WO1980002460A1 - Procede et dispositif pour le dosage des lipoproteines seriques - Google Patents

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WO1980002460A1
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lipoprotein
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L Carlson
L Holmquist
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Goella Lab
L Carlson
L Holmquist
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
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Definitions

  • the invention relates to a method for the determination of serum lipoproteins and to devices for carrying out this method. More specifically, the method according to the invention is intended for the determination of the protein constituents of serum lipoproteins.
  • Recent epidemiological studies on the risks of occurrence of cardiovascular diseases have shown the advantage of determining serum lipoprotein levels not only globally, but also and above all by making a distinction according to the group to which these lipoproteins belong, and, within these groups, depending on the type of apoprotein (C 1 , C 2 , C 3 , E, B, A 1 , A 2 ).
  • VLDL very light density lipoprotein
  • LDL low density lipoprotein
  • HDL high density lipoprotein
  • the present invention therefore proposes to provide means for carrying out an assay of the various lipoproteins or lipoprotein fractions, which is both simple, very sensitive and precise.
  • the method consists in reacting, under conditions suitable for the formation of an antibody-antigen type complex, on the one hand, a given amount of an antibody specific for the apoprotein (s) that the we want to assay, this antibody being fixed on a solid support inert with respect to the reaction medium in which the antibody-antigen complex is formed and the medium in which the enzymatic activity is subsequently measured, on the other hand, the serum sample to be analyzed and a given quantity of a lipoprotein coupling compound of the type to be assayed, or of several lipoproteins including that to be assayed, with an enzyme which does not alter the formation of the antigen complex antibodies; the latter being carried out, the reagents which are not attached to the solid support phase are eliminated and the enzymatic activity of the complex attached to the support is measured.
  • the principle of measurement is as follows.
  • the antigens present in the sample to be assayed and in the compound coupled to the enzymes compete in the formation of the antigen-antibody complex.
  • the quantity of enzyme in the c ⁇ riplex formed is a function of the quantity of antigen in the sample analyzed, and the lower the latter.
  • the separation of the antigen-antibody complex, and the measurement of activity which follows it, is all the easier when operating in the heterogeneous phase.
  • the fixing of the antibody on the container constitutes a preferred form, it can also be fixed on a support independent of the latter.
  • any support capable of fixing the antibodies, whatever its form, can be used.
  • Forms such as grains, beads, pearls, etc. are particularly suitable.
  • the quanhities of antibodies and of apoprotein-enzyme compound are adjusted so that the dosage has maximum sensitivity.
  • these quantities are close to the equivalence.
  • Lipoproteins consist, as their name suggests, of a lipid part and a protein part, apoprotein. Some of these apoproteins are characteristic of the lipoprotein fractions indicated above.
  • the apoproteins C 1 , C 2 , C 3 are carried essentially by VLDL; apoprotein B is carried by LDL and VLDL; the apoproteins A 1 and A 2 are carried by the HDLs; apoprotein E appears in some cases of hyperproteinemia (in the VLDL fraction). All these apoproteins carry saecific immunogenic determinants. It is by the specificity of these determinants in the reaction of formation of the complex that one can assay a determined apoprotein within a complete serum sample, that is to say of a sample on which it does not it is not necessary to carry out separation operations beforehand.
  • the preparation of the purified apoproteins necessary to obtain the corresponding antibodies is made from the fractions of serum lipoproteins traditionally separated by ultracentrifugation on density gradient.
  • the lipoprotein fractions once separated are subjected to defatting and the separate apoproteins are isolated by an equally traditional method such as chromatography, electrophoresis, etc.
  • fractionated serum lipoproteins are also used for the preparation of the lipoprotein-enzyme coupling compounds. 2) Specific antibodies.
  • the specific antigens are administered in a dose sufficient to elicit an immune response.
  • the antigen is administered with a response stimulating adjuvant.
  • Booster administrations can also be performed to enhance the formation of antibodies.
  • the blood of the immunized animal is then withdrawn and the serum containing the antibodies is separated. To facilitate subsequent operations, it may be advantageous to isolate the immunoglobulins from this serum by known methods, for example by precipitation. 3) Fixation of the antibodies on the support.
  • the fastening must meet several requirements.
  • the antibody must first be fixed stably, that is to say it must not be released in contact with the media used for the formation of the antigen-antibody complex.
  • the binding must not significantly alter the reactivity of the antibody vis-à-vis the antigen.
  • fixation means can be envisaged on a solid support. These means depend to a large extent on the nature of the support material. In a simplified manner, two kinds of fixation can be envisaged: a fixation involving stable chemical bonds, in particular covalent bonds for the case where the material has functional groups capable of fixing the antibodies, a fixing by adsorption on the support material .
  • a wide variety of materials can be used as a support; however, because of their high cost and low cost, polymeric materials such as polystyrene, polyamide, polyethylene, etc. are advantageously used. The adsorption capacity of these materials is often low. In other words, the quantity of antibody fixed, and consequently of enzyme, in the complex, is low taking into account the volume of the support.
  • the support material to coat the support material with a film of a material having a higher adsorption power, and the inertia leads to the reaction medium.
  • the mode of fixation chosen it is necessary to introduce a constant quantity of antibodies during the various analyzes and calibration operations.
  • the quantity of anti-ordeals fixed is regulated by the identity of the various containers used and that of the antibody solutions with which they are brought into contact during fixation.
  • Coupled lipoprotein-enzyme compound If a support in the form of balls or similar corpuscles is used, it is ensured that an equal amount of homogeneous elements are introduced into the container during the analysis. 4) Coupled lipoprotein-enzyme compound.
  • the enzyme chosen must meet several conditions to allow practical use. It must first be stable. The reagents must be able to be stored for relatively long periods without undergoing significant degradation.
  • alkaline phosphatase peroxidase or -galactose oxidase are advantageously used.
  • the coupling of the enzyme to lipoproteins is carried out according to conventional techniques for attaching enzymes to proteins.
  • the coupling is carried out in such a way that neither the activity of the enzyme nor, above all, the reactivity of the apoprotein (with respect to the antibodies) is profoundly modified.
  • Different coupling methods are possible. It is preferred to use a coupling carried out with a dialdehyde, in particular glutaraldehyde.
  • Another advantageous form of coupling consists in forming a Schiff base.
  • the invention also relates to the devices used for implementing the method, and in particular the necessary products and reagents combined in the form of a practical presentation.
  • This presentation comprises at least one antibody specific for a serum apoprotein and the corresponding lipoprotein-enzyme complex (s), the various reagents being in amounts dosed and isolated from each other under conditions suitable for their preservation.
  • the antibody or antibodies are fixed on containers intended for analysis.
  • containers are preferably tubes or tanks which can be used directly, without transfer, in the measuring equipment, that is to say in a spectrophotometer or in a colorimeter.
  • Plates of the type used for microtitrations, and having a multiplicity of wells on which the antibodies are attached, can also be used, in particular for serial assays.
  • the containers containing the antibodies, as well as the lipoprotein-enzyme complexes, are stored protected from light and in airtight packaging.
  • the enzyme lipoprotein complex is preferably in solution.
  • the enzyme coupling product is preferably used with the serum lipoprotein fractions resulting from sedation by ultracentrifugation.
  • an enzyme-VLDL complex for the analysis of apoprotein C 1 , C 2 , C 3 or E, an enzyme-LDL complex for the assay of apoprotein B, and an enzyme-HDL complex for apoprotein A 1 or A 2 .
  • the enzyme-lipoprotein complexes are advantageously dosed approximately equivalent to the amounts corresponding antibodies. They can be presented in the form of unit doses, in ampoules for example, or in a bottle containing the doses necessary for all of the containers contained in the presentation.
  • the presentation according to the invention also contains primary or secondary standard reagents as described above and therefore consist either of a purified apoprotein or a lipoprotein fraction. These standards are advantageously presented in lyophilized form and can be reconstituted by adding distilled water.
  • the presentation may also contain the reagents necessary for measuring the enzymatic activity.
  • the presentation can finally contain bottles for the measurement medium and / or the washing medium used according to the method.
  • the procedure is carried out by immunization of rabbits with apoprotein of human origin obtained by preparative ultracentrifugation.
  • emulsified antigens 50 ⁇ g are injected intradermally at several points in the Freund couplet adjuvant. A recall under the same conditions is made two months later. Blood is collected after 8 months by cardiac puncture and the serum is isolated. From the latter, the immunoglobulins are separated by selective precipitation with ammonium sulfate.
  • the containers used are rectangular crystal polystyrene tanks. Three fixing methods have been implemented. a) By covalent bond.
  • a surface nitration of the polystyrene is carried out by contact with an HNO 3 -H 2 SO 4 mixture, followed by the reduction of the nitro groups to amino.
  • the amino groups are then diazotized and the diazo formed is copulated with free amino groups of the antibody to be fixed. b) By adsorption on the surface of the tank.
  • the polystyrene tanks are filled with this solution. After a few minutes, the liquid is removed by suction and the tanks are dried.
  • the incubation is carried out as in b) but lasts only 30 minutes.
  • EXAMPLE 3 Enzyme-apoprotein coupling.
  • the lipoproteins used come from a preparative ultracentrifugation allowing the separation of the fractions according to their density.
  • the solution is dialyzed at 4 ° C for 16 hours against a phosphate-buffered saline at pH 7.4, renewing the buffer. 10 ⁇ l of a 4.2% glutaraldehyde solution are added in the same buffer. After 2 hours of reaction at room temperature (20-25 ° C), the mixture is again dialyzed under the same conditions as above.
  • the complex collected is diluted to 4 ml by the phosphate buffered saline solution supplemented with 1% serum albumin and containing a bactericidal agent. This solution is that used later for the measurement. In this form, the complex can be stored at 4 ° C for more than a year.
  • Glutaraldehyde in addition to its role as a coupling agent, stabilizes the protein.
  • a variant of the mode described above consists in carrying out the coupling in two stages. In. the first, glutaraldehyde reacts in excess with one of the constituents of the complex. The excess glutaraldehyde is eliminated and the second constituent is reacted.
  • glutaraldehyde reacts in excess with one of the constituents of the complex. The excess glutaraldehyde is eliminated and the second constituent is reacted.
  • an enzyme such as peroxidase
  • EXAMPLE 4 Measurement protocol. To determine the level of a serum apoprotein in a sample, a container is used on the walls of which is fixed the antibody corresponding to this apoprotein. The container can be prepared extemporaneously or in advance, as indicated above, and kept dry at 4 ° C.
  • the measurement medium used is phosphate-buffered saline at pH 7.4, containing 1% bovine albumin to avoid parasitic adsorption and a bactericidal agent such as merthiolate or sodium azide at rai 0.02% sound.
  • 0.3 ml of the measurement medium is introduced into the container. 0.5 ml is added either of a dilution in the same medium of the serum sample to be analyzed, or of the medium alone when making a "blank", or of a dilution in the same medium of standards intended to calibrate the dosage. Finally, 0.2 ml of a 1/250 dilution is added to this medium of the lipoprotein-enzyme complex. After overnight incubation, the containers are emptied and washed 3 times with the buffer.
  • the residual enzymatic activity is measured by adding reagents and substrates corresponding to the enzymes used.
  • reaction After incubation at room temperature for 30 to 120 minutes, the reaction is stopped by adding 0.1 ml of 1 M sodium hydroxide.
  • the absorbance is measured with a spectrophotometer, at 480 nm, against a "blank", directly through the container if it is intended for this use, or by transfer to the appropriate tanks.
  • the activity of the peroxidase can be measured by adding to the container a solution containing 0.94 mg of phenol, 0.4 mg of amino-4-phenazone, 0.075 ml of methanol, 0.02 ml of Triton X 100 in 1 ml of potassium phosphate buffer O, 4 M, pH 7.7.
  • the absorbance measurement is carried out by reading at 500 nm against a blank under the same conditions as in a).
  • purified apoproteins can be used directly in a determined amount (by protein dosage or by gravimetry). This procedure constitutes direct or primary calibration.
  • primary standards are used as there are separate apoprotein measurements (C 1 , C 2 , C 3 , E, A 1 , A 2 ).
  • Apoprotein B is difficult to obtain pure; lipoprotein isolated by ultracentrifugation in the density range of 1.043 - 1.055 and quantified by protein assay is used as the primary standard.
  • secondary standards determined by the measurement method described above and by comparison with primary standards.
  • These secondary standards can be made from a human serum kept liquid at 4 ° C. and containing a bactericide, or frozen, or even freeze-dried. This serum is calibrated for each of the apoproteins it contains. It is also possible to use serum fractions by type VLDL, LDL and HDL.
  • the container used is a 2 ml crystal polystyrene capacity tube and is coated with a film of cellulose nitrate as described in Example 2.
  • the tubes are incubated for 30 minutes at 37 ° C. with an antiserum solution. anti-apoprotein C 3 rabbit.
  • the incubation solution (1 ml) is a sodium carbonate buffer, pH 9.8, containing 2 ⁇ g of protein from the immunoglobin fraction of the antiserum.
  • the tubes are washed 3 times with the washing buffer constituted by the phosphate saline buffer at pH 7.4, containing 0.065% Tween 20. For each washing, the tubes are filled with the washing solution.
  • VLDL isolated by density 1.006 ultracentrifugation are coupled to alkaline phosphatase by glutaraldehyde in a single step.
  • the measurement medium is constituted by the phosphate salt buffer pH 7.4 containing 1% of serum albumin bovine and 0.02% sodium azide.
  • each tube Into each tube are introduced 0.3 ml of the measuring medium, 0.5 ml of a “measuring” solution of apoprotein C 3 in the same medium, and 0.2 ml of a 1/250 dilution always in the same medium of the mother solution of the VLDL-enzyme conjugate.
  • C 3 apoproteins "measured" are respectively 10, 25, 50, 100 and 200 nanograms. After an overnight incubation at room temperature, the tubes are emptied and washed 3 times with the washing buffer.
  • the measurement of the enzymatic activity is made as indicated in Example 4 - a) over a period of 30 minutes.

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Abstract

L'invention est relative a un procede pour le dosage des lipoproteines seriques par une methode immuno-enzymatique. Le procede selon l'invention consiste a faire reagir un anticorps specifique de l'apoproteine dosee, fixe sur un support, avec, d'une part, le compose de couplage de la lipoproteine correspondante avec un enzyme et, d'autre part, l'echantillon analyse. La quantite d'enzyme fixe est alors une fonction inverse de la teneur en apoproteine de l'echantillon. On separe le support avec les produits qui lui sont fixes du reste des reactifs, et l'on mesure l'activite de l'enzyme du support que l'on compare a des mesures etalon. Le procede est utile pour les analyses seriques, notamment pour le depistage de risques d'affections cardiovasculaires.

Description

Procédé et dispositif pour le dosage des lipoprotéines sériques.
L'invention est relative à un procédé pour le dosage des lipoprotéines sériques ainsi qu'aux dispositifs pour la mise en oeuvre de ce procédé. De façon plus précise, le procédé selon l'invention est destiné au dosage des constituants protéiques des lipoprotéines sériques. Des études épidémiologiques récentes sur les risques d'apparition de maladies cardio-vasculaires ont montré l'intérêt de la détermination des taux de lipoprotéines sériques non seulement globalement, mais aussi et surtout en effectuant une distinction selon le groupe auquel ces lipoprotéines appartiennent, et, à l'intérieur de ces groupes, selon le type d'apoprotéine (C1, C2, C3, E, B, A1, A2) . Traditionnellement, les trois groupes principaux considérés sont les VLDL, LDL et HDL, ces abréviations correspondant aux termes anglais "very light density lipoprotein", "light density lipoprotein" et "high density lipoprotein". Cette désignation fait référence à la façon dont s'effectue le partage dans les techniques de séparation par ultracentrifugation. L'importance de cette distinction réside dans le fait que des corrélations étroites ont pu être établies, d'une part, entre les taux de ces types de lipoprotéines et, d'autre part, le risque d'apparition des maladies en question. De façon très succincte, le risque est d'autant plus grand que les taux de VLDL et LDL (et de l' apoprotéine B) sont élevés et, au contraire, d'autant plus faible que le taux de HDL est élevé.
Pour mesurer les taux des différents types de lipoprotéines, plusieurs techniques ont été proposées antérieurement, qui comprennent une sé-oaration des différentes fractions de lipoprotéines de l'échantillon analysé, puis le dosage des fractions ainsi séparées. La principale difficulté de ce genre d'analyse réside dans la séparation des différentes fractions. Ainsi, les méthodes de séparation par ultracentrifugation ne sont pas praticables pour des analyses effectuées en grand nombre. Pour ces analyses de routine, les seules méthodes actuellement utilisées comprennent une séparation par précipitation sélective. La précision de ces méthodes repose notamment sur la spécificité de la précipitation effectuée dans les recherches antérieures, et on s'est efforcé de mettre en oeuvre des moyens améliorant cette spécificité. Des améliorations appréciable ont pu être obtenues dans ce domaine par un choix approprié de conditions et d'agent utilisés pour cette précipitation. De plus, les méthodes traditionnelles ne permettent pas la séparation de chaque type d'apoprotéine à l'intérieur d'un même groupe. Cependant, un accroissement supplé entaire de la précision et de sensibilité des mesures, tout en maintenant une grande facilité de mise en oeuvre et la possibilité de doser chaque apoprotéine, était souhaitable.
La présente invention s'est donc proposée de fournir des moyens pour la réalisation d'un dosage des différentes lipoprotéines ou fractions de lipoprotéines, qui soit à la fois simple, très sensible et précis.
Ce but a été atteint, selon l'invention, par la mise en oeuvre, pour le dosage des lipoprotéines sériques, d'un procédé combinant des techniques immunologiques et enzyma tiques, et présentant la spécificité des unes et la grande sensibilité des autres.
Selon l'invention, le procédé consiste à faire réagir, dans des conditions appropriées pour la formation d'un complexe du type anticorps-antigène, d'une part, une quantité donnée d'un anticorps spécifique de la ou des apoprotéines que l'on veut doser, cet anticorps étant fixé sur un support solide inerte vis-à-vis du milieu réactionnel dans lequel est formé le complexe anticorpsantigène et du milieu dans lequel est mesurée ultérieurement l'activité enzymatique, d'autre part, l'échantillon sérique à analyser et une quantité donnée d'un composé de couplage de la lipoprotéine du type de celle à doser, ou de plusieurs lipoprotéines dont celle à doser, avec un enzyme qui n'altère pas la formation du complexe antigène anticorps ; cette dernière étant réalisée, les réactifs non fixés sur la phase solide support sont éliminés et l'on mesure l'activité enzymatique du complexe attaché au support. Le principe de la mesure est le suivant. Les antigènes présents dans l'échantillon à doser et dans le composé couplé aux enzymes sont en compétition dans la formation du complexe antigène-anticorps. La quantité d'enzyme dans le cσriplexe formé est fonction de la quantité d'antigène dans l'échantillon analysé, et d'autant plus faible que cette dernière est plus grande. Après élimination des réactifs non fixés sur le support, la mesure de l'activité enzymatique du support constitue donc indirectement une détermination de la quantité de la protéine, présente dans l'échantillon analysé, correspondant à l'anticorps spécifique fixé sur le support.
La séparation du complexe antigène-anticorps, et la mesure d'activité qui lui fait suite, est d'autant plus facile que l'on opère en phase hétérogène. Pour des raisons de commodité, il est avantageux d'utiliser les anticorps en phase hétérogène, ce que l'on obtient par leur fixation sur le support. Il est cependant possible également de réaliser 1 ' hétérogénécité des phases après la formation du complexe antigène-anticorps (ou simultanément) suivant les techniques habituelles utilisées en analyse enzymatique : précipitation, adsorption sélective, etc.
Dans tous les cas, il est nécessaire, selon l'invention, d'aboutir à une forme hétérogène fixant le com¬plexe et qui soit facilement séparable des constituants du mélange restés dans la phase liquide. Dans la suite de la description, on ne développe que le cas des anticorps fixés sur support solide. Ce cas représente en effet, comme il a été dit, la mise en oeuvre la plus commode et la plus simple. Une façon pratique consiste à utiliser, pour support des anticorps, le matériau même du récipient dans lequel la réaction de complexation est effectuée. Ainsi, une fois cette réaction accomplie, il suffit d'évacuer le milieu réac tionnel ; le récipient contenant le complexe peut alors servir directement pour la mesure de l'activité enzymatiqu retenue, par introduction du substrat ar>proprié.
Si la fixation de l'anticorps sur le récipient con titue une forme préférée, on peut également le fixer sur un support indépendant de celui-ci. Dans ce sens, tout support capable de fixer les anticorps, quelle que soit sa forme, peut être utilisé. Il est préférable cependant de choi'sir le suoport de telle sorte qu'il permette un bon contact avec le milieu reactionnel, d'une part, et, d'autr part, puisse se séparer aisément une fois la réaction achevée. Des formes telles que des grains, billes, perles... conviennent particulièrement.
Pour réaliser le procédé de dosage selon l'invention, il est nécessaire d'utiliser un composé formé par le couplage de l'apoprotéine et d'un enzyme. La réaction ne s'effectue, bien entendu, qu'entre les anticorps et les antigènes correspondants. Seul, l'apoprotéine-enzyme correspondant à l'anticorps fixé est susceptible de réagir. Cependant, compte tenu de la difficulté et par conséquent du coût, de la préparation et de la purification d'apoprotéines isolées, il est avantageux d'utiliser non pas le composé de couplage d'un enzyme avec une apoprotéine, mais celui résultant du couplage avec un ensemble d'apoprotéines sériques. Le mélange d 'apoprotéine s-enzyme joue le même rôle vis-à-vis de l'anticorps spécifique que l'apoprotéine isolée.
Il est commode d'utiliser comme composé de couplage apoprotéine-enzyme celui résultant de la fixation de l'enzyme sur les fractions de lipoprotéines telles qu'obtenues par les techniques de fractionnement traditionnelles.
Avantageusement, on règle les quanhités d'anticorps et de composé apoprotéine-enzyme de telle sorte que le dosage présente un maximum de sensibilité. Avantageusement, ces quantités sont voisines de l'équivalence.
Nous allons maintenant considérer de façon plus détaillée chacun des moyens utilisés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention. 1°) Les apoprotéines.
Les lipoprotéines sont constituées, comme leur nom l'indique, d'une partie lipidique et d'une partie protéique, l'apoprotéine. Certaines de ces apoprotéines sont caractéristiques des fractions lipoprotéiques indiquées précédemment. Les apoprotéines C1, C2, C3, sont portées essentiellement par les VLDL ; l'apoprotéine B est portée par les LDL et les VLDL ; les apoprotéines A1 et A2 sont portées par les HDL ; l'apoprotéine E apparaît dans certains cas d 'hyperprotéinémies (dans la fraction VLDL). Toutes ces apoprotéines sont porteuses de déterminants immunogéniques saécifiques. C'est par la spécificité de ces déterminants dans la réaction de formation du complexe que l'on peut doser une apoprotéine déterminée au sein d'un échantillon serique complet, c'est-à-dire d'un échantillon sur lequel il n'est pas nécessaire de procéder au préalable à des opérations de séparation.
La préparation des apoprotéines purifiées nécessaires pour obtenir les anticorps correspondants est faite à partir des fractions de lipoprotéines sériques traditionnellement séparées par ultracentrifugation sur gradient de densité.
Les fractions de lipoprotéines une fois séparées sont soumises à une délipidation et les apoprotéines distinctes sont isolées par une méthode également' traditionnelle telle que chromatographie, électrophorèse, etc.
Par ailleurs, les lipoprotéines sériques fractionnées servent également à la préparation des composés de couplage lipoprotéine-enzyme. 2°) Les anticorps spécifiques.
Ils sont obtenus suivant un mode traditionnel, par immunisation d'un animal vis-à-vis de l'apoprotéine humaine isolée. Divers protocoles peuvent être utilisés pour la vaccination conduisant plus ou moins rapidement à une teneur plus ou moins forte en anticorps spécifiques. Pour préparer cet antisérum contenant ces anticorps, on utilise avantageusement des lapins, mais d ' autres animaux peuvent également être utilisés : chèvre, mouton, cheval, cobaye, etc.
Les antigènes spécifiques sont administrés à une dose suffisante pour engendrer une réponse immunitaire. Eventuellement, l'antigène est administré avec un adjuvant stimulant la réponse. Des administrations de rappel peuvent également être effectuées pour amplifier la formation des anticorps. Le sang de l'animal immunisé est ensuite prélevé et l'on sépare le sérum contenant les anticorps. Pour faciliter les opérations ultérieures, il peut être avantageux d'isoler les immunoglobulines de ce sérum par des méthodes connues, υar exemple par précipitation. 3°) Fixation des anticorps sur le support.
La fixation doit répondre à plusieurs exigences. L'anticorps doit d'abord être fixé de façon stable, c'est-à-dire qu'il ne doit pas être libéré au contact des milieux utilisés pour la formation du complexe antigène-anticorps.
La fixation ne doit pas altérer de façon sensible la réactivité de l'anticorps vis-à-vis de l'antigène.
Plusieurs moyens de fixation sont envisageables sur un support solide. Ces moyens dépendent pour une large part de la nature du matériau support. De façon simplifiée, deux sortes de fixation peuvent être envisagées : une fixation mettant en jeu des liaisons chimiques stables, notamment des liaisons covalentes pour le cas où le matériau présente des groupements fonctionnels capables de fixer les anticorps, une fixation par adsorption sur le matériau support. Des matériaux très divers peuvent être utilisés comme support ; cependant, en raison de leur coir ité d'emploi et de leur faible coût, on utilise avantageusement des matériaux polymères tels que polystyrène, polyamide, polyéthylène, etc. La capacité d'adsorption de ces matériaux est souvent faible. Autrement dit, la quantité d'anticorps fixée, et par suite d'enzyme, dans le complexe, est faible compte tenu du volume du support. Pour accroître l'adsorption, il est possible, selon l'invention, de revêtir le matériau support d'une pellicule d'un matériau présentant un pouvoir d'adsorption plus élevé, et la mène inertie vis-à-vis du milieu reactionnel. Quel que soit le mode de fixation choisi, il est nécessaire d'introduire une quantité constante d'anticorps au cours des différentes analyses et opérations d'étalonnage. Lorsque la fixation est faite sur la paroi du récipient d'analyae, la quantité d'anti-^ords fixée est réglée par l'identité des différents récipients utilisés et celle des solutions d'anticorps avec lesquelles ils sont mis en contact au cours de la fixation.
Si l'on utilise un support sous forme de billes ou de corpuscules analogues, on veille à ce qu'une quantité égale d'éléments homogènes soient introduits dans le récipient lors de l'analyse. 4°) Composé couplé lipoprotéine-enzyme.
L'enzyme choisi doit répondre à plusieurs conditions pour permettre une utilisation pratique. II doit d'abord être stable. Les réactifs doivent pouvoir être conservés pendant des périodes relativement longues sans subir de dégradation sensible.
Il doit présenter une activité importante facile à quantifier et surtout cette activité ne doit pas s'exercer vis-à-vis des constituants du milieu de la réaction immunochimique aboutissant au complexe antigène-anticorps. L'enzyme ne doit pas non plus se trouver dans les constituants sériques.
Parmi les enzymes utilisables répondant à ces conditions, on utilise avantageusement l'alkaline-phosphatase, la peroxydase ou la -galactose oxydase.
Le couplage de l'enzyme aux lipoprotéines (ou apoprotéines) est réalisé suivant des techniques classiques de fixation des enzymes sur des protéines. Le couplage est conduit de façon que ni l'activité de l'enzyme, ni surtout la réactivité de 1 'apoprotéine (vis-à-vis des anticorps) ne soient profondément modifiées. Différentes méthodes de couplage sont possibles. On préfère utiliser un couplage réalisé avec un dialdéhyde, notamment le glutaraldéhyde. Une autre forme avantageuse de couplage consiste à former une base de Schiff.
Selon un autre aspect, l'invention concerne également les dispositifs utilisés pour la mise en oeuvre du procédé, et notamment les produits et réactifs nécessaires réunis sous forme d'une présentation pratiσue.
Cette présentation comprend au moins un anticorps spécifique d'une apoprotéine sérique et le ou les complexe(s) lipoprotéine-enzyme corresondant (s), les différents réactifs étant en quantités dosées et isolés les uns des autres dans des conditions appropriées pour leur conservation.
Avantageusement, dans cette présentation, le ou les anticorps sont fixés sur des récipients destinés à l'analyse. Ces récipients sont de préférence des tubes ou cuves directement utilisables, sans transvasement, dans l'appareillage de mesure, c'est-à-dire dans un spectrophotomètre ou dans un colorimètre. Des plaques du type utilisé pour les microtitrations, et présentant une multiplicité de cupules sur lésquelles sont fixés les anticorps, peuvent également être utilisées, en particulier pour les dosages en série.
Les récipients contenant les anticorps, de même que les complexes lipoprotéine-enzyme, sont conservés à l'abri de la lumière et dans des emballages étanchesl
Le complexe lipoprotéine enzyme est de préférence en solution. Comme nous l'avons indiqué précédemment, suiyant le type d'apoprotéine analysé, on utilise de préférence le produit de couplage de l'enzyme avec les fractions de lipoprotéines sériques résultant de la sédaration par ultracentrifugation. Ainsi, oh utilise avantageusement un complexe enzyme-VLDL pour l'analyse de l'apoprotéine C1, C2, C3 ou E, un complexe enzyme-LDL pour le dosage de l'apoprotéine B, et un complexe enzyme-HDL pour l'apoprotéine A1 ou A2.
Les complexes enzyme-lipoprotéines sont dosés avantageusement de façon environ équivalente aux quantités des anticorps correspondants. Ils peuvent être présentés sous forme de doses unitaires, en ampoules par exemple, ou dans un flacon regroupant les doses nécessaires à l'ensemble des récipients contenus dans la présentation. La présentation selon l'invention contient en outre des réactifs étalons primaires ou secondaires tels que décrits précédemment et constitués, par conséquent, soit par une apoprotéine purifiée, soit par une fraction lipoprotéinique. Ces étalons sont avantageusement présentés sous forme lyophilisée et peuvent être reconstitués par addition d'eau distillée.
La présentation peut aussi contenir les réactifs nécessaires à la mesure de l'activité enzymatique. La présentation peut enfin contenir des flacons pour le milieu de mesure et/ou le milieu de lavage utilisés selon le procédé.
Les exemples suivants illustrent de façon détaillée différentes caractéristiques du procédé et du dispositif selon l'invention.
EXEMPLE 1 Préparation des anticorps spécifiques.
L'on opère par immunisation de lapins au moyen d'apoprotéine d'origine humaine obtenue par ultracentrifugation préparative.
On injecte intradermiquement en plusieurs points 50 μg d'antigènes émulsifiés dans l'adjuvant couplet de Freund. Un rappel dans les mêmes conditions est effectué deux mois plus tard. Le sang est collecté après 8 mois par ponction cardiaque et l'on isole le sérum. De ce dernier, on sépare les immunoglobulines par précipitation sélective au sulfate d'ammonium.
EXEMPLE 2 Fixation des anticorps aux parois du récipient.
Dans ce qui. suit, les récipients utilisés sont des cuves parallépipédiques en polystyrène "cristal". Trois modes de fixation ont été réalisés. a) Par liaison covalente.
On effectue une nitration superficielle du polystyrène par contact avec un mélange HNO3-H2SO4, suivie de la réduction des groupes nitro en amino. Les groupes amino sont ensuite diazotés et le diazo'ique formé est copule avec des groupes aminé libres de l'anticorps à fixer. b) Par adsorption à la surface de la cuve.
2 μg de protéines de la fraction immunoglobuline sont ajoutés à 1 ml de tampon carbonate de sodium pH = 9,8 Après une incubation de 3 heures à 37°C, le contenu liquid est éliminé et les récipients sont lavés trois fois avec du tampon phosphate salin à pH 7,4, à 4°C, contenant 0,065 % d 'un agent tensio-actif comme le Tween 20 ou le Triton X 100. c) Par adsorption sur une pellicule de cellulose.
Pour obtenir une adsorption plus forte, il est possible de déposer à la surface du récipient une pellicule adsorbante.
On dissout à cet effet 1,5 g de cellulose (ou d'un dérivé cellulosique ccmme le nitrate de cellulose ou le brcmo-acétyl-cellulose) dans 15 ml d'acétone. Après dissolution complète, on ajoute 85 ml d'éthanol absolu.
Les cuves de polystyrène sont remplies de cette solution. Après quelques minutes, le liquide est éliminé par aspiration et les cuves sont séchées.
L'incubation s'effectue comme en b) mais ne dure que 30 minutes.
EXEMPLE 3 Couplage enzyme-apoprotéine. Les lipoprotéines utilisées proviennent d'une ultracentrifugation préparative permettant la séparation des fractions selon leur densité.
Trois couplages différents ont été réalisés, a) Une suspension d'alkaline phosphatase (0,3 ml) est centrifugée sur une centrifugeuse de laboratoire pendant 2 minutes. Le surnageant est éliminé et le précipité d'environ 1,5 mg de matière solide est dissout dans 0,2ml de la solution de lipoprotéine contenant environ 2,3mg de protéine par millilitre.
La solution est dialysée à 4°C pendant 16 heures contre un tampon phosphate salin à pH 7,4 en renouvelant le tampon. On ajoute 10 μl d'une solution à 4, 2 % de glutaraldéhyde dans le même tampon. Après 2 heures de réaction à la température ambiante (20-25°C) , le mélange est à nouveau dialyse dans les mêmes conditions que précédemment. Le complexe recueilli est dilué à 4 ml par la solution tampon de phosphate salin additionnée de 1 % d' albumine sérique et contenant un agent bactéricide. Cette solution est celle utilisée ultérieurement pour la mesure. Sous cette forme, le complexe peut être conservé à 4°C pendant plus d'un an. Le glutaraldéhyde, en plus de son rôle d'agent de couplage, stabilise la protéine. b) Une variante du mode décrit précédemment consiste à effectuer le couplage en deux temps. Dans. le premier, le glutaraldéhyde réagit en excès avec un des constituants du complexe. Le glutaraldéhyde excédentaire est éliminé et l'on fait réagir le second constituant. c) Suivant une autre méthode, lorsque l'on utilise un enzyme comme la peroxydase, il est possible d'oxyder la partie glucidique de l'enzyme par du periodate pour former une fonction aldéhyde. Cette fonction permet la formation d'une base de Schiff avec une fonction aminé libre de la partie protéique de la lipoprotéine.
EXEMPLE 4 Protocole de mesure. Pour déterminer le taux d'une apoprotéine sérique dans un échantillon, on utilise un récipient sur les parois duquel est fixé l'anticorps correspondant à cette apoprotéine. Le récipient peut être préparé extemporanément ou à l'avance, comme indiqué précédemment, et conservé sec à 4°C. Le milieu de mesure utilisé est le tampon phosphate salin à pH 7,4, contenant 1 % d'albumine bovine pour éviter les adsorptions parasites et un agent bactéricide comme le merthiolate ou l'azoture de sodium à rai son de 0,02 %.
On introduit dans le récipient 0,3 ml du milieu de mesure. On ajoute 0,5 ml soit d'une dilution dans le même milieu de l'échantillon sérique à analyser, soit du milieu seul lorsque l'on fait un "blanc", soit d'une dilution dans le même milieu d'étalons destinés à calibrer le dosage. On ajoute enfin 0,2 ml d'une dilution au 1/250 dans ce milieu du complexe lipoprotéine-enzyme. Après une nuit d'incubation, les récipients sont vidés et lavés 3 fois avec le tampon.
L'activité enzymatique résiduelle est mesurée par addition des réactifs et substrats correspondant aux enzymes utilisés.
Par exemple, on peut effectuer l'une des mesures suivantes. a) Pour l'alkaline-phosphatase, on ajoute au récipient
1 mg de p.nitrophenylphosphate dans 1 ml de tampon 0,05 M de carbonate de sodium pH 9,8, et 1 mM MgCl2.
Après incubation à température ambiante pendant 30 à 120 minutes, on stoppe la réaction par addition de 0,1 ml de soude 1 M.
On mesure l'adsorbance au spectrophotomètre, à 480 nm, contre un "blanc", directement à travers le récipient s'il est prévu pour cet usage, ou par transvasement dans les cuves appropriées. b) L'activité de la peroxydase peut être mesurée par addition dans le récipient d'une solution contenant 0, 94 mg de phénol, 0,4 mg d'amino-4-phénazone, 0,075 ml de méthanol, 0,02 ml de Triton X 100 dans 1 ml de tampon phosphate de potassium O, 4 M, pH 7,7.
Après 30 minutes d'incubation à la température ambiante, on effectue la mesure d'adsorbance par lecture à 500 nm contre un blanc dans les mêmes conditions qu'en a) . Pour effectuer l'étalonnage du dosage de chaque apoprotéine, on peut utiliser directement des apoprotéines purifiées en quantité déterminée (par dosage des protéines ou par gravimétrie) . Cette façon de procéder constitue un étalonnage direct ou primaire. On utilise autant d'étalons primaires que l'on veut effectuer de mesures d 'apoprotéines distinctes (C1, C2, C3, E, A1, A2) . L' apoprotéine B est difficile à obtenir pure ; on utilise, à titre d'étalon primaire, la lipoprotéine isolée par ultracentrifugation dans le domaine de densité de 1,043 - 1,055 et quantifiée par dosage de protéine.
Compte tenu des difficultés qu'il peut y avoir à préparer des quantités importantes de ces étalons primaires, il est avantageux d'utiliser des étalons secondaires déterminés par la méthode de mesure précédemment décrite et par comparaison à des étalons primaires. Ces étalons secondaires peuvent être constitués à partir d'un sérum humain conservé liquide à 4°C et contenant un bactéricide, ou congelé, ou encore lyophilisé. Ce sérum est calibré pour chacune des apoprotéines qu'il contient. On peut également utiliser des fractions sériques par type VLDL, LDL et HDL.
EXEMPLE 5 Dosage de l'apoprotéine C3 selon le protocole décrit à l'exemple 4.
Le récipient utilisé est un tube de contenance 2 ml en polystyrène cristal et est revêtu d'une pellicule de nitrate de cellulose de la façon décrite à l'exemple 2. Les tubes sont incubés 30 minutes à 37°C avec une solution d'antisérum de lapin anti-apoprotéine C3. La solution d'incubation (1 ml) est un tampon carbonate de sodium pH 9,8, contenant 2 μg en protéine de la fraction immunoglobine de l'antisérum. Après incubation, les tubes sont lavés 3 fois avec le tampon de lavage constitué par le tampon phosphate salin à pH 7,4, contenant 0,065 % de Tween 20. Pour chaque lavage, les tubes sont remplis de la solution de lavage.
Des VLDL isolées par ultracentrifugation à densité 1,006 sont couplées à de l'alkaline phosphatase par le glutaraldéhyde en une seule étape.
Le milieu de mesure est constitué par le tampon phosphate salin pH 7,4 contenant 1 % d'albumine sérique bovine et 0,02 % d'azoture de sodium.
Dans chaque tube sont introduits 0,3 ml du milieu de mesure, 0,5 ml d'une solution "à mesurer" d 'apoprotéine C3 dans le même milieu, et 0,2 ml d'une dilution au 1/250 toujours dans le même milieu de la solution mère du conjugué VLDL-enzyme.
Les quantités d ' apoprotéines C3 "mesurées" sont re pectivement 10, 25, 50, 100 et 200 nanogrammes. Après une nuit d'incubation à la température ambiante, les tubes sont vidés et lavés 3 fois avec le tampon de lavage.
La mesure de l'activité enzymatique est faite comm indiqué à l'exemple 4 - a) sur un temps de 30 minutes.
Les résultats des mesures sont présentés à la figure 1. Le pourcentage d'adsorbance à la longueur d'onde de 480 nm par rapport à un "blanc" est indiqué en fonction de la quantité d'apoprotéine introduite.
On constate, dans l'intervalle de concentration considéré, une bonne linéarité du pourcentage en question en fonction du logarithme de la concentration en apoprotéine.
Grâce à l'invention, on dispose de moyens pour le dosage des apoprotéines sériques, dosage effectué de façon très spécifique, très sensible (jusqu'à 0,001 yg/ml d'apoprotéine exprimé en contenu d'azote) et de bonne précision
(l'erreur sur la mesure est normalement inférieure à 5 %) .

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé pour le dosage d'apoprotéines sériques consistant à faire réagir, d'une part, une quantité donnée d'un anticorps spécifique de l'apoprotéine dosée, ledit anticorps étant fixé sur un support solide inerte, et, d'autre part, l'échantillon sérique à analyser et une quantité donnée d'un composé de couplage enzyme-lipoprotéine (correspondant à l'apoprotéine à doser), la réaction anticorps-lipoprotéine étant réalisée, à séparer le support des réactifs non fixés, et à mesurer l'activité enzymatique du complexe retenu sur le support.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le composé de couplage est celui résultant de la fixation d'un enzyme sur une fraction de lipoprotéine sérique contenant plusieurs apoprotéines distinctes.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la fraction de lipoprotéine est soit la fraction VLDL, soit la fraction LDL, soit la fraction HDL, telles que définies dans les méthodes de séparation par ultracentrifugation.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé de couplage enzyme-lipoprotéine résulte d'un couplage au moyen de glutaraldéhyde, ou par formation d'une base de Schiff.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'enzyme du composé enzyme-lipoprotéine est l'alkaline-phosphatase, la peroxydase ou la galactose oxydase.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'anticorps est fixé au support solide de façon covalente.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'anticorps est fixé au support par adsorption.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le support solide est revêtu d'une pellicule d'un matériau adsorbant.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que le matériau d' adsorption est une cellulose ou un dérivé cellulosique.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support de l'anticorps est le récipient dans lequel l'analyse est effectuée.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que, après réaction anticorps-lipoprotéine, le récipient est vidé et lavé, et l'on y introduit les réactifs pour la mesure de l'activité enzymatique, la mesure étant effectuée dans le récipient lui-même.
12. Présentation pour la mise en oeuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle regroupe dans un même ensemble au moins un anticorps spécifique d'une apoprotéine sérique et le (ou les) lipoprotéine (s)-enzyme correspondant (s).
13. Présentation selon la revendication 12, caractérisée en ce que l'anticorps est fixé sur les parois de récipients utilisés pour l'analyse.
14. Présentation selon la revendication 13, caractérisée en ce que les récipients sont des tubes à hémolyse, des cuves de spectrophotométrie ou des plaques de microtitration.
15. Présentation selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre des lipoprotéines étalons.
16. Présentation selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisée en ce qu'elle comporte en outre les réactifs nécessaires à la mesure de l'activité enzymatique.
17. Présentation selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisée en ce qu'elle comprend également des solutions constituant les milieux de mesure et de lavage.
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