CS208739B2 - Method of immunological determination of the antidotes by means of the bonded enzyme - Google Patents

Description

Vmniez se týká způsobu imirnoOogického stanovení protilátek pomooí vázaného enzymu a prostředku k provádění tohoto způsobu. Pod pojmem rnitigen se v tomto sm*Slu rozumějí nejenom látky,'které jsou schopné vyvolat tvorbu protilátek u savců, tj. imiunogeny, nýbrž také látky obvykle nazývané hapteny, které po navázání . na dalSÍ molekulu jsou schopné vyvolat tvorbu protilátek a s těmito specifickými protilátkami reagovat.

Je velmi dCůežité, aby bylo možno stanovit a měěit mnžství vznikej dících antigenů. Obvykle jde o koi^p^pť^eaní látky, Často s neznámou chemickou strukturou, přičemž se tyto látky v biologických i jiných maaeeiálech ve velmi nízkých koncentracích, takže není možné použít běžné analytické metody. V důsledku toho vznikaly v několika posledních letech způsoby zjišťování těchto látek, které byly založeny na reakci mezi antigenem a protilátkou a v nichž byla jedna z reakčních složek značena radioaktivním atomem nebo enzymem, takže produkty této ¹ reakce, nebo v některých případech nespotřebované činidlo bylo možno zjistit a/nebo i kvalitativně stanovit. Metody, založené na ponižtí radioaktivně značených látek, maaí některé teoretické výhody, jde zejména o to, že tyto ' látky, zvláště v případě pouužtí tricia nebo ¹⁴C, oeioterferují tyto ^látky s vlastoí rea^kcí . mezi antogenem a ^0^1^^^ na druhé straně maaí tyto metody nevýhody, které spočívají v poddtatě použitých metod, zejména v tom, že je zapotřebí pouS^t zcela zvláštních přístrojů k-měření radioaktivně značených látek a mimoto je zapotřebí chránit personál laboratoře před.možnými nepříznivými účinky radioaktivity. Mimoto je nutno odstranit bezpečným způsobem použitý radioaktivní maatriál. Navíc je nutno některé radioaktivně .značené látky odstraňovat ' v pravidelných intervalech, vzhledem k radiochemickému rozkladu radioaktivního izotopu.. .Mimoto může být velmi obtížné značit tímto způsobem antigeny s nízkou molektu.ární hmootossí při zachování jejich základních ahtigenních vlastností. Ve středu zájmu jsou z tohoto důvodu způsoby; jíMž je možno sledovat reakci mez ji antigenem a protilátkou při pouužtí činidla, v němž já značenou složkou enzym. Tyto metody je možno provádět jednoduchým způsobem při použití poměrně jednoduchého zařízení a mimoto nejsou tyto metody spojeny s žádným nebezpečím vzhledem ke zdravotnímu stavu personálu. Řada navrhovaných metod však měla tu nevýhodu, že je předem nutno připravit konjugát užitého enzymu a antigenu, který má být stanoven. Příprava těchto konjugátů není vždy snadná, protože je nutno zachovat enzymatickou účinnost užitého enzymu v konjugátu, takže je zvládtě nevýhodné připravit oddělený konjugát pro každý jednotlivý antigen, který má být zjištěn.

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob, při němž by bylo možno užít vždy stejného konjugátu s obsahem enzymu pro širokou škálu antigenů.

V dříve známých publikacích, například Engvall a další, J. Immunology 109, 1972 str. 129, bylo navrhováno stanovit protilátky reakcí s antigenem na nerozpustném nosiči s následnou reakcí konjugátu antigenu a protilátky s enzymaticky značeným antiimunoglobulinem, o němž je známo, Že reaguje s protilátkou konjugátu. Při provádění tohoto způsobu závisí množství enzymu, který je navázán na nosič na konci reakce, na množství protilátky ve zkoumaném vzorku, protože enzym se váže na nosič způsobem, jehož základním článkem je protilátka.

Předmětem vynálezu je způsob imunologického stanovení protilátek pomocí vázaného enzymu, při němž se uvede ve styk antigen na nerozpustném materiálu nebo ve formě nerozpustného agregátu, první protilátka a enzymaticky značená druhá protilátka, načež se nerozpustný a rozpustný materiál od sebe oddělí a stanoví se enzymatická účinnost, vyznačující se tím, že se první protilátka uvede do styku se vzorkem, který obsahuje stanovovaný antigen, a druhá protilátka se naváže na nerozpustný materiál v nepřímé závislosti vzhledem к množství antigenu ve zkoumaném vzorku.

Podstatou vynálezu je, že se první protilátka rovněž uvede ve styk se vzorkem, který obsahuje antigen, jenž má být stanoven, přičemž tento antigen může být totožný s prvním rozpustným antigenem nebo se může od tohoto antigenu lišit, přičemž druhá protilátka se váže na nerozpustný materiál v poměru obráceném vzhledem к množství antigenu ve zkoumaném vzorku. Pod pojmem první protilátka se rozumí protilátka, která je schopna vázat i antigen navázaný na nerozpustný nosič, i antigen, který má být stanoven. Pod pojmem druhá protilátka se rozumí protilátka, která je specifická proti všem protilátkám imunoglobulinové třídy, к níž náleží první protilátka, například protilátka proti veškerým ovčím imunoglobulinům, králičím imunoglobulinům nebo králičímu antigenu IgM. Například v případě, Že první protilátkou je imunoglobulin určitého živočišného druhu, například ovce, tak druhá protilátka je protilátkou proti imunoglobulinům tohoto druhu bez ohledu na specifičnost vlastních protilátek, které mohou vzniknout u některých zvířat, například u osla.

Nový způsob podle vynálezu je možno snadno upravit pro zjištění a stanovení široké škály antigenu. Kromě běžných antigenů, které se vyskytují v séru a ve tkáňových bílkovinách, jako jsou například «^-foetoprotein, ^-haptoglobulin a karcinoembryonické antigeny, je možno zjišlovat také hapteny, například hormony, jako trijodothyronin, norepinefrin, tryreostimulační hormon, folikulostimulační hormon, luteinizačni hormon, inzulín a thyroxin, steroidy, například kortisol, progesteron, esterón, estradiol a testosteron, léčiva, například morfin, amfetamin, barbituráty, difenylbydantoin, methotrexát a gentamycin, vitamíny a složky potravy, například pyridoxal-5-fosfát a aflatoxin, herbicidy, insekticidy a nitrozomočoviny. Nerozpustný antigen je s výhodu týž jako antigen vzorku a je uložen na nerozpustném nosiči, například na agarozovém gelu s příčnými můstky, aktivovaném 1,4-bis-(2,3-epoxypropoxy ) butanem. V každém případě je vázán antigen chemicky nebo alespoň fyzikálně na nosič, jak bude dále popsáno.

Je zřejmé, že povaha enzymaticky značené druhé protilátky nijak nezávisí na antigenu, který má být stanoven. Je pouze nutné vyvolat tvorbu první protilátky u zvířete téhož živočišného druhu, к němuž náleží imunoglobulin, použitý к vyvolání tvorby druhé protilátky u jiného druhu. Z tohoto důvodu není zapotřebí získat ' širokou škálu protilátek, značených enzymem^a nesnáze, které spočívají ve vazbě enzymů na protilátky, je nutno vyřešit pouze jednou.

Ke značení druhé protilátky je možno užít jakýkoli enzym. Může jít například o oxidázy jako je peroxidáza z křenu, .· hydrolytické enzymy, například alkalickou fosfatázu nebo dehydrogenázu, například dehydrogenázu glukózo-6~fosfátu. Ideální enzym pro použití k tomuto účelu má mít· následnicí vlastnosti:

1. Enzym má být poměrně levný při vysoké čistotě.

2. Enzym má mít vysokou účinnost na jednotku hmootosti.

3. Užitý enzym má být snadno rozpustný ve vodě a stálý při běžném způsobu skladování.

4. Enzym má být po^ilelný při provádění zkoušek, které jsou jednoduché, rychle, citlivé a levné.

5. Enzym má být prostý dalších biologických kapalin.

6. Biologické kapaliny nemej obsahovat žádné inhibitory nebo aktivátory pro substrát.

7. Enzym má obsahovat vhodné chemické skupiny pro vazbu na druhou protilátku, což umožňuje pouze minimální efekt konjugace na aktivitu·enzymu a protilátky.

Ze známých enzymů splňuje tyto požadavky napříkla β-galaktozidáza, ICLší vhodné, avšak méně výhodné enzymy jsou například glukozooxidáza, glukoamy-áza αcetylchslioetterázy, lysozym, glukozo-6-fssfátleLylrsgeoáza a ooaátlehydrsgenázc·

Užitý enzym se s výhodou váže na druhou protilátku dále uvedeným způsobem, který je použitelný pro jakoukoli kombinaci protilátko enzymu za předpokladu, že enzym obsahuje merkaptotkupiou, nebo je možno jej poziměnt tak, aby tuto skupinu obsahová. Je však rovněž možno užít dalších způsobů vazby. Jde například o následující způsoby:

a) Vazba glutsroddelydu v jediném stupni, v níž se užívá glutaraldežydu k vazbě bílkovin ve velmi složité reakci za vzniku heterogenních konjugátů s vysokou mo0ek^U.ároí hmotností. [Avrameas, S., ImшuookemosSry 6, 43 (1969)]

b) Dvoustupňová vazba glutaraldelydu, při níž reaguje enzym, v tomto případě peroxidáza z křenu pouze s jednou mo o ©kutou £^10^^©^^. Tím je omezena konjugace mezi jednotl-v^^ý^mL οοΙ-θΙ^^Ι enzymu a tento způsob tedy znamená zlepšení jednostupňového způsobu. Metoda však není pouužtelná pro celou řadu enzymů, odlišných od peroxUáz, protože tyto enzymy jsou schopné vázat více než jednu molekulu [Avrameas, S.₇a Ternynck, Imwnochemistry 8, 1175 (1971)]

8) Oxidace sacharidových zbytků v enzymu·s následnou tvorbou Schiffovy báze. Peroxidáza křenu obsahuje několik oligosacharidových skupin a základem tohoto způsobu je oxidace těchto skupin na aldehydové skupiny joHstanu. Vznnklé aldehydové skupiny pak mohou reagovat s ami^skupinami. Jiné enzymy, které rovněž působí oligosacharidové skupiny, je možno zásadně také pouužt, často však doclházzí ke tvorbě konjugátů s vysokou mooekiuární hmo0ností. [Nekane ^p. ^K. a Kowack^k, A. ^J. mstochem· Cytochem. ^{22, 1084 (197}4)³

d) Dimmleioilsvá vazba při pouSití imidu kyseH-ly N, N—o-fenylendimaleinové po zavedení skupin -SH do protilátky při 2-oerltaptoethylcmLnu, který snižuje předem existující můstky -S-S- na dvě skupiny -SH. [Kato a další, European · J. Biochem^ 62. 285, (1976$] .

e) Potužtí dalších bifunkčních reakčních činidel, jako jsou například tslsen-2,4-liisokyanát-p*,p-diflssr-o,o*--lnOtrsfeoylsslfso, · 1-cyklohexyLf3-(2~mosfoliooethyL) karbodiimid, avšak při pouužtí tohoto způsobu se obvykle dosáhne ·méně · dobrých výsledků.

f) Vazby je možno dosáhnout také při pouSití · heterobifunkčních činidel, například reakčních činidel, která obsáhni dvě různé funkční skupiny v každé ooSekLUe· Tímto činidlem je například ester m-maaeimidobbnozl-N-lydrojysiukcinimidu, který byl poiUit pro dvoustupňovou reakci k navázání inzulínu na p-galaktozidázu. [T. Kitagawa a T. Aikawa, J. Biochem. 22, 233 ai 236 (1976)]

g) Nekoovaentní vazba za současné tvorby příčných můstků, při nichi dochází například k vazbě protilátek na peroxidázu křenu za vzniku konjugátu, který není kovalentné vázán, avšak má poměrně stálou povahu. Tento způsob má následující nevýhody; při skladování se konjugát enzymu a protilátky pomalu rozkládá; protilátky mohou inhibovat použitý enzym; tvorba protilátek trvá několik měsíců, přičerni protilátky, získané různými pracovníky, maj různé vlastnooti.

Vzlhledem k vyšší ryclúosti a lepším výsledkům v případě, ie se postup provádí s poměrně větším miožstvím protilátek, je.obvykle výhodnŠSSí vyvolat tvorbu první i druhé protilátky u poměrné velkých zvířat, jako jsou kůň, osel nebo ovce, kdežto tvorba protilátek u malých zvířat, jako jsou krysy, щтё1, moočata nebo křečci, je méně výhodná, přestoie ji není možno vyloučit. Jak Jíž bylo uvedeno, je nutno vyvolat tvorbu i druhé protilátky u různých zvířat. Bylo zjištěno, ie je výhodné vyvdat tvorbu jiné protilátky u ovcí a druhé protilátky u oslů, zásadně však je možno užít jakoukoli dvorci různých druhů zvířat.

Moonoot interference druhé protilátky ·s reakcí antigenu a první protilátky se snižuje v tom případě, že tvorba druhé protilátky není vyvolána proti celé první protilátky, ale pouze proti Fc-frigmentu ^1^10^0^0. inu, který tvoří první protilátku.

Tvorbu druhé protilátky je možno vyvoo-at zásadně znáným způsobem,' avšak výhodným způsobem je přenběžoá příprava zvířat, po níi následuje vyvolání tvorby protilátek s · řadou dalších dávek v případě, ie hladina protilátek·v krevním séru překročí vrchol. Krevní sérum nebo · . · celá krev pak obvykle obsahuje nejvyšší hladinu protilátek po kaidé další injekci. V případě,·ie se dosáhne dostatečně vysoké dávky, pokud možno meacimáání možné dávky antiimшlolg.obulinu v krvi zvířete, odebere se krev a odd^šlí se sérum,které obsahuje anti-munoglleιULio.

Druhá protilátka se s výhodou čistí · tak,. ie se aotisérim osla inkubuje s přišitým imunologickým absorpčním· prostředkem, například sefa^n nebo ji rým nerozpustím nosičem, který byl aktivován reakcí s vhodným bifinkčním reakčním činidlem, například 1,4-bLs-(2j3-epoxypropoxy)butanem, i pak se uvede ve styk s roztokem imгul0lgobeU.inl nebo frjgmentem Fc tohoto imш]Oolobel.inu, který· byl užit k vyklání druhé protilátky· Tímto způsobem se získá imшloadnorpční prostředek, který je specifický pro druhou protilátku a kterou je možno čistit adsurpcí · na imunooddorpční činidlo s následnou elucí, a to před, nebo po označení enzymem.

Při přípravě značené druhé protilátky je výhodné uvést ve styk imunoaddorpční prostředek s adsorbovanou druhou protilátku s reakčním činidlem, například meeílmerkaatobulyrimidlthydrochloridem, čími dojde k moodiikaci i^í^l^c^í^I^i^j^^ío v protilátce a k zavedení tří iž pěti thiolových skupin do kaidé mooekuly protilátky. Pak se druhá protilátka, která nyní obsahuje meekapto-sklpinl, vymJe z imuroadsorpčního prostředku a nav^e se na ni enzym. S výhodou se tento postup provádí tak, ie se protilátka uvede ve styk s NlN-o-fero/enObsimidem maleinové a pak se uvede ve styk s čištěnou β-glllktlzinázll, která se získá běSným způsobem z Escherichia coli. Konjiugát enzymu a druhé protilátky se pak čistí chroma^graficky na diet^yrlminoet^y'lgaarZlovém gelu nebo na jiném vhodném ^s^pčním prostředku, čími se oddrní konjugát od nezbavovaného enzymu a od nezbavované druhé protilátky.

Tvorba první protilátky se vyvolá eSž1ým způsobem na vhodném zvířeti. V případě, ie stanovený antigeo je hapten s poměrně jednoduchou chemickou strukturou, jako je tomu například v případě ^Тс^НгТю-п, estrad-olu, gertam/cinu nebo mo^inu, není tento aotigeo sám o sobě schopen vyvolal tvorbu první protilátky. Je proto nutné vázat tento aotigeo na molekulu nosiče za vzniku konjugátu, kterým pak je možno vyvo^t tvorbu protilátky. K tomuto účelu je výhodné vytvořit konjugét antigenu s běžně dosažitelnou bílkovinou, která je užitému zvířecímu druhu cizí; je možno například užit hovězí sérový albumin (BSA). Konjugaci je možno provést reakcí tohoto albuminu nebo jiné bílkoviny například s 1-β^^-3-(3-ϋmetlhyLaminopropyl^arbodiimidem s následnou reakcí získaného produktu s který musí pro účely této reakce obsahovat aminoskupinu nebo karboxylovou skupinu. V případě potřeby je možno užit jiné způsoby konjugace, v nejvýhodnějších případech se na každou molekulu albuminu nebo na každou oolekiUu jiné bílkoviny s vysokou hmoonoosí váže 3 až 30 mooekul antigenu.

Tvorbu první protilátky je možno vyv°oat tak, že se podá ineekčně vhodnému zvvřeti, například ovci, antigen nebo konjugát antigenu opakovaně v průběhu týdnů nebo měsíců tak dlouho, až se dosáhne dostatečně vysoké hladiny protilátek s žádanými vlastnostmi v krvi zvířete. Ζνίϋθτ.! se pak odebere krev a intiséruo se odddlí.

První protilátka se pak s výhodou čistí tak, že se uvede ve styk s antigenem, který byl užit k vyvolání tvorby -této protilátky nebo s příbuznou sloučeninou při potustí nerozpustného nosiče. Po absorpci je možno protilátky vytyvat, oapříklad rozookem quanidiLшlhl“ iruc]U.oriil pi vysokém nebo nízkém pH a p^i řoožití roztoku s vysokou - ^ποθ^^οί sooí nebo pil rozpouštědel nevodné povahy s následnou dialýzou proti vhodnému pufru k odstranění elučního činidla.

Nerozpustnou maaricí, která se užije k vnesení antigenu nebo příbuzné látky při čištění a pii provádění způsobu podle vynálezu, může být jžkýkooi ve vodě nerozpustný maže^šl, na nějž se váže antigen nebo příslsSná příbuzná sloučenina dostatečně silně tak, aby bylo možno zajistit, že vazba nebude přerušena v průběhu reakce, v průběhu čištění nebo v průběhu stanovení.

Zásadně je možno užit ma^eršl, který antigen adsorbuje, jako je tomu v systému, který řopřali Engvall a další ve svrchu uvedené citaci, je však výhodné vázat antigen na nosič chemicty, to znamená, že nosič musí obsahovat funkční skupiny, které jsou pro tuto vazbu nutné. Vhodným ooieriáleo je οιρΜΟΙ^ sklo, nylon, ř⁰U-liloryllmii, celulóza nebo ^х1г1О. Některé typy orpčních prostředků s obsahem UydroχyloaýcU skupin je možno uvést v reakci s 1,4-bit-(2,3-tpotςlpropoxy)buianeo a produkt této reakce uvést v reakci s aitigenem. Tento způsob je jednoduchý, bezpečný a účinný a poskytuje stálou vazbu - za předpokladu, že utigen nebo příbuzná látka obsahuj hydroxyl ové skupiny, aminoskupiny nebo thiolové skupiny. Požadavky ni imunoadsorpční prostředek k tříštění protilátek - nejsou vždy stejné. .

Způsob podle vynálezu je možno provádět různým způsobem. Μ^ε^ί první protilátky, i tím i zničené složky navázané ni nerozpustný intigen, je v nepřímé záv^slosto k oooosíví ant^enu ve zkoumaném vzorku. Měří se enzymolická účinnost, bu3 volného enzymu, nebo enzymu vázaného ni nerozpustný nebo adsorbovaný antigen. Tento postup je možno provádět někooiki speecficlýoi způsoby.

Podle prvního provedení způsobu podle vynálezu se první protilátka inkubuje se vzorkem, který obsahuje zkoumaný inti-gen. Po skončení reakce se přidá utigen ni noosči i směs se znovu inkub^e. Pik' se o(ičliě:í pevná fáze od kapalné fáze, pevná fáze se promyje i smísí s přebytkem enzymolicky zničené druhé protilátky. Po další inkubaci se pevná fáze opěb odděěí i pO^ye. Mioossví - účinnost, - zjiS^né v nerozpustné frakci, je v nepřímé zdáve^eti k ο^ε^ί ve vzorku., kdežto oioossví v supernatantu je tomuto ο^ε^ί přímo úmOrné, takže je možno шёШ OttiulooOi frakci.

Podle druhého provedení způsobu podle vynálezu se první protilátka uvede v reakci s enzzynoiicky zničenou druhou prttiláOktl zi vzniku komplexu, který se pik přivdá v přebytku ke vzorku, který obsahuje hledaný antigen, i směs se inkub^e. Pik se přidá nerozpustný malt^á!, ni nějž je navázán intigen, i po dl.ší inkubaci se oddděí pevná kapalná fáze.

Stanovením enzymatické účinnooti v kapalné fázi se získá údaj, který je přímo závislý na možství antigenu ve vzorku.

Podle třetího provedení způsobu podle vynálezu se současné inkubuje komplex první a druhé protilátky, vzorek s obsahem stanoveného antigenu a mattr‘i^ál, na nějž je navázán antigen, načež se pevná a kapalná fáze odamu a stanoví se enzymmaická účinnost kapalné fáze. Získaný výsledek je přímo závislý na konceenraci aotigeou ve vzorku.

Jak již bylo uvedeno, při kvalitativním stanovení podle prvního a druhého provedení způsobu podle vynálezu je nutné, aby první protilátka byla příoomoa v přebytku vzhledem k rmntžSví, které je nutné pro reakci s antigenem ve vzorku, a мteгi(^l.₎ na nějž je vázán antigen, musí být přítomen rovněž v přebytku ' vzhledem k moožsví, které je nutné k absorpci velkerého aaotžSví první protilátky. Při praktickém provádění způsobu podle vynálezu je nejjedoodušší provést- sérii předběžných stanovení s různými.koncentracemi první protilátky aritmetickou nebo geomeerickou řadou. Pak je velmi snadné rychle naléz příslušnou koncentraci první protilátky pro přesné stanovení.

VynOlez bude osvětlen následujícími příklady.

Příklad 1

1. Výroba a značení druhé protilákly

a) Výroba F_c fragmentu ovčího imunoglobulinu IgG

Způsob výroby ovčího F_c fragmentu je založen na Porterově metodě (R. E. Porter 1959, Biochem. J. 13, 119).

320 ml séra se odebere 28 ovcím. 150 ml séra se inkubuje za stálého míchání na ledové lázni s 30 g die1^hy^l^É^:Lno^th^^L (DEAE) - A 50 Sephadexu, který byl předem uveden do rovnovážného stavu s 10 moly fosfátového pufru o pH 6,5. Po 1 hodině se gel zfiltruje ve skleněné nálevce, opatřené slotem,- a promuje se 50 m. fosfátového pufru o konccen-raci 10 ^mlů a - o pH 6,5. Filtrát a promývací kapalina se znovu ioksbuSí s - -30 g téhož adsorpčního maeriálu, zfiltrují se a promj 100 ml fosfátového pufru. 300 ml filtrátu a promývací kapaliny se smísí se 150 ml nasyceného roztoku síranu amorného, který se přidává kontinuálně za stálého míchání. Vznikne sraženina, která se oddá^-í a promyje 100 O. roztoku síranu amorného o Concee0rtci 20 %· VVsledná sraženina se rozpustí v 50 al fosfátového pufru o koncceOraci 50 maalů a o pH 8,0 a provádí se diagnóza přes noc při teplotě 4 °C proti 4 lirrm destilované vody. Získaný roztok se pak lyofilizuje.

1,5 g takto získaného lýofi^^izzv^^x^é^h^o ovčího iamotlobιS.ios se rozpuutí v 50 Ol 0,1 M tris-pufru s přísadou kyseliny chlorovodíkové o pH 7,2, piufr obsahuje ještě 10 mealů cysteinu a 2 mnmly kyseliny ethylendiaain0etrtoctOié. Piufr se připravuje bezprostředně před použitím. Pak se přidá ještě 0,6 ml krystalické suspenze papainu, který se předem podrobí dvojmu překrystelování v octanovém pufru o konceenraci 50 mmlů a o pH 4,5. Roztok se inkubuje při teplotě 37 °C 4 hodiny při občasném protřepání. Pak se přidá 0,222 g jodacetamidu a roztok se okammžtě nanese na sloupec o rozměrech 80 x 5 cm s obsahem Sephadexu G 100 v octanovém pufru o konce^^ci 10 mmmlů a o pH 5,6 při teplotě 4 °C ·

Sloupec se vymývá octanovým pufem o konceenraci 10 mamlů a o pH 5,6. Druhý vrchol obsahuje směs fragmentů Fc a Fab. První vrchol obsahuje nezbavovaný iaιsloglobιS.io. Maateiál získaný z druhého vrcholu se nanese na sloupec o rozměrech 40 x 2,5 cm s náplní karboxymee^y celulózy (Watman CM 32) v acetátovém pufru o konceenraci 10 mamlů a o pH 5,6 při teplotě 4 °C. Sloupec se vymývá teetátivýa pufrem o konceeneci 10 mamlů při pH 5,6, čímž se získá jeden hlavní vrchol a několik menOích vrcholů, tyto vrcholy se postupně vymývá tak, že se koncentrace acetátového pufru o pH 5,6 zvyšuje z 10 mamlů oa 500 mmo, přičemž každá koncentrace se užije v množství 1 000 ol. Materiál získaný .izolováním hlavního vrcholu se podrobí další chroщategrrfii oa sloupci karboxyneehhlcceiULózy· V tomto případě se zvyšuje koncentrace aceeátového puiru o pH 6 z 10 molů, až oa 300 molů, dojde k vyvrtí jediného vrcholu, který se izoluje, dializuje proti destilované vodě a takto získaný materiál se Liooilituje.

b) Příprava druhé protilátky (oslí ioonoolobuuin proti ovčímu antigenu)

Připraví se stálá emulze smísením 1 dílu roztoku chloridu sodného o koncentraci 0,9 % s obsahem ovčího Fc fragmentu v konccnl-raci 0,75 mg/oi a s obsahem Baaillus Calmette-Guerin o koncentraci 1,5 mi/ml a 2 dílů pomocného prostředku Marcol 52. Do zadní nohy osla se aplikuje 6 nitrosvalových, injekcí emulze vždy o obsahu 1 ml· Po 2 měěících byla produkce protilátek tak vysoká, že bylo možno podat další injekce k dosažení maximOlní hladiny protilátky. V tomto případě bylo užito znovu 6 nitrosvalových injekcí na různých místech zadní končeeioy vždy o obsahu 0,5 ml, v tomto případě emulze sestávala z 2 dílů pomocného prostředku oa 1 díl roztoku chloridu sodného s obsahem ovčího Fc fragmentu o koncentraci 0,75 mg/ml· Oslům byla odebírána krev 10 dní po poslední injekci a v průběhu dalšího O^ě^íce, přičemž byla vždy získána vysoká hladina protilátek.

c) Příprava i^m^r^c^f^c^í^(^i'pe^:Cho prostředku pro čištění oslího ioшl0llobulinu proti ovčímu antiienu

Sepharóza 4B se aktivuje tak, že se smísí s 1,4-bis-(2,3-eplxyprlplxy)butanem, přičemž se inkubují stejné objemy .gelu, svrchu uvedeného epoxidu a 0,6 M roztok hydroxidu sodného s obsahem 2 mi borohydridu sodíku v 1 ml za stálého míchání při teplotě 25 °C 8 hodin, načež se adsorpční mateeiál promuje. Ovčí ioiuioog.obuuio se připraví slitím noroOáních sér s oásledrýo vysrážnnío 33% rozookeo síranu amonného. Přidá se roztok ovčího iOTu'ioog.obulinu v 0,1 M roztoku hydrovuilčitanu sodného o pH 10 a užije se 10 mi ovčího imшl0lgobtUliou oa 1 ml gelu. Ativovaný gel se inkub^ije s imiuooglobULinem 48 hodin, takto získaný озО-п^! se promyje, smísí se s 0,1 M roztokem ttlaool· aminu při pH 10 a nechá se stát 24 hodin.

d) Čištění a značen:! druhé protilátky z oslů proti ovčímu αneilnou

Oslí iomoog.obuuio proti ovčímu anti-genu se čistí tak, že se iokubuje ovčí antisérim, připravené svrchu uvedeným způsobem při použžtí imшloadsorpčoíll prostředku. Triolové skupiny se včlení do imшo>llobtž.iou tak, že se imtuioog.obiuLio adsorbuje ог imuroadsorpční prostředek při pouužtí oetthyl-4-oerkaptobutyгioidátu ve formě hydrochloridu k ooodfikaci aminoskupin iounolloOuUiou· Postup se provádí tak, že výsledný οθΟ-ι:^! obsahuje 3 až 5 Molových skupin oa 1 molekulu iounoogobtuiou.

Kommlex iounoads opčního prostředku a protilátky se promyje a uvede se v suspenzi 0,1 M roztoku N-etlyLoolfolinlydrocihLlridž při pH 7,5 a při ^ηοαπΟΓαοΙ 1 ml_ imrniooadorpčního prostředku v celkovém objemu 10 - Ol. Roztok oettlrl-4-oenktaloOužyrioidátlrdrocih.oridu v 0,2 M roztoku uhličitanu omamtého v 10 mg/ol roztoku se připravuje těsně před použitím, přičemž se přidá 0,1 ml tohoto roztoku oa 10 ml suspenze. Suspenze se míchá při teplotě oístnooti 30 oinut a pak se promyje 0,1 M roztokem N-etlylmolfolinlydrlchLlridu o pH 7,5 s obsahem 1 mg ditlilthrtitllž oa 10 mL piufru. Gel se pak důkladně promyje kyselinou chlorovodíkovou s obsahem 0,1 M chloridu sodného až do pH 3,5.

Takto získaný irunoiLlbulin s obsahem thiolových skupin se vymývá kyselinou clhLlrlvodíkovou s obsahemO,1 M chLoridu sodného při pH 2,5. NeevýhoodtějšX mtodou k provádění tohoto způsobu je naplnit iount od dořečním prostřddkeo malý sloupec a odebírat e^dt do zkumavek, které obsahuj pUir. Protože další stupeň tohoto postupu se provádí v ^г2itátovér pufru o koncentraci 0,1 M při pH 5,0, je výhodné ^е^гаг eluát do dostatečného moožtví αcttátovélo pufru o koi^c^^i^trac:i 0,1 M a o pH 6,0, čímž se dosáhne konečného pH 5,0.

ol acetltového pnutu o koncentraci . 0,1 M aopH5,0 s obsahem 2,5 mg imunoglobuLinu s obsahem thiolových skupin se zchladí na ledové lázni. Získaný roztok se pak po kapkách přidá k 1 ni nasyceného roztoku ioidu kyseliny N,N*-o-fenylenbismeleinové v octanovém pWfru o kontcritraci 0,1 M a o pH 5,0 v ledové lázni. Pak se směs inkubuje při teplotě 30 °C 20 minut, načež se imvun>olobiú.in oddělí od přebytku svrchu uvedeného imidu' tak, že se výsledný roztok nechá projít sloupcem o rozměrech 20 x 1,5 cm β obsahem Sephadexu G 25 v rovnovážném stavu ve fosfátovém pufru o konc Straci 0,01 M s obsahem chloridu hořečnatého o koncentraci 0,01 M a pH 6,0 při teplotě místnooti.

5,0 pg [-galaktosidázy z Escheeichia coli, vysrlžené síranem amonným, se rozpustí v čiěčnném aktivovaném roztoku imrninolobulinu a inkubuje se 4 hodiny při teplotě 30 °C. Pak se přidá dostatečné mnnožtví normálního roztoku hydroxidu sodného k úpravě pH na hodnotu 7,5 a dostatečné onnožtví 2-oerkaptoeteantlu o koncceitraci 2 M tak, aby konečná koncentrace této látky byla 10 mnooiů.

KonUuiát ^щ^^ЬиИн a enzymu se ve formě roztoku nanese na sloupec o rozměrech x 0,9 cm s náplní DEAE-aairozy (Biogel) v rovnovážném stavu v tris-pufru s obsahem kyseliny chlorovodíkové o pH 7,5 a s obsahem 10 meolů 2-oenkaptoeteanolu, 10 otoolů chloridu hořečnatého a 50 meolů chloridu sodného při teplotě 4 °C. Roztok se vpraví do sloupce tak, že se převrství vrstva užitého pufn. Pak se soísí týž pufr se stoupajícím mnoostvím chloridu sodného tak, aby sloupec byl vymýván pufrem s konneenrací 50 až 200 omolů chloridu sodného. Celkové množní pufru je 250 ol. Ioιulttlotulin, který se nenavázal na enzym, se neadsorbuje ve sloupci a vypije se dříve, než dojde k vymytí komplexu. Komplex imunoglobulinu s enzymem se však vymývá dříve, než dojde k vyptí volného enzymu. Frakce, která obsahuje značený ioιulttlo0>ulin, se lyofilizuje, čímž se získá značená druhá protilátka.

2. Výroba první protilátky

a) . Příprava konjugátu trio od třu?! oni nu (T^)

250 mg sérového albuminu Skotu se rozpuutí ve 25 ol destilované vody a 1 000 mg 1-etetl-3-(Зddimet^tιlmintprtpyl)tarbtdiioldu se rozpuutí v 50 ol destilované vody. Oba roztoky se zchladí na 4 °C a dvě třetiny druhého roztoku se pomelu smísí s roztokem sérového albuminu, skotu. 150 pg čištěného se rozpustí ve 25 ol smOs! ethanolu a 2 M hydroxidu amonného v objemovém poměru 25:1 a roztok se zchladí na 4 °C, načež se po kapkách přidá ke svrchu uvedené směsi za stálého míchání, přičemž pH se udržuje na hodnotě 7,0 tak, Že se po kapkách přidává 0,25 M roztoku kyseliny chlorovodíkové. Pak se reakční směs míchá dalších 10 oinut a zbytek roztoku karbodiioidu se přidává po kapkách, přičemž pH se znovu udržuje na hodnotě 7,0.

Soěs se míchá přes noc při teplotě 4 °C. Ráno se roztok odstředí a supernatant se dialyzuje třikrát vždy proti čerstvému roztoku, který obsahuje soěs ^h^itanu sodného a ^агог^^^т sodného o celkové koncertnci 0,1 M a o pH 11,0, načež se dialyzuje proti destilované vodě. VVsledný roztok se lyofilizuje. Bylo prokázáno, že tímto způsobem se včlení 4,3 molu trioodtlrOoninu na 1 ool sérového albuminu skotu.

b) Hříprava první protilátky (T-prooilltky)

Stálá eoiú.ze se připraví tak, že se s^fí^:í 1 díl fyziologického roztoku chloridu sodného s obsahem 50 % přípravku Tween 80, T^-sérového albuminu skotu v ktntentraei 2 pg/ml a Bacillus Calrneete-Guerin v konccrtnci 1 pg/ml a 2 díly pomocného prostředku Maacol 52. Do hřbetu zvířete se na různá pista podkožně aplikuje 6 dávek této emulze v ennoství 1 ol a do končetin se titгosoIltoě aplikují 4 injekce po 0,75 ol emulze. Stanoví se titr protilátek a po 36 týdnech se podá další injekce k dosažení esximPlní produkce protilátek. V tomto případě jde o 6 titrosoalooýce injekcí vždy o objemu 0,5 ol do končetiny. V tomto případě sestává emtu-ze ze 2 dílů pomocného prostředku na 1 díl fyziologického roztoku, který obsahu9 je 2 mg konjugátu v 1 ml· Krev, odebíraná 10 dní po druhé injekci a další 2. měsíce,obsahuje vysoké hladiny T-pro ti látek.

c) Příprava imunoadsorpčního prostředku přo čištění první . protilátky '

Sepharóza 4B se aktivuje 1,4-bbs-(2,3“epoxypropoxy)butanem svrchu uvedeným způsobem.

ml takto aktivovaného mattriálu se přidajík 20 ml fosfátového pufru o koncentraci 0,025 M a o pH 12,0 s obsahem 50 mg trjjodthriotinu. Pifr se míchá 45 hodin při teplotě místnosti. Gel se pak promyje 250 ml fosfátového pufru o koncentгaei 0,025 M a o pH 12,0, 150 ml roztoku elhLoridu sodného o koncentrtei 0,1 M a 100 ml destioované vody. Je možno prokázat, že se včlení 9 mg tr jo od hrd o ni nu do jednoho ml nabobtnalého gelu. Jakékoli zbývající oxiranové skupiny se blokují tak, že se gel uvede v suspenzi ve 4násobku svého objemu ve vodném roztoku ethanolaminu o ^ппс^^с! 1 M a pH 11 a směs se míchá 4 hodiny, načež se gel důkladně promyje dettiOovanou vodou k odstranění přebytku ethanoleminu.

d) Čištění první protilátky ml tttitért proti tr jo od připraveného svrchu uvedeným způsobem, se hodinu mísí při teplotě místnooti s 1 ml Sepharózy, substituované trjoodhhr0tntreш. Neeppecficky adsorbované bílkoviny se odstraní z imunoadsorpčního prostředku tak, že se tento prostředek důkladně pr omývá . roztokem chloridu sodného s přísadou fosfátu o konceenraci 0,05 M a pH 7,0, koncentrace chloridu sodného je 0,2 M. ^1 se naplní do malého sloupce svrchu uvedeným způsobem a promyje se kyselinou chlorovodíkovou o pH 3 k odstranění fstfáSovéhs pufru. Ρ^<^ί^:ί— látky proti iriOodt^nriotitt se vym^vaj 4 ml guanidinitm^hrУdocehoriiu o ksncentraei 6 M a o pH 2 a uvádděí do barbioonového pufru v mnnoství 1 ml o ksntentraei 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % sérového albuminu skotu..Pak se uvedené protilátky důkladně dielyzují proti témuž pufru k odstranění guanidinitmýdroceUoridu.

3. Příprava antigenu (T-) na nosiči

Postupuje se steným způsobem, který již byl popsán při výrobě imiuioadsorpčního prostředku pro čištění první protilátky (odstavec 2c svrchu), s tím rozdílem, že se užije nižší koncentrace triOoit^r·iotitt. Tímto způsobem sesníží také koncentrace uvedené látky v gelu.

Stanovení trjoodpři pouští rekačních činidel, jejichž příprava se popisuje, bylo již popsáno.

Unnverzální reakční činidlo, které je možno získat svrchuuvedeným způsobem, lze užít ke stanovení antigenů podle několika odlišných způsobů.

Postup 1a: První protilátka a volný antigen se inku^uj, přidá se imirnoaddorpční prostředek a po prornt* se přidá značící látka.

Postup 1b: Současně se inkubuje první protilátka, volný antigen a imtuioadsorpční prostředek. Značčcí složka se přidá k probytému imwnoadsorpčnímu prostředku.

Postup 2a: Inkubuje se první protilátka, volný antigen a značící látka. Po určité době se přidá imunoadsorpční prostředek. Způsob 2a je možno modifikovat tak, že se inkubuje první protilátka s enzymaaickou značící složkou před přidáním volného antigenu. Pak jde o postup 2b.

Postup 3: Při provádění tohoto postupu se současně smísí první protilátka, značící složka, volný antigen a imunooddorpční prostředek. Tento postup je rovněž možno pdzměstt tak, že se předem vytvoří komplex složky a první pro'tilátky.

V dalších příkladech jsou popsány výsledky pokusů, které byly provedeny při použití univerzálního reakčního činidla některým ze svrchu uvedených postupů.

Příklad 2

Stanovení trijodthrioninž při pouužtí univerzálního reakčního činidla

Postup Ia: Ovčí antiséuira proti tr jtoSttu·toniru v ředění 1:2 000 v 0,1 Ш1 barbioonového pufru o konccntraci 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % sérového albuminu (hmoonootní $/objemová %) se smísí s 0,1 ml trijodthritntoového standardu v barbionnovém pufru a směs se nechá stát 24 hodin při teplotě 4 °C. Přidá se 0,1 ml ba^^onového pufru s obsahem 0,3 % (hmotnostní %/objemová %) přípravku Tween 80 a s obsahem 50 mikrogramů T^-imirnoadsorpčního prostředku a po_: promísení se směs nechá hodinu stát při teplotě 4 °C, pak se dvíOcrát promyje 5% roztokem chloridu sodného s přísadou barbioonového pufru a promj® ještě barbionoovým pufrem. S promytým imunoadsorpčním prostředkem se smíí^rí enzymatická značící složka, kterou je 100 mikro^t^ oslího obbú-inu proti ovčímu antigenu s vázanou galaktosidázou, a směs se udržuje 24 hodin při teplotě 4 °C, pak se promyje svrchu uvedený^ způsobem a běžnými metodami se měří účinnost enzymu, vázaného na imunoadsorpční prostředek. Výsledky jsou uvedeny v následnicí tabulce:

Tabulka

Konoeηtrtce (nnoly/litr)J	Ootická hustota (2 hodiny)	$ slepé zkoušky *
0 '	0,29	100
1	0,17	50
4	0,16	47
32	0,135	35

Vazba značené složky na imiuioaddorpční prostředek nespecifccýým způsobem je 0,05.

# vazba, vypočítaná po odečtení nespecifické vazby.

Podobný pokus byl proveden při pouužtí oslího Fc fragmentu proti ovčímu antigenu s navázanou gtltkttsiSάztž jako značící složkou. Jde o obdobný způsob jako svrchu, s tím rozdílem, že se antiséra se standardem nechají stát 8 hodin a že ředění antiséra je 1:1 600. VVsledky jsou uvedeny v následnicí tabulce:

Tabulka

Κο^βηΟ^^ T3 (nmooy/1, ng/riL)	Oppická hustota (2 hoHHy)	% slepé.zkoušky
0	0	0,43	100
0,42	0,25	0,35	81
1,56	1.0	0,28	65
6,25	4,0	0,16	37
25	16	0,15	35
NSB 0,025

Stanovení tritoSt^π’ionitž při univerzálního reakčního činidla

Postup 2a: 0,1 ml čištěného ovčího Ττ-anniséra a 0,1 ml T^-standardu v barbionnovém pufru o konccnnraci 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % (hmotnottní fc/objemová %) 'sérového albuminu skotu se smísí se značící složkou, kterou je 25 mikrolitrů oslího komplexu antiimunoglobulinu proti ovitou antigenu a enzymu a směs se udržuje ^{24 h}odin na ‘teploté ^{4 O}C. Pak se přidá 0,1 ml Uarbioonového pufru, který obsahuje Tj-imuo°tdo°rtíního prostředku v mnnožsví 50 mikrogr«mů a 0,3 % (hmoonootní ^/objemová %) přípravku Tween 80 a směs se udržuje hodinu na te^plotě 4 ⁰C. ^pak se imunoaddorpční pros^třede^k promyje a ú^^ost vázaⁿého enzymu se stanoví stejně jako v příkladu 2. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka

Koncentrace Τ» (ююЫШг/	Optická hustota (1 hodina)	% slepé zkoušky *
0	0,47	100
0,5	0,42	90
1	0,35	70
2	0,24	45
4	0,21	38
8	0,20	36
16	0,18	33
32	0,17	31
64	0,14	22
NSB	0,05
44 hodnoty byly vypočítány po odečtení nespecificky vázaných látek.

Příklad 4

Stanovení trilodhriloniol při použití univerzálního reakíního činidla

Postup 2b: íkšěěné Tз-ppolildtry v uvedení 1:1 500 v 8,5 í Uarbioonového pufru o koncenn-raci 0,05 M a o pH 8,6 s přísadou 0,1 % (hmoonootní %/objemová %) sérového albuminu skotu se smísí s enz^ynmtickou značící složkou, kterou je konjugát oslí protilátky ·proti ovíímu antigenu s vázanou gtltktlsidázou v mrlo°žSví 5,1 ml, a směs se nechá stát při teplotě 4 °C až do poo^kí.

standardy v 50 mikroUtech UtrUilonovéhl pufru se smísí s 200 шйгоШоу komplexu značené složky s první prltilárkou a dalším mužstvím 0,5 οΙ^ο^^Δ UtгUklonového pu'ru, ot^íe^ž se udržuuí ⁴ h°din^y na teplot ^{4 0}C. Do z^kumavek: se přidá 5⁰ mikrogramů ^-imunoadsorpíního prostředku v UtrUilonovéi pufru s obsahem 0,4 % přípravku Tween 80 a zkumavky se hodinu ^^buuí piřx teplot ^{4 0}C. ^pak se imunoadsorpční prostředek pro^je Utr^Ui0onovým pufrem s obsahem 5 % chloridu sodného a pak tímtéž pufrem s obsahem 1 % chloridu sodného. Účinnost enzymu vázaného na imunoadsorpční prostředek se stanoví běžným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v nádsed^!^ tabulce.

Tabulka

Koncentrace T, Optická hustota %· slepé zkoušky (nnolo/vitr)^J(1 hodina)ή-

0	0,44	100
0,125	0,40	83
0,25	0,36	69
0,5	0,37	74
1	0,29	46
2	0,24	27
4	0,20	15
8	0,19	12

NSB 0,16

X hodnoty byly získány po odečtení neoppccficky vázané látky.

Pokus byl opakován s obdobným výsledkem při použití Fc fragmentu.

Příklad 5

Stanovení trijodthrioninu při použití univerzálního reakčního činidla

Postup 3: T^-etandardy ve 100 mikrolitrech barbitonového pufru se smísí s 200 mikrolitry komplexu první protilátky se značenou složkou a 25 mikrogramy T^-imunoadsorpčního prostředku ve 100 mikrolitřech barbitonového pufru s obsahem 0,4 % (hmotnostní %/objemová %) prostředku Tween 80 a směs se inkubuje 2 hodiny při teplotě 4 °C. Pak se imunoadsorpční prostředek promyje a vázaný enzym se stanoví způsobem podle příkladu 4. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Koncentrace (nmol/litr)	Optická hustota Cl hodina)	% slepé zkoušky . *
0	0,33	100
0,5	0,32	94
1	0,29	83
2	0,28	77
4	0,24	60
8	0,21	42
16	0,18	32
NSB = 0,114

# hodnoty byly získány po odečtení nespecificky vázané látky

Stanovení trijodthrioninu při použití univerzálního reakčního Činidla

Postup 2b: Byl opakován postup podle příkladu 4, s tím rozdílem, Že globulin schopný vázat hormon Štítné Žlázy byl rozložen zahříváním vzorku plazmy při teplotě 70 °C po dobu 1 hodiny. Získané výsledky byly obdobné výsledkům z příkladu 4«

Příklad 7

Stanovení růstového hormonu (HGH) při použití univerzálního reakčního činidla

Postup 1a: Králičí antieérum proti růstovému hormonu v ředění 1:20 000 v 0,1 ml barbitonového pufru o koncentraci 0,05 M při pH 8,6 s přísadou 0,65 M chloridu sodného a 0,5 % (hmotnostní %/objemová %) hovězího sérového albuminu se smísí se standardy růstového hormonu, ředěnými v 0,1 ml barbitonového pufru, a směs se udržuje 24 hodin na teplotě 4 °C. Pak se přidá imunoadsorpční prostředek pro růstový hormon 0,1 ml barbitonového pufru v množství 10 mlkrogramů, po smísení se směs hodinu udržuje na teplotě 4 °C a pak se znovu promyje 0,05 M barbitonovým pufrem o pH 8,6 v množství 2 ml s obsahem 5 % chloridu sodného a nakonec se směs proqyje tímtéž pufrem s obsahem 1 % chloridu sodného. Pak se přidá 50 mikrolitrů enzymatické značící složky, kterou je oslí Fc galaktozidáza proti králičímu antigenu, směs se znovu udržuje 24 hodin na teplotě místnosti, promyje se svrchu uvedeným způsobem a účinnost enzymu, vázáného na imunoadsorpční prostředek, se měří běžným způsobem. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

Tabulka

Soiventrace růstového hormonu

Optická hustota (1 hodina) % slep⁰ zkoušky *

0	0,64	100
0,39	0,61	95
0,78	0,60	93
1,56	0,51	75
3,125	0,43	63
6,25	0,38	53
12,5	0,31	41
25	0,26	33
30	0,22	24
100	0,18	18

Nespecificky vázaná značená složka na imwioadsorpční prostředek = 0,08.

% vazba byla vypočítána po odečtení nespecificky vázaných látek

Příklad8

Stanovení inzuLinu imunologickým způsobem při použití univerzálního reakčního činidla

Postup la: Moočecí antisénm v ředění 1:10 000 nebo v ředění 1:40 000 v 0,1 ml fosfátového pufru o kor^c^i^e^tjrai^i 0,04 M a pH 7,4 s přísadou 0,5 ' % (hmočnočtní %/objemová %l hovězího sérového albuminu se sm!^:í se standardy hovězího tového pufru, a vzorky se udržují 24 hodin na teplotě prostředek pro inzulín v 0,1 mí fosforového pufru při smísení se zkumavky 30. minut na teplotě 4 °C.

pro^je 2 ml fosfátového pUfru s obsahem 5 % chloridu hem 1 % chloridu sodného. Do zkumavek se přidá 50 miknoitrů enzymatické konjugát galaktosidázy s oslím imiunoglobulinem proti morčecímu antigenu, směs udržuje 24 hodin na teplotě míítnoosi. Imu^c^č^c^s^(^č^]^to:í prostředek se uvedeným způsobem a účinnost galaktosidázy vázané na imirnoadsorpČní prostředek se měří běžným způsobem. Výsledky jsou uvedeny y následující tabulce inzulinu, připraverými v 0,1 ml fosfá4 °C. Pak se přidá imunoadsorpční obsahu 25 mikrogramů prostředku a po Im^un)odsoгpδní prostředek se pak sodného a pak 2 ml téhož pufru s obsasložky, kterou je a po smísení se promde svrchu

Tabulka

Konccntrace inzulínu	Optická hustota (90 minut)	% slepé zkoušky
ředění antiséra	1:10 000
0	0,62	100
0,96	0,50	83
4,8	0,34	55
24	0,26	42
ředění antiséra	1:40 000
0	0,36	100
0,96	0,18	50
4,8	0,17	47
24	0,16	44

Neepecifická vazba = 0,05 enzymatické složky v imwnoadsorpěním prostředku.

Příklad 9

Stanovení kortisolu imunobiologiclým způsobem při použití univerzálního reakčního činidla

Postup 1a: Ovčí antisérim proti kortisolu v ředění 1:20 000 v 0,1 mL fosfátového piufru o koncenttraci 0,1 M a o pH 7,4 s přísadou 0,1 % (hmoonostní %/objemová %) želatiny, 0,83 % chloridu sodného a 0,1 % thiomersalu se smísí se standardy kortisolu v 0,1 ml fosfátového pufru a směs se udržuje 24 hodin při teplotě 4 °C. Pak se přidá 0,1 ml fosfátového pufru s obsahem 0,3 % (hmoonnotní %/objemová %) přípravku Tween 80 a 25 mikrogramů kortisolového imunoabsorpčního prostředku, po smísení se směs udržuje hodinu na teplotě 4 °C, načež se pro^je ^sído©!^ pufrem s obsahem 3 % chloridu sodného a nakonec čistým fosfáooýfa pjrfrem. K promytému imunoadsorpčnímu prostředku se přidá 25 mikkooitrů enzymatické složky, kterou je konjugát galaktosidázy s oslím imunoglobulinem proti ovčímu antigenu s přísadou 0,5 % (hmoSnostní ^/objemová %) přípravku Tween 80, a směs se udržuje dalších 24 hodin na teplotě 4 °C, pak se směs promje svrchu uvedeným způsobem a účinnost enzymu se stanoví běžnými postupy. Výsledky jsou uvedeny v následující tabiu.ce.

Tabulka

koncentrace kortisolu (na/m.)	Optická hustota (1 hodina)	% slepé zkoušky 44
0	0,33	100
125	0,29	87
250	0,26	74
500	0,21	59
1 000	0,18	47
2 000	0,15	37
4 000	0,11	24
8 000	0,11	24

Nespeccfická vazba značené složky na imwioaddórpční prostředek je 0,04.

* výpočet byl proveden po odečtení nespecificky vázaných látek.

Je běžné a velmi výhodné navrhovat zkušební balíčky, které obsahají všechny látky pro provedení určité zkoušky, v tomto případě k provádění způsobu podle vynálezu při zjišťování různých antigenů. Takový balíček by měl obsahovat nerozpustný maateiál s vázaným antigenem, který může být totožný nebo odlišný od antigenu, který má být zjišťován , pomocí zkušebního balíčku. Dále by měl balíček obsahovat vhodnou povozí protilátku, vhodný typ enzymaticky značené druhé protilátky a prostředek pro stanovení enzymatická účinn^ti vázaného enzymu a s výhodou rovněž roztok s obsahem známého m^živ! antigenu, který má být zjišťován pomocí zkušebního balíčku ke kalibračním účelům.

Je výhodné, aby balíček obsahoval pevnou fázi ve formě tyčinky, kterou je možno ponořit do dalších ' složek uvedené směsi a opět ji z této směsi vyjmout. Toto uspořádán může velmi usnadnit několikanásobné proývání pevné fáze a tím zýšit přesnost stanovení.

Zkušební balíček určený pro stanovení ^^о^йгЮоХоп by například měl obsahovat následuuzdící složky:

1. nerozpustný pevný maaterál buč ve formě suspenze v pufru, například barbitonovém' pufru, nebo v 1ysfilisovaoé formě s navázaným antigenem T^J

2. povozí protilátku (například ovčí anti-Tj) spolu s druhou protilátkou, kterou m^íže být například oslí Fc-frígment imunnoloblinu proti ovčímu antigenu, přičemž tato druhá látkv je značena p-galaktosidázou a zkušební biOLÍSek ji s . výhodou obsahuje v lyofilizované formě; .

³. substrát, napří^klv^d nitrofenyi-gv^^osid v tonečné ^koncentrvci napříW.^ I⁰*³ M v piufru, napříklvd bvrbionnovém o · pH s výhodou 7 vž 9 v 0,01 vž 0,2 M, s výhodou v lyofilizoaaté formě v

4. roztok s obsv^hLe^m známého mnnoství T^, napříklvd 10 nM/1, s výhodou v lytfilitootné formě.

Claims (8)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob imunologického stanovení protilátek pomooí vázvného enzymu, při němž se uvede ve styk entigen nv nerozpustném mataeiálu nebo ve formě nerozpustného vgregátu, první protilátke v enzymavicky znvčená druhá protilátkv,.nvčež se nerozpustný v rozpustný materiál od sebe oddděí v st^oví se nnz;ynatická účinnost,„vyživující se tím, že se první protilátkv uvede do styku se vzorkem, který obsahuje tttnovovaný vutigen, v druhá protilátkv se n^áže nv nerozpustný шattniál v nepřímé závislosti vzhledem k mnnžssví vntigenu ve zkoumeném vzorku.
2. 2. Způsob podle bodu 1, vyznávsuící se tím, že se první protilátkv uvede v revkcíi s vneseném v se vzorkem, nvčež se pevná fáze oddděí od kvpvlné fáze v veškerá první látkv vázvná nv oddělenou pevnou fázi se uvede v revkci s druhou protilátkou v druhém kvpvlném prostředí, prostém první protilátky v vzorku, poté se odděěí pevná fáze od druhého kvpalného prostředí v stanoví.se nebo se změěí enzymevická účinnost pevné fáze.
3. 3. Způsob podle bodu 1, ^znav^ící se tím, že se uvede v druhá protilátkv v první protilátkt zv vzniku komplexu obou pro telátek, který se pvk uvede v rnvkci s antigenem v se vzorkem.
4. 4. Způsob podle bodů 2 v 3, oy^zntující se tím, že se první protilátkv nebo vzniklý komplex uvede do revkce nejdříve se vzorkem v potom s antigenem.
5. 5. Způsob podle bodů 2 v 3, oyznatující se tím, že se první protilátkv nebo vzniklý komplex uvede v rev^^i soύčasně se vzorkem v s vntigenem·
6. 6. Způsob podle bodů 1 vž 5, ^zna^ící se tím, že první protilátkv je v přebytku, vzhledem k mnoosíví nutnému pro rntkci s veškerým vntigenem, který je přítoπιen ve vzorku, v celkové ^ι^β^ί tntignnu ve vzorku v nerozpustného vntigenu je v přebytku vzhledem k mn^a^í první protilátky.
7. 7. Způsob podle bodů 1 vž 6, oy2^δ^ntudíc:í se tím, že tntignn je totožný s vntigenem ve vzorku v je uložen nv nerozpustném mattniálu, nv agarozooém . gelu s příčnými můstky, vktvvovaném 1,4-bis-(2,n-epoxyroP0o:)yгSbutanem.
8. 8. Způsob podle bodů 3 vž 7, uící se tím, že se nnzymatická účinnost stanoví v oddělené kvpalné fázi.