CH628739A5 - Process of immunological assay using a bound enzyme, and means for implementing the process - Google Patents

Description

La présente invention concerne le dosage immunologique par enzyme fixé et a pour objet un nouveau procédé pour mettre en évidence et doser les antigènes, de même que les réactifs nécessaires à cette fin. Par antigènes, il convient d'entendre, aux fins de l'invention, non seulement les substances qui sont capables par elles-mêmes de provoquer l'apparition d'anticorps chez les animaux, c'est-à-dire les immunogènes, mais aussi les substances appelées parfois haptènes qui, après conjugaison avec une molécule véhiculaire, deviennent capables de provoquer l'apparition d'anticorps spécifiques et de réagir avec ceux-ci.

La possibilité de mettre en évidence et de doser les antigènes offre un intérêt théorique et pratique considérable. Du fait que ces substances ont souvent une structure chimique complexe et fréquemment inconnue et ne sont présentes qu'en concentration très faible dans les milieux biologiques et autres, les techniques analytiques habituelles sont inapplicables. Par conséquent, au cours des dernières armées, on a mis au point différentes techniques fondées sur une réaction entre antigène et anticorps, pour laquelle l'un de ceux-ci est marqué d'un marqueur radioactif ou, par exemple, au moyen d'un enzyme, afin que les produits de réaction ou parfois les réactifs non consommés puissent être mis en évidence et/ou dosés. Les procédés fondés sur les marqueurs radioactifs offrent certains avantages théoriques, en particulier le fait que certains modes de marquage, notamment au moyen de l'isotope 3 de l'hydrogène ou de l'isotope 14 du carbone, font que le marqueur lui-même ne gêne pas la réaction entre antigène et anticorps, mais cette technique expose à quelques inconvénients, en particulier à la nécessité de disposer de l'appareillage pour la mesure du marqueur radioactif, de protéger le personnel contre les effets nuisibles éventuels de la radioactivité et d'évacuer les déchets radioactifs ultérieurement. De nombreux marqueurs radioactifs doivent être rejetés à intervalles réguliers à cause de la décomposition radiochimique de l'isotope radioactif. De plus, il peut être difficile d'effectuer le marquage radioactif des antigènes de bas poids moléculaires, tout en conservant leur pouvoir antigénique essentiel. Les procédés suivant lesquels la réaction entre antigène et anticorps est observée au moyen d'un réactif dans lequel un enzyme sert de marqueur ont donc suscité un intérêt considérable. Ces procédés sont d'une application simple avec un appareillage relativement peu compliqué, et ne sont pas dangereux pour la santé. Néanmoins, beaucoup des systèmes proposés jusqu'ici présentent l'inconvénient qu'il est nécessaire, pour le succès de l'opération, de préparer un produit de conjugaison entre l'enzyme servant de marqueur et l'antigène à déceler. La préparation de ces produits de conjugaison n'est pas toujours facile, parce qu'il est nécessaire de conserver l'activité enzymatique de l'enzyme dans le produit de conjugaison et il est particulièrement incommode de devoir préparer un produit de conjugaison distinct pour chaque antigène particulier qu'il faut mettre en évidence. Au contraire, le procédé de l'invention permet d'utiliser un produit de conjugaison enzymatique unique avec de très nombreux antigènes. En effet, en principe, un seul produit de conjugaison de ce genre convient pour tous les antigènes.

Suivant une proposition qui a déjà été avancée (Engvall et al., « J. Immunology», 109 (1972) p. 129), les anticorps sont déterminés par réaction avec des antigènes sur un support insoluble, le produit de réaction d'antigène et d'anticorps sur le support est alors observé par réaction avec une Immunoglobuline marquée au moyen d'un enzyme, dont on sait qu'il est capable de réagir avec l'anticorps du produit de conjugaison. Suivant ce mode opératoire, la quantité d'enzyme finalement fixé au support dépend de la quantité d'anticorps dans l'échantillon examiné, parce que l'enzyme se fixe au support par une

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

3

628739

chaîne dont l'anticorps à observer constitue un chaînon distinct et essentiel.

Suivant le procédé de l'invention, pour le dosage immunologique par enzyme fixé, on met en contact, simultanément ou par stades, dans un milieu liquide: l)un antigène sur un support insoluble ou sous la forme d'un produit d'agrégation insoluble, 2) un premier anticorps, 3) un second anticorps marqué au moyen d'un enzyme, on sépare la fraction insoluble et la fraction soluble et on mesure l'activité enzymatique de l'un ou l'autre d'entre eux.

La caractéristique de l'invention est que le premier anticorps 2 se trouve aussi au contact de l'échantillon contenant l'antigène à déceler ou doser, qui peut être ou non le même que l'antigène 1, le second anticorps 3 se fixant ainsi au constituant insoluble en raison inverse de la quantité d'antigène dans l'échantillon qu'il convient d'examiner ou de doser, pour évaluer la présence ou la quantité de l'antigène dans l'échantillon.

Par premier anticorps, il convient d'entendre, aux fins de l'invention, un anticorps propre à se fixer tant à l'antigène sur le support insoluble qu'à l'antigène à déceler. Par second anticorps, il convient d'entendre un anticorps spécifique à l'égard de tous les anticorps de la classe d'immunoglobulines à laquelle appartient le premier anticorps, c'est-à-dire toutes les immunoglobulines IgG de mouton, IgG de lapin et IgM de lapin. Par exemple, si le premier anticorps est une immunoglobuline suscitée chez un animal particulier, par exemple le mouton, le second anticorps est un anticorps à l'égard des immunoglobulines de cette espèce, indépendamment de leur propre spécificité d'anticorps suscitées chez un autre animal, par exemple l'âne.

Le nouveau procédé peut être adapté aisément à la mise en évidence et au dosage de différents antigènes. Indépendamment des antigènes proprement dits, notamment les protéines du sérum et des tissus, comme l'a-fœtoprotéine, l'a-haptoglobuline et l'antigène carcino-embryonnaire, des haptènes tels que les hormones, comme la triiodothyronine, la norépinéphrine, l'hormone de stimulation thyroïdienne, l'hormone de stimulation folliculaire, l'hormone lutéini-sante, l'insuline et la thyroxine, des stéroïdes tels que le cortisol, la progestérone, l'œstrone, l'œstradiol et la testostérone, des médicaments tels que la morphine, l'amphétamine, les barbituriques, la diphénylhydantoïne, le méthotrexate et la gentamycine; des vitamines et des polluants alimentaires, tels que le pyridoxal-5-phosphate et l'aflatoxine, les herbicides, insecticides et nitroso-urées conviennent aussi. Dans chaque cas, l'antigène doit être fixé chimiquement ou, avec une préférence moins marquée, physiquement à un support approprié, par exemple comme décrit plus en détail ci-après.

Il convient de noter que la nature du second anticorps marqué au moyen d'un enzyme ne dépend nullement de la nature de l'antigène à mettre en évidence. Il suffit de susciter le premier anticorps chez un animal de la même espèce que celle procurant l'immunoglobuline utilisée pour induire la production du second anticorps chez une autre espèce. Il n'est donc pas nécessaire de disposer d'un grand nombre d'anticorps marqués au moyen d'un enzyme et les difficultés propres à la fixation d'un enzyme sur un anticorps ne doivent être résolues qu'une fois.

Tout enzyme conviendrait comme marqueur fixé sur le second anticorps. Les oxydases, comme la Peroxydase de raifort, les enzymes hydrolytiques, comme la phosphatase alcaline ou les déshydrogéna-ses comme la glucose-6-phosphate déshydrogénase, conviennent particulièrement bien. Idéalement, un enzyme utilisé comme marqueur devrait avoir les propriétés suivantes: 1) être disponible sous forme très pure à un prix modéré; 2) avoir une haute activité par unité de poids; 3) être facile à dissoudre dans l'eau et stable dans les conditions ordinaires de conservation; 4) permettre l'application d'une technique de dosage simple, rapide, sensible et peu onéreuse; 5) ne pas être contenu dans les fluides biologiques; 6) n'avoir aucun inhibiteur ou activateur qui se trouve contenu dans des fluides biologiques; 7) contenir des radicaux chimiques appropriés en vue de la conjugaison avec le second anticorps, de façon que cette conjugaison n'ait qu'un effet minimal, tant sur l'activité enzymatique, que sur l'activité de l'anticorps. La ß-galactosidase satisfait à ces critères. D'autres enzymes possibles mais moins préférés sont la glucose oxydase, l'acétylcholine estérase, la glycoamylase, le lyso-zyme et la malate déshydrogénase.

L'enzyme utilisé est de préférence fixé au second anticorps suivant le procédé de couplage décrit ci-après qui est applicable à toute combinaison d'anticorps et d'enzyme, à la condition que ce dernier comprenne un radical mercapto ou puisse être modifié de façon à en comprendre un. Toutefois, d'autres procédés de couplage sont applicables si la chose est désirée. Ceux-ci sont notamment:

a) Fixation en un stade par le glutaraldéhyde pour laquelle le glutaraldéhyde sert à unir des protéines au cours d'une réaction compliquée donnant naissance à des produits de conjugaison hétérogènes de haut poids moléculaire [voir Avrameas, S., «Immunoche-mistry», 6,43 (1969)].

b) Fixation en deux stades par le glutaraldéhyde, au cours de laquelle la Peroxydase de raifort ne réagit qu'avec une seule molécule de glutaraldéhyde. Cette réaction limite la conjugaison d'enzyme à enzyme et conduit à de meilleurs résultats que la fixation en un stade. Toutefois, ce procédé n'est probablement pas applicable à de nombreux enzymes autres que la Peroxydase de raifort, parce qu'ils réagissent ave plus d'une molécule de glutaraldéhyde [voir Avrameas, S. et Ternynck, «Immunochemistry», 8,1175 (1971)].

c) Oxydation des résidus de saccharose dans l'enzyme, puis formation d'une base de Schiff. La Peroxydase de raifort comprend un certain nombre de radicaux d'oligosaccharides et leur oxydation par un periodate en radicaux aldéhyde pouvant réagir avec des radicaux amino constitue la base de ce procédé de fixation. D'autres enzymes contenant aussi des radicaux d'oligosaccharides pourraient s'utiliser en principe aussi. Toutefois, ce mode opératoire conduit à des produits de conjugaison de haut poids moléculaire [Nakane, P.K., Kawaoki, A., «J. Histochem. Cytochem.», 22,1084 (1974)].

d) Fixation par le dimaléimide à l'aide de N,N'-o-phénylènedimaléimide, après introduction de radicaux — SH dans l'anticorps au moyen de 2-mercaptoéthylamine qui réduit les ponts — S—S — préexistants en deux radicaux — SH [Kato et al., «European J. Biochem.», 62,285 (1976)].

e) Utilisation d'autres réactifs bifonctionnels, tels que le 2,4-diisocyanatotoluène, lap,p'-difluoro-m,m'-dinitrophénylsulfone ou le l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoéthyl)-carbodiimide, mais qui donnent généralement de moins bons résultats que les moyens précités.

f) Fixation également possible au moyen d'autres réactifs hêtéro-bifonctionnels, c'est-à-dire de réactifs contenant deux radicaux fonctionnels différents par molécule, comme l'ester m-maléimidobenzyl N-hydroxysuccinimidique qui a été utilisé pour une réaction en deux stades afin de fixer l'insuline à la ß-galactosidase [T. Kitagawa et T. Aikawa, «J. Biochem.», 79,233-236 (1976)].

g) Réticulation non covalente, par exemple fixation d'anticorps à de la Peroxydase de raifort pour la formation d'un produit de conjugaison qui n'est pas covalent, mais relativement stable. Les inconvénients de ce dernier mode opératoire sont:

i) que le produit de conjugaison d'enzyme et d'anticorps peut se dissocier lentement lors de la conservation, •

ii) que les anticorps peuvent inhiber l'enzyme lorsqu'ils sont suscités,

iii) que la préparation des anticorps peut durer quelques mois et que ceux préparés par différents opérateurs peuvent avoir des propriétés différentes.

En raison de la plus grande vitesse de réaction et de la commodité de la manipulation de quantités relativement importantes d'anticorps, il est souvent avantageux que le premier anticorps et le second soient suscités chez des animaux d'assez grande taille, comme le cheval, l'âne ou le mouton, plutôt que chez de petits animaux,

comme le rat, la souris, le cobaye ou le hamster, bien que ceux-ci ne soient pas à exclure. Comme déjà indiqué, le premier anticorps et le second doivent provenir d'animaux d'espèces différentes. Il s'est révélé favorable de susciter le premier anticorps chez le mouton et le second chez l'âne, mais d'autres paires d'espèces différentes peuvent être préférées.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

628739

4

La possibilité que le second anticorps perturbe la réaction entre l'antigène et le premier anticorps diminue lorsque le second anticorps n'est pas suscité contre l'ensemble du premier anticorps, mais uniquement contre le fragment Fc de l'immunoglobuline constituant le premier anticorps.

Les seconds anticorps peuvent être préparés essentiellement de manière classique, mais le procédé préféré consiste à inoculer les animaux, puis à produire les anticorps et à administrer des doses de rappel lorsque les taux sériques d'anticorps ont franchi leur maximum. Le sang contient d'habitude les anticorps en concentration maximale peu après l'administration de la dose de rappel. Lorsqu'une concentration suffisamment élevée ou maximale en antiim-munoglobulines s'est accumulée dans le sang de l'animal, celui-ci est saigné et le sérum contenant l'antiimmunoglobuline est recueilli.

Le second anticorps est de préférence purifié par incubation de l'antisérum d'âne avec un immunoadsorbant convenable, par exemple le Sépharose, ou un autre support insoluble, qui a été activé par réaction préalable avec un réactif bifonctionnel approprié, par exemple le 1,4-bis-(2,3-époxypropoxy)butane, puis avec une solution de l'immunoglobuline (ou de son fragment Fc) utilisée pour susciter le second anticorps. L'opération donne un immunoadsorbant qui est spécifique à l'égard du second anticorps et ce dernier peut être purifié par adsorption sur l'immunoadsorbant, puis par élution, avant ou après marquage à l'aide de l'enzyme.

Pour la préparation du second anticorps marqué, il est préférable de traiter l'immunoadsorbant sur lequel le second anticorps est adsorbé à l'aide d'un réactif comme le chlorhydrate de mercaptobu-tyrimidate de méthyle, de façon à modifier les radicaux amino de l'anticorps et introduire 3 à 5 radicaux thiol dans chaque molécule d'anticorps. Le second anticorps, auquel les radicaux mercapto sont ainsi incorporés, est alors élué de l'immunoadsorbant et soumis à un traitement en vue de la fixation de l'enzyme. Il est de préférence traité au moyen de N.N'-o-phénylènebismaléimide, puis mis à réagir avec de la ß-galactosidase purifiée provenant normalement d'Escherichia coli. Le produit de conjugaison entre l'enzyme et le second anticorps est finalement purifié par Chromatographie sur un gel de diéthylami-noéthylagarose ou sur un autre adsorbant convenable, qui permet de séparer le produit de conjugaison de l'enzyme qui n'a pas réagi et du second anticorps qui n'a pas réagi.

Le premier anticorps est suscité chez un animal convenable suivant une technique connue. Lorsqu'il arrive, comme la chose est fréquente, que l'antigène à mettre en évidence ou doser est un haptène d'une structure chimique relativement simple, par exemple la triiodothyronine, l'œstradiol, la gentamycine, la phénytoïne ou la morphine, il n'est pas capable par lui-même de provoquer la formation du premier anticorps. Il est donc nécessaire de conjuguer cet antigène avec une molécule vêhiculaire pour obtenir une molécule conjuguée pouvant provoquer la formation de l'anticorps. A cette fin, il est favorable de conjuguer l'antigène avec une protéine facile à obtenir et étrangère à l'animal chez lequel le premier anticorps est suscité, par exemple de l'albumine de sérum de bœuf. La conjugaison peut être effectuée par réaction de l'albumine ou d'une autre protéine avec, par exemple, du l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodi-imide, puis par réaction du produit intermédiaire avec l'antigène, qui, pour cette réaction, doit comprendre un radical amino ou acide carboxylique. D'autres procédés de conjugaison connus sont applicables si la chose est désirée et, idéalement, les molécules d'antigène sont incorporées au nombre d'environ 3 à 30 par molécule d'albumine ou d'autre protéine de haut poids moléculaire.

Le premier anticorps peut être suscité par injection à un animal convenable, comme le mouton, du produit de conjugaison d'antigène ou de l'antigène à plusieurs reprises, pendant quelques semaines ou quelques mois jusqu'au moment où l'anticorps ayant le ppouvoir de fixation désiré a atteint un titre suffisamment élevé dans la masse sanguine. L'animal est alors saigné et l'antisérum est recueilli.

Le premier anticorps est de préférence purifié ensuite par contact avec l'antigène contre lequel il a été suscité ou avec un composé apparenté sur un support insoluble. Après l'adsorption, les anticorps peuvent être élués, par exemple avec une solution de chlorhydrate de guanidinium à pH élevé ou faible, avec des solutions à haute teneur en sel ou avec des solvants non aqueux, puis à être soumis à une dialyse contre un tampon convenable qui chasse le réactif d'élution. 5 Le support insoluble utilisé pour porter l'antigène ou le composé apparenté, tant pour la purification précitée que pour le procédé de l'invention, peut être toute substance appropriée insoluble dans l'eau, sur laquelle l'antigène ou composé apparenté peut être fixé commodément avec une énergie suffisante pour qu'il reste fixé pendant les io réactions mises enjeu pour la purification ou le dosage, suivant le cas. Il et possible d'utiliser un support qui adsorbe simplement l'antigène, comme le système décrit par Engvall et collaborateurs dans la référence précitée, mais il est préférable de fixer l'antigène chimiquement au support et, à cette fin, il est nécessaire que le 15 support comprenne des radicaux fonctionnels permettant la conduite des réactions requises. Des supports tels que le verre, le Nylon, les Polyacrylamides, la cellulose et le dextrane conviennent. Certains immunoadsorbants portant des radicaux hydroxyle peuvent être mis à réagir avec le l,4-bis-(2,3-époxypropoxy)butane et le produit 20 intermédiaire peut être mis à réagir à son tour avec l'antigène. Ce procédé s'est révélé être simple, sûr et efficace et former une liaison covalente stable à la condition que l'antigène ou composé apparenté comprenne des radicaux hydroxyle, amino ou thiol. Les critères auxquels doit satisfaire un immunoadsorbant pour la purification des 25 anticorps ne sont pas nécessairement les mêmes que ceux auxquels doit satisfaire l'immunoadsorbant utilisé pour le dosage réel.

Le procédé de l'invention est applicable de nombreuses façons différentes. La quantité du premier anticorps et, par conséquent, du marqueur fixé à l'antigène insoluble est en relation inverse de la 30 quantité d'antigène dans l'échantillon à examiner. L'activité enzymatique, tant libre que fixée sur l'antigène insoluble ou appliqué sur le support, fait l'objet de la mesure. Certains modes spécifiques d'application du nouveau procédé sont détaillés ci-après.

Suivant un premier procédé, le premier anticorps et mis à incuber 35 avec un échantillon contenant l'antigène à déterminer. Après achèvement de la réaction, l'antigène fixé sur le support est ajouté et le mélange est soumis à une nouvelle incubation. La phase solide est alors séparée de la phase liquide et lavée, puis mélangée avec un excès du second anticorps marqué à l'aide de l'enzyme. Après incubation, 40 la phase solide est à nouveau séparée et lavée. La quantité d'activité retrouvée sur la phase solide est en raison inverse de la quantité d'antigène que contient l'échantillon, tandis que l'activité enzymatique du liquide surnageant lui est directement proportionnelle. La mesure peut être effectuée sur l'une ou l'autre fraction.

45 Suivant un second procédé, le premier anticorps est mis à réagir avec le second anticorps marqué au moyen de l'enzyme pour la formation d'un complexe qui est alors ajouté en excès à l'échantillon contenant l'antigène qu'il faut déterminer et le tout est mis à incuber. Le support insoluble portant l'antigène est alors ajouté et, après 50 incubation, la phase solide et la phase liquide sont séparées. Le dosage de l'activité enzymatique dans la phase liquide donne un résultat qui est directement proportionnel à la quantité d'antigène dans l'échantillon.

Suivant un troisième procédé, le complexe formé par le premier 55 anticorps et le second, l'échantillon contenant l'antigène à déterminer et le support portant l'antigène sont mis en incubation simultanée et, après séparation de la phase solide, l'activité enzymatique de la phase liquide est déterminée. Le résultat est à nouveau directement proportionnel à la concentration en antigène de l'échantillon. 60 Comme déjà indiqué, pour un dosage quantitatif suivant le premier procédé ci-dessus et le second, la quantité de premier anticorps utilisée doit être supérieure à celle nécessaire pour la réaction avec tout l'antigène de l'échantillon et le support portant l'antigène doit être ajouté en un excès suffisant pour assurer 65 l'adsorption de tout le premier anticorps qui n'a pas réagi avec l'antigène de l'échantillon. En pratique, la façon la plus commode d'obtenir un tel résultat est d'exécuter des dosages du premier anticorps pris en concentrations successives formant une série

5

628739

arithmétique ou géométrique. Il est alors simple de trouver la concentration convenable en premier anticorps qui permet la conduite d'un dosage précis.

Les exemples suivants illustrent l'invention.

Exemple 1:

1. PRODUCTION ET MARQUAGE DU SECOND ANTICORPS

a) Préparation du fragment Fc de l'immunoglobuline de mouton ( IgG)

Le procédé appliqué pour la préparation du fragment Fc de mouton est celui de Porter (R. R. Porter, 1959, «Biochem. J.», 73, 119).

On collecte 320 ml de sérum sur 28 moutons. On met 150 ml de sérum à incuber sous agitation au bain de glace avec 30 g de diéthylaminoéthyl Séphadex A 50 humide préalablement mis à l'équilibre dans du tampon au phosphate 0,010 molaire à pH 6,5. Après 1 h, on sépare le gel par filtration à l'aide d'un filtre en verre fritté grossier et on le lave avec 50 ml de tampon au phosphate 0,010 molaire à pH 6,5. On met le mélange de filtrat et de liquide de lavage à nouveau à incuber avec 30 g de diéthylaminoéthyl - Séphadex humide qu'on sépare par filtration et qu'on lave avec 100 ml du tampon au phosphate. On mélange 300 ml de filtrat et de liquide de lavage, on ajoute lentement 150 ml d'une solution saturée de sulfate d'ammonium, tandis qu'on agite le mélange sans interruption. On recueille le précipité qu'on lave avec 100 ml d'une solution à 20% de sulfate d'ammonium. On dissout le précipité final dans 50 ml de tampon au phosphate 0,050 molaire d'un pH de 8,0, et on effectue la dialyse jusqu'au lendemain à 4°C contre 51 d'eau distillée. On lyophilise ensuite la solution.

On dissout 1,5 g de l'immunoglobuline G de mouton lyophylisée résultante dans 50 ml de tampon au chlorhydrate de tris(hydroxy-méthyl)aminométhane 0,1 molaire à pH 7,2 contenant, par litre, 10 mmol de cystéine et 2 mmol d'acide éthylènediaminetétraacétique. On prépare le tampon immédiatement avant de l'utiliser. On ajoute 0,6 ml d'une suspension de papaïne cristalline (de marque Sigma, cristallisée deux fois) dans du tampon à l'acétate 0,050 molaire d'un pH de 4,5. On met la solution à incuber à 37° C pendant 4 h en l'agitant de temps à autre. On y ajoute alors 0,222 g d'iodoacétamide, puis on verse la solution immédiatement sur une colonne de 80 cm x 5 cm de Séphadex G. 100 amenée à l'équilibre avec du tampon à l'acétate 0,010 molaire d'un pH de 5,6 à 4°C.

Le second pic élué de la colonne avec du tampon à l'acétate 0,010 molaire à pH 5,6 contient un mélange des fragments Fc et Fab. Le premier pic contient l'immunoglobuline G inchangée. On applique les fractions constituant le second pic sur une colonne de 40 x 2,5 cm decarboxyméthylcellulose (Whatman CM 32) amenée à l'équilibre avec du tampon au phosphate 0,010 molaire à pH 5,6 à 4° C. On élue un pic de la colonne au moyen d'un tampon au phosphate 0,010 molaire à pH 5,6 et on en élue quelques pics mineurs et un pic majeur au moyen d'un tampon à l'acétate en établissant un gradient de 0,010 jusqu'à 0,500 mol/1 à pH 5,6 (1000 ml dans chaque compartiment d'un mélangeur à gradient). On recueille les fractions du pic majeur et on les Chromatographie une nouvelle fois sur la colonne de carboxyméthylcellulose. On établit à cette fin un gradient d'un tampon à l'acétate de 0,010 jusqu'à 0,300 mol/1 à pH 5,6 avec 1000 ml dans un récipient mélangeur. On élue un pic unique. On recueille les fractions constitutives du pic et on les soumet à une dialyse exhaustive contre de l'eau distillée, puis on les lyophilise.

b) Préparation du second anticorps (Immunoglobuline d'âne antimouton)

On prépare une émulsion stable en mélangeant 1 partie de solution physiologique salée contenant du fragment Fc de mouton (0,75 mg/ml) et du bacille de Calmette-Guérin (1,5 mg/ml) avec 2 parties d'adjuvant Marcol 52. On effectue six injections intramusculaires de 1 ml de l'émulsion aux pattes arrière. On observe l'apparition des anticorps d'âne antimouton, l'animal paraissant prêt pour les injections de rappel après 2 mois. On injecte une émulsion formée de 2 parties d'adjuvant et de 1 partie de solution physiologique salée (fragment Fc de mouton à raison de 0,75 mg/ml) par voie intramusculaire en six endroits (0,5 ml) des pattes arrière. Le sang prélevé 10 d plus tard de même qu'au cours du mois suivant a un titre élevé en anticorps.

c) Préparation de l'immunoadsorbant pour la purification de l'immunoglobuline d'âne antimouton

On active du Sépharose 4B au moyen de 1,4-bis-(2,3-époxypropoxy)butane par incubation de volumes égaux du gel, du bisépoxyde et d'hydroxyde de sodium 0,6 molaire contenant du borohydrure de sodium à raison de 2 mg/ml, sous agitation continue à 25° C pendant 8 h, après quoi on lave le gel. On prépare de l'immunoglobuline G de mouton au départ d'une réserve de sérum normal par précipitation avec une solution à 33% de sulfate d'ammonium. On ajoute une solution de l'immunoglobuline G de mouton dans du tampon au bicarbonate de sodium 0,1 molaire à pH 10 en prenant 10 mg d'immunoglobuline G de mouton par millilitre de gel. On met le gel activé à incuber avec l'immunoglobuline G pendant 48 h et finalement on lave l'immunoadsorbant et on le traite avec de l'éthanolamine 0,1 molaire à pH 10 pendant 24 h.

d) Purification et marquage du second anticorps d'âne antimouton

On purifie de l'immunoglobuline d'âne antimouton par incubation de l'antisérum d'âne (préparé comme ci-dessus) avec l'immunoadsorbant. On incorpore des radicaux thiol à l'immunoglobuline tandis qu'elle se trouve adsorbée sur l'immunoadsorbant en utilisant du chlorhydrate de 4-mercaptobutyrimidate de méthyle afin de modifier les radicaux amino de l'immunoglobuline. On limite le degré d'incorporation à 3-5 radicaux thiol par molécule de globuline.

On lave le complexe d'immunoadsorbant et d'anticorps et on le met en suspension dans du chlorhydrate de N-éthylmorpholine 0,1 molaire à pH 7,5 à une concentration de 1 ml d'immunoadsorbant dans un volume total de 10 ml. On prépare une solution de chlorhydrate de 4-mercaptobutyrimidate de méthyle dans du carbonate de sodium 0,2 molaire (à 10 mg/ml) immédiatement avant l'utilisation. On ajoute cette dernière solution à la suspension dans un rapport de 0,1 ml pour 10 ml. On agite la suspension pendant 30 min à la température ambiante, puis on la lave avec du chlorhydrate de N-éthylmorpholine 0,1 molaire à pH 7,5 contenant, pour 10 ml de tampon, 1 mg de dithiothréitol. On lave le gel alors soigneusement avec de l'acide chlorhydrique contenant du chlorure de sodium 0,1 molaire jusqu'à pH 3,5.

On élue l'immunoglobuline contenant les radicaux thiol incorporés ainsi préparée alors avec de l'acide chlorhydrique contenant du chlorure de sodium 0,1 molaire à pH 2,5. Le mode opératoire le plus favorable est d'introduire l'immunoadsorbant dans une petite colonne et de recueillir l'effluent dans des tubes contenant du tampon. Du fait que le stade suivant des opérations est exécuté dans du tampon à l'acétate 0,1 molaire à pH 5,0, on recueille l'effluent dans une quantité suffisante de tampon à l'acétate 0,1 molaire à pH 6,0 pour que le pH final soit de 5,0.

On refroidit au bain de glace 2 ml du tampon à l'acétate 0,1 molaire à pH 5,0 contenant 2,5 mg de l'immunoglobuline modifiée par les radicaux thiol. On ajoute cette solution alors lentement et goutte à goutte à 1 ml d'une solution saturée de N,N'-o-phénylènebismaléimide dans du tampon à l'acétate 0,1 molaire à pH 5,0 conservé au bain de glace. On met le mélange alors à incuber à 30° C pendant 20 min. On sépare l'immunoglobuline de l'excès de N, N'-o-phénylènebismaléimide par passage de la solution dans une colonne de 20 cm x 1,5 cm de Sephadex G. 25 à l'équilibre à la température ambiante avec du tampon au phosphate 0,010 molaire contenant du chlorure de magnésium 0,01 molaire à pH 6,0.

On dissout 5,0 mg de ß-galactosidase d'Escherichia coli précipitée par le sulfate d'ammonium dans la solution d'immunoglobuline activée purifiée et on met le mélange à incuber à 30° C pendant 4 h. On ajoute suffisamment d'hydroxyde de sodium 1 molaire pour amener le pH du mélange de réaction à 7,5 et suffisamment de 2-mercaptoéthanol 2 molaire pour amener à la concentration finale à 0,010 mol/1.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

628739

6

On applique la solution de produit de conjugaison d'immunoglobuline et d'enzyme sur une colonne de 60 cm x 0,9 cm de diéthyl-aminoéthylagarose (Biogel) à l'équilibre à 4°C avec du tampon au chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0,010 molaire à pH 7,5 contenant, par litre, 10 mmol de 2-mercaptoéthanol, 10 mmol de chlorure de magnésium et 50 mmol de chlorure de sodium. On lave la solution sur la colonne avec le tampon de mise à l'équilibre. On établit un gradient de 0,050jusqu'à 0,200 mol/1 de chlorure de sodium dans le même tampon avec 250 ml dans les récipients de mélange. L'immunoglobuline non conjuguée avec l'enzyme n'est pas adsorbée sur la colonne et s'élue avant le passage du gradient. Lors du passage du gradient, l'immunoglobuline marquée par l'enzyme est éluée avant l'enzyme libre. On lyophilise la fraction éluée contenant l'immunoglobuline marquée, de manière à obtenir le second anticorps marqué au moyen de l'enzyme qu'il faut utiliser suivant l'invention.

2. PRÉPARATION DU PREMIER ANTICORPS.

a) Préparation du produit de conjugaison de triiodothyronine (T3)

On dissout 250 mg d'albumine de sérum de bœuf dans 25 ml d'eau distillée et on dissout 1000 mg de l-éthyl-3-(3-diméthylamino-propyl)carbodiimide dans 50 ml d'eau distillée. On refroidit les deux solutions à 4° C et on mélange lentement les deux tiers de la solution de l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide à la solution d'albumine de sérum de bœuf. On dissout 150 mg de triiodothyronine purifiée dans 25 ml d'un mélange 25:1 en volume d'éthanol et d'hydroxyde d'ammonium 2 molaire, puis on refroidit la solution à 4° C et on l'ajoute goutte à goutte au mélange, sous agitation ininterrompue, en maintenant le pH à 7,0 par addition goutte à goutte d'acide chlorhydrique 0,25 molaire. On agite le mélange de réaction pendant encore 10 min, puis on ajoute le reste de la solution de l-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide goutte à goutte en maintenant le pH à 7,0.

On agite le mélange jusqu'au lendemain à 4°C. On centrifuge la solution au cours de la matinée et on dialyse le liquide surnageant contre 3 aliquotes de solution 0,1 molaire de carbonate de sodium et de bicarbonate de sodium à pH 11,0, puis contre de l'eau distillée. On lyophilise finalement la préparation. On peut observer que le degré d'incorporation de la triiodothyronine dans l'albumine de sérum de bœuf est de 4,3 mol du composé par mole d'albumine.

b) Préparation du premier anticorps (anticorps de triiodothyronine)

On prépare une émulsion stable en mélangeant 1 partie de solution physiologique salée contenant 0,5% de Tween 80, du complexe de triiodothyronine et d'albumine de sérum de bœuf en quantité de 2 mg/ml et du bacille de Calmette-Guérin en quantité de 1 mg/ml avec 2 parties d'adjuvant Marcol S2. On injecte six doses de 1 ml de l'émulsion par voie sous-cutanée dans le dos et quatre doses de 0,75 ml par voie intramusculaire dans les pattes. On observe le titre en anticorps et on administre les injections de rappel aux animaux après 36 semaines. Pour le rappel, on réalise 6 injections de 0,5 ml par voie intramusculaire dans les pattes. L'émulsion est formée de 2 parties d'adjuvant pour 1 partie de solution physiologique salée contenant du produit de conjugaison de triiodothyronine et d'albumine de sérum de bœuf en quantité de 2 mg/ml. Le sang prélevé 10 d après le rappel et pendant les deux mois suivants a un titre élevé en anticorps contre la triiodothyronine.

c) Préparation d'un immunoadsorbant pour la purification du premier anticorps.

On active du Sepharose 4B au moyen de l,4-bis-(2,3-époxy-propoxy)butane comme déjà indiqué. On ajoute 4 ml du Sepharose activé à 20 ml de tampon au phosphate 0,025 molaire d'un pH de 12,0 contenant 50 mg de triiodothyronine. On ajoute le tampon pendant 45 h à la température ambiante. On lave alors le gel avec 250 ml de tampon au phosphate 0,025 molaire d'un pH de 12,0 avec 150 ml de solution de chlorure de sodium 0,1 molaire et avec 100 ml d'eau. La quantité de triiodothyronine incorporée par millilitre de gel gonflé est de 9 mg. On bloque les radicaux oxiranne éventuellement restants en mettant le gel en suspension dans quatre fois son propre volume d'éthanolamine aqueuse 1 molaire à pH 11 et en agitant la suspension pendant 4 h. On lave alors le gel soigneusement à l'eau distillée pour éliminer l'éthanolamine en excès.

d) Purification du premier anticorps.

On mélange 20 ml du sérum antitriiodothyronine préparé comme décrit ci-dessus pendant 1 h à la température ambiante avec 1 ml de Sepharose portant de la triiodothyronine. On chasse les protéines non spécifiquement adsorbées de l'immunoadsorbant par un lavage soigneux avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (d'un pH de 7,0) 0,050 molaire contenant du chlorure de sodium 0,2 molaire. On tasse le gel dans une seringue comme décrit précédemment et on le lave avec de l'acide chlorhydrique à pH 3 pour éliminer le tampon au phosphate. On élimine les anticorps de triiodothyronine par lavage avec 4 ml de chlorhydrate de guanidi-nium 6 molaire d'un pH de 2 et on les recueille dans 1 ml de tampon à la barbitone 0,050 molaire d'un pH de 8,6 contenant 0,1% d'albumine de sérum de bœuf. On soumet les anticorps de triiodothyronine à une dialyse poussée contre ce tampon pour séparer le chlorhydrate de guanidinium.

3. PRODUCTION DE L'ANTIGÈNE Tz SUR SUPPORT À UTILISER POUR LE DOSAGE

Le mode opératoire est tel que décrit à propos de la production de l'immunoadsorbant pour la purification de premier anticorps (2c ci-dessus), la différence étant que la concentration en triiodothyronine est plus faible. Il en résulte une baisse de la concentration en triiodothyronine fixée par substitution sur le gel.

Le dosage de la triiodothyronine au moyen des réactifs dont la préparation est décrite ci-dessus s'effectue comme déjà indiqué.

Ce réactif universel peut être utilisé dans différentes analyses pour le dosage des antigènes. Il convient de citer:

Analyse la

On met à incuber le premier anticorps et l'antigène libre, puis on ajoute l'immunoadsorbant et, après lavage, on ajoute le marqueur.

Analyse lb

On met à incuber simultanément le premier anticorps, l'antigène libre et l'immunoadsorbant. On ajoute le marqueur à l'immunoadsorbant lavé.

Analyse 2a

On met à incuber le premier anticorps, l'antigène libre et le marqueur. Après un délai convenable, on ajoute l'immunoadsorbant.

On peut modifier l'analyse 2a en mettant le premier anticorps à incuber avec l'enzyme de marquage avant d'ajouter l'antigène libre (analyse 2b).

Analyse 3

On ajoute simultanément au premier anticorps le marqueur, l'antigène libre et l'immunoadsorbant. On peut modifier quelque peu les opérations en formant au préalable le complexe du marqueur et du premier anticorps.

Les exemples ci-après décrivent les résultats de dosages effectués à l'aide du réactif universel suivant les techniques d'analyse ci-dessus.

Dosage immunologique par enzyme fixé de la triiodothyronine à l'aide du réactif universel.

On effectue de différentes manières le dosage de la triiodothyronine.

Exemple 2:

Analyse la

On mélange de l'antisérum de triiodothyronine (de mouton à la dilution de 1:2000 dans 0,1 ml de tampon à la barbitone 0,050 molaire d'un pH de 8,6 contenant 0,1 % en poids/volume d'albumine de sérum de bœuf avec des étalons de triiodothyronine

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

628739

préparés dans 0,1 ml de tampon à la barbitone et on maintient les mélanges à 4° C pendant 24 h. On ajoute 0,1 ml de tampon à la barbitone contenant 0,3% en poids/volume de Tween 80 et 50 (ig d'immunoadsorbant portant de la triiodothyronine, on mélange le tout et on conserve le nouveau mélange à 4° C pendant 1 h, puis on le lave deux fois avec de la solution salée tamponnée à la barbitone à 5% poids/volume de chlorure de sodium et une fois avec du tampon à la barbitone. On mélange de l'enzyme de marquage, à savoir 100 [il de complexe de galatosidase et d'immunoglobuline d'âne anti-immunoglobuline G de mouton, à l'immunoadsorbant lavé, on conserve le mélange à 4° C pendant 24 h, on lave comme décrit précédemment et on détermine de la façon habituelle l'activité

Résultats des essais.

Concentration en

Différence

Pourcentage triiodothyronine de densité optique de liaison au zéro*

(nmol/1)

(2 h)

0

0,29

100

1

0,17

50

4

0,16

47

32

0,135

35

Liaison non spécifique de l'enzyme de marquage sur l'immunoadsorbant: 0,05

* Liaison calculée après soustraction de la liaison non spécifique.

On effectue un dosage semblable en prenant comme marqueur de la galatosidase conjuguée avec l'immunoglobuline d'âne anti-Fc de mouton. On opère comme ci-dessus, la différence étant: 1) qu'on conserve les antisérums et les étalons en contact pendant 8 h, et 2) que la dilution des antisérums est de 1:1600.

Concentration en

Différence

Pourcentage triiodothyronine de densité optique de liaison au zéro*

(nmol/1) (ng ml)

(2 h)

0 0

0,43

100

0,42 0,25

0,35

81

1,56 1,0

0,28

65

6,25 4,0

0,16

37

25 16

0,15

35

Liaison non spécifique = 0,025.

* Liaison calculée après soustraction de la liaison non spécifique.

Exemple 3:

Analyse 2a

On mélange 0,1 ml d'antisérum de triiodothyronine purifiée (de mouton à la dilution de 1:1500) et des étalons de 0,1 ml de triiodothyronine dans du tampon à la barbitone 0,050 molaire d'un pH de 8,6 contenant 0,1 % poids/volume d'albumine de sérum de bœuf avec 25 [il du marqueur, qui est l'enzyme fixé sur de l'immunoglobuline d'âne anti-immunoglobuline G de mouton et on conserve les mélanges à 4° C pendant 24 h. On ajoute sous agitation 0,1 ml de tampon à la barbitone contenant 0,3% poids/volume de Tween 80 et contenant 50 |xg d'immunoadsorbant portant de la triiodothyronine et on conserve le mélange à 4° C pendant 1 h. On lave l'immunoadsorbant et on dose l'activité enzymatique fixée, en opérant comme décrit dans l'exemple 2.

( Tableau en tête de la colonne suivante)

Exemple 4:

Analyse 2b

On mélange de l'anticorps de triiodothyronine purifié à la dilution de 1:1500 dans 8,5 ml de tampon à la barbitone

Résultats

Concentration en

Différence

Pourcentage triiodothyronine de densité optique de liaison au zéro*

(nmol/1)

(lh)

0

0,47

100

0,5

0,42

90

1

0,35

70

2

0,24

45

4

0,21

38

8

0,20

36

16

0,18

33

32

0,17

31

64

0,14

22

LNS

0,05

* Calculé après soustraction de la liaison non spécifique.

0,050 molaire d'un pH de 8,6 contenant 0,1 % poids/volume d'albumine de sérum de bœuf avec 5,1 ml de l'enzyme de marquage, à savoir le produit de conjugaison de galactosidase et d'immunoglobuline d'âne anti-immunoglobuline G de mouton et on conserve le mélange à 4° C jusqu'au moment de l'utiliser.

On mélange des étalons de 50 [il de triiodothyronine dans du tampon à la barbitone à 200 (il du complexe formé par le marqueur et le premier anticorps et 0,5 ml de tampon à la barbitone, puis on conserve les mélanges à 4° C pendant 4 h. On ajoute au contenu des tubes 50 |Ag d'immunoadsorbant portant de la triiodothyronine dans du tampon à la barbitone contenant 0,4% de Tween 80 et on met les mélanges à incuber à 4° C pendant 1 h. On lave l'immunoadsorbant tour à tour avec du tampon à la barbitone contenant 5% puis 1 % de chlorure de sodium. On détermine de la manière habituelle l'activité enzymatique fixée sur l'immunoadsorbant.

Résultats

Concentration en

Différence

Pourcentage triiodothyronine de densité optique de liaison au zéro*

(nmol/1)

(lh)

0

0,44

100

0,125

0,40

83

0,25

0,36

69

0,5

0,37

74

1

0,29

46

2

0,24

27

4

0,20

15

8

0,19

12

LNS

0,16

* Calculé après soustraction de la liaison non spécifique.

On répète l'expérience avec un marqueur formé d'un enzyme fixé sur de l'immunoglobuline d'âne anti-Fc de mouton. Les résultats sont semblables à ceux obtenus ci-dessus.

Exemple 5:

Analyse 3

On mélange des étalons de 100 (il de triiodothyronine dans du tampon à la barbitone avec 200 (il du complexe formé par le marqueur et le premier anticorps et avec 25 (ig d'immunoadsorbant portant de la triiodothyronine dans 100 jjl1 de tampon à la barbitone contenant 0,4% poids/volume de Tween 80, puis on met les mélanges à incuber à 4°C pendant 2 h. On lave l'immunoadsorbant et on dose comme dans l'exemple 4 l'enzyme fixé.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

628739

Résultats

Concentration en

Différence

Pourcentage triiodothyronine de densité optique de liaison au zéro*

(nmol/1)

(lh)

0

0,33

100

0,5

0,32

94

1

0,29

83

2

0,28

77

4

0,24

60

8

0,21

42

16

0,18

32

LNS = 0,114

0,18

32

* Calculé après soustraction de la liaison non spécifique.

Exemple 6:

Analyse 2b

On répète les opérations de l'exemple 4, mais au moyen d'étalons préparés dans du plasma épuré. On détruit la globuline thyroïdienne par chauffage des échantillons de plasma au bain-marie à 70° C pendant î h. Les résultats obtenus sont très semblables à ceux atteints dans l'exemple 4.

Exemple 7:

Dosage immunologique par enzyme fixé de l'hormone de croissance humaine au moyen du réactif universel

Analyse la

On mélange 0,1 ml d'antisérum d'hormone de croissance humaine (de lapin à la dilution de 1:20000) dans un tampon à la barbitone 0,050 molaire d'un pH de 8,6 contenant du chlorure de sodium 0,65 molaire et 0,5% poids/volume d'albumine de sérum de bœuf avec des étalons d'hormone de croissance humaine en solution dans 0,1 ml de tampon à la barbitone et on conserve les mélanges à 4° C pendant 24 h. On ajoute alors 10 fig d'immunoadsorbant contenant de l'hormone de croissance humaine dans 0,1 ml de tampon à la barbitone, on mélange les constituants et on conserve le mélange à 4° C pendant 1 h, puis on lave l'immunoadsorbant une fois avec 2 ml de tampon à la barbitone 0,050 molaire d'un pH de 8,6 contenant 5% de chlorure de sodium et une fois avec le tampon contenant 1 % de chlorure de sodium. On mélange à l'immunoadsorbant lavé 50 [xl d'enzyme de marquage, à savoir de ß-galactosidase fixée sur de l'immunoglobuline d'âne anti-Fc de lapin et on conserve le mélange à la température ambiante pendant 24 h, puis on effectue le lavage comme précédemment et on dose de la manière habituelle l'activité enzymatique fixée sur l'adsorbant.

( Tableau en tête de la colonne suivante)

Exemple 8:

Dosage immunologique par enzymefixé de l'insuline au moyen du réactif universel

Analyse la

On mélange 0,1 ml d'antisérum d'insuline (de cobaye à la dilution de 1:10000 ou 1:40000) dans 0,1 ml de tampon au phosphate 0,040 molaire d'un pH de 7,4 contenant 0,5% poids/volume d'albumine de sérum de bœuf avec des étalons d'insuline de bœuf dans 0,1 ml de tampon au phosphate et on conserve les mélanges à 4°C pendant 24 h. On ajoute alors 25 (ig d'immunoadsorbant portant de l'insuline dans 0,1 ml de tampon au phosphate, on mélange le tout et on conserve les tubes à 4° C pendant 30 min. On lave l'immunoadsorbant ensuite avec 2 ml de tampon au phosphate contenant 5%, puis 1 % de chlorure de sodium. On ajoute au contenu des tubes 50 (il de l'enzyme de marquage, à savoir du produit de conjugaison de galactosidase et d'immunoglobuline d'âne anti-immunoglobuline G de cobaye et on mélange le contenu des tubes qu'on conserve à la

Résultats

Concentration en

Différence

Pourcentage hormone de densité optique de liaison au zéro*

de croissance

(lh)

humaine

(ng/ml)

0

0,64

100

0,39

0,61

95

0,78

0,60

93

1,56

0,51

75

3,125

0,43

63

6,25

0,38

53

12,5

0,31

41

25

0,26

33

50

0,22

24

100

0,18

18

Liaison non spécifique de marqueur sur l'immunoadsorbant = 0,08.

* Calculé après soustraction de la liaison non spécifique.

température ambiante pendant 24 h. On lave l'immunoadsorbant comme décrit précédemment et on dose de la manière habituelle l'activité de la galactosidase fixée à l'immunoadsorbant.

Résultats

Concentration

Différence

Pourcentage d'insuline de densité optique de liaison au zéro

(ng/ml)

(90 min)

Dilution d'antisérum

1: 10000

0

0,62

100

0,96

0,50

83

4,8

0,34

55

24

0,26

42

Dilution d'antisérum

1; 40000

0

0,36

100

0,96

0,18

50

4,8

0,17

47

24

0,16

44

La liaison non spécifique est de 0,05 pour l'enzyme de marquage sur l'immunoadsorbant.

Exemple 9:

Dosage immunologique par enzyme fixé du Cortisol au moyen du réactif universel

Analyse la

On mélange de l'antisérum de cortisol (de mouton à la dilution. 1:20000) dans 0,1 ml de tampon au phosphate 0,1 molaire d'un pH de 7,4 contenant 0,1% poids/volume de gélatine, 0,83% poids/ volume de chlorure de sodium et 0,1% de thiomersal avec des étalons de cortisol préparés dans 0,1 ml de tampon au phosphate et on conserve les mélanges à 4° C pendant 24 h. On ajoute alors 25 jj.g d'immunoadsorbant portant du cortisol dans 0,1 ml de tampon au phosphate contenant 0,3% poids/volume de Tween 80, puis on agite les mélanges et on les conserve à 4° C pendant 1 h, après quoi on lave l'immunoadsorbant une fois avec de la solution salée à 3% poids/ volume contenant du tampon au phosphate et une fois avec du tampon au phosphate. On ajoute 25 fil d'enzyme de marquage, à savoir de produit de conjugaison de galactosidase et d'immunoglobuline d'âne anti-immunoglobuline G de mouton, contenant

8

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

628739

0,5% poids/volume de Tween 80 à l'immunoadsorbant lavé, on agite les mélanges et on les conserve à 4° C pendant 24 h, puis on lave l'immunoadsorbant comme ci-dessus et on dose de la manière habituelle l'activité enzymatique fixée sur la phase solide.

Résultats

Concentration en

Différence

Pourcentage cortisol de densité optique de liaison au zéro*

(ng/ml)

(lh)

0

0,33

100

125

0,29

87

250

0,26

74

500

0,21

59

1000

0,18

47

2000

0,15

37

4000

0,11

24

8000

0,11

24

La liaison non spécifique de l'enzyme avec l'immunoadsorbant est de 0,04.

* Calculé après soustraction de la liaison non spécifique.

Il est intéressant de constituer des trousses de matériel permettant 25 d'appliquer le procédé de l'invention pour des antigènes particuliers, une telle trousse comprenant un support insoluble sur lequel est fixé un antigène, qui peut être ou non le même que celui qu'il faut déceler ou doser, un premier anticorps convenable et un second anticorps marqué au moyen d'un enzyme convenable, outre des moyens pour doser l'activité enzymatique suivant les besoins pour la conduite des opérations et, de préférence, pour l'étalonnage, une solution contenant une quantité connue de l'antigène pour la mise en évidence ou le dosage duquel la trousse de matériel est prévue.

Il peut être intéressant que la phase solide soit fixée à un bâtonnet qui peut être introduit dans les autres constituants du mélange à essayer et en être retiré. Cela faciliterait le lavage de la phase solide et augmenterait la précision du dosage.

Par exemple, une trousse pour le dosage de la triiodothyronine comprendrait les constituants suivants:

1. un support insoluble, soit à l'état de suspension dans un tampon, par exemple à la barbitone, soit à l'état lyophilisé et portant l'antigène de triiodothyronine fixé,

2. le premier anticorps, qui est un anticorps antitriiodothyronine suscité chez le mouton, ainsi que le second anticorps (immunoglobu-line d'âne anti-Fc de mouton), le second anticorps étant marqué au moyen de ß-galactosidase, ce second constituant étant de préférence présenté sous forme lyophilisée,

3. un substrat, comme du nitrophénylgalactoside, en une concentration finale d'environ 10~3 mol/1 dans un tampon, par exemple à la barbitone, ayant de préférence un pH de 7 à 9 et une molarité de 0,010 à 0,200, ce constituant étant de préférence présenté à l'état lyophilisé,

4. une solution contenant une quantité connue d'antigène de triiodothyronine (par exemple 10 nmol/1), ce constituant étant de préférence présenté sous forme lyophilisée.

Claims (12)

628739

1. Procédé de dosage immunologique par enzyme fixé, suivant lequel on met en contact dans un milieu liquide, simultanément ou par stades: 1) un antigène, consistant en un immunogène ou un haptène, sur un support insoluble ou sous la forme d'un agrégat insoluble, 2) un premier anticorps propre à se fixer à l'antigène insolubilisé, et 3) un second anticorps, spécifique à l'égard de la classe d'immunoglobulines à laquelle appartient le premier anticorps, marqué au moyen d'un enzyme, on sépare le constituant soluble et le constituant insoluble et on détermine l'activité enzymatique soit dans le constituant soluble, soit dans le constituant insoluble, caractérisé en ce que le premier anticorps (2) est également mis en contact avec un échantillon contenant l'antigène à mettre en évidence ou doser, qui peut être ou non différent de l'antigène (1), le second anticorps (3) se fixant ainsi au constituant insoluble en raison inverse de la quantité d'antigène dans l'échantillon où il doit être décelé ou dosé, ce qui permet de déterminer la présence ou la quantité de l'antigène dans l'échantillon.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le premier anticorps (2) est mis à réagir avec l'antigène (1) et l'échantillon, la phase solide est séparée de la phase liquide et l'ensemble du premier anticorps fixé à la phase solide séparée est ensuite mis à réagir avec le second anticorps (3) dans un second milieu liquide exempt du premier anticorps (2) et de l'échantillon, après quoi la phase solide est séparée du second milieu liquide avant la mise en évidence ou la mesure de l'activité enzymatique de la phase solide.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le second anticorps (3) est mis à réagir avec le premier anticorps (2)

pour la formation d'un complexe de ces deux anticorps, lequel complexe est alors mis à réagir avec l'antigène (1) et l'échantillon.

4. Procédé suivant l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le premier anticorps ou le complexe est mis à réagir avec l'échantillon, puis avec l'antigène (1).

5. Procédé suivant l'une des revendications 2 ou 3, caractérisé en ce que le premier anticorps ou le complexe est mis à réagir avec l'antigène (1) et avec l'échantillon simultanément.

6. Procédé suivant l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la quantité du premier anticorps est plus que suffisante pour la réaction avec tout l'antigène contenu dans l'échantillon, mais pas plus que suffisante pour la réaction avec tout l'antigène de l'échantillon augmenté d'antigène (1).

7. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'antigène (1) est le même que l'antigène de l'échantillon et est porté par le support insoluble.

8. Procédé suivant l'une des revendications 3 à 7, caractérisé en ce que l'activité enzymatique est mesurée dans la phase liquide séparée pour la détermination de la présence ou de la quantité de l'antigène dans l'échantillon.

9. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, le premier anticorps (2) étant une Immunoglobuline suscitée chez une espèce animale, par exemple le mouton, le second anticorps (2) est un anticorps à l'égard des immunoglobulines de cette espèce, suscité chez une autre espèce animale, par exemple l'âne.

10. Procédé suivant l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que le second anticorps (3) est marqué au moyen d'une oxydase, d'un enzyme hydrolytique ou d'une déshydrogénase,

comme la Peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la glucose-6-phosphate déshydrogénase et la 3-galactosidase.

11. Moyen pour la mise en œuvre du procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend: un support insoluble (1) auquel est fixé un antigène, qui peut être ou non différent de celui pour la mise en évidence ou le dosage duquel ledit moyen est prévu, ou ledit antigène (1) sous la forme dudit agrégat insoluble, un premier anticorps (2), un second anticorps marqué au moyen d'un enzyme (3) et des moyens pour déterminer l'activité enzymatique.

12. Moyen selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend une solution contenant une quantité connue de l'antigène à doser.