigener med MB-D-GL, hvorved man får fremstilt D-GL-antigen, f.eks. D-GL-E eller D-GL-In-konjugater av, henholdvis, ambrosiaantigen E eller insulin.

Ved foreliggende fremgangsmåte fremstilles og isoleres protein-D-GL-konjugater, eksempelvis OVA-D-GL-konjugater, ved at man utvikler SH-D-GL (biotin) fra dets beskyttede forløper

in situ i nærvær av MB-protein, samt rensing ved at man di-

rekte påfører reaksjonsblandingen til en avidin-sefarosekolonne.

Det skal påpekes at OVA-D-GL-konjugatsysternet, utgangs-reagenser og mellomprodukter samt de reaksjoner hvor man bruker ovalbumin, samt den informasjon som angår disse reaksjoner, reagenser og fremgangsmåter kun er angitt for å eksemplifisere oppfinnelsen, og ikke som en begrensning av denne.

Figur 1 er et prosessdiagram som viser kjemisk kobling

av protein til D-GL ved å bruke protein (eller D-GL)-konjugater med en maleimidgruppe og tiolert D-GL (eller protein);

Figur 2 er'en grafisk kurve som viser rensingen av biotin-merket OVA-D-GL-konjugat ved affinitetskromatografi på avidin-sefarose. Konjugatpreparatet besto av 9,9 mg (220

nmol) av OVA og 11,9 mg (187 nmol) D-GL, og dette ble påsatt kolonnen av avidin-sefarose (40 ml) ekvilibrert med PBS

ved 4°. Piler indikerer forandring av elueringsmidlet. Strømningshastighet: 57 ml/time;

Figur 3 er et grafisk diagram av: (a) Sephadex G-100 kromatografi med biotin-eluert materiale fra avidin-sefarosekolonne (figur 2, annen topp); og (b) Sephadex G-100 kromatografi av PBS-eluert materiale fra avidin-sefarosekolonne

(figur 2, første topp). Kolonnen på 1,6x80 cm ble ekvili-

brert med PBS og eluert med samme oppløsningsmiddel ved 4°. Strømningshastigheten var 9,6 ml/time; Figur 4 er et grafisk diagram som viser en spektrofotometrisk undersøkelse av biotin-merket D-GL og OVA-D-GL-konjugat. En 1 ml's oppløsning av avidin (8,3 uM) inneholder 4-hydroksyazobenzen-2<1->karboksylsyre (HABA 240 uM) ble titrert med en oppløsning (3 mg/ml) av biotin4 ,--D-GL (-o-o-) eller en blanding av biotin^ ^-D-GL og biotin^ ^-D-GL-OVA inneholdende en ekvivalent mengde (3 mg/ml) totalt biotin^ ^-D-GL (-o-o-) ; Figur 5 er en grafisk fremstilling av en kvantitativ utfelningsreaksjon av OVA og OVA-D-GL-konjugat med kanin anti-OVA-serum. Reaksjonene ble utført med 200 yl OVA eller OVA-D-

GL (mengden av OVA i konjugatet ble bestemt som beskrevet i teksten) og 100 yl antiserum. Blandingen ble inkubert ved 37°C i 1 time og 4°C over natten. Bunnfallet ble oppsamlet, vasket med kald PBS og analysert ved hjelp av Lowry-Folin-metoden;

Fig. 6 er en grafisk fremstilling av de resultater man fikk ved å prøve insulin-D-GL-antigenegenskapen ved hjelp av en insulinradioimmunoprøve. Insulin (svin) eller insulin-D-GL ble inkubert med kanin anti-insulinserum (1:40) ved

4° i 1 1/2 time. <131>I-insulin ble tilsatt, og blandingen ble inkubert i 4° i 1 1/2 time. Antigen-antistoffkompleksene ble utfelt ved geiteanti-kanin-y-globulin og den overliggende

131

væske ble målt for I radioaktivitet. Det ble utført tre parallelle prøver for hver konsentrasjon av antigen;

Figur 7 er en grafisk fremstilling av OVA-D-GL-induksjon av vedvarende toleranse i IgE, men ikke nevnte IgG-antistof f gruppen i CAF^mus sensitivert flere ganger med OVA i alun. Normal CAF^mus ble enten ikke behandlet eller behandlet med ukonjugert OVA (100 yg) en blanding av ukonjugert OVA (100 yg), samt D-GL (250 yg) eller OVA-D-GL (250 yg D-GL inneholdende 100 yg OVA). Forbehandlede mus ble injisert fire ganger med de doser som er angitt. Dosene ble tilført som angitt på alternerende dager. En dag etter fjerde dose ble alle musene primært immunisert med 10 yg OVA i 4 mg alun. Den annen behandling ble utført på dagene 15, 16, 17 og 20

og ble utført som angitt. En ny reaksjon ble utført på dag 21 med 10 yg OVA i 2 mg alun. En tredje reaksjon ble utført på 6 6nde dag på samme måte (alle immuniseringer ble utført intra-peretonealt). Serum IgE (nedre del av tegningen) og IgG (øvre del av tegningen) anti-OVA-antistoffreaksjoner for grupper på 3 mus som ble tappet for blod på forskjellige dager etter den primære immuniseringen, slik det er indikert, er vist på tegningen;

Figur 8 viser grafisk induksjon av toleranse for IgE-antistoffgruppen ved å tilføre OVA-D-GL til CAF^-mus som på forhånd var sensitivert overfor OVA. Normale CAF^-mus ble primært immunisert med 10 yg OVA i 4 mg alun på dag 0. To uker senere ble en av disse gruppene behandlet med OVA-D-GL (250 yg D-GL inneholdende 10 yg OVA) tilførte fire ganger, enten i.d. eller i.v. som angitt, på dag 15, 16, 17 og 20 (250 yg pr. injeksjon). På dag 21 ble denne gruppen og en ubehandlet kontrollgruppe igjen utsatt for en reaksjon med 10 yg OVA i 2 mg alun. På dag 59 ble gruppen med OVA-D-GL-behandlende mus underkastet en ny behandling med OVA-D-GL til-ført på dag 59, 62, 64 og 66 som angitt, og i samme dose som for første behandling. Også på dag 66 ble begge grupper gitt en tredje dose 10 yg OVA i 2 mg alun. Serum IgE (nedre del av tegningen) og IgG (øvre del av tegningen) antistoffreaksjoner for de behandlede mus er på tegningen angitt som prosent av den reaksjon som utviklet seg i den ubehandlede kontrollgruppen med de virkelige antistoffnivåer i kontrollgruppen angitt i parenteser over eller under hvert enkelt datapunkt. Hver gruppe besto av 3 mus;

Figur 9 viser grafisk antigen E-D-GL-induksjon av toleranse for IgE-antistoffgruppen når denne ble tilført CAF-^-mus over ett år etter den første sensitiveringen med antigen E. Normale CAF^-mus ble eksponert overfor 250 R

hel kroppsbestråling av røntgen før den primære immunisering med 10 yg RAG i 4 mg alun. Alle mus ble blodundersøkt på

dag 10 og 20 etter sensitiveringen, og nivåene med hensyn til IgE-anti-AgE-antistoff er vist på venstre side av tegningen. Disse mus ble så ikke undersøkt i ett år, hvoretter de igjen ble tappet for blod for å bestemme det residuale nivå av IgE-anti-AgE-antistoffer (som også er angitt på venstre side av tegningen). Disse mus ble så delt i 3 grupper hvorav 2 ble gitt 4 injeksjoner (i.d. eller i.p. som angitt på venstre side av tegningen), som hver besto enten av ukonjugert AgE

(75 yg) eller AgE-D-GL (250 yg D-GL inneholdende 75 yg AgE). Disse injeksjoner ble gitt daglig. 5 dager etter en endelig injeksjon, ble disse 2 behandlede grupper og en tredje gruppe ubehandlede kontrollmus utsatt for en reaksjon med 5 g AgE i 4 mg alun. IgE-anti-AgE-antistoffreaksjonen for grupper på 3 mus er angitt på høyre side av tegningen som prosent av kontrollreaksjonen slik denne utviklet seg hos ubehandlede mus, og de virkelige kontrollverdier er angitt i parenteser over og under det tilsvarende datapunkt etter annen reaksjon. Beste fremgangsmåte for gjennomføring av oppfinnelsen Reagenser

Den vilkårlige kopolymeren av D-glutaminsyre og D-lysin (poly (D Glu<60>D Lys<40>).eller D-GL) fikk man fra Miles Laboratories, Inc., Elkhart, IN som HBr-saltet og ble brukt som mottatt. Polymeren hadde en midlere molekylvekt på 63 0 00 og et forhold mellom D-glutaminsyre til D-lysinrester på 60:40. Hønseeggovalbumin (OVA), 5 ganger omkrystallisert ble kjøpt fra Pentex, Inc., Kankakee, IL. Insulin (svin) fikk man fra Schwarz/Mann, Orangeburg, New York. m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester (MBS) og N-succinimidyl-e-(4-hydroksyfenyl)propionat fikk man fra Pierce Chemical Co., Rockford, IL. S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid, avidin og d-biotin ble kjøpt fra Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

5,5<1->ditiobis-(2-nitrobenzosyre) fikk man fra Calbiochem,

i La Jolla, CA. d-[karbonyl- 14C]biotin fikk man fra Amersham/

Searle Co., Chicago, IL. Biotinyl-N-hydroksysuccinimidester og [karbonyl- 14C]biotinyl-N-hydroksysuccinimidester ble fremstilt fra d-biotin og d-[karbonyl- 14C]biotin, henholdsvis, som beskrevet av Bayer og Wilchek, 1974, Jasiewicz et.

; al., 1976.

Den mengde umodifisert D-GL som er angitt nedenfor refererer seg til den innveide mengden, og mengden umodifisert protein ble bestemt ved uv-absorpsjon.

A. Radiomerking av D- GL, OVA, insulin og ambrosia E

) For å radiomerke D-GL med 12 5I, ble den syntetiske kopolymeren substituert med hydroksyfenylpropionyl (HPP) på følgende måte: 10 mg (157 nmol) D-GL ble oppløst i 1 ml 0,075 molar borat-buffer, pH 8,5, og pH på oppløsningen ble

justert til 8,5. 50 mikroliter av en oppløsning av N-

i succinimidyl-3-(4-hydroksyfenyl)propionat (4 mg/ml, 760

nmol) i dimetylformamid ble tilsatt, og blandingen ble rørt 1/2 time ved romtemperatur. Den resulterende HPP-substi-tuerte D-GL ble dialysert meget lenge mot fosfatbufret salt-oppløsning (PBS, 0,01 molar fosfatbuffer, 0,15 molar NaCl, ) pH 7,2). Ved å bruke e (280 nm) = 1660 M~1cm~1 for 3-(4-hydroksyfenyl)propionamid (i PBS, pH 7,2), bestemte man den molare mengde av nevnte hydroksyfenylpropionylgruppe.

125

HPP^-D-GL ble radiomerket med I ved å bruke den kjente standard kloramin-T-oksydasjonsmetoden (Greenwood et al.,

i 1963). Den spesifikke aktiviteten på prøven var 420 yCi/mg.

131

OVA og insulin ble merket med I ved den faste fase laktoperoksydase-metoden (David, 1972, David og Reisfeld, 1974).•-Den spesifikke aktivitet var 2 mCi/mg og 5 mCi/mg,

131 henholdsvis. Ambrosia antigen E ble merket med I på samme måte.

B. m- maleimidobenzoyl- ovalbumin ( MB- OVA)

Maleimidgruppen ble inkorporert i OVA ved å reagere proteinet med m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester (MBS, Kitagawa og Aikawa, 1976). OVA (17 mg, 380 nmol)

ble oppløst i 1,0 ml 0,01 M fosfatbuffer ved pH 7,0. 50 yl av en oppløsning av MBS (24,8 mg/ml, 4 ymol) i dimetylformamid ble så tilsatt. Etter omrøring ved romtemperatur i 3 0 minutter ble blandingen påsatt en 0,9 cm x 40 cm kolonne av Sephadex G-25 (Pharmacia, Piscataway, NJ) ekvilibrert med 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0, og eluert med samme buffer ved 4°C. Opp-samlede fraksjoner ble undersøkt for absorpsjon ved 280 nm og de som inneholdt derivatiserte OVA ble slått sammen og brukt direkte for konjugeringsreaksjonen. For å bestemme den mengde maleimidgrupper som var inkorporert, ble en prøve (100 yl inneholdende 9 nmol protein) av oppløsningen tatt ut, boblet gjennom med nitrogen og omsatt med en kjent mengde av en deoksygenert vandig oppløsning av 2-merkaptoetanol (2-Me, 25 yl, 35 nmol) i 20 minutter. Deoksygenert 0,2 F tris-buffer, pH 8,2 (1 ml) og 0,01 M 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzo-syre) i deoksygenert metanol (100 yl): ble tilsatt, og man målte den farge som utviklet seg i prøven etter 3 0 minutter ved 412 nm på et Beckman-model 25 spektrofotometer (Ellman's metode, Ellman, 1959). Den molare mengde maleimidgrupper som er tilstede vil være lik den molare mengde 2-ME som er for-brukt. Mengden av derivatisert OVA i prøven ble bestemt ved Folin-Lowry's metode (Lowry et al., 1951) idet man brukte OVA som standarden og man fant at forholdet maleimidgrupper til OVA var 2,4:1 (dvs. MB2 4~OVA).

C. m- maleimidobenzoyl- D- GL ( MB- D- GL)

Denne forbindelsen ble i alt vesentlig fremstilt som beskrevet for MB-OVA, idet man brukte radiomerket D-GL som en tracer. Den buffer som ble brukt for å oppløse D-GL var 0,2 M fosfatbuffer, pH 7,2, og det molare forhold MBS til D-GL i reaksjonen var 5:1. Den molare mengde av maleimidgrupper ble bestemt på lignende måte, og mengden av det derivatiserte D-GL ble kvantitisert ved radioaktivitet. Man fant at MB:

D-Gl-forholdet var 2,4:1 (MB -D-GL).

D. m- maleimidobenzoyl- insulin ( MB- In)- ambrosiaantigen E

( MB- AgE)

MB-In ble fremstilt i alt vesentlig som beskrevet

for MB-OVA bortsett fra at den eluent man brukte for Sephadex G-25-kolonne.n var PBS (pH 7,2). Reaksjon av insulin (1 mM) med 5 mol-ekvivalent MBS ga MB_ --insulin. MB-AgE

ble fremstilt ved å reagere 20 mg (540 nmol) antigen E og 4,2 mg (13,5 ymol i 200 yl dimetylformamid) av MBS i 2,0 ml 0,01 M fosfatbuffer, pH 7,0, og isolert ved gelfiltrerings-kromatografi på en kolonne av Sephadex G-25, i alt vesentlig som beskrevet for MB-OVA. MB:AgE-forholdet ble bestemt til 3,6:1.

E. Merkaptosuccinyl- D- GL ( SH- D- GL)

Tiolering av D-GL ble utført som angitt av Klotz og Heiney, 1962, for tiolering av proteiner med e-aminogruppene

i lysinrester. D-GL (40 mg, 627 nmol, inneholdende spormengder av <125>I-D-GL) ble oppløst i 900 yl 0,125 M fosfatbuffer, pH 7,2, og pH på oppløsningen ble justert til 7,2

med IN NaOH. 20 yl av en oppløsning S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid (12 mg/ml, 1,4 ymol) i dimetylformamid ble tilsatt, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1/2 time og pH ble opprettholdt ved 7,0 ved å tilsette IN NaOH. Opp-løsningen ble påsatt en Sephadex G-25-kolonne (1 cm x 23 cm) ekvilibrert med PBS, 0,01 M Na2EDTA og ble eluert med samme buffer ved 4°C. Den eluent på 4 ml som inneholdt den deri-125

vatiserte D-GL ( I) ble oppsamlet og deoksygenert 3 ganger ved vakuumutlufting i nitrogen. Deoksygenert 0,5 M hydroksylamin, pH 7,3 (400 yl) ble tilsatt, og blandingen ble inkubert ved 37°C i 20 minutter for å fjerne beskyttende acetylgruppe. De tilstedeværende sulfhydrylgrupper ble kvantitisert ved Ellman's metode som beskrevet ovenfor (Ellman, 1959).

Mengden av derivatisert D-GL i prøven ble bestemt ved radioaktivitet og man fant at SH:D-GL-forholdet var 1,2:1 (SH,

i, z

D-GL).

SH-^ g-D-GL ble bestemt på lignende måte ved å bruke et molart forhold S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid til D-GL

på 5:1.

F. Merkaptosuccinyl- OVA ( SH- OVA)

Denne forbindelsen ble i alt vesentlig fremstilt som beskrevet for SH-D-GL. Det molare forhold S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid til OVA i reaksjonen var 8,6:1. Forholdet sulfhydrylgrupper til OVA i produktet var 1,1:1 (SH1 ^OVA). G. Biotin- D- GL

100 mg D-GL (1,57 ymol) inneholdende spormengder av 125

I-D-GL ble oppløst i 3 ml 0,05 M fosfatbuffer, pH 7,2.

pH ble justert til 7,2 med IN NaOH og man tilsatte 500 yl av en oppløsning av biotinyl-N-hydroksysuccinimidester (5,3 mg/ml, 7,84 ymol) i dimetylformamid. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og ble så dialysert mot PBS og så igjen mot destillert vann og tilslutt lyofilisert. Innvinningen (basert på 12 5I-tellinger) var generelt 90-95%.

Ved å bruke [karbonyl- 14C]biotinyl-N-hydroksysuccimid-ester (og ingen <125>I-D-GL), fant man at 90±% radioaktivitet ble inkorporert under de samme betingelser som beskrevet ovenfor. Derfor- må forholdet biotingrupper til D-GL i produktet være ca. 4,5:1.

H. Merkaptosuccinyl- D- GL- biotin ( SH- D- GL- biotin)

Denne forbindelsen ble fremstilt fra biotin^ 5~D-GL som beskrevet for SH-D-GL.

I. Fremstilling av avidin- sefarose- konjugater med redusert affinitet for biotin

Avidin-sefarosekonjugat ble fremstilt ved å koble

50 mg avidin med 5 g cyanogenbromid-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia) i 15 ml 0,1 M NaHC03 og 0,5 M NaCl, pH 8,3

i 16 timer ved 4°C slik det er beskrevet i Pharmacia-brosjyren (Affinity Chromatography Principles and Methods). En suspen-sjon av konjugatet i PBS ble tilsatt en kolonne. For å dissosiere tetrameren av avidin og fjerne ikke-kovalente bundne undergrupper, ble kolonnen eluert med 30 ml 6 M guanidiniumklorid og hensatt ved romtemperatur over natten og deretter eluert med 6 M guanidiniumklorid inntil den ut-tømmende væske hadde & 280 < ^/01 ^0 m^ var tilstrekkelig)

(Green og Toms, 1973). Kolonnen ble re-ekvilibret i PBS

(40 ml) og alle bindende posisjoner ble mettet ved en ekvili-brering med 1,2 mM biotin i PBS (40 ml). Eluering med 0,1 M

glycin-HCl, pH 2,0 (40 ml) fjernet så biotinet fra de bind-ingsposisjoner med lav affinitet, og kolonnen ble tilslutt re-ekvilibrert i PBS og var ferdig for bruk (15 ml pakket sjikt).

Kapasiteten på det modifiserte avidin-sefarose ble bestemt på følgende måte: 1 ml (pakket volum) av gelen ble helt over på en mindre kolonne og et overskudd av [karbonyl-14

C]biotin med kjent spesifikk aktivitet ble tilsatt. Kolonnen ble eluert med PBS (5 ml) for å fjerne ubundet ["^C] biotin. Det bundne [^~^ C] biotionet ble så eluert med PBS inneholdende biotin (1,2 mM) og ble kvantitisert med radioaktivitet. Man fant at kapasiteten på avidin-sefarose var 10,3 \ ig (42,2 nmol) buitin/ml gel. Ved å bruke biotin.

125 14 D-GL- I istedenfor [ C]biotin, fant man at kapasiteten var 0,5 mg (7,8 nmol) biotin^ ^-D-GL/ml gel.

J. Fremstilling og isolering av OVA- D- GL ( biotin)

MB .-OVA (30 mg, 667 nmol) i 3,0 ml 0,1 M fosfat-

Z , 4

buffer, pH 6,0, ble blandet med acetyl-S, p-D-GL-biotin. _

125 ^/->

(36 mg, 565 nmol, inneholdende en spormengde av I-merket molekyler) i 3,8 ml PBS, 0,01 M i EDTA (pH på blandingen var 6,4). Blandingen ble deoksygenert tre ganger ved vakuum-utluftning i nitrogen. Til oppløsningen tilsatte man 680 ul deoksygenert 0,5 M hydroksylamin, pH 7,3, og blandingen ble omrørt under nitrogen ved 25°C i 2 1/2 time. 2-merkaptoetanol ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM fulgt av N-etylmaleimid til en sluttkonsentrasjon på 2 mM. Opp-løsningen ble omrørt ved 25°C i 20 minutter etter tilsetning av hver reagens.

1/3 av reaksjonsblandingen ble påsatt en kolonne av avidin-sefarose (40 ml pakket sjikt) ekvilibrert med PBS ved 4°C og eluert med 100 ml og tilslutt med 80 ml 0,1 M glycin-HCl, pH 2,0. Kolonnen ble så ekvilibrert med PBS for ny bruk.

125

Effluentene ble undersøkt for I-radioaktivitet og uv-absorpsjon ved 280 nm.

De biotinholdige fraksjoner ble dialysert for å fjerne fritt biotin og ble konsentrert enten ved amicon-ultrafiltrering eller lyofilisering (se resultatdelen for kvantifiseringen).

K. Fremstilling av D- GL- In og D- GL- AgE ( biotin)

Insulin-D-GL (biotin) ble på lignende måte fremstilt

ved å reagere MB 0,9-insulin (59 uM) og acetyl-S.^ 2~D-GL-biotin. j. (47 yM) i PBS. Ambrosia-D-GL (biotin) ble frem-

stilt ved å reagere MB^ q~ A( 3e (16 mg, 4 33 nmol i 3,6 ml 0,1 M fosfatbuffer, pH 6,0), og SH1 g-D-GL-biotin45 (30,6

mg, 480 nmol, inneholdende spormengder av "'"'^I-merkede molekyler, i 3,13 ml PBS, 0,01 M EDTA) og isolert ved affini-tetskolonnekromatografi på avidin-sefarose i alt vesentlig som beskrevet for OVA-D-GL. Man fikk et produkt sammen-

satt av konjugert ÅgE og total D-GL i et forhold på 0,5:1

og dette ble kvantitisert ved samme fremgangsmåte som brukt for OVA-D-GL. Konjugatet beholdt generelt fra 10-20% av sin antigenevne for antigen E slik dette kunne bestemmes ved prosentvis adsorpsjon av konjugert protein ved hjelp av anti-AgE-sefarose-immunoadsorpsjon.

L. Antiserum

Kanin-anti-OVA-antiserum ble oppnådd ved hyperimmuni-sering av New Zealand røde kaniner med 50-100 yg OVA emul-

gert først i et fullstendig Freund's fortynningsmiddel og deretter i et ufullstendig Freund's fortynningsmiddel og til-ført subkutinøst. Kanin-anti-insulin-antiserum ble fremstilt ved å hyperimmunisere kaninene på samme måte først med 200 yg insulin-KLH i fullstendige eller ufullstendige prøver

av Freund's fortynningsmiddel som beskrevet ovenfor, og så

med 200 yg insulin-KLH i 4 mg alun, tilført intraperitonealt.

M. Affinitetskromatografisk kolonne for immunoadsorpsjonsmiddel

Konjugatet av OVA med Sepharose 4B ble fremstilt ved

å reagere OVA med cyanogenbromid-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia). Kolonnen ble vasket med 0,1 M glycin-HCl, pH

2,2, inntil A2g0<<> 0,005.

Antistoffer med affinitet for OVA ble isolert ved å

føre kanin-anti-OVA-antiserum gjennom OVA-sefarose og eluere med 0,1 M glycin-HCl, pH 2,2, etter vasking med PBS. De syreeluerte oppløsninger ble nøytralisert med fast tris(hydroksy-metyl)aminometan og først dialysert mot PBS og så 0,1 M NaHC03, 0,15 M NaCl, pH 8,3. Oppløsningen ble brukt direkte for å konjugere med cyanogenbromid-aktivert Sepharose 4B, hvorved

man fikk et immmunoadsorpsjonsmiddel med affinitet for OVA. Kolonnen ble vasket med 0,1 M glycin-HCl, pH 2,2, før hver bruk.

Immunoadsorpsjonsmiddel med affinitet for insulin

ble fremstilt på lignende måte fra anti-insulin-antistoff isolert fra kanin-anti-insulinserum ved insulin-sefarosekolonne .

Aminosyreanalyse

Aminosyreanalysene ble utført på en Beckman Spinco modell 121-M aminosyreanalysator, og proteinprøvene ble hydrolysert i 6N HC1 i lukkede og evakuerte rør ved 110°C

i 24 timer.

Modifikasjon av OVA og D- GL: Generelle betraktninger

En oversikt over de preparative reaksjoner som ble brukt i denne undersøkelsen er angitt på figur 1. Denne fremgangsmåte er diskutert i de følgende avsnitt.

A. Maleimidobenzoylering

Tidlig i de foreliggende undersøkelser fant man at maleimidgruppen på MB-OVA og MB-D-GL ikke var stabil ved nøytral pH. Maleimidinnholdet sank i grader, sannsynligvis ved en reaksjon med e-aminogruppen på lysinrester. Dette var spesielt tydelig på D-GL som har en rekke slike amino-

r

grupper. Man fant at halvlivet for maleimidgruppen på D-GL var bare et par timer ved romtemperatur og pH 7,0. Reaksjonen av maleimidderivater med aminer er angitt i litteraturen (Smyth et al., 1960). Man fant at maleimidgruppen på MB-.

OVA og MB-D-GL var lengre intakt ved lavere pH, dvs. pH 6,0. Mindre enn 10% av maleimidgruppene på modifisert OVA og D-GL reagerte iløpet av en time ved romtemperatur og pH 6,0. Det var derfor viktig at gelfiltreringen ble utført ved pH 6,0

i kulden og at prøven ble holdt ved samme pH. I tillegg så tok man hensyn til at forbindelsen ble fremstilt like før konjugeringsreaksjonen.

Når maleimidgruppen er inkorporert i OVA-molekylet,

så kan både aminogrupper og sulfhydrylgrupper fra OVA reagere med maleimidgruppen enten på samme eller på et annet molekyl.

Man oppnår derfor meget sannsynlig en dimerisering eller selv-tverrbinding. Når MB-OVA ble inkubert ved romtemperatur

og pH 6,2 i 2 timer (OVA-D-GL-konjugeringsbetingelser),

så ble ca. 10% OVA dimerisert slik dette kunne bestemmes fra uv-absorpsjon for den topp som ble eluert tidligere enn OVA på Sephadex G-100. Dette representerer den maksimale mengde dimerisering som kunne opptre i OVA-D-GL-konjugeringsreaksjonen.

B. Tiolering

Under den spektrofotometriske bestemmelsen av sulfhydrylgrupper ved Ellman's metode fant man at det var meget viktig å deoksygenere rekasjonsoppløsningen ettersom reagensen 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzosyre), raskt ble oksydert i bufferoppløsningen (0,2 M tris-buffer, pH 8,2) og ga en farge som påvirket avlesningen ved 412 nm. Hydroksylamin synes å akselerere denne oksydasjon, og en deoksygenering av oppløs-ningen var spesielt viktig i denne forbindelsens nærvær, hvis man skulle få det korrekte SH-innholdet. En stringent deoksygenert oppløsning,og hydroksylamin vil ikke påvirke denne spektrofotometriske bestemmelsen.

Oksydasjonen av sulfid (OVA eller D-GL) til disulfid og den resulterende dannelse av protein og D-GL-dimerer var hovedproblemet under tioleringen av OVA og D-GL. Under en undersøkelse av tioleringen av D-GL fant man at succinyl-reaksjonen og den etterfølgende gelfiltrering på Sephadex G-25 ikke måtte utføres under deoksygenerte betingelser, men at det var spesielt viktig at oppløsningen var deoksygenert før hydroksylaminbehandlihgen. Når SH-OVA ble inkubert ved romtemperatur og pH 6,2 i 2 timer, ble 26% av proteinet dimerisert slik dette kunne bestemmes ved kromatografi på en Sephadex G-100-kolonne.

Man fant også at hydroksylaminet ikke innvirket på reaksjonen mellom sulfhydrylgruppen og maleimidgruppen, og derfor ikke nødvendig måtte fjernes fra SH-OVA eller SH-D-GL-preparatet før konjugeringsreaksjonene. I virkeligheten kan utvikling av fritt sulfhydryl fra S-acetyl utføres i nærvær av maleimid.

Tiolert OVA og D-GL er stabilt hvis det holdes i be-skyttet form (dvs. S-acetylert). Man fant f.eks. at acetyl-S-D-GL var stabilt i minst en uke ved 4°C.

Konjugering av OVA og D- GL

Det er to alternativer for å koble OVA og D-GL med maleimid-sulfhydrylkoblingsmetoden: i) Reaksjon av MB-OVA med SH-D-GL; ii) Reaksjon av SH-OVA med MB-D-GL som vist

131

på figur 1. I de inngående undersøkelser ble I-merket protein og <125>I<->merket D-GL brukt som tracere for å lette identifikasjonen av konjugatet ettersom dette ville inneholde

125T 131_ ,. ,

bade I- og I-radiomerker. •

I hver reaksjon ble de to komponentene blandet og oppløsningen inkubert ved romtemperatur og pH 6,2 i 2 timer under nitrogenatmosfære (oppløsningene ble deoksygenert tre ganger ved en evakueringsutluftning i nitrogen), og etter 2 timers reaksjonstid, ble de uomsatte sulfhydrylgrupper blokkert med N-etylmaleimid (1 mM). Reaksjonsoppløsningen ble i hvert tilfelle påsatt en Sephadex G-100-kolonne. Fraksjonene ble tellet for ^^i- og ^"^<1->radioaktivitet som

131

ble fulgt av en topp som bare inneholdt I. Eluerings-posisjonene for D-GL og dets konjugater var i det ubesatte volum nærmere enn det man kunne vente på basis av deres molekylvekter. Dette antar man skyldes den ikke-globulære natur på D-GL-molekylet. I parallelle eksperimenter hvor modifisert OVA (MB-OVA eller SH-OVA) ble inkubert alene under konjugeringsbetingelser og deretter underkastet en gelfiltrering på Sephadex G-100, fant man at eluerings-posisjonen for OVA-dimerene (og oligomerer) ble dannet nærmere den man hadde for D-GL og konjugatet. Den første toppen som således inneholdt en blanding av OVA-D-GL-konjugat, D-GL og OVA-dimerer (og oligomerer), ble således renset ved affinitetskromatografi.

I begge metoder reagerte den samme mengde protein slik dette kunne indikeres ved hjelp av forholdet mellom 131

I-tellinger i første og annen topp på Sephadex G-100-kolonnen. Imidlertid er fremgangsmåte i) antagelig den beste ettersom den resulterer i mindre proteinselvkobling, slik dette er angitt i de tidligere avsnittene. En annen mulig fremgangsmåte for å konjugere OVA med D-GL er å koble MB-D-GL til umodifisert OVA ved å bruke naturlig forekomne sulfhydrylgrupper i OVA. Når ekvimolare mengder MB-D-GL og OVA ble omsatt, dannet konjugatet seg bare i lavt utbytte. I dette ekseprimentet brukte man ikke radiomerket OVA som tracer ettersom sulfhydrylgruppen i OVA meget sannsynligvis om-

danner seg til sulfenyljodid ved radiomerkningen.

(Cunningham og Nuenke, 1961). Det konjugerte protein i første topp på Sephadex G-100-kolonnen ble kvantifisert ved Lowry-Polin-metoden (se nedenfor for kvantifiserings-metoder).

Fremstilling og isolering av biotin- merket OVA- D- GL- konjugat

Fremgangsmåten for fremstilling av OVA-D-GL (biotin)

fra MB-OVA og SH-D-GL (biotin) er beskrevet ovenfor. Et trekk ved denne fremstillingen er utviklingen av SH-D-GL (biotin) fra sin beskyttede forløper in situ i nærvær av MB-OVA. Graden av selvkobling med SH-D-GL ble derved redusert, og selve fremgangsmåten forenklet. Et annet trekk ved fremstillingen er den direkte påsetting av reaksjonblandingen til avidin-sefarosekolonnen for rensing.

Separasjonsprofilen er vist på figur 2. Fraksjonene ble undersøkt for radioaktivitet og uv-absorpsjon ved 280 nm. Eluering med PBS alene ga en topp som besto av en blanding sammensatt av en 1) ukonjugert OVA og/eller OVA-dimerer og aggregater; og 2) ukonjugert D-GL eller OVA-D-GL-konjugatet som enten manglet biotin eller hvor biotinmolekylene var ueksponert for binding til avidin. Eluering med PBS-holdig biotin (1,2 mM) ga så det forønskede OVA-D-GL (biotin)-konjugat sammen med ukonjugert D-GL (biotin). Ytterligere eluering med 0,1 M glycin-HCl, pH 2,0, ga lite materiale.

1?5

Den første toppen inneholdt 15% av de " I-tellinger som

var påsatt kolonnen. Den annen topp inneholdt 70% av tellingene og den tredje topp 5%. Den totale innvinning var således ca. 90%.

Effektiviteten for avidin-sefarosekolonnen for rensing av OVA-D-GL-konjugat er vist på figur 3. Materiale eluert med PBS ble fraksjonert på Sephadex G-100 (fig. 3B) og viste seg å inneholde ialt vesentlig OVA og dets dimer (eluert ved de posisjoner som er identiske med de posisjoner man hadde for produkter oppnådd når MB-OVA ble hensatt ved romtemperatur i 2 timer). Materiale eluert med biotin-holdig buffer kunne på lignende måte vise seg å være helt tom for ukonjugert protein

125

(fig. 3A). Det skal også bemerkes at D-GL ( I) viser lang haledannelse på Sephadex G-100 (fig. 3A) . Ettersom dinitro-fenylert D-GL (DNP^q-D-GL) ikke viser en slik haledannelse (fraksjoner undersøkt ved absorpsjon ved 360 nm), så skyldes dette antagelig en fragmentering av D-GL-molekylene ved radiojodbehandlingen eller en radiodekomponering av det radio-merkede D-GL (Bayly og Evans, 1966), skjønt det også delvis kan skyldes heterogeniteten på det anvendte D-GL. Kvantifisering av biotin- holdig protein- D- GL- konjugat

131

For kvantifisering av OVA brukte man først I-merket OVA som tracer og antok at konjugatet kunne identi-125 131 fiseres ved et nærvær av både I- og I-tellinger når dette lot seg utfelle ved anti-OVA-antistoff. Man fant

131

imidlertid at mesteparten (> 70%) av I-merkene på OVA

ikke ble innvunnet fra avidin-sefarosekolonnen. Dette skyldes sannsynligvis en frigjøring av labile radiomerker på OVA som er tilstede som sulfenyljodid (Cunningham og Nuenke, 1961) .

Det er også et problem ved kvantifiseringen av protein i konjugatfremstillingen ved Lowry-Folin-metoden, ettersom D-GL vil gi en Folin-farge. Således hadde en prøve-oppløsning (2,4 ml) som inneholdt en sluttkonsentrasjon på 0,65 yM D-GL, en A7Qq på 0,22 sammenlignet med en A^q<q> på 0,75 for en oppløsning av OVA (0,92 yM) . Mengden av protein kan imidlertid kvantifiseres ved Lowry-Folin-metoden (Lowry et al., 1951), forutsatt at man korrigerer for bidraget fra D-GL. Således viste det seg at mengden av farge (A^qq) som ble utviklet i prøver for oppløsninger inneholdende 50 yg D-GL og varierende mengder OVA, er lineær for 0-100 yg OVA og tilsvarer summen for de isolerte D-GL og OVA.

Kvantifisering kan mer hensiktsmessig utføres ved uv-absorpsjon for konjugatet. MBS-modifisert protein har ikke den samme absorpsjon som umodifisert protein, ettersom maleimidobenzoyl (MB) gruppene bidrar til absorpsjon ved 280 nm. Uv-absorpsjonen av konjugatreaksjonsblandingen ble målt etter at maleimidgruppene var nøytralisert med merkaptoetanol. Ettersom reaksjonsblandingen inneholder kjente mengder av protein derivatisert med MB hvor maleimidgruppene er mettet eller nøytralisert ved kobling til SH enten på D-GL eller merkaptoetanol, så kan ekstinksjonskoeffisienten for modifisert protein beregnes, og man kan kvantifisere mengden av konjugert protein oppnådd fra avidin-sefarosekolonnen. Ettersom proteinene sannsynligvis ikke er ensartet modifi-

sert ved MBS (dvs. at antall MB-grupper på de modifiserte proteiner kan følge en Poisson-fordeling (Gennis og Cantor, 1972), så vil den brukte absorpsjonen være en midlere absorpsjon. Man antok også at det ikke var noen betydelig forskjell mellom den midlere absorpsjon mellom D-GL-konjugeringsreaksjonen og en annen og at det samme gjaldt for rensningsmetodene.

Under utviklingen av konjugerings- og rensningsmetodene brukte man alltid <1>25I-merket D-GL for å lette kvantifiseringen. Biotinmodifisert D-GL kan også kvantifiseres ved en sensitiv spektrofotometrisk prøve for biotin-holdige forbindelser.

Det er basert på bruken av fargestoffet 4-hydroksyazobenzen-2'-karboksylsyre som binder seg til avidin og danner et kompleks med et absorpsjonsmaksimum ved 500 nm. Biotin kan forskyve dette fargestoffet fra avidin og frembringe en senkning i absorpsjonen ved 500 nm som er lineær og proporsjonal til konsentrasjonen av biotin (Green, 1970). Man fant at det var et lineært forhold mellom senking av absorpsjon og mengde av biotin-D-GL opp til et maksimum på 2 50 yg som tilsvarte en A A^qq på 0,55. Man fant også at konjugering av protein til D-GL hadde liten effekt på bindingen av biotinet på D-GL til avidin (fig. 4). Mengden av D-GL i konjugatpreparatet kan derfor kvantifiseres ved å bruke biotin-D-GL som en standard.

Kvantifisert på denne måten inneholdt et spesielt konjugat framstilt etter avidin-sefaroserensing, 11,0 mg

(244 nmol) konjugert OVA og 21,0 (330 nmol) konjugert og ikke-konjugert D-GL idet man gikk utfra 667 nmol MB-OVA og 565 nmol acetyl-S-D-GL. Prøven ble underkastet en aminosyreanalyse for å oppnå en mer nøyaktig kvantifisering av det konjugerte protein. Resultatene indikerte at den virkelige mengde protein var mindre enn den som er beregnet ovenfor med

en forskjell på mindre enn 10%.

Immunokjemisk karakterisering av OVA- D- GL og rensing av konjugatet ved immunoadsorpsjonsaffinitetskromatografi

Kvantitativ utfellingsreaksjon av OVA-D-GL-preparatet etter avidin-sefaroserensing med kanin anti-OVA-

serum er vist på figur 5 som viser at hovedmengden av de antigeniske determinanter på OVA ble beholdt etter konjugering.

Protein-D-GL-konjugatet ble ytterligere renset ved immunoadsorpsjons-affinitetskromatografi på kolonner framstilt med anti-protein-antistoffer. Kolonnen ble først eulert med PBS og det forønskede konjugat innvunnet ved eluering med 0,1 M glycin-HCl-buffer ved pH 2,2. Man fant at konjugatene var stabile under slike rensingsbetingelser ettersom de kunne kvantitativt readsorberes ved hjelp av immunoadsorpsjonsmidlet etter nøytralisering. Når OVA-D-GL-preparatet ble underkastet denne rensning, så var 76% av proteinet i de syreeluerte fraksjoner slik dette kunne bestemmes fra absorpsjoner ved 280 nm. Dette representerer den fraksjon av konjugert-OVA som hadde beholdt sin evne til å kombinere med antistoffer. Sammen med proteinet, 39 <+> 3%

125 D-GL (kvantifisert ved I-tellinger) forefantes i de syreeluerte fraksjoner. Dette representerer mengden D-GL konjugert til OVA som beholdt sin antigenevne. Man fant at disse immunoadsorpsjonskolonner ikke hadde affinitet for ikke-konjugert D-GL.

Fremstilling av insulin- D- GL og ambrosia- antigen E konjugater

Man brukte de samme konjugerings- og isolasjonsmetoder for fremstilling av insulin-D-GL-konjugat. Konjugatet ble på lignende måte renset ved avidin-sefarose og anti-insulin-immunoadsorpsjonskolonner. Et preparat inneholdende insulin og D-GL i et forhold på 0,8:1 (konjugert insulin:totalt D-GL) ble oppnådd ved å reagere MB-insulin og SH-D-GL i konsentra-sjoner slik dette er angitt tidligere, deretter underkaste konjugatet en avidin-sefaroserensing.

Affiniteten for D-GL-konjugert insulin for kanin anti-insulin-antistoffer før og etter immunoadsorpsjons-rensingen, ble undersøkt ved en radioimmunoprøve ialt vesentlig som beskrevet av Glover et al. (1967). Resultatene er vist på figur 6. Det er et vesentlig tap av antigenevne for insulin ved konjugering til D-GL. Den prosentsats antigenevne man bedømmer ut fra denne radioimmunoprøve er avhengig av hvor meget prosentvis bundet man velger. Ved 50% bundet vil antigenevnen være beholdt i 30%, noe som er i overensstemmelse med prosent insulin-D-GL som er adsorbert av anti-insulinkolonnen. Etter rensing med anti-insulinimmunoadsorps-middel, så viste insulin-D-GL 68% av insulinets antigenevne.

131

Forskjellen mellom hemming for I-insulinbinding ved insulin og det rensede insulin-D-GL, må følgelig reflektere forskjellen i affiniteten for de to molekyler for anti-insulin-antistoff.

Den samme preparative teknikk ble brukt for fremstilling av ambrosia antigen E-D-DG-konjugater. Koblingsmetoden er basert på en reaksjon mellom en maleimidgruppe konjugert til proteinet (eller D-GL) og en sulfhydrylgruppe enten tilstede på det opprinnelige protein eller innført i proteinet (eller D-GL) ved tiolering (fig. 1), slik det opprinnelig er utviklet av andre (Kato et al., 1975, 1976; Kitawawa og Aikawa, 1976). Ved å bruke OVA som et prototypeprotein undersøkte man tre forskjellige metoder, og man kunne vise at konjugering ved å reagere MB-OVA og SH-D-GL var den mest til-fredsstillende med hensyn til effektivitet og liten grad av selvkobling i proteinet. Modifisert OVA med et middel på

fra to til tre maleimidgrupper og modifisert D-GL med et middel på en til to sulfhydrylgrupper, ble reagert i denne konjugeringsreaksjon.

Denne metoden er meget mild, har høy koblingseffekti-vitet og resulterer ikke i sterk selvkobling, enten intra-molekylær eller intermolekylært på D-GL, noe som vanligvis opptrer med andre koblingsreagenser (så som glutaraldehyd, bisimidoestere, toluendiisocyanat og karbodiimider). Man fant imidlertid at en dimerisering av protein ikke totalt lot seg unngå ettersom maleimidgruppene også reagerer med amino- og sulfhydrylgrupper på andre proteinmolekyler. Det var derfor nødvendig med en -fremgangsmåte for å skille proteindimerer fra konjugatene. Affinitetskromatografi er følgelig en god metode. Hvis det var tilgjengelig antistoffer som var spesifikke for D-GL, så kunne man ideelt bruke et anti-D-GL-immunoadsorpsjonsmiddel som affinitetskolonne. Men ettersom D-GL ikke er immunogenisk, så er dette ikke mulig. For å unngå dette problem, har man utviklet en fremgangsmåte hvor man anvender den velkjente affiniteten mellom et protein, avidin og et mindre vitaminmolekyl, nemlig biotin. Bruken av biotin for dette formål vil videre var i overensstemmelse med de etiske medisinske terapeutiske prinsipper man vanligvis anfører, ettersom dets tilførsel til kroppen ville være fullstendig uten risiko. Biotin ble således innført i D-GL-molekylet for å skape en forbindelse som gjør det mulig å skille biotinmerket protein-D-GL-konjugat fra ikke-konjugert protein ved affinitetskromatografi på en avidin-sefarosekolonne .

Avidin-biotinkomplekset er et av de mest tettest bundne biologiskekomplekser man kjenner (for oversikt, se Green, 1975) . På grunn av sin høye affinitet og spesifitet er dette system blitt anvendt i mange biologiske undersøkelser (se for referanser i Liu og Leonard, 1978). Imidlertid så har anvendelsen av avidin-sefarose ved affinitetskromatografisk isolering av biotinholdige molekyler vært begrenset på grunn av et problem med innvinningen, ettersom affinitet for avidin til biotin er så høy. For å unngå dette problem ble avidin-sefarosen modifisert på en slik måte at de biotin-merkede forbindelsene kan innvinnes med høyt utbytte under meget milde betingelser og at affinitetskolonnen lett kan resirkuleres. En lignende modifikasjon for avidin-sefarose for rensing av biotinholdige enzymer har nylig vært angitt i litteraturen (Maloy, 1977) .

Ved hjelp av disse fremgangsmåter kunne man oppnå

et OVA-D-GL-(biotin)-konjugat som er absolutt fritt for ikke-konjugert OVA. Forholdet OVA til D-GL var 0,7:1. Disse preparater besto av konjugatet og fritt D-GL-(biotin). Det skal bemerkes at ettersom det er mer enn en sulfhydrylgruppe og maleimidgruppe på D-GL og OVA, henholdsvis, så er det sannsynlig også tilstede molekyler som inneholder to OVA på ettD-GL eller to D-GL på ett OVA. For det foreliggende formål så er det ikke nødvendig å fjerne fritt D-GL-(biotin) fra

konjugatpreparatene, ettersom det er veletablert at D-GL verken er immunogenisk eller giftig. Videre skulle en til-føring av et lite antall av vitaminmolekylet biotin, ikke indusere noen forandring i D-GL-ets ikke-immunogene og ikke-toksiske egenskaper.

Industriell anvendelse

Foreliggende fremgangsmåte kan anvendes

for fremstilling av mange protein-D-GL-konjugater. Generelt blir protein modifisert med m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester til MB-protein som omsettes med SH-D-GL-biotin utviklet in situ fra acetyl-S-D-GL ved hjelp av hydroksylamin. Reaksjonsblandingen underkastes deretter kromatografi med avidin-sefaroseaffinitet for å skille konjugatet og D-GL fra proteindimerer, oligomerer eller aggregater. Konjugatfraksjonene kan ytterligere renses ved immunoadsorpsjonsaffinitetskromatografi på en kolonne fremstilt med anti-protein-antistoffer. Dette skulle fjerne ikke-konjugert D-GL og eventuelt andre konjugater som inneholder protein med ødelagte antigeniske determinanter fra det stabile konjugat. Det har derfor vist seg at en anvendelse av avidin-biotinsystemet er hensiktsmessig og meget effektivt for rensing for de fremstilte konjugater. Mer viktig har det vist seg å være en fremgangsmåte man kan bruke for å oppnå konjugater som er absolutt frie for ikke-konjugert protein.

Konjugerings- og rensingsmetodene har også vært anvendt for insulin-D-GL. Effektiviteten for konjugeringsreaksjonen er meget avhengig av det protein som brukes. Man fikk insulin-D-GL i meget høyt utbytte selv når man brukte MB-insulin som bare inneholdt et middel på en maleimidgruppe.

I denne undersøkelsen var det en viss bekymring med hensyn til bibehold av antigenevnen for de proteiner som ble konjugert til D-GL. Det burde også være av generell interesse for å se effekten av proteinmodifikasjon ved hjelp av en polymer inneholdende et større antall amino- og karboksyl-grupper som kan påvirke proteinene ved elektrostatiske bindinger eller hydrogenbindinger, og hvorledes dette påvirket proteinets kapasitet til å kombinere seg med sine antistoffer. Det kunne vises at konjugering av OVA med D-GL ikke påvirket dettes evne til å danne utfellende komplekser med antistoffer (fig. 5). Formen på den kvantitative ut-felningsreaksjonskurven for OVA-D-GL tilsvarer den man har for OVA. Ekvivalenspunktet er forskjøvet til en høyere anti-genkonsentrasjon for OVA-D-GL, og dette skyldes nærværet av visse konjugater inneholdende OVA med forandrede antigeniske determinanter som ikke lot seg utfelle med antiserum og som ikke lot seg adsorbere ved hjelp av anti-OVA-immunoadsorpsjonsmidlet.

Effekten av D-GL på affiniteten av D-GL-konjugert protein for sine antistoffer og effekten av rensingen ved hjelp av affinitetskromatografi ved hjelp av immunoadsorpsjonsmidlet, kan best vises i forbindelse med insulin-D-GL (fig. 6). Insulin-D-GL fremstilt under de foreliggende konjugeringsbetingelser beholdt mindre enn 30% av insulinets antigenevne. Dette er ikke uventet ettersom insulinets antigen-

evne er meget følsomt overfor kjemiske modifikasjoner. En modifikasjon av fenylalinin-B 1-aminogruppen på insulin, f.eks. ved acetylering eller acetoacetylering, gir en markert nedgang i insulinets affinitet for anti-insuliri immunoadsorpsjonsmiddel. Insulin-D-GL viste et vesentlig bibehold av insulinets antigeniske struktur. Disse konjugater må derfor ha D-GL konjugert ved visse spesifikke posisjoner. Det er interessant at insulinets antigenevne ikke i særlig grad blir forstyrret ved en konjugering med et stort molekyl,

så som D-GL, hvis konjugeringen utføres passende. Ettersom den foreliggende rensingsmetode garanterer et fravær av et eventuelt ikke-konjugert insulin, så ville det være av interesse å prøve kpnjugatets hormonelle aktivitet.

Biologisk reaksjon

Resultatene av disse undersøkelser over den tolerogeniske aktiviteten for OVA-D-GL i mus, har vist at konjugatet er meget effektivt for å undertrykke reaginiske (IgE) antistoffreaksjoner. Dette at slike protein-D-GL-konjugater har en kapasitet til å undertrykke spesifikke antistoffreaksjoner, er selvsagt av betydning for deres kliniske anvendelse for terapi i forbindelse med forskjellige allergiske og autoimmunologiske lidelser og sykdommer.

Dyr og immunisering

CAF-^-mus (8-12 uker gamle hvis intet annet er angitt) fikk man fra Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, og de ble immunisert og reagert intraperitonealt (i.p.) med 10 yg OVA eller 5 yg AgE (eller ambrosiaekstrakt-RAG) adsorbert på Al(0H)3~gel (alun, 4 mg eller 2 mg) slik det er beskrevet,

og resultatene er angitt nedenfor.

Måling av antistoffer

A. Konsentrasjonen av IgE-anti-OVA eller anti-AgE-antistoffer ble kvantifisert ved passiv kutenøs anafylakse (PCA) reaksjoner hos rotter slik det tidligere er beskrevet, og titereringsverdiene er angitt som resiproke verdier for den høyeste fortynning som ga positive reaksjoner.

B. IgG-antistoffaktiviteten for mus anti-OVA-antiserum

ble målt ved en fast-fase radioimmunoprøve idet man brukte 125

I-merket kanin-anti-mus Fab. Aktiviteten for mus anti-AgE-antiserum ble bestemt ved en dobbel antistoffmetode

125

idet man brukte I-AgE og et kanin-anti-musserum.

OVA- D- GL induserer vedvarende toleranse i IgE- gruppen, men

ikke i IgG- antistof f gruppen i CAF-^- mus

Tre grupper av normale CAF^-mus ble injisert intra-dermalt (i.d.) og intravenøst (i.v.) med 4 doser tilført med 2 dagers mellomrom, enten av 1) OVA-D-GL inneholdende 250 yg totalt D-GL (100 yg konjugat); 2) 100 yg ukonjugert OVA; eller 3) en blanding av 250 yg D-GL, samt 100 yg ukonjugert OVA. Ett døgn etter den fjerde dosen ble disse musene og en gruppe ubehandlede kontrollmus primært immunisert med 10 yg OVA pluss alun (dag 0). På dag 15 ble musene igjen behandlet som første gang, og så på ny reagert med 10 yg OVA pluss alun.

Som vist i nedre del av figur 7, så utviklet kontroll-musene en meget god primær og sekundær anti-OVA IgE-antistoffreaksjon. Mus forbehandlet og senere sekundært behandlet med OVA-D-GL ga ingen påvisbar anti-OVA IgE-antistoffreaksjon på noe tidspunkt under denne observasjonsperioden. Denne manglende reaksjonsevne vedvarte i meget lang tid, selv etter en tredje reaksjon med en sensitiverende dose av OVA tilført 4 5 døgn etter den annen behandling med OVA-D-GL. Grupper av mus som ble behandlet enten med OVA eller en blanding av OVA pluss D-GL viste også en nedsatt IgE-antistoffreaksjon. Dette mønster med hensyn til manglende reaksjon i de to sistnevnte gruppene var imidlertid betydelig forskjellig fra den som var manifisert hos mus behandlet med OVA-D-GL. I begge disse tilfeller var senkningen av IgE-antistoffproduksjonen kortvarig og ble fulgt av en fornyet produksjon av anti-OVA IgE-antistoffer på et nivå som til tider var høyere enn det man fant i ubehandlede kontrollmus. En spesielt kontrast i denne relative effektiviteten for disse forskjellige fremgangsmåter for behandling, er illustrert ved den klare evne man fant hos mus behandlet med en blanding av OVA pluss D-GL, til å gi en betydelig IgE-anti-OVA-reaksjon etter en tredje antigenisk reaksjon som var tilført relativt sent i under-søkelsen (dag 66), mens mus som var behandlet med OVA-D-GL ikke reagerte i det hele tatt på dette tidspunkt.

I kontrast til den klare effektiviteten for OVA-D-GL til å gi manglende reaksjon overfor IgE-antistoffgruppen, så feilet behandlingen til å senke anti-OVA-antistoffreaksjonen for IgG-gruppen, og synes i virkeligheten til å forhøyne IgG-reaksjonen (figur 7, øvre del av tegningen). Dette var tilfelle både med mus behandlet enten med ukonjugert OVA eller en blanding av D-GL pluss OVA. Det skal bemerkes at disse behandlede mus ga et høyere nivå av IgG-anti-OVA-antistoffer enn de tilsvarende ubehandlede kontrollmus, spesielt under de tidligere deler av undersøkelsen.

Sammenlignbare resultater ble oppnådd i et separat eksperiment hvor man brukte AgE-D-GL som et middel for å svekke IgE-antistoffreaksjonen som er spesifikk for AgE.

Induksjon av toleranse av IgE- antistoffgruppen ved å tilsette OVA- D- GL til CAF-^- mus på forhånd sensitivert overfor OVA

To grupper ubehandlede mus ble primært sensitivert

med 10 yg OVA pluss alun. 15 døgn senere ble den ene gruppen injisert i.d. og i.v. med 4 doser OVA-D-GL, mens den annen gruppe ikke ble behandlet. Ett døgn etter den siste dose med OVA-D-GL, ble begge grupper sekundært reagert med 10 yg OVA pluss alun.

Som vist i nederste del av figur 8, så fikk man umiddel-bart etter behandlingen med OVA-D-GL, og like før den annen reaksjon, så viste slike behandlede mus et høyere nivå av IgE-anti-OVA-antistoffer enn kontrollgruppen. I motsetning til den ubehandlede gruppen som utviklet god sekundær reaksjon, så viste de OVA-D-GL-behandlede mus et skarpt fall med hensyn til IgE-anti-OVA-antistoffnivå. Disse ned-satte reaksjoner i de behandlede mus vedvarte i 15-18 døgn hvoretter deres IgE-antistoffer steg kortvarig til normalt nivå og så sank til 50% av kontrollverdien på dag 59. På dette tidspunkt ble gruppen behandlet på nytt, slik som de ble første gang, og så gitt en tredje reaksjon med 10 <y>g OVA pluss alun. I motsetning til de ubehandlede kontrollmus som utviklet en vesentlig tertiær respons etter en slik reaksjon, så fikk man ikke bare manglende reaksjon hos de OVA-D-GL-behandlede mus, men man fikk i virkeligheten en senkning av nivået av deres IgE-anti-OVA-antistoffer til upåvisbare mengder.

Den selektive type av toleranseinduksjon for antistoffer av IgE-gruppen kunne igjen observeres i dette eksperiment. Som vist på øvre del av figur 8, så var anti-OVA IgE-antistof f reaksjonen for den behandlede gruppen 43 ganger høyere enn den som man kunne finne i ubehandlede kontrolldyr etter første behandling med OVA-D-GL. Denne markerte overreaksjons-evnen for IgG-gruppen sank slik at de OVA-D-GL-behandlede mus ga sammenlignbare nivåer med hensyn til IgG-antistoffer i forhold til kontrollgruppen etter annen reaksjon. Etter den annen behandling med OVA-D-GL (dag 59), så ble imidlertid IgG-antistoffproduksjonen igjen øket i de behandlede mus. Antigen E- D- GL induserer i IgE- antistoffgruppen ved tilførsel til CAF^- mus ett år etter første sensitivering med antigen E

Skjønt de foregående eksperimenter viser effektiviteten for protein-D-GL-konjugater for å indusere en spesifikk immunologisk toleranse enten hos usensitiverte eller tidligere sensitiverte mus når disse ble analysert under akutte omstendigheter, ønsket man å undersøke hvor effektiv denne fremgangsmåten var under forhold som lå mer opp til de man har under et klinisk allergiproblem. Fremgangsmåten var derfor å sensitivere mus, i dette tilfelle med antigen E, og så la de være i ro i et tidsrom på ett år før de ble underkastet videre manipulering. Etter dette tidsrom ville visse mus behandles, mens andre ikke ville bli behandlet, og man kunne undersøke deres relative evne til å utvikle spesifikke antistoffreaksjoner etter en reaksjon med AgE. Resultatene av en slik undersøkelse er angitt på figur 9.

CAF^-mus ble eksponert med hele kroppen ovefor en lav dose med røntgen (250 R) kort før deres primære sensitivering med 10 yg RAG pluss alun. Grunnen til å eksponere nevnte mus overfor en slik røntgenbestrålning ligger i at tidligere undersøkelser har vist at en slik manipulering resulterer i en vesentlig bedring med hensyn til IgE-antistoffproduksjonen etter en sensitivering med en rekke antigener. Som vist på venstre side av figur 9, resulterte denne immuniseringen i en meget god primær IgE-anti-AgE-antistoffreaksjon. Etter ett års hvile ble alle disse mus undersøkt med hensyn til mengden av spesifikke anti-AgE IgE-antistoffer som lot seg påvise i deres serum. Det er av interesse å bemerke seg at alle mus som var undersøkt, hadde påvisbare IgE-antistoffer, selv når de ikke var blitt eksponert overfor AgE iløpet av ett år.

Mus som ga de laveste titeringsverdier for IgE-antistoffer (PCA-titering - 40) ble så oppdelt i 3 grupper.

2 grupper ble injisert i.d. og i.p. med 4 doser enten av

1) AgE-D-GL inneholdende 250 yg D-GL (75 yg konjugert AgE), eller 2) 75 yg ukonjugert AgE. Den tredje gruppen beholdt man som kontrollgruppe. Fem dager etter siste dose ble alle dyr sekundært reagert med 5 yg AgE pluss cilun. Som vist på høyre side av figur 3, så utviklet de ubehandlede kontroll-musene en utmerket sekundær IgE-antistoffreaksjon som toppet seg 7 døgn etter den sekundære reaksjon. Mus behandlet med ukonjugert AgE, skjønt de var manifest 50% lavere enn de ubehandlede kontrolldyrene på dag 7, ga IgE-anti-AgE-reaksjoner som enten lot seg sammenligne med eller var 2 ganger høyere enn kontrolldyrene senere i undersøkelsen. I en mcirkert kontrast fant man at de mus som var behandlet med AgE-D-GL viste en tydelig manglende evne til å utvikle noe annet enn meget svak AgE-spesifikk IgE-reaksjon.

Disse resultater viser en gunstig induksjon av spesifikk immunologisk toleranse 1) for to forskjellige protein antigener, OVA og AgE, 2) i både usensitiverte og tidligere sensitiverte eksperimentdyr, og 3) og at denne er selektivt begrenset til reaksjoner med hensyn til IgE-antistoffgruppen. En slik toleranse er oppnådd ved å tilføre passende doser

av de respektive protein-D-GL-konjugater. Foreliggende under-søkelser har klart vist den absolutte antigenspesifiteten for den tolerante tilstand som er indusert med et av de to protein-D-GL-konjugater som er brukt her, og at den mekanisme som er oppnådd for en manglende reaksjon med protein-D-GL-konjugater, ikke innbefatter en medvirkning av påvisbare aktive suppressorceller.

Det framgår av disse data at IgE-antistoffreaksjonen ikke bare kunne senkes ved å tilføre protein-D-GL-konjugater, men også ved å tilføre sammenlignbare doser av ukonjugert protein alene. Det skal imidlertid understrekes at mønsteret med hensyn til IgE-antistoffproduksjonen etter behandling på de to forskjellige måter, er vesentlig forskjellig. En tilføring av ukonjugert protein senket IgE-produksjonen effektivt, men bare kortvarig. Det skal bemerkes at når behandlingen ble utført ett år etter den første sensitiveringen, så ga en tilførsel av ukonjugert protein bare en marginal hemmende effekt med hensyn til spesifikk reaksjon, og at denne effekt raskt etter ble fulgt av en markert "oppblomstrende" effekt på den spesifikke IgE-reaksjon. En tilførsel av protein-D-GL-konjugater resulterte på den annen side i en hemning av IgE-antistoffproduksjonen som vedvarte meget lenge, selv etter gjentatt eksponering overfor det sensitiverende antigen. Man har for tiden ingen informasjon hvorvidt den toleransemeka-nisme som induseres i de to forskjellige fremgangsmåter er kvalitativt de samme eller forskjellige.

Et annet poeng som er verdt å undersøke er den betyde-lige selektiviteten med hensyn til manglende reaksjon man kunne observere i disse undersøkelser. IgE-antistoffreaksjonen ble markert nedsatt samtidig som den spesifikke IgG-antistof f reaksjonen overfor de samme determinanter synes å

øke og dette var uavhengig av hvorvidt man tilførte protein-D-GL-konjugater eller ukonjugerte proteiner. Dette representerer en vesentlig forskjell mellom protein-D-GL-systemet og det hapten-D-GL-system som har vært undersøkt tidligere,

for i det sistnevnte system så var det klart at antistoffreaksjonen for alle immunoglobulintyper var følsomt overfor toleranseinduksjon etter eksponering overfor hapten-D-GL-konjugater. Det foreligger i øyeblikket ingen data som kan hjelpe å forklare selektiviteten hos protein-D-GL-konjugater for reaksjoner av IgE-typen, og videre studier er nødvendig for å bringe klarhet på dette området. Den relative konsentrasjon av protein-determinanter på et gitt D-GL-molekyl kan muligens bestemme rekkevidden av den observerte Ig-type selektivitet. Ikke dessto mindre er det klart at det eksi-sterer fundamentale forskjeller i mottageligheten for tole-ranseinduks jon av IgE- og IgG-antistoffsystemene, respektivt, under betingelsene i de her rapporterte forsøk. Godtgjørelsen av grunnlaget for denne forskjell vil være av stor betydning for videreføring av forståelsen av regulatorisk kontroll av disse to antistoff-typer.

I hapten-D-GL-toleransemodellene har man tidligere oppnådd vesentlig materiale som viser den hurtige og irrever-sible inaktivering av B-lymfocyter spesifikke for det benyttede hapten etter kort eksponering overfor konjugatet, muligens ved forstyrrelse av normal membran-virksomhet. Mekanismen for toleranseinduksjon av protein-D-GL-konjugater er ennda ikke tilveiebrakt. Konjugatet kan virke direkte på B-lymfocyter, særlig de av IgE-typen, på protein-spesifikke T-lymfocyter (av enten hjelper- eller suppressor-typen, eller begge) eller på både B- og T-lymfocyter. Studier i andre laboratorier har nylig demonstrert at antigen-spesifikke suppressor-T-celler, som kan undertrykke IgE-antistoffproduksjon, kan utvikles i forsøksdyr ved administrasjon av urea-denaturert antigen eller protein koblet til polyetylen-glykol. Fra det sistnevnte studium er det ikke rapportert kontrollforsøk med hensyn til undertrykkende virkninger hos ukonjugert protein, og dette lar således den mulighet stå åpen at den oppnådde undertrykkelse med protein-polyetylen-glykol-konjugater kan være lik den som oppnås med ukonjugert protein alene, som demonstrert i foreliggende studium. Mens inhibering av IgE-antistoffproduksjon ved innvirkning av antigen-spesifikke T-celler i seg selv er viktig, er det ikke forventet at anvendbarheten av slike metoder som en terapeutisk modalitet er langtrekkende på grunn av den forbigå-ende natur av et slikt undertrykkelsesfenomen.

Det skal påpekes at en nylig rapport angir at DNP-D-GL induserte DNP-spesifikke suppressor-T-Celler i et system hos musefamilien. Siden de benyttede forsøksbetingelser ikke var adekvate med hensyn til eliminering av den mulige over-bringelse av tolerogeniske DNP-D-GL-molekyler i celleblanding-ene, kan imidlertid denne tolkning ikke har noen verdi. Som angitt ovenfor er det ikke dessto mindre noen a priori grunn for ikke å anse at mekanismene for toleranseinduksjon med hapten-D-GL- og protein-D-GL-konjugater, respektivt, kunne være temmelig forskjellige.

Den åpenbare implikasjon av de oppnådde resultater er at allergene.proteiner koblet med D-GL kan vise seg å være nyttige hos mennesket for den spesifikke opphevelse av IgE-antistof f reaksjoner overfor det relevante allegen ved de IgE-formidlede forstyrrelser hvor typen av de dominerende sensitiverende proteiner er kjent. Det faktum at protein-D-GL-konjugater induserer selektiv inhibering av IgE-antistof fproduks jon, mens de ikke minsker IgG-antistoffreaksjoner mot det samme antigen, oppfyller kriterier for ideelle egenskaper hos terapeutiske midler av denne type for bruk ved allegiske forstyrrelser hos mennesker.

Konjugerings-, rensings- og kvantiseringsmetoder som her er beskrevet og anvendelse av avidin-biotin-systemet an-sees som meget egnet for fremstilling av konjugater av proteiner, protein-polypeptider og protein-polysakkarider for en rekke forskjellige eksperimentelle formål hvorved slike stoffer kan være av verdi.

Claims (4)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av terapeutisk virksomme, immunosuppressive konjugater av D-glutaminsyre-D-lysin-kopolymer og et antigen eller protein, karakterisert ved følgende trinn: (a) innføring av biotin i.D-glutamin-D-lysin-ko-polymermolekylet for dannelse av D-GL(biotin); (b) omsetning av D-GL(biotin) med enten m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester for dannelse av MB-D-GL-(biotin) eller med S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid for dannelse av SH-D-GL(biotin); (c) omsetning av antigen eller protein med enten m-maleimidobenzoyl-N-hydroksysuccinimidester for dannelse av MB-antigen eller -protein med S-acetylmerkaptoravsyreanhydrid for dannelse av SH.antigen eller -protein; (d) omsetning av MB-D-GL(biotin) med SH-antigen eller -protein, eller omsetning med SH-D-GL(biotin) med MB-antigen eller -protein for dannelse av konjugater av D-glutaminsyre-D-lysin(biotin) med antigen eller protein; og (e) separering av nevnte D-glutaminsyre-D-lysin(biotin)-antigen- eller -proteitrkonjugat fra ikke-konjugert antigen eller protein, fortrinnsvis ved hjelp av affinitetskromatografi på en avidin-sefarose-kromatografikolonne.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som antigen anvendes insulin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som antigen anvendes Ambrosia E.-antigen.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som protein anvendes ovalbumin.