SE450861B - Forfarande och medel for bestemning av apolipoproteiner i serum - Google Patents

Description

lO 15 20 25 30 35 '4sotse1 .2 den utförda utfällningen är enligt den tidigare forskningen, och man arbetar på att försöka få fram medel för att förbättra denna specificitet. Väsentliga förbättringar har kunnat erhållas inom- detta område genom lämpligt val av betingelser och av medel för användning för åstadkommande av denna_utfällning.f Dessutom möjš liggör de kända metoderna inte separation av varje typ av apo- protein inom en och samma grupp.» Det skulle därför vara önskvärt att åstadkomma ytterligare förbättring av precisionen.och av känsligheten vid mätningarna, samtidigt som man bibehåller en enkel metodik för genomförande av analysen samt möjligheten att kvantitativt bestämma varje apoprotein. _ i id gFöreliggande uppfinning utgör en lösning på ovannämnda problem i och med att det enligt uppfinningen har visat sig möj- ligt att kvantitativt analysera olika lipoproteiner eller frak- tioner av lipoproteiner, varvid gäller att analysen på samma gång är enkel, mycket känslig och exakt. 7 _ Detta syfte har enligt uppfinningen uppnåtts genom att man för bestämningen av serumlipoproteiner använder sig av ett för- farande, vid vilket man kombinerar immunologiska och enzymatiska tekniker, varvid förfarandet uppvisar den specificitet.som gäller för den ena och den stora känslighet som gäller för den andra av dessa båda metoder. .A 3 a Förfarandet enligt uppfinningen består i att man bringar till omsättning å ena sidan en given kvantitet av en antikropp som är specifik för det apoprotein¿ som skall bestämmas, varvid nämnda antikropp är fixerad på en fast, inert bärare, och å andra sidan det serumprov, som skall analyseras, och en given kvantitet av ett [enzym-lipoproteíni]komplex _ ' VLDL~enzym för Apo C1, C2; CB och E; LDL-enzym för Apo C1, C2, C3 och B; öDL-enzym för Apo A1 och A2, som har förmåga att i konkurrens med det apoprotein som skall be- stämmas binda till den fastfasbundna apoprotein-antikroppen, att man utför reaktionen antikropp-lipoprotein, att man separerar bä- raren från de icke fixerade reaktanterna samt att man mäter den enzymatiska aktiviteten för komplexet kvarhållet på bäraren.

Principen för mätningen är följande. De antigener som är 10 15 20 25 ÉO 35 3 _ É 450 861 närvarande i det prov, som skall analyseras, och i-föreningen kopplad till enzymerna konkurrerar vid bildningen av komplexet av antigen och antikropp. Kvantiteten enzym i det bildade komp- lexet är en funktion av kvantiteten antigen i det analyserade provet och är lägre ju högre den sistnämnda kvantiteten är. Efter avlägsnande av de reaktanter, som inte har fixerats vid bäraren, utgör mätningen av enzymaktiviteten på bäraren sålunda indirekt en bestämning av kvantiteten protein närvarande i det analyserade provet, vilket motsvarar den specifika antikropp som har fixerats på bäraren. _ Separationen av komplexet antigen-antikropp samt den akti- vitetsmätning som följer därpå blir allt enklare ju mera man arbetar i heterogen fas. Av bekvämlighetsskäl är det fördel- aktigt att använda antikropparna i heterogen fas, vilket erhålles genom deras fixering vid bäraren. Det är dock likaväl möjligt fatt åstadkomma heterogeniteten mellan faserna efter bildningen av antigen-antikroppkomplexet (eller samtidigt därmed) enligt de metoder som vanligen användes vid enzymatisk analys: utfällning, selektiv adsorption, etc. ' I samtliga fall är det enligt uppfinningen nödvändigt att åstadkomma en heterogen form, som fixerar komplexet och som lätt kan separeras av de beståndsdelar i blandningen som finns kvar i vätskefasen. I fortsättningen kommer emellertid enbart det fall att beskrivas som innebär fixering av antikropparna_pâ_en fast bärare. Detta fall representerar i realiteten, såsom tidigare har omtalats, det bekvämaste och enklaste genomförandet.

Ett praktiskt genomförande består.i att som bärare för antikropparna använda samma material som behållaren, i vilken komplexbildningsreaktionen utföres. När denna reaktion sålunda väl är fullbordad, är det tillräckligt att avlägsna reaktions- mediet; behållaren innehållande komplexet kan härvid direkt an- vändas för mätning av den kvarvarande enzymatiska aktiviteten, genom införlivande av lämpligt substrat. . Även om fixeringen av antikroppen på behållaren utgör en föredragen utföringsform, kan man likaså fixera den vid en bärare som är oberoende av densamma. För detta ändamål kan man använda vilken som helst bärare med förmåga att fixera antikropparna oberoende av dess form. Det är emellertid lämpligt att välja bäraren på ett sådant sätt att den å ena sidan möjliggör god kon- lO 15 20' 25 I 30 35 450 861 4 takt med reaktionsmediet och ä andra sidan kan avskiljas lätt sedan reaktionen väl är fullbordad. Sådana former som korn, kulor; pärlor ... är speciellt väl lämpade. - ' D D .

För utförande av analysförfarandet enligt uppfinningen är det nödvändigt att använda en förening bildad.genom koppling av I apoprotein och ett enzymf Reaktionen sker naturligtvis enbart mellan antikropparna och motsvarande antigener. Endast det apo- protein-enzym som svarar mot den fixerade antikroppen är benäget att reagera. Med hänsyn till svårigheterna och därmed sammanhäng- ande kostnader är det dock för framställningen och reningen av iso- lerade apoproteiner lämpligt att använda inte den förening som erhålles genom koppling av ett enzym med ett apoprotein utan i- i stället den förening som härrör från koppling med ett flertal serumapoproteiner. Blandningen av apoproteiner-enzym spelar samma roll gentemot den specifika antikroppen som det isolerade apo- proteinet. 1 -Det är bekvämt att som apoprotein-enzymkopplingsförening använda den förening som härrör från fixering av enzymet på frak- tioner av lipoproteiner som de erhålbs medelst de kända fraktio- neringsmetoderna. ' I ' 7 I I _ Företrädesvis reglerar man kvantiteterna av antikropp och apoprotein-enzymförening på ett sådant sätt att analysen ger ett maximum ifråga om känslighet. Dessa kvantiteter ligger företrädes- vis i närheten av jämvikts- eller ekvivalenskvantiteterna.

De olika medel som användes för genomförande av förfarandet enligt uppfinningen kommer nu att beskrivas mera i detalj._ 1) Apoproteiner. I _ Lipoproteinerna utgöres, såsom framgår av namnet, av en lipiddel och en proteindel, apoproteinet. Vissa av dessa apopro- teiner är karakteristiska för de tidigare omtalade lipbprotein- fraktionerna. Apoproteinerna Cl, C2, C3 ingår i huvudsak i VLDL; apoprotein B_ingår i LDL och VLDL; apoproteinerna Al och A2 ingår i HDL; apoprotein E uppträder mkivissa fall av hyperproteinemi (i fraktionen VLDL). Alla dessa apoproteiner är bärare av speci- fika immunogena determinanter. Det är tack vare specificiteten för dessa determinanter vid reaktionen för bildning av komplexet som man kan bestämma ett visst apoprotein i ett komplett serum- prov, dvs ett prov, på vilket det inte är nödvändigt att i förväg utföra'separationsoperationer. lO 15 20 25 BO 35 i '450 861 s Framställningen av de renade apoproteiner som är nödvändiga för erhållande av motsvarande antikroppar sker utgående från frak- tioner av serumlipoproteiner, som har separerats-på konventionellt sätt medelst ultracentrifugering enligt täthetsgradienten.

När lipoproteinfraktionerna väl har separerats, utsättes de för en delipidering, och de bestämda apoproteinerna isoleras 7 medelst en likaså konventionell metod, såsom kromatografi, elektro- fores, etc. ' _ _ För övrigt fungerar de fraktionerade serumlipoproteinerna a likaväl för framställning av föreningar för koppling av lipopro- tein-enzym. I I l~å 2) 'specifika antikroppar. g _ I -Dessa erhålles på konventionellt sätt genom immunisering av ett djur gentemot isolerat humant apoprotein. Olika regler kan _ användas för vaocineringen, vilket mer eller mindre snabbt leder _till mer eller mindre hög halt av specifika antikroppar.

För framställning av detta antiserum innehållande dessa antikroppar använder man företrädesvis kaniner, men andra djur kan likaså användas: get, får,-häst, marsvin, etc. 7 I De specifika antigenerna administreras i en dos som är tillräcklig för åstadkommande av immuniseringsrespons. -Ev. ad- ministreras antigenet tillsammans med ett-adjuvantium, som sti- mulerar responsen. Upprepade administrationer kan också utföras för att förstärka bildningen av antikroppar. Blodet från det immuniserade djuret uttas därefter, och man separerar serumet innehållande antikropparna. För att underlätta de slutliga opera- tionerna kan det vara fördelaktigt att isolera immunoglobulinerna från detta serum medelst kända metoder, t.ex. genom utfällning. 3) Fixering av antikroppar på bäraren. iFixeringen skall uppfylla ett flertal krav." Antikroppen skall för det första fixeras på ett stabilt sätt, dvs så att den inte kan frigöras vid kontakt med de media som an- vändes för-bildningen av komplexet antigen-antikropp.

Fixeringen bör inte nämnvärt påverka reaktiviteten hos antikroppen relativt antigenet. l Ett flertal medel för fixering kan komma ifråga för en fast Dessa medel är tillstor del beroende av arten av bärar- material. Något förenklat kan man säga att två typer av fixering kan förekomma: en fixering under användning av stabila kemiska bärare. lO 15 'lyserna och justeringsoperationerna. 20 25 50 35 450 861 6 bindningar, speciellt kovalenta bindningar i det fall då materi- alet uppvisar funktionella grupper med förmåga att fixera anti- kropparna, oëh en fixering genom-adsorption_på bärarmaterialet.

Mycket olikartade material kan användas som bärare; på grund av att de är bekväma att använda och att de är relativt billigafanvänder man dock företrädesvis polymermaterial, såsom i polystyren, polyamid, polyeten, etc.

Adsorptionskapaciteten hos dessa material är ofta liten.

Med andra ord är_kvantiteten fixerad antikropp, och därmed enzym, i komplexet liten med hänsyn tagen till bärarvolymen. I syfte att öka adsorptionen är det enligt uppfinningen möjligt att belägga bärarmaterialet med en film av ett material, som uppvisar högre adsorptionsförmåga och som är lika inert i förhållande till reak- tionsmediet. I . '4 D Vilken fixeringsmetod som än användes, är det nödvändigt att införa konstant kvantitet av antikroppar under de olika ana- När fixeringen utföres på analysbehållarväggen, regleras kvantiteten fixerade antikroppar medelst identiteten mellan de olika använda behållarna ooh de - antikropplösningar, med vilka de bringas i kontakt under fixeringen.

Om man använder en bärare i form av kulor eller analoga kroppar, ser man till att lika stor kvantitet av homogena element införes i behållaren under analysen. ' 4) Kopplad förening av lipoprotein och enzym. _ Det valda enzymet bör uppfylla ett flertal betingelser för att tillåta ett praktiskt utnyttjande] _ _ i Det bör för det första vara stabilt. Reaktanterna bör kunna bevaras under relativt långa tidsperioder utan att undergâ nämnvärd nedbrytning; D D Det bör uppvisa betydande aktivitet, som är lätt att kvan- tifiera, och i synnerhet bör denna aktivitet inte utövas gentemot beståndsdelarna i mediet för den immunokemiska reaktion som leder till komplexet antigen-antikropp. Enzymet bör inte längre be- _ finna sig bland serumbeståndsdelarna. _Bland användbara enzymer, som uppfyller dessa betingelser, använder man företrädesvis alkaline~fosfatas, peroxidas eller galaktosoxidas. _ y Kopplingen av enzymet till lipoproteinerna (eller apopro- teinerna) utföres enligt känd teknik för fixering av enzymer på (f 10 15 20 25 30 35 UO 7, g É ,45o 861 proteiner. 7 _ Kopplingen utföres på ett sådant sätt att varken enzymets aktivitet eller speciellt apoproteinets reaktivitet (gentemot antikroppar) modifieras eller ändras nämnvärt. _ Olika kopplingsmetoder är tänkbara; Koppling utförd med_ en dialdehyd, speciellt glutaraldehyd, föredras. En annan före- dragen form för koppling består i att man bildar en Schiffsk bas.

Uppfinningen hänför sig vidare till de medel som användes för genomförande av förfarandet och speciellt till de nödvändiga produkterna och reaktanterna förenade i form av ett.praktiskt~ medel. ' hf Detta medel innehåller iden och samma enhet minst en anti- kropp, som är specifik för det apoprotein, som skall bestämmas, varvid nämnda specifika antikropp är fastfasbunden/kan fastfas- bindas, och ett [enzym-lipoprotein]komplex' - ' VLDL-enzym för Apo Cl, G2, G3 och E; LDL-enzym för Apo G1, G2, G3 och B; HDL-enzym för Apo A1 och A2, , som har förmåga att i konkurrens med det apoprotein-som skall bestämmas binda till nämnda antikropp., 7 Företrädesvis föreligger antikroppen eller antikropparna i i detta medel eller preparat, fixerade vid behållare avsedda för användning vid analysen. Dessa behållare är företrädesvis rör eller kar, som är direkt användbara, utom omtappning, i mätappa- raturen, dvs i en spektrofotometer eller i en kolorimeter, Plattor av den typ som användes för mikrotitreringar och uppvisande ett flertal fördjupningar, i vilka antikropparna fixe- ras, kan likaså användas, speciellt för serieanalyser.

Behållarna innehållande antikropparna, liksom lipoprotein- enzymkomplexen, bevaras skyddade från ljus och i vattentäta för- packningar. i e Komplexet av lipoprotein och enzym föreligger företrädesvis 1 lösning. Såsom tidigare har omtalats, använder man alltefter typ av analyserat apoprotein företrädesvis produkten erhällen genom koppling mellan enzymet och de serumlipoproteinfraktioner som härrör från separation genom ultracentrifugering. Sålunda W använder man ett komplex enzym-VLDL för analys av apoproteinet Cl, C2, C3 eller E, ett komplex enzym-LDL för analys av apopro- teinet B samt ett komplex enzym-HDL för apoproteinet A1 eller A2.

Enzym-1ipoproteinkomplexen doseras företrädesvis på ett sätt som är ungefär ekvivalent med kvantiteterna av motsvarande anti- 10 450 861 p 8 kroppar. De kan presenteras i form av enhetsdoser, t.ex. i ampuller, eller i en flaska som fördelar de doser som är erforder- liga i alla Behållare ingående i preparatet. b Medlet eller preparatet enligt uppfinningen innehåller dess- utom primära eller sekundära standardreaktanter,-såsom har be- skrivits ovan och vilka följaktligen utgöres av antingen ett renat apoprotein eller av en lipoproteinfraktion. I p " Dessa standardreaktanter_är företrädesvis närvarande i lyo-f filiserad form och kan rekonstitueraš genom tillsats av destil- lerat vatten. , _ _ Medlet kan även innehålla de nödvändiga reaktanterna för f mätning av den enzymatiska aktiviteten. 15 20 25 30 35 H0 Medlet kan slutligen innehålla flaskor för det mätníngs- medium och/eller det tvättningsmedium som användes enligt för- farandet. ' ' ._ _ Följande exempel illustrerar mera i detalj förfarandet och 'medlet enligt uppfinningen.

Exempel 1 _ Framställning av specifika antikroppar Kaniner immuniseras med hjälp av apoprotein av humant ur- sprung erhållet genom preparativ ultracentrifugering.

Intradermiskt injiceras vid flera ställen 50/ug antigener emulgerade i Freunds kompletta adjuvantium. Detta upprepas under samma betingelser två månader senare. fy .p V ' Blodet uppsamlas efter 8 månader genom kardiakpunktion, och serumet isoleras. Från det sistnämnda avskiljes immunoglobulin- erna genom selektiv utfällning med ammoniumsulfat. pExempel 2 Fixering av antikroppar på behållarväggen .- f I detta fall gäller att de använda behållarna är parallell- epipediska kar av polystyren-"kristall". f _ Tre fixeringssätt användes. a) Genom kovalent bindning. _ En ytnitrering av polystyren utföres genom kontakt med en blandning av H05 och HESOÄ följt av reduktion av hitrogrupperna till aminogrupper. Aminogrupperna diazoteras därefter, och det bildade diazotatet kopplas med fria aminogrupper från de anti- kroppar som skall fixeras. b) Genom adsorption på karets yta.. e 2/ug proteiner från immunoglobulinfraktionen sättes till l ml LI) *u 10 15 20 25 _3o -35 450 8-61 9 o _ natriumkarbonatbuffert med pH = 9,8. Efter inkubation i 3 timmar vid 3700 elimineras vätskeinnehållet, och behållarna tvättas tre gånger med saltfosfatbuffert med pH 7,4, vid ÄOC, innehållande 0,065% av ett ytaktivt ämne, såsom "Tween 2OÜ eller "Triton X 100". c) 5 Genom adsorption på en cellulosafilm. - I _ För åstadkommande av_starkare adsorption är det möjligt att på behållarytan avsätta en adsorberande film. g * Man löser för detta ändamål 1,5 g.cellulosa (eller ett cellu- losaderivat såsom cellulosanitrat eller bromacetyleellulosa) i 15 ml aoeton, Efter fullständig upplösning tillsättes 85 ml absolut etanol.' I I ï t Polystyrenkaren fylles med denna lösning. Efter några min. avlägsnas vätskan med hjälp av sug, och karen torkas._ _ Inkubationen utföres såsom under punkt b) men endast under 30 min. o ' - Exempel 2 Koppling enzym-apoprotein . _ De använda lipoproteinerna härrör från en preparativ ultra- centrifugering, som möjliggör separation av fraktionerna allt- efter deras täthet. _ Tre olika kopplingar utföres. a) En suspension av alkalisktfosfatas (0,3 ml) centrifugeras i en laboratoriecentrifug under 2 min. Supernatanten avlägsnas, och fällningen om ca 1,5 mg fast material löses i 0,2 ml av lipo- proteinlösningen innehållande ca 2,3 mg protein per ml.

Lösningen dialyseras vid 400 under 16 timmar mot en fosfat- saltbuffert med pH 7,4 under förnyande av bufferten. l Man tillsätter 10/ul av en lösning med 4,2% glutaraldehyd till samma buffert. Efter 2 timmars reaktionstid vid rums- temperatur (20-25°C)Vdialyseras blandningen på nytt under samma betingelser som tidigare. ' I ' Det utvunna komplexet utspädes till 4 ml med_saltfosfat- buffertlösningen, vilken är tillsatt 1% serumalbumin och vilken innehåller ett baktericidalt medel. Denna lösning är den lösning som slutligen användes för mätningen. Under denna form kan komp- lexet bevaras vid 400 i mer än ett år. Förutom att glutaralde- hyden fungerar som kopplingsmedel, stabiliserar den proteinet. b) En variant av det tidigare beskrivna förfarandet består i att utföra kopplingen i två steg. I det första steget bringas lO 15 20 25 50 35 450i 861 ' 10- glutaraldehyden att reagera i överskott med en av beståndsdelarna i komplexet. Överskottet av glutaraldehyd elimineras, och den andra beståndsdelen bringas att. reagera. ' I Enligt en annan metod är det möjligt, när man använder ett enzym såsom peroxidas, att oxidera glyciddelen av enzymet med perjodat till bildning av en aldehydfunktion{ Denna funktion möj- liggör bildning av en Schiffsk bas med en fri aminfunktion från proteindelen av lipoproteinet. ' 0 _ “ e' , 4 , Exemgel 4 Mätningsförfarande För bestämning av halten av ett serumapoprotein 1 ett prov användes en behållare, på vars väggar antikroppar svarande mot g Behållaren kan prepareras vid an- - c). -f/ detta apoprotein är fixerade. vändningstillfället eller-i förväg, såsom har omtalats ovan, och bevaras torr vid 400. ' I ' Det använda mätningsmediet är fosfatsaltbufferten med pH" 7,4, vilken buffert innehåller 1% bovinalbumin för undvikande av _ konkurrerande adsorptioner samt ett bakterioidalt medel som ' mertiolat eller natriumazid iden koncentration av 0,02%.

I behållaren införes 0,5 ml av mätningsmediet. Man till- sätter 0,5 ml antingen av en utspädning i samma medium av det serumprov som skall analyseras eller av mediet ensamt, när man bereder ett "nollprov", eller en utspädning i samma medium av prover avsedda för kalibrering av mätningen. Slutligen tillsättes 0,2 ml av en utspädning till l/250 i detta medium av kompleket lipoprotein-enzym.e 0 , _ 0 Efter inkubation under en natt tömmes behållarna och tvättas tre gånger med ifrågavarande buffert. 0 i Den kvarvarande enzymaktiviteten mätes genom tillsats av reaktanter och substrat svarande mot de använda enàymernap Ex.vis kan man utföra en av följande mätningar.' w a) För alkaline-fosfatas sätter man till behållaren l mg av pfnitrofenylfosfat i l ml av 0,05 M buffert av natriumkarbonat med pH 9,8 samt ett l mM MgCl2. _ 0 Efter inkubation vid rumstemperatur under 30-120 min. av- bryter man reaktionen genom tillsats av 0,l ml lM natriumhydroxid.

Man mäter därefter adsorbansen på en spektrofotometer, vid 480 nm, mot ett "nollprov", direkt genom behållaren, om den är avsedd för detta ändamål, eller genom att hällas över i lämpliga .fl 10 _ 15 20 25 30 35 450ls61l 11 kuvetter. _ b) Aktiviteten för peroxidas kan mätas genom tillsats till be- hållaren av en lösning innehållande 0,94 mg fenol, 0,4 mg amino- 4-fenazon, 0,075 ml metanol, O,Ö2 ml “Triton X lOO" i l ml O,4M kaiiumfosfatbuffer-t med pH 7,7. _ _ Q ' V Efter 30 min. inkubation vid rumstemperatur utföres mät- ning av adsorbansen genom avläsning vid 500 mm mot ett nollprov under samma betingelser som i_a) ovan. , y För åstadkommande av justering av dosen av varje apoprotein kan man direkt använda renade apoproteiner.i förutbestämd kvanti- tet (genom dosering av proteiner eller genom gravimetri). Detta förfaringssätt innebär direkt eller primär justering.

Man använder_lika mycket primär justeringssubstans som man behöver för mätningen av de enskilda apoproteinerna (Ci, 02; C5, E, Al, A2). Apoprotein B är svårt att erhålla i ren form; man använder för detta ändamål, i syfte att erhålla primär kalibre- rings- eller justeringssubstans, det lipoprotein som isoleras -genom ultracentrifugering inom täthetsområdet l,ö43-l,O55 och som kvantifieras genom dosering av protein. _ ' Med hänsyn tagen till de svårigheter som kan uppträda vid beredningen av betydande kvantiteter av dessa primära kalibre- ringssubstanser, är det fördelaktigt att använda sekundära kalib- reringssubstanser, vilka bestämmes genom den tidigare beskrivna mätningsmetoden och genom jämförelse med primära kalibrerings- substanser. Dessa sekundära kalibreringssubstanser kan erhållas ur ett humanserum bevarat i flytande form vid 406 och innehållan- de en baktericid, eller i fryst form eller lyofiliserade. Detta serum kalibreras för var och en av de apoproteiner som det inne- håller. Man kan likaså använda serumfraktioner av typen VLDL, LDL och HDL.

Exempel 5 Bestämning av apoprotein C; enligt den i ex. 4 beskrivna mätmetoden Den använda behållaren är ett rör innehållande 2 ml poly- styrenkristall och är belagd med en film av cellulosanitrat på det i ex. 2 beskrivna sättet. Rören inkuberas'under 30 min. vid 5700 med en lösning av antiserum från kanin anti-apoprotein C3.

Inkubationslösningen (1 ml) är en natriumkarbonatbuffert med pH 9,8 innehållande 2/ug protein från immunoglobinfraktionen i anti- serumet. 10 15 20 25 30 450 861 12 Efter inkubationen tvättas rören tre gånger med tvättnings~ bufferten i form av fosfatsaltbufferten med pH 7,Ä innehållande 0,065% "Tween 20". För varje tvättning fylles rören med tvätt- 'ningslösningen.

-VLDL isolerade genom ultracentrifugering vid densiteten l,OO6 kopplas till alkaline-fosfatas medelst glutaraldehyd i ett enda steg. ' " ” Mätningsmediet utgöres av fosfatsaltbufferten med pH 7,4 innehållande 1% bovinserumalbumin och 0,02% natriumazid- I varje rör införes 0,5 ml av mätningsmediet,tO,5 ml av en lösning i samma medium av det apoprotein C som skall mätas, och 0,2 ml av en utspädning till 1/250 likaså i samma medium av moder- lösningen för konjugatet VLDL-enzym. I _ " _ Kvantiteterna av de apoproteiner G3, som skall mätas,_är 10, 25, 50, 100 resp. 200 nanogram. 2 . _ _ Efter inkubation under en natt vid rumstemperatur tömmes rören och tvättas tre gånger med tvättningsbufferten.

Mätningen av den enzvmatiska aktiviteten utföres såsom i ex. 4-a) under en tid av 50 min. lö Mätningsresultaten presenteras i fig. 1.- Den procentuella adsorbansen vid våglängden 480 nm i förhållande till ett nollprov anges som en funktion av den införda kvantiteten apoprotein.

Man kan konstatera att, inom det betraktade koncentrations- området, lineariteten är god för procenthalten ifråga som en funk- tion av logaritmen för koncentrationen av apoprotein. I Tack vare föreliggande uppfinning förfogar man nu över medel för bestämning av serumapoproteiner, vilken bestämning ut- föres på ett mycket specifikt sätt, vilket.dessutom är mycket känsligt (ända till 0,001/ug/ml apoprotein uttryckt som innehåll av kväve) och utföres med god precision (mätfelet är normalt mindre än_5%). i w, 'å i)

Claims (1)

1. - QATENTKRAV, 13 _, l ~. 450 861.

   1. Förfarande för bestämning av serumapoproteiner i en lipoproteinfraktion, som är antingen fraktionen VLDL eller frak- tionen LDL eller fraktionen HDL, såsom de-definieras_medelst metoderna för separation genom ultracentrifugering, k ä n -7 n e t e c k n a t av att man bringar till omsättning å ena sidan en given kvantitet av en antikropp som är specifik för det apoprotein, som skall bestämmas, varvid nämnda antikropp är fixe- rad på en fast, inert bärare, och å andra sidan det serumpróv, m som skall analyseras, och en given kvantitet av ett [enzym-lipoproteinïkomplex mVLDL-enzym för Apo C1, G2, CS och E; LDL-enzym för Apo C1, CZ, C3 ooh B; HDL-enzym för Apo A1 och A2, _ g som har förmåga att i konkurrens med det_apoprotein som skall bestämmas binda till den fastfasbundna apoprotein-antikroppen, att man utför reaktionen antikropp-lipoprotein, att man separe- rar bäraren från de icke fixerade reaktanterna samt att man mäter den enzymatiska aktiviteten för komplexet kvarhållet på bäraren. '2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att kopplingsföreningen är_den förening som härrör från fixe- ring av ett enzym på en fraktion av serumlípoprotein innehållan- de ett flertal distinkta apoproteiner. _ '3. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n_n e t e c k n a t av att föreningen för koppling enzym- lipoproteín härrör från koppling med hjälp av glutaraldehyd eller från bildning av en Schiffsk bas. I m4. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e c k n a tm av att enzymet i föreningen enzym- -lipoprotein är alkaline-fosfatas, peroxidas eller galaktos- oxidas. _

   15. Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e_t e c k n a t av att antikroppen är fixerad vid den fasta bäraren på kovalent sätt. W

   6. »Förfarande enligt något av de föregående kraven, k ä n n e t e'c k n a t av att antikroppen är fixerad vid bä- raren genom adsorption. I

   7. Förfarande enligt krav 6, k ä n n e t e c k n a t av att den fasta bäraren är belagd med en film av ett adsorbe- rande material. 14 45:11 861

   8. Förfarande enligt krav 7. k ä n_n e t e c k n a t 'av att det adsorberande materialet är en cellulosa eller ett cellulosaderivat. _ _

   9. 7 Förfarande enligt något av de föregående kraven,' k ä n n'e t e c k n a t ”av att bäraren för antikroppen är den behållare, i vilken analysen utföres. I _ , I

   10. Förfarande enligt krav 9,' k ä n n e t e c k n a t av att man efter reaktionen antikropp-lipoprotein tömmer och tvättar behållaren, och att man däri inför reaktanterna för. mätning av den enzymatiska aktiviteten, varvid mätningen utfö- res i själva behållaren. 1 1 I

   11. Medel för genomförande av ett förfarande enligt nå- got av de föregående kraven för bestämning av serumapoproteiner i en lipoproteinfraktion, som är antingen fraktionen VLDL eller fraktionen LDL eller fraktionen HDL, såsom de definieras medelst metoderna för separation genom ultracentrifugering, k ä n n e - t e c k n a t av att det innehåller i en och samma enhet minst en antikropp, som är specifik för det apoprotein, som skall be- stämmas, varvid nämnda specifika antikropp är fastfasbunden/kan fastfasbindas, och ett Kenzym-lipoproteín]komp1ek' VLDL-enzym för Apo C1, G2, C3 och E; LDL-enzym för Apo Q1, CZ, C3 och B; HDL-enzym för_Apo A1 och A2, .- som har förmåga att i konkurrens med det apoprotein som skall bestämmas binda till nämnda antikropp. 12.'- Medel enligt krav 11, Ik ä n n e t e c krn a t av att antikroppen är fixerad vid väggarna på behållare, som använ- des för analysen. . _^ _

   13. Medel enligt krav 12, 'k ä n n e t e c-k n a t av .att behållarna är hemolysrör, spektrofotometerbehållare elleri -kyvetter eller mikrotitreringsplattor. _ 14.. Medel enligt något av kraven 11-13, k'ä n n e - t e c-k nga t av att det dessutom innehåller kalibrerings- lipoproteiner. I

   15. Medel enligt något av kraven 11-14, k'ä n n e - w) t e c k.n a td av att det dessutom innehåller de reaktanter som I? är nödvändiga för mätning av den enzymatiska aktiviteten.

   16. Medel enligt något av kraven 11-15, k ä-n n e - t e c k n a t av att det vidare innehåller lösningar; som ut- gör mätnings- och tvättningsmedia.