JPH0231163A - イムノアツセイの決定のための装置およびその方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、細胞生物学、ウィルス学の分野であり、とく
に分析する試料中の物質、とくに抗体を決定する新規な
イムノアッセイの装置および方法に関する。

分析する試料中の生物学的物質、とくに試料がヒトの体
液であるとき、抗原および抗体の存在を決定するとき使
用するための、多数の方法および材料が過去において記
載されて来た。最も普通に用いれている方法の１つは、
酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬ
　Ｉ　ＳＡ型アッセイは、しばしばマイクロタイタープ
レートを使用して実施され、このマイクロタイタープレ
ートは一般にプラスチックまたは同様な材料から成形さ
れ、試料およびアッセイ試薬のアリコートを受容するた
めの多数のウェルを有するとして記載することができる
。マイクロタイタープレートは、普通、生理学的流体ま
たは排泄物を標的分析物、これはしばしば抗体または抗
原である、の存在についてアッセイするための臨床的設
備において用いられる。事実、マイクロタイタープレー
トは、ある場合においてさえ、研究する特定の抗原に対
して特異的である、抗体がウェルに既に加えられている
ものを購入することができる。このような予備被覆した
マイクロタイタープレートの調製において、抗体の個々
のアリコートを各ウェルに手動的にピペットで加えてそ
の底を被覆するか、あるいは自動化されたピペット装置
で１系列のウェルに加えることができる。従来、実験室
の設備において、分析する試料のアリコートはマイクロ
タイタープレートの各々に、通常手動ピペッティング技
術により加えられる。次いで、試料を抗体と相互作用さ
せる。

頻繁に、これらのマイクロタイタープレートにおける個
々のウェルの数は非常に大きいことがある。反復したピ
ペッティングは、自動化されているか、あるいは手動で
あっても、個々のウェルの各々への抗体のアリコートの
被覆の均一性において大きい誤差の限界を残す。被膜の
非均一性はアッセイの結果に変動性を導入し、アッセイ
の信頼性を減少し、そして、また、試験の全体の感度に
影響を及ぼすことがある。

また、ＥＬＩＳＡ技術を利用する決定は大量の試薬を必
要とし、これはしばしば、入手が困難であるか、あるい
は高価であるため、供給を制限される。さらに、この分
野において実施されるこれらのタイプのアッセイを実施
するために要する反応時間は、一般に、約２〜４時間で
ある。

本発明の１つの面において、比較的少量の試薬で、生物
学的アッセイの決定、とくにイムノアッセイの決定を急
速にかつ効率よ〈実施するとき使用するために適当な装
置を提供する。現在特許請求されている装置は、選択し
た数の、大きいまたは小さい試料を使用してこのような
アッセイ全実施するという柔軟性をユーザーに提供する
。アッセイは、９０ウェルのマイクロタイタープレート
を使用して非常に小さい数の試料を実施するとき、現在
の場合におけるような、装置の一部分を消耗しないで実
施することができる。

装置は、本質的には、支持体からなり、その上で生物学
的結合反応が起こり、前記アッセイ支持体は略平らな、
細長い形状を有する。このアッセイ支持体は、その最も
広い面において、３つの区画、すなわち、■端における
試料受容ウェル区画、反対の端における握り区画、およ
びその間の接続区画からなる。試料受容ウェル区画は、
少なくとも２つの間隔をおいて位置する受容ウェルから
なり、前記受容ウェルは一般にアッセイ支持体の端に存
在し、結合反応成分が加えられる。前記ウェルの各々は
、前記支持体の第１面に開いた端、前記支持体中に凹状
に延びる凹状内表面、および前記支持体の反対の面から
凸状に突起する凸状外表面を有する。こうして、これら
のウェルは本発明の結合試薬のアリコート、ならびに分
析試料を含有するする受器として働き、前記分析試料は
多分結合試薬に結合するであろう材料、以後「標的分析
物」と呼ぶ、含有する。ウェルの少なくとも１つ凸状外
表面は、また、少なくとも１つ安定化脚を有し、この安
定化脚は、平らな表面に配置するとき、前記ウェルの回
転を防止する。本発明のアッセイ支持体は、また、水平
化突起を有し、前記水平化突起は前記少なくとも１つ安
定化脚と共働して、平らな表面上に配置するとき、前記
支持体を平行に維持することができる。この装置の試料
受容ウェル区画は、また、ダム手段を有し、前記ダム手
段は前記ウェルの間の空間に存在し、そして前記アッセ
イ支持体の第１面から突起し、液状試料が前記ウェルの
１つから他のウェルへ流れるのを防止する。

本発明の好ましいアッセイ支持体は、前記試料受容ウェ
ル区画に２つのウェルを有し、前記ウェルはお互いに隣
接し、ダム手段により分離されている。この立体的配置
のダム手段は、両端に表示部分を含み、表示部分は本質
的に矢の形状の上昇したブロックであり、各ブロックは
その上に印刷された文字を有し、そしてそれぞれのウェ
ルを指している。この好ましいアッセイ支持体は、試料
について比較アッセイを実施するためにとくに有用であ
る。ウェルのお互いの密接な近接性は、各ウェルの内容
物を表示するしるし、およびダム手段と一緒になって、
１つのウェルの内容物が他の内容物で汚染されるのを防
止し、そしてこの設計を比較研究にとくに適するものと
する。

本発明のアッセイ支持体は、単一であるか、あるいは分
離可能に接続された平らな系列であり、平らな系列にお
いて、アッセイ支持体はお互いに接合されていて、複数
の、好ましくは約２〜約２５、より好ましくは約５〜約
１５、最も好ましくは約５〜約ＩＯの数の範囲のアッセ
イ支持体を形成する。本発明のこの平らな系列の実施態
様は、所望の数の支持体を容易に系列から分離すること
ができるので、任意の所望の数の試料数でイムノアッセ
イを実施することを促進する。

本発明のアッセイ支持体、または２またはそれ以上の支
持体を含有する平らな系列は、手動であるいは機械的手
段により保持し、そして試薬を含有する浴中に浸漬して
、試薬を支持体の各々の試料受容ウェル区画上に被覆す
ることができる。こうして、アッセイ支持体は、均一な
方法で所望の試薬で便利に予備被覆し、そして後の時間
に結合反応において使用することができる。

本発明の他の面において、本発明の装置を、ことにイム
ノアッセイにおいて、使用して生物学的アッセイの決定
を実施する方法が提供される。好ましい方法において、
比較研究、例えば、ヒトの生物学的試料中のＩｇＧおよ
びＩｇＭの抗体の決定を実施する。これらの最後に述べ
た抗体は、ニブスティン−パール（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂ
ａｒｒ）ウィルス（これは中でも単核症の感染の原因で
ある）による過去または現在感染に対する臨床的補正を
提供する。ここに記載するような好ましい装置を使用し
て、色の比較を受容ウェルの各々において発生した色の
間で行うことができる。生物学的試料を抗原で予備被覆
されている装置に加える。

ＩｇＧまたはＩｇＭの抗体が試料中に存在する場合、そ
れらは予備被覆した抗原に結合するであろう。次いで、
抗ｒｇＭ抗体を「Ｍ」と表示する受容ウェルに加え、モ
して抗１ｇＧ抗体をその次のｒＧＪと表示する受容ウェ
ルに加える。基質を両者のウェルに加え、そしてそれぞ
れの抗体が存在する場合、色が発生する。次いで、一方
のウェルで生成した色を他方と比較して、一方の抗体対
他方の抗体の適当な相対比を誘導する。

ここに記載する装置および方法は、いくつかの利点を提
供する。本発明は、現存する方法および装置の主要な簡
素化を表し、特許請求されているアッセイ支持体の立体
的配置は、支持体のウェルの各々中に被覆した第１結合
反応成分の量のウェル対ウェルの変動を排除し、次いで
これに多分標的分析物を含有する試料を結合反応のため
に加えする。このような被膜の再現性はこの分野ににお
いて普通に使用されている、第１結合反応成分がピペッ
トで加えられる、マイクロタイターグレートについて問
題を有してきた。本発明の構成は、■または２以上の支
持体を、すべて同時に、第１結合反応成分中に浸漬し、
それ以上の決定のために支持体を予備被覆することがで
きる。

本発明は、また、実質的なインキュベーション時間の必
要性を排除して、存在しうる標的分析物と第１結合反応
成分、または追加の結合反応成分との間の結合反応を起
こすことを可能とする。ここで詳述するような装置の特
定の構成は、反応成分のすぐれた分散を可能とし、そし
てまた、小さい、容易に検査される区域において起こら
せることができる。第１結合反応成分の予備被覆物質の
濃度は、この被膜で覆う区域が比較的小さいので、大き
く増加することができるが、分散がするぐれるという利
点かえられ、これにより結合の事象を起こらせるために
必要なインキュベーション時間を大きく減少されること
ができる。

本発明のアッセイ支持体は、生物学的アッセイのための
、略平らな、細長い形状の支持体からなり、前記支持体
は握り区画、試料受容ウェル区画、およびそれらの間の
接続区画からなり、前記区画の各々は縦軸に沿って整列
している。試料受容ウェル区画は、一般に前記支持体の
１端に存在し、そしてアッセイ、とくにイムノアッセイ
のための受器として作用する、少なくとも２つの受容ウ
ェルからなる。前記ウェルの各々は、前記支持体の第１
面上に開いた端、前記支持体中に凹状に延びる凹状内表
面、および前記支持体の反対の面から凸状に突起する凸
状外表面を有する。前記受容ウェル区画における受容ウ
ェルの深さおよび直径は。

広く変化できるが、アッセイのための反応成分を含有す
るする液状媒質の少なくとも約ｌｏμＱを含有するため
に十分な大きさであることが好ましい。

ウェルの各々は、また、ダム手段により隣接するウェル
から分離されていて、一方のウェルから他方のウェルへ
の内容物の拡散を防止する。ダム手段は隣接するウェル
の間の区域において前記支持体の第１面から突起し、好
ましくは前記隣接するウェルの間の線に対して横方向に
延びる。ダム手段は任意の形状を取ってこの目的を達成
することができる。しかしながら、ダム手段が第１表面
から延びる高さは、このような延長の長さに沿って規則
的に変化すべきであること、すなわち、いずれかの端か
らこのような長さの中心に向かって増加するか、あるい
はこのような長さを横切って均一な高さであるべきでで
あることが発見された。

ダム手段がこのような長さを横切って不規則な高さを有
すると、すなわち、増加または減少し、次いで再び増加
すると、このような変動はダム手段の壁間に毛管作用を
つくり、ウェル中に堆積された液体はダム手段の最高の
高さまで上昇し、下のレベルを横切って隣接するウェル
中に漏れ、これによりこのようなウェルを汚染するであ
ろう。

アッセイ支持体の受容ウェル区画は、所望の数のウェル
を含有するために適当な面積をもつ。受容ウェル区画の
形状寸法は、その中に含有される受容ウェルの数、お互
いに関するそれらの位置、およびウェルそれら自体の形
状寸法とともに変化するであろうことが理解されるであ
ろう。好ましい実施態様において、受容ウェル区画はほ
ぼ３０ｍｍの長さ、２２ｍｍの幅、および３１ｍｍの最
大深さであり、受容ウェルそれら自体のウェルの直径は
ほぼ１０ｍｍである。好ましい実施態様における受容ウ
ェル区画の大きさは、装置の受容ウェル区画を予備被覆
するとき、最適にして、第１結合反応成分の予備被覆溶
液の最小量を必要とするようにする。

受容ウェルは、さらに、ウェルに加えられるであろう内
容物が放り出されないように、平らな表面上に装置が安
定して静止できるような構造を、凸状表面上に有する。

好ましい実施態様において、ウェルの凸状表面は、丸い
形状を四角にする役目をする、各々２つの構造を有し、
これらを安定化脚と呼ぶ。

とくに好ましい実施態様において、受容ウェルの凹状表
面は、荒くされているか、あるいはｌ系列のうねを有し
、これらは第１の結合試薬の被覆工程の間のウェルの表
面積を増加し、そしてまた、究極的に被覆されたウェル
に加えられるすべての試薬の分散を促進し、全体の結合
反応を助ける働きをする。液状媒質中に含有される試薬
のアリコートは、ある種の支持体、例えば、プラスチッ
クの支持体に加えるとき、「ビードアップ（ｂｅａｄ−
ｕｐ）Ｊする傾向があることを理解すべきである。液状
媒質中に含有される反応成分は、この荒くすることの助
けによりよりよく分散し、こうして小さい区域において
結合反応を起こすことができるようにす・ることが発見
された。これは、また、液状媒質中に少量、好ましくは
約１０μＱ〜約１００μＱ程度に少ない量を使用して、
結合反応を起こすことを可能とする。この目的を達成す
るために任意のタイプの形状の荒さを適当に用いること
ができるが、好ましい実施態様において、うねを、とく
に同心円の形状で、ウェルの凹状表面上にもうける。こ
れらのうねは、溶融したプラスチックから装置それ自体
を製作する間に、便利に形成することができる。

受容ウェル区画は、ダム手段と隣接するか、あるいはそ
の一部であることさえでき、例えば、ダム手段の上部に
存在することができる。この表示部分は、アッセイ技術
を実施するとき試料の混乱が起こる可能性を少なくする
ために、その上にしるしを有することができる。例えば
、特定の反応成分の名称の最初の文字を、その反応成分
を加えるウェルの近くに設けることができる。普通の成
形、打ち抜きまたは印刷の技術をこの目的に使用するこ
とができる。可視化容易である大きさの文字を設ける余
地がほとんどない、アッセイ支持体の形状において、文
字をもつ上昇したブロックをダム手段に隣接させてかつ
ウェル付近に配置することができる。上昇したブロック
は、また、特定の試薬を加える適当なウェルを指す矢印
の形状であることができる。この特徴は本発明の好まし
いアッセイ支持体において存在する。

アッセイ支持体の接続区画は、受容ウェル区画に隣接し
、その端に、一般に実質的に受容ウェル区画からテーパ
ーをもち、そして前記区画を握り区画と接続する。この
接続区画は任意の適当な形状、丸いか、あるいは平らな
形状、またはそれらの組み合わせであることができる。

この区画は、装置を全体として予備被覆工程の間容易に
保持することができるようにし、次いで平らな表面に配
置して、それを使用する生物学的結合アッセイを実施す
ることができるようにする、任意の長さを有することが
できる。

好ましい実施態様において、接続区画の少なくとも一部
分を平らな形状にして、装置の表示、例えば、アッセイ
する多くの異なる試料のトラックを保持することが有用
であるとき、臨床的または研究の設備において普通に必
要とされる表示、を可能とする。この接続区画の表示区
域はしばしば荒くして、要求される情報をその上に筆記
できるようにする。また、アッセイ支持体は、また、ア
ッセイにおいてｌ系列の試料を使用するとき、認識が容
易であるように、この表示区域に前以て番号を付すこと
ができることを理解すべきである。

この装置の握り区画は、前述の接続区画に隣接し、そし
てこの装置の末端部分を形成する。好ましい実施態様に
おいて、握り区画は、所望の予備被覆工程のため、ある
いはアッセイの実施を容易とするため、装置の手による
か、あるいは機械的な取り扱いを容易にする形状をもつ
。こうして、好ましい実施態様において、握り区画はう
ねをもつか、あるいはだの方法で荒くされていて、これ
によりユーザーの手から滑り落ちないようにする。

また、それは試料または患者の識別の目的で数字を可視
化することが非常に容易である。

平らな表面上に装置をその全体を横切って平行に配置す
ることを可能とするために、別の構造、例えば、水平化
突起、をｌまたは２以上の場所に接続区画または握り区
画に沿って設ける。水平化突起は装置のこの部分が平ら
な表面上に静止できるようにする大きさおよび高さをも
ち、こうして装置の受容ウェル区画における受容ウェル
の深さを補償する。この構造は、傾斜面に装置を設置す
るアッセイを実施するとき固有のこぼれおよび非分散を
排除する。

本発明の最も好ましい実施態様において、個々のアッセ
イ支持体はお互いに分離可能に実施して、アッセイ支持
体の平らな系列を提供する。この平らな系列の形状は、
■より多い試料によるアッセイの決定にとくに有用であ
る。アッセイ支持体の合理的な数をお互いに接続し、こ
うしてｌ系列で提供することができるは、本発明の範囲
内である。

好ましい実施態様において、任意の１つの系列における
数は約５〜１５の個々のアッセイ支持体の間に通常存在
する。最も好ましい実施態様において、アッセイ支持体
はお互いに並置し、そして握り区画の長さに沿って結合
により接続する。結合は成形工程の間に達成され、この
結合は機械的操作により容易に破壊することができるが
、自発的に、例えば、系列の輸送の間、あるいは装置が
ラブベンチ（ｌａｂ　　ｂｅｎｃｈ）などの上に配置す
るとき破壊しない。破壊可能な結合は破壊できるが、多
くのアッセイ支持体を所定のアッセイにおいて必要とす
る。例えば、１５の試料をアッセイしようとする場合、
ｌＯのアッセイ支持体の系列をその全体において、１０
の第２系列の半分と一緒に、合計１５で使用することが
できる。

好ましい実施態様において、アッセイ支持体の装置を平
らな系列で準備するとき、また、試料から延び、反対の
面のウェル区画を受容するスペーサー突起を設け、こう
してそれが隣接する平らな系列のダム手段と共働するこ
とができるようにする。このスペーサー突起の存在は、
ある数の支持体を機械的手段によって縦列で保持すると
き、系列の被覆のためお互いに分離して平らな系列で支
持体を保持する。■系列の支持体の各々が被覆の間に適
切に分離されない場合、それらは種々の点において接触
し、これにより受容ウェル区画の被覆の均一性に影響を
及ぼすことができる。好ましい実施態様において、スペ
ーサー突起の高サバ、隣接する平らな系列のダム手段と
共働して、１つの系列と前記隣接系列との間で少なくと
も２．０ｍｍを維持するために必要な高さである。好ま
しい実施態様において、この高さは通常約１．Ｑｍｍ〜
約１．２ｍｍである。約１．５ｍｍより大きいと、機械
的手段により保持されるとき、１つの系列は隣接する系
列から扇形にひろがり、こすてい１つの被覆工程におい
て保持できる系列の数は少なくなり、これによりこのよ
うな被覆工程の経済性は低下する。

添付図面に図解される本発明のアッセイ支持体装置の好
ましい実施態様を下にさらにせつめいする。図面におい
て、同様な参照文字は異なる図面または別の実施態様に
おいて同一の部分を意味する。図面はかならずしも一定
の割合でなく、その代わりアッセイ装置の原理を説明す
るとき、ならびに代表的実施例を提供するとき強調され
ているる。

第１図および第２図を参照すると、これらは単一のアッ
セイ支持体装置１０の、それぞれ、斜視図およぶ後側面
図であり、この装置は３つの区画、すなわち、試料受容
ウェル区画１２、接続区画１４、および握り区画１６か
ら構成されている。ここに描かれている試料受容ウェル
区画１２は、ダム手段２２によって分離された２つの受
容ウェル１８および２０を有する。ダム手段２２は、ま
た、三角形の表示部分２４および２６からなり、三角形
の表示部分の頂点はそれぞれの受容ウェルの各々を指す
。表示部分２４は「Ｍ」としるされており、これはＩｇ
Ｍｌすなわち、単核症の活性な病気の状態であるとき存
在する抗体、を表すための記号である。表示部分２６は
ＩｇＧを表すｒＧＪとしるされており、そしてこの装置
の接続区画と隣接する受容ウェルを指す。

試料受容ウェル区画１２は接続区画１４にテーパーをな
しており、そしてこの接続区画は受容ウェル区画のテー
パ一部分を接合する円筒形部分２８からなる。接続区画
の円筒形部分２８は、ラベルの配置に、あるいはその上
の情報の記載に適当な、たんらな表示区域３ｏと隣接す
る。表示区域３０は、部位ラベルの付着のための荒くし
た表面３２を有する。表示区域３ｏは握り区画１６に接
合し、そして握り区画１６は手または機械による握りに
容易なうね３４を有する。握り区画１６は、また、試料
の数値による識別が容易であるように数字３６を有する
。

受容ウェル１８および２ｏの凸状表面は安定化脚２１を
有し、この脚は、平らな表面上に水平に静止するとき、
装置の回転を防止する脚とＩ−で作用する。脚２１は、
また、受容ウェルを強化するはたらきをする。スペーサ
ー突起２３は、受容ウェルＩ８および２０の間に位置し
そして、詳述するように、所望の最初の結合試薬を装置
上に被覆するための機械化された浸漬工程の間、１つの
アッセイ支持体装置をその後部に縦列で並置された他方
から間隔をもって配置する。表示区域３ｏは会社のしる
しく図示せず）を有し、そして水平化突起２５により握
り区画１６から分離されており、この水平化突起２５は
安定化脚２１と共働して、アッセイ支持体装置を平らな
表面上にその装置の全長に沿って水平に配置できるよう
にする。第３図は、装置ｌＯの側面図であり、装置が平
らな表面上に静止する方法を明らかにする。

第４図は、他の別の実施態様を示し、ここでアッセイ支
持体の平らな系列１１は結合２７においてお互いに接合
されており、この結合は手の操作で破壊して、この系列
の個々の支持体の各々に分離することができるので、任
意の数の支持体を使用してアッセイを実施することがで
きる。

第５図は、本発明の装置の別の実施態様１０Ａを示し、
この装置は、受容ウェル区画１２Ａにおいて、２つの受
容ウェル１８および２０の間に、両端がテーパーをもつ
ダム手段２２を有する。この装置の受容ウェルおよび末
端部分のいずれにもラベルは存在しない。水平化突起は
この装置の末端部分の端に存在する小さいノブ２５′で
ある。

第６図は、本発明のなお他の実施態様であり、ここで試
料受容ウェル区画１２Ｂは、好ましい実施態様に示す２
つの代わりに３つの受容ウェルを有する。

第７図は、他の実施態様であり、ここで試料受容ウェル
区画１２ｃは横方向に配置された２つのウェルを有する
。

第８図は、被覆溶液４２を有する浴４０および浸漬支持
棒４４を示し、これらの浸漬支持棒から、予備被覆工程
に付されている平らな系列を代表する、アッセイ支持体
の２つの平らな系列１１が吊り下げられている。例示の
目的で、８つのみのアッセイ支持体がお互いに接続され
ていることが示されている。任意の数の分離可能に接続
されたアッセイ支持体をお互いに接続し、そして被覆の
目的で懸垂することができることに注意すべきである。

第９図は、試料受容ウェル区画１２が、浸漬支持棒４４
から吊り下げられるとき、実質的に平行な関係を維持し
て、浴４０中に含有される被覆溶液４２でこの区画を均
一に被覆することができる方法を示す。これは、１つの
平らな系列１１におけるアッセイ支持体のダム手段２２
と隣接する平らな系列におけるアッセイ支持体のスペー
サー突起１３との共働によって達成される。

本発明のアッセイ支持体の主な機能は、生物学的結合反
応、特に免疫反応のための部位または焦点として作用す
ることである。これに関して、装置を第１結合反応成分
で予備被覆し、これに、必要に応じて、追加の反応成分
と一緒に、分析物を加えことができる。本発明の範囲内
の第１結合反応成分は性質がタンパク質である。次いで
、この目的に、本発明のアッセイ支持体装置の組成はタ
ンパク質が付着する普通の組成であることができる。例
えば、多くのプラスチックがこの目的に普通に入手可能
でありかつ適当であり、こうして装置全体を容易に所望
の形状に普通の成形技術により成形することができる。

広範な種類の有機および無機のポリマーを使用すること
ができ、それらの例は次の通りであるニポリエチレン、
ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリ−４−メチルブ
テン、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレ
ンテレフタレート、レーヨン、ナイロン、ポリビニルブ
チレート、ポリホルムアミド、セルロース、セルロース
アセデート、ニトロセルロースなど。考えられる他の材
料は、紙、ガラス、メタロイド、半導電性材料などを包
含する。好ましい実施態様において、一般に使用する材
料はナイロンおよび高衝撃性ポリスチレンを包含し、後
者は選択する組成物である。

前述の材料から形成したアッセイ支持体は、典型的には
、約０．７ｍｍ〜約０．８ｍｍの厚さを有する。組成物
は不透明、半透明または透明であることができるが、ア
ッセイの間に発生したシグナルは支持体の形成の間ｕｄ
する組成物の性質！こよりマスクされるべきではない。

好ましい実施態様において、組成物は不透明であり、そ
して広く変化する色をもつ。色の可視化がアッセイの統
合された一部であるとき、装置は生物学的結合反応のシ
グナル発生の結果として発生しうる色と相殺するもので
あるべきである。例えば、完全な白色は結合反応の間発
生した淡い色、例えば、淡し１緑、黄、青などの検出の
促進にしばしば有用であった。

好ましい実施態様において、装置は完全な白色であり、
これはタルクまたは二酸化チタンなどを成形工程の間添
加することによって得ることができる。しかしながら、
当業者は理解するように、多くの他の色は、本発明のア
ッセイ装置を使用して実施しようとする特定の反応、お
よび発生する色の可視化に依存して適当であることがあ
る。

本発明の装置の新規な形状は、受容ウェルそれら自体を
第１結合反応成分で便利に浸漬被覆または他の方法で予
備被覆することを可能とする。選択した第１結合反応成
分を使用する本発明のア・ソセイ支持体装置を予備被覆
するとき、いくつかのパラメーターを考慮することが必
要である。本発明のアッセイ支持体装置は、単一の支持
体であるか、あるいは系列であるかにかかわらず、この
ような第１結合反応成分を含有する被覆溶液中に浸漬す
るとき、個々のかい形支持体がお互いにまたは適当な予
備被覆溶液を保持する容器の側面に接触しないように注
意すべきである。これは被膜の均一性を保証することを
助ける。

第４図、第８図および第９図に示されているアッセイ支
持体装置の系列の立体的配置の１つの利点は、ある数の
これらの系列を制御された方法で機械的手段により保持
することができるということであり、ここで系列の側面
は予備被覆溶液を保持する容器の側面に接触せず、そし
て系列の各々は隣接する系列から十分に間隔をおいて位
置する。

この被覆法、浸漬被覆と呼ぶ、に利用する被覆溶液の液
面は、アッセイ支持体装置の受容ウェル区画全体を覆う
ために十分であるべきである。受容ウェル区画は、また
、他の普通の技術、例えば、前記装置の被覆溶液による
噴霧により予備被覆することができる。

本発明の装置の立体的配置の他の利点は、受容ウェルの
間の距離を最小にすることができるということである。

したがって、浸漬浴中の浸漬溶液の体積は、また、最小
に保持することができ、これはコストのかかる成分の使
用を省略する。当業者は、また、理解するように、本発
明のアッセイ支持体装置上に被覆しようとする物質を含
有する容器は、タンパク質が付着できない材料から製作
し、こうして第１結合反応成分、すなわち、タンパク質
がアッセイ支持体装置に優先的に結合し、そして容器の
側面を被覆して、被覆容器中に残留しないようにする。

ここに記載するように、第１結合反応成分は一般に性質
がタンパク質、とくに１または２以上のペプチドである
。広範な種類の自然タンパク質またはタンパク質サブユ
ニットを装置上に被覆することができる。このようなタ
ンパク質は次のものを包含する：ヒストン、核タンパク
質、リポタンパク質、糖タンパク質、ソマトトロピン、
プロラクチン、酵素、ヒト血漿タンパク質構成成分、例
えば、ヒトアルブメン、チロキシン結合グロブリン、ハ
プトグロビン、セルロブラスミン、ミオグロビン、フイ
ブリノゲン、フラスミノゲン　ＡｌＤ、Ｅ、ＧまたはＭ
クラスのポリおよびモノクローナルの免疫グロブリン、
Ｆ（ａｂ）断片またはＦ（ａｂ）２断片、免疫グロブリ
ンの遊離の軽鎖または重鎮、免疫グロブリンの可変領域
、高可変領域、または一定額域；補体因子、血液・凝固
因子、ペプチドおよびタンパク質ホルモン、例えば、イ
ンスリン、グルカゴン、エリトロボイエチン、ＦＳＨ，
ＬＨ，ＴＳＨ，ＨＣＧ、　オキシトシン、バンプレシン
など。抗体で被覆しようとする場合、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｇま
たはＭクラスのポリおよびモノクローナルの免疫グロブ
リン、または免疫グロブリンの遊離の軽鎖または重鎮は
よく知られたポリクローナル抗体またはモノクローナル
抗体の技術において調製することができる。ポリクロー
ナル抗体は種々の試験動物、例えば、マウス、ラント、
ヤギ、ウサギ、ウマなどにおいてレイズすることができ
る。モノクローナル抗体はよく知られた技術、例えば、
次の文献に開示されている技術を使用して調製すること
ができる：コーラー（ＫｏｈＩ　ｅ　ｒ）およびミルス
ティン（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ）、「前景て決定した特異
性の融合した細胞分泌抗体の連続的培養（Ｃｏｎｔｉｎ
ｕｏｕｓ　　Ｃｕ１ｕｔｕｒｅｓ　　ｏｆ　　Ｆｕｓｅ
ｄ　　ＣｅｌｌＳｅｃｒｅｔｉｎｇ　　Ａｎｔｉｂｏｄ
ｙ　　ｏｆＰｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　　５ｐｅｃｉ
ｆｉｃｉｔｙ）Ｊ、ネイチャー　（Ｎａ　ｔ　ｕ　ｒ　
ｅ）１ＸＶＯ＋、２５６、ｐｐ、４９５−４９７．１９
７５年８月。

この分野において普通であるように、オーツ（−コーテ
ィング方を、また、実施して、アッセイ支持体それ自体
の上の部位のすべてを結合し、こうしてアッセイの実施
の間の分析試料中に存在する標的分析物の非特異的結合
を排除することができる。普通のオーバーコーテイング
溶液ノ（り質、例えば、アルブミン、ヤギ血清、ウマ血
清、ウサギ血清、ゼラチンおよび胎児仔ウシ血清を使用
することができる。ヤギ血清および胎児仔ウシ血清は、
ここで使用するとき好ましい。

さらに、結合反応成分の被膜の安定性は、アッセイ支持
体を「湿潤コして保持する働きをする成分をオーバーコ
ーテイングに添加することによって増加することができ
る。オーバーコーテイングの技術の使用は、一般に、こ
の分野において新しくはないが、本発明において、実施
する包装および貯蔵期間の間、本発明のアッセイ支持体
を湿潤して保持することが必須であることが発見された
。

これはこの分野において通常量は入れられているものと
対照をなす。例えば、マイクロタイタープレートは歴史
的に吸湿剤と一緒にアルミニウム箔中に実際に包装され
て、マイクロタイタープレートを出来るだけ乾燥状態に
保持されてきている（結合材料をその上に結合して）。

本発明において、アッセイ支持体上に被覆された第１結
合反応成分の安定性は、シロップ状アルコールまたは糖
をオーバーコーテイング溶液に添加すると著しく改良さ
れることが発見された。これに関して適当な化合物のう
ちで、スクロース、トレハロースおよびグリセロールを
述べることができる。本発明の好ましい実施態様におい
て、グリセロールを選択してオーバーコーテイング溶液
中で使用して、貯蔵の間支持体をこの湿った状態に維持
する。濃度は好ましくは約５％以上、より好ましくは約
１０〜約５０％であり、最も好ましくは約１０〜約２５
％である。

本発明の装置を使用するイムノアッセイ技術前述したよ
うに第１結合反応成分で予備被覆した、本発明のアッセ
イ支持体装置は、分析する生物学的試料を使用するイム
ノアッセイ技術の実施において使用するのに特に適し、
前記試料は多分標的分析物を含有する。当業者は理解す
るように、装置に被覆された結合反応成分と試料中に存
在する標的分析物との間の免疫反応の存在をシグナルす
るために、このような免疫系において、表示または指示
手段は必要である。典型的な指示手段は、次のものを包
含する：放射性同位元素、例えば、１２６Ｔまたは＋３
１　■、酵素、例えば、アルカリ性ホスファターゼ、ホ
ースラデッシュペルオキシダーゼ、ベーターＤ−ガラク
トシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ、およびフル
オロクローム色素、例えば、フルオレセイン、ローダミ
ンおよびフィコビッツタンパク質。好ましいアッセイに
おいて、この指示手段は、一般に、別の分子、例えば、
免疫反応生成物に結合する第２抗体に連結される化合物
である。本発明は検出の特定の手段または標識の特定の
タイプに制限されない。しかしながら、この指示手段は
適切にはＥＬＩＳＡまたはＥＩＡと呼ばれる。これに関
して適当な酵素は、次のものを包含する：ベーターＤ−
ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベーター
Ｄ−グルクロニダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ラクト
ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびホ
ースラデッシュペルオキンダーゼ。ホースラデッシュペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびアルカ
リ性ホスファターゼは本発明のアッセイにおいて選択さ
れる酵素である。当業者は容易に理解するように、作用
させると色のシグナルを発生することができる任意の物
質、例えば、酵素はこれに関して使用するために適当で
ある。

本発明の好ましい実施態様において、指示手段は別の分
子、例えば、第２抗体に連結して、免疫反応生成物と反
応する接合体を形成する酵素である。−緒に、この第２
分子に連結した指示手段は、「標識試薬」と呼ぶ、本発
明の方法の第２結合試薬を形成する。この標識試薬の調
製は、任意の普通の技術を使用して達成することができ
る。例えば、タンパク質と反応する活性な基をもつ酵素
標識はしばしば商業的に入手可能である。しばしば活性
な基は、窒素またはオオウの類似体、例えば、混合無水
物中の、カーポジイミド、カーボネートモノエステルで
活性化したカルボン酸、を包含する活性化カルボニル、
塩化カルボニル、および活性エステルである。これらの
例は次の通りである二Ｎ−ヒドロキシ、スクシンアミド
、バラニトロフェニル、イソシアネート、イソチオシア
ネート、イミデートエステル、゛チオエステル、チオノ
エステルなど。還元性アルキル化、活性ハロゲン化、お
よび他のよく知られた技術を使用することができる。し
ばしば、酵素で予備標識した抗体でさえ商業的に入手可
能である。

本発明において、標識試薬の濃度は本発明のアッセイの
実施において臨界的であること、および非常に高い濃度
は免疫反応生成物を検出するために要する時間を有意に
減少することができることが発見された。この検出時間
は、従来、２〜４時間であり、そして本発明の装置およ
びアッセイ技術の使用により数分の量に減少することが
できる。

典型的なイムノアッセイの工程を次にｉＪ［する。

イムノアッセイの実施の第１工程において、多分予備被
覆した第１結合反応成分に結合する標的分析物を含有す
る生物学的試料のアリコートを、特許請求されている装
置の受容ウェルに、適当な小出し手段、例えば、ピペッ
ト、ドロッパーなどで加える。利用する小出し手段は均
一なアリコートをウェルの各々に小出しすることが好ま
しい。生物学的試料は液状媒質中に存在し、そして試験
前に普通の精製技術にかけることもできる。例えば、ア
ッセイする試料が血液である場合、全血と反対に血清ま
たは血漿をアッセイして、試料から妨害を排除すること
が望ましいことがある。

免疫反応成分を、十分な時間インキュベーションして、
標的分析物をウェル中で被覆された第１反応成分に結合
させる。次いで、生物学的試料中の過剰の結合しない標
的分析物を、免疫反応から、普通の洗浄溶液で洗浄し、
この洗浄溶液は結合の事象を妨害しないか、あるいは非
特異的結合を可能とするか、あるいは他の方法で試験結
果をゆがめない。次いで、これに関して、蒸留水、生理
的塩類溶液、リン酸塩緩衝液、メチルセルロース、ポリ
オキシエチレンソルビタンモノラウリルエーテル、例え
ば、Ｔｗｅｅｎ　　２０”（Ｋｏａ−Ａｔｏｌａｓ　　
Ｃｏ−Ｌｔｄ、）などを組み合わせて洗浄溶液として使
用することができる。

次いで、装置の受容ウェルの各々中の免疫反応した生成
物に、第２結合試薬、標識試薬、を添加する。この混合
物を十分な時間インキュベーションして、標識試薬を免
疫反応した生成物に結合させる。好ましい実施態様にお
いて、少なくとも約２分はこのインキュベーションに許
される。次いで、第２洗浄工程を使用して、未反応の標
識試薬を除去する。この標識試薬が酵素検出系を利用す
るとき、適当な基質を次の工程において、普通の量で、
加えて、免疫反応した生成物を存在をシグナルさせる。

好ましい実施態様において、約９０秒〜約１５０秒、好
ましくは約１１０秒〜約１３０秒の臨界的インキュベー
ション時間を用いて、このアッセイを実施する。装置の
受容ウェル中の標識の検出は、肉眼による色の可視化に
よるか、あるいは標識の検出に必要な計器の使用によっ
て達成することができる。受容ウェル中の標識の検出は
、定性的のみであって、免疫反応した生成物が存在する
か否かに関して、イエスまたはノーを与えることができ
る。別法として、定量的検出は、標準の参照値、例えば
、標準の濃度曲線などのこの分野において受は入れられ
ている技術に色または計器の値を比較することによって
なすことができる。１つのウェル対他のウェルにおいて
発生した色または色濃度は、異なる標識試薬を使用する
場合において、２またはそれ以上の免疫反応成分の相対
量の指示として役立つことができる。

好ましい装置およびそれらを使用するイムノアラ本発明
のアッセイ支持体装置は、ニブスティン−バールウィル
ス（ＥＢＶ）、すなわち、ヒトにおける感染性単核症の
原因である、ヘルペスウィルス族の１員、の検出におけ
る使用にとくに適する。ＥＢＶは世界中の人口の８０〜
１００％を感染する極端に普通の環境因子である。初期
のまたは一次の感染は急性または無症状であることがあ
る。次いで、ＥＢＶの感染が循環血液、リンパ節または
肺臓中に存在する８９２３球において潜伏する長い期間
が続く。

ヒトの患者においてＴｇＭｋ呼ぶ免疫グロブリンの存在
は、一般に、彼らが単核症の急性の場合ををすること、
あるいは彼らが単核症からちょうど回復したことを示す
。ヒトの血液中のＩｇＧ免疫グロブリンと呼ばれる免疫
グロブリンの存在は、そのヒトが過去において単核症を
有しＩ；か、あるいはそれから回復したことを示す。両
者の免疫グロブリンが存在する場合、ＩｇＧがＩｇＭよ
り大きいとき、これは感染が過去の感染であることを示
す。反対の場合、感染は急性または活性である。

ＩｇＭの濃度がＩｇＧのそれに等しいとき、これは病気
がまた急性であるが、そのヒトは回復し始めたことを示
す。これらの免疫グロブリンの相対比を区別することが
できる場合、ある患者が単核症の急性または過去の感染
を有するとし、て診断することができるという重要な診
断の利点が得られるであろう。こうして、患者の血液試
料が過去の感染をもつものとして試験され、そしてなお
臨床的症候が単核症と一致するとき、主治医はこれらの
症候がある他の場合に起因されるに違いないことを認識
するであろう。また、理解されるように、［七〇コンバ
ート（ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｊ）、１する、すなわち、
免疫グロブリンの１つのタイプから他のタイプに変換す
る状態である患者は、抗体の各々についてほとんどの等
しい濃度を有するであろう。

イムノアッセイの現在特許請求されている装置および方
法は、ＩｇＧまたはＩｇＭの存在を検出し、そして生物
学的試料、最も好ましくは血清または血漿の試料中のそ
れらの相対量を比較ためにとくに適当である。本発明の
好ましい面を用いるキットの形態の例示的診断系は、系
列のフォーマットの本発明のアッセイ支持体装置からな
る。この系列はまずニブスティン−パールウィルスの抗
ｉまたはその断片で予備被覆し、ここで前記抗原または
断片は患者の血液中に存在する抗体と免疫反応するであ
ろう。タンパク質全体を使用できるが、特定の抗原の配
列を使用するとき、バックグラウンドの反応は最小とす
ることができる。

古典的には、−次感染はウィルスキャプシド（ＶＣＡ）
に対する抗体により検出し、そして回復期ハＥ　Ｖ　Ｒ
エンコード核抗ＪＪｉ［［ＥＢＮＡ］に対する一抗体の
クイズによって認められる［Ｈｅｎ１ｅｅｔ　　ａｔ、
、ヒユーマン・バンロジー（Ｈｕｍ・Ｐａｔｈｏｓ、）
、５：５５１　５６５　Ｃ１９７４）］、ＥＢＮＡ−１
（また、とくにはここでＥＢＮＡと呼ぶ）、認識すべき
最初の抗原、はイムノブロッティング技術により６５，
０００〜８５゜０００キロダルトン（ｋＤ）タンパク質
として同定された［５ｔｒｎａｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、
ウィルス字詰（Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、３８：９９０
（１９８１）；Ｈｅｎｎｅｓｓｅｙ　　ｅｔ　　ａｌ。

、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８０　：　５６６５−５６６９
　（１９８３）；およびＢｉ　ｌ　ｌ　ｉｎｇｓ　　ｅ
ｔ　　ａｔ、、グａシーデインダス・才ブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　
ｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ。

８０　：　７１０４　（１９８３）］。

］グリシンーアラニンＥＢＮＡ−１領の一部分を含有す
る合成ペプチドは、ＥＢＶ−ＩＭをもつ患者からの血清
と反応性であることが示された［Ｒｈｏｄｅｓ　　ｅｔ
　　ａｔ、、ヘルペス・ウィルス（Ｈｅｒｐｅｓ　　　
ｖｉｒｕｓ）、Ｒ，Ｒａｐｐ編、Ａｌａｎ　　Ｒ，Ｌｉ
５ｓ、ニューヨーク；ｐ、４８７　４９６　（１９８４
）；Ｒｈｏｄｅｓ　　ｅｔａｌ、、ジャーナル・才ブ・
イムノロジー（Ｊ。

Ｉｍｍｕｒ＋ｏｌ）、１３４：２１１−２１６　　（１
９８５）；Ｓｍ１ｔｈ　　ｅｔ　　ａｌ、、ジャーナル
・オブ・インフェクシャス・デイジージス（Ｊ。

ｒｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、）、１５４　：　８８５−８８９
（１９８６）およびＧｅ１ｔｏｓｋｙ　　ｅｔａｌ、、
Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｌａｂ　　ＡｎａｌｙｓｉｓＳ　ｌ：１
５３　１６２（１９８７）］。米国特許第４，６５４．
４１９号および引き統いてどこかに示すように、Ｐ６２
と命名されるペプチドはＥＬｒＳＡアッセイにおいて使
用して、回復期およびＴＭの回復期からのＥＢＶ−ＩＭ
の急性期を区別することができる［Ｓｍ１ｔｈ　　ｅｔ
　　ａｌ。

、ジャーナル・才ブ・イン７エクシヤス・デイジージス
（Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、）、１５４：８８５−８８
９　（１９８６）８よびＧｅ１ｔｏｓｋｙ　　ｅｔ　　
ａｌ、、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｌａｂ　　Ａｎａｌｙｓｉｓ
、ｌ：］５３　１６２（１９８７）］。この抗原の配列
は、病気の症候と良好に相関関係をもち、こうして装置
の受容ウェル上に被覆される第１結合反応成分としてこ
こにおいて好ましい。

病気の急性期はこのペプチドに対するＩｇＭ抗体の出現
により検出可能である。回復期の間、ＩｇＭ抗体の力価
は減少し、そしてＩｇＧ抗体は検出することができる［
Ｓｍ１ｔｈ　　ｅｔ　　ａｌ、、ジャーナル・オブ・イ
ンフェクシャス・デイジージス（Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉ
ｓ、）、１５４：８８５−８８９　（１９８６）］、長
い過去の感染をもつ患者は、優性の免疫グロブリンのク
ラスとして、ペプチドに対するＩｇＧ抗体を有する。

こうして、とくに好ましい実施態様において、ポリペプ
チド、例えば、ポリペプチドＰ６２を抗原として使用し
、そしてアッセイ支持体装置の受容ウェルに浸漬被覆法
によって付着させる。装置の平らな系列を、手動による
か、あるいは機械的手段により保持し、そして媒質、例
えば、わずかにアルカリ性のｐ）ｌの緩衝液、例えば、
ホウ酸塩緩衝液中にほぼ８ｍｇ／Ｑ−約２０　ｍ　ｇ　
／　Ｑ　、好ましくは８　ｍ　ｇ　／　Ｑ　〜約１２ｍ
ｇ／ｆｆｃ７）抗原金含有する溶液中に浸漬する。この
抗原被覆溶液は容器中に保持され、この容器は被覆抗原
の非特異的結合を促進しない材料、好ましくはステンレ
ス鋼から作られている。この系列をこの溶液中に通過さ
せ、こうして抗原が受容ウェル区画上に被覆されるよう
にする。その後、アッセイ支持体上の非特異的部位を典
型的にはタンパク質のオーバーコーテイングで遮断し、
このタンパク質は抗ニブスティンーバールウィルスが結
合または免疫反応する配列を含まず、その例はウシ血清
アルブミン、ヤギ血清、仔ウシ血清、および胎児仔ウシ
血清である。これに関して好ましいオーバーコーテイン
グタンパク質は胎児仔ウシ血清である。パラメーター、
例えば、被覆工程の時間の長さ、被覆工程を実施する温
度、被覆タンパク質の濃度、およびオーバーコーテイン
グタンパク質の濃度は、すべて、当業者より日常的に最
適化することができる。

キントの形態の本発明の好ましい診断系は、また、別に
包装された抗ヒト１ｇＧおよびＩｇＭ抗体を含み、それ
らの各々は標識または指示手段としての酵素、例えば、
ホースラデッシュベルオキシダーゼに連結されている。

最終のユーザーに便利であるように、かつこれらの試薬
を混乱させる傾向を少なくするために、抗１ｇＧ接合体
（すなわち、標識、例えば、ホースラデッシュベルオキ
゛シダーゼに接合した抗ＩｇＧ抗体）は典型的には安定
な色素で緑色に着色され、ここで色素は、試薬に加えた
とき、沈澱せず、色を変化させない。

ＦＤ＆Ｃ色素はこの目的に使用することができる。

このＩｇＭ接合体は典型的には、また、Ｆ　Ｄ＆Ｃ色素
で着色する。なぜなら、他の赤色素はこの系において安
定でないことが発見されたからである。

抗１ｇＧ３よび抗［ｇＭ抗体は、一般に、ポリクローナ
ル抗体またはモノクローナル抗体として提供されること
ができ、次いでホースラデッシュペルオキシダーゼまた
は同様な標識に、普通の手段により、例えば、ヘテロニ
官能性（ｈｅｔｅｒ。

ｂｉｆｕｎｃｔ　１ｏｎａｌ）カップリング手順により
連結することができる。

当業者は理解するように、ここに記載する標識試薬接合
体の安定性は、ある程度、その中Ｊこ含有される希釈媒
質、ことにイオン強度、ｐＨおよび使用する緩衝剤のタ
イプに依存する。ある接合体は緩衝液単独中で安定であ
るが、他の接合体はタンパク質または他の成分、例えば
、フェリシアン化カリウム、グリセロール、ゼラチンな
どの使用により安定化しなくてはならない。試薬の安定
が大きくなるほど、その希釈した形態の試薬の貯蔵寿命
は長くなる。試薬を濃縮物として貯蔵し、次いでイムノ
アッセイにおける使用前に希釈することができる場合、
安定性はそれほど大きい問題ではない。ここで記載する
試薬の安定性を増大するために使用する好ましい成分は
、胎児仔ウシ血清、リン酸塩緩衝液、トメルサル（ｔｈ
ｉｍｅｒｓａｌ）、およびフェリシアン化カリウム、と
くに胎児仔ウシ血清および７エリシアン化カリウムの組
み合わせである。

現在特許請求されているア・ノセイの文脈内で、標識試
薬（ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体）の濃度は、分析試料中に
存在するＩｇＧ対ＩｇＭの比の精確な分析を達成ために
、ことに利用する非常に短いインキュベーション時間内
で、臨界的であることが発見された。

比較的少量の反応媒質中の抗体の高い濃度は、免疫反応
生成物の存在を検出するために要する時間を、従来の数
時間と対照的に、数分の期間に減少する働きをする。し
かしながら、任意の監視しない過剰材の一方または他方
の接合体は試料中のＩｇＭ８よびＩｇＧの検出の間の繊
細なノくランスを混乱させ、そして試料中に存在するこ
れらの抗体の相対的比較を偏らせるであろう。さらに、
抗体はそれらの結合親和性においてお互いに異なる。

こうして、一方の抗体接合体が抗原に固定化された標的
抗体に、他方の接合体よりも速く、所定の時間内に結合
することができる。したがって、好ましい実施態様にお
いて、抗１ｇＧおよび抗ＩｇＭの結合は、２分のインキ
ュベーション期間に関して、接合体の各々の濃度を調節
して、各々がこの期間内に前以て決定した比で結合する
よう番こすることによって、正規化する。これを達成す
るために、種々の濃度の所定の接合体を標準の接合体と
前以て決定した濃度で比較することができ、この濃度は
標的抗体に結合するときある種の色濃度を発生する。そ
のそれぞれの接合体の適当な濃度は、その同一の前以て
決定しｔ：濃度の標的抗体に接合体が結合したとき、そ
の同一の色濃度を発生する濃度である。各々について適
当な濃度がいったん選択されると、抗ＩｇＭおよび抗Ｉ
ｇＧの両者の接合体は、標的抗体に結合するとき、前以
て決定した標準のとして同一の色濃度を発生するであろ
う。次いで、接合体は試料中の標的抗体の同一量を所定
の時間内に検出する能力を有するであろう。各それぞれ
の標識試薬中の抗体の濃度は異なることがあるが、受容
ウェル中の抗体への結合速度は実質的に正規化されてい
る。

抗１ｇＧおよび抗ＩｇＭ漂識試薬の濃度、結合の正規化
のバランスは、患者の試料中のこれらのそれぞれの抗体
がほぼ等しい場合の検出を可能とするために臨界的であ
る。好ましい実施態様において、抗ＩｇＭまたはＩｇＧ
抗体標識試薬の各々についての最終濃度（その接合体を
いったん受容ウェルに加えたとき）は約１．５μｇ　／
　ｍ　Ｑ〜約４．５ｐｇ／ｍＱｓ好ましくは約２ｔｔｇ
／ｍＱ　−約４μｇ　／　ｍ　Ｑ　１最も好ましくは２
μｇ　／　ｍ　Ｑ〜約３μｇ　／　ｍ　Ｑの範囲である
。しかしながら、異なるインキュベーション期間を選択
するか、あるいはホースラデッシュベルオキシダーゼ以
外の酵素を使用するなどの場合、これらの濃度は実質的
に変化することができる。

本発明の診断キットは、また、抗ＩｇＭおよび抗１ｇＧ
接合体に指示手段として連結さる酵素のための基質を含
むことができる。連結された酵素をそれに作用させて検
出可能な結果を生成する任意の基質は、これに関して適
当である。ホースラデッシュペルオキシダーゼが酵素で
ある、好ましい実施態様において、この酵素をそれに作
用させる任意の基質、例えば、安定化された過酸化水素
またはＡＢＴＳ系中の普通に使用されているオルトフェ
ニレンジアミン（ＯＰ　Ｄ）は適当であろう。

ＡＢＴＳ系はここで使用するために好ましく、ここで基
質へおよびＢは使用前に混合し、それに酵素を作用させ
るとき、○ＰＤの黄色とは反対に、これは緑の反応の色
を発生する。この緑は黄よりも視的に感知することが容
易である。さらに、この基質系は、オルトフェニレンジ
アミン系のように、感光性ではない。

包装されかつキットで供給されるか、あるいは最終ユー
ザーにより供給される、診断キットの追加の成分は、洗
浄溶液、例えば、生理的塩類溶液Ｔｗｅ　ｅ　ｎ”など
、ならびに基質−酵素反応を停止させる成分、例えば、
ＳＤＳ、酸などである。

これはウェル間の色の比較を促進するために発生した段
階で色の発生を阻止することができる。

次の実施例は本発明のある種の実施態様をいっそう詳し
く説明するが、本発明を限定しない。

ス買渥 ＩｇＧおよびＩｇＭの抗体の比を検出する好ましいイム
ノア、ツセイにおいて、本発明のアッセイ支持体装置を
使用することを説明する。ここで明瞭さを目的として、
第１図に示すアッセイ支持体装置について言及する。多
分標的分析物を含有する生物学的試料、例えば、唾液、
血清、全血、血漿などの等しいアリコートを、ニブステ
ィン−バールウィルス抗１（ＥＢＮＡ）で予備被覆した
、受容ウェルの各々に加える。アリコートは約２５μＱ
〜約１５０μＱ１好ましくは４０〜約６０μＱである。

次いで、アッセイ支持体を室温において少なくとも約２
分間インキュベーションして、生物学的試料中の抗体を
装置に被覆された抗原に結合させる。次いで、結合しな
い反応成分を装置から、単にこの系列を、適当な洗浄溶
液、例えば、生理的塩類溶液とＴｗｅｅｎＲとの組み合
わせを含有する容器中に浸漬するこ２０とによって洗浄
する。この系列をティプルトップに戻して平らに配置し
、紙タオルまたは同様な吸収材料で吸い取る。次に、受
容ウェル１８に漂識試薬、抗ＩｇＭ抗体のアリコートを
加え、そして受容ウェル２０に抗ＴｇＧのアリコートを
加え、２つのアリコートは等しく、そしてウェルをオー
バー７０−しないような量、好ましくは約１００μａで
ある。この装置を少なくとも約２分間インキュベーショ
ンし、こうして接合した標識試薬が標的抗体と反応して
予備被覆した抗原に結合できるようにすることができる
。第２洗浄工程および吸い取り工程を用いて、予備被覆
したタンパク質に結合しなかった標的抗体を試料から除
去し、そして受容ウェル１８および２０の各々に、製造
業者の指示に従い、前厄て混合した基質Ａおよび（Ｋｉ
ｒｇｅｇａａｒｄ　　＆　　Ｐｅｒｒｙ）の基質のアリ
コートを加える。ここで再び、ウェルの各々に加える基
質溶液の量は、反応の結果をゆがめないように、等しい
。これは、一方の抗体対他方の抗体の相対比を確認する
ことを可能とする。この基質の工程のインキュベーショ
ン時間は、約２分〜約２．５分、好ましくは２分である
。基質をより長い時間アッセイ支持体の凹状表面上に固
定化された免疫反応生成物とともにインキュベーション
させる場合、結果はゆがめられることがある。ＩｇＭが
ＩｇＧより大きい抗体である場合、ＨＲＰのよりおおく
がその上に存在する。こうして、反応の色は異なる速度
で発生する傾向がある。しかしながら、ある時点におい
て、速度はプラトーとなり、そしてすべての意図および
目的について、一方の抗体対他方の抗体の比はｌ：ｌの
比であったように思われるであろう。それゆえ、このプ
ラトーに到達する前に色の発生を、色の発生曲線の上昇
する部分で（ここで色の発生は時間の関数である）比較
しなくてはならない。前述のように結合親和性の区別の
ために正規化した、抗１ｇＧおよび抗ＩｇＭの好ましい
濃度の関係内で、基質ＡおよびＢと一緒の２分のインキ
ュベーション期間は「２分の窓」と呼ぶものを提供し、
ここでＩｇＧのウェルにおいて発生した色または色濃度
をＩｇＭのウェルに対して比較して、一方の抗体対他方
の抗体の適切なかつ現実の相対比を得ることができる。

次いで、この反応を必要に応じて２分の窓で、酵素を不
活性化する成分、例えば、ＳＤＳ、酸などの添加により
停止する。このようにして、色の発生は２分の段階で停
止させ、そして色の比較を研究することができる。

本発明の主な特徴および態様は、次の通りである。

ｌ、アッセイ支持体であって、前記アッセイ支持体は、
略平らな、細長い形状を有し、そして握り区画、試料受
容ウェル区画、およびそれらの間の接続区画からなり、
前記区画の各々は縦軸に沿って整列しており、 前記試料受容ウェル区画は少なくとも２つの間隔を置い
て位置する受容ウェルからなり、前記ウェルの各々は、
前記支持体の第１面に開いた端、前記支持体中に凹状に
延びる凹状内表面、および前記支持体の反対の面から凸
状に突起する凸状外表面を有し、 前記ウェルの少なくとも１つの前記凸状外表面は、平ら
な表面上に配置するとき、前記ウェルの回転を防止でき
る、少なくとも１つの安定化脚を有し、 前記アッセイ支持体は水平化突起を有し、前記水平化突
起は、前記反対の面から延び、前記少なくとも１つ安定
化脚と共働して、平らな表面に配置するとき、前記支持
体を水平に維持することができ、 前記試料受容区画は、また、前記ウェルの間の空間に位
置しかつ前記支持体の第１面から延びる、ダム手段を有
し、前記ダム手段は前記ウェルの１つから他のウェルへ
の液状試料の流れを防止することができる、 ことを特徴とするアッセイ支持体。

２、前記ウェルの前記凹状内表面は、さらに、うねを含
み、前記うねはウェル内に堆積する液状反応成分の均質
な分散を促進することができる、上記第１項記載のアッ
セイ支持体。

３、前記うねは同心円の形状である上記第２項記載のア
ッセイ支持体。

４、前記ダム手段は、さらに、少なくとも１つ表示部分
を含む上記第１項記載のアッセイ支持体。

５、前記少なくとも１つ表示部分は前記ダム手段に隣接
し、そして前記平らな支持体の前記第１面から前記ダム
手段の高さに等しい高さに突起している、上記第４項記
載のアッセイ支持体。

６、前記少なくとも１つ表示部分は略三角形の形状であ
り、その頂点は１つの受容ウェルに向かって延びている
、上記第５項記載のアッセイ支持体。

７、萌記少なくとも１つ表示部分は、さらに、表示のし
るしを含む、上記第６項記載のアッセイ支持体。

８、前記アッセイ支持体の前記接続区画内に、前記アッ
セイ支持体の表示のための表示区域が設けられている、
上記第７項記載のアッセイ支持体。

９、前記表示区域は前記アッセイ支持体の前記握り区画
と隣接する、上記第８項記載のアッセイ支持体。

１０、少なくとも１つの安定化脚と共働することができ
る前記水平化突起は、前記接続区画の前記表示区域と前
記握り区画との間に位置する、上記第９項記載のアッセ
イ支持体。

１１、前記握り区画は前記支持体の手による握りを促進
するうねを含む、上記第１Ｏ項記載のアッセイ支持体。

Ｉ２、前記握り区画は、さらに、数字のしるしを含む、
上記第１１項記載のアッセイ支持体。

１３、アッセイ支持体の各々が、略平らな、細長い形状
を有し、そして握り区画、試料受容ウェル区画およびそ
れらの間の接続区画からなり、前記区画の各々は縦軸に
沿って整列しており、前記試料受容ウェル区画は少なく
とも２つの間隔を置いて位置する受容ウェルからなり、
前記ウェルの各々は、前記支持体の第１面に開いた端、
前記支持体中に凹状に延びる凹状内表面、および前記支
持体の反対の面から凸状に突起する凸状外表面を有し、 前記ウェルの少なくとも１つの前記凸状外表面は、平ら
な表面上に配置するとき、前記ウェルの回転を防止でき
る、少なくとも１つの安定化脚を有し、 前記アッセイ支持体は水平化突起を有し、前記水平化突
起は、前記反対の面から延び、前記少なくとも１つ安定
化脚と共働して、平らな表面に配置するとき、前記支持
体を水平ｊこ維持することができ、 前記試料受容ウェル区画は、また、前記ウェルの間の空
間に位置しかつ前記支持体の第１面から延びる、ダム手
段を有し、前記ダム手段は前記ウェルの１つから他のウ
ェルへの液状試料の流れを防止することができる、 ことを特徴とする複数の分離可能なアッセイ支持体。

１４、前記アッセイ支持体は、一般に各支持体の前記握
り区画において、お互いに分離可能に接続されている、
上記第１３項記載の複数のアッセイ支持体。

１５、実質的に単一の平面において接続されていて、複
数の同様な平らな系列と一緒に浴中に浸漬することによ
って、前記ウェルに試薬を適用するための前記支持体の
平らな系列を形成し、こうして前記系列の第１面は隣接
する平らな系列の反対の面に面し：前記支持体の各々は
スペーサー突起を有し、前記スペーサー突起は反対の面
の試料受容区画から延び、そして隣接する平らな系列の
アッセイ支持体のダム手段と共働して、面記平らな系列
のウェルの凸状表面を隣接する系列のウェルの凹状表面
から離れて保持することができる、上記第１４項記載の
分離可能に接続されたアッセイ支持体。

１６、約８〜約ｌＯの分離可能に接続されたアッセイ支
持体からなる、上記第１５項記載の平らな系列。

１７、生物学的試料中のＩｇＧ対ＩｇＭ抗体の比のイム
ノアッセイの決定を実施するとき有用なアッセイ支持体
であって、前記支持体は、略平らな、細長い形状を有し
、モして遅り区画、試料受容ウェル区画、およびそれら
の間の接続区画からなり、前記区画の各々は縦軸に沿っ
て整列しており、 前記試料受容ウェル区画は２つの間隔を置いて位置する
受容ウェルからなり；前記ウェルの各々は、前記支持体
の第１面に開いた端、前記支持体中に凹状に延びる凹状
内表面、前記内表面は同心円をもつ、および前記支持体
の反対の面から凸状に突起する凸状外表面を有し、 前記ウェルの少なくとも１つの前記凸状外表面は、平ら
な表面上に配置するとき、前記ウェルの回転を防止でき
る、少なくとも１つの安定化脚を有し、 前記アッセイ支持体は水平化突起を有し、前記水平化突
起は、前記反対の面から延び、前記少なくとも１つ安定
化脚と共働して、平らな表面に配置するとき、前記支持
体を水平に維持することができ；前記試料受容区画は、
また、前記ウェルの間の空間に位置しかつ前記支持体の
第１面から延びる、ダム手段を有し、前記ダム手段は前
記ウェルの１つから他のウェルへの液状試料の流れを防
止することができ、 前記ダム手段は、さらに、表示部分を含み、前記表示部
分はダムと隣接し、そして前記支持体の前記第１面から
前記ダム手段の高さに等しい高さに延び：前記表示部分
は略三角形の形状をもち、その頂点は１つの受容ウェル
に向かって延びている、 ことを特徴とするアッセイ支持体。

１８、前記受容ウェル区画は抗体に結合できるタンパク
質で予備被覆されている、上記第１７項記載の装置。

１９、工程： ａ）等しいアリコートの生物学的試料を第１受容ウェル
および第２受容ウェルに、十分な時間の間、加えて、前
記試料中に含有される標的抗体を前記ウェルの各々にお
ける予備被覆したタンパク質に結合させ、 ｂ）未反応の試料を前記受容ウェルから洗浄し、Ｃ）第
１抗体のための標識試薬のアリコートを前記第１受容ウ
ェルに、そして第２抗体のための標識試薬の等しいアリ
コートを前記第２受容ウェルに、約１１０〜約１３０秒
のインキュベーション時間の間、加え：ここで前記標識
試薬は酵素接合抗体であり、 ｄ）未反応の標識試薬を前記ウェルから洗浄し、ｅ）前
記ウェルの各々に、前記酵素接合抗体のための基質の等
しい濃度を約１１０〜約１３０秒のインキュベーション
時間の間加え：前記基質は前記酵素と反応して色を生成
することができ、ｆ）そのように生成した色を前記イン
キュベションの終わりに検出し、そして前記第１受容ウ
ェルにおいて生成した色濃度を前記第２受容ウェルにお
いて生成したそれと、前記第１抗体および前記第２抗体
の相対的量の決定として、比較する、かもなることを特
徴とする、第１抗体および第２抗体の存在を決定し、そ
してそれらの相対的量を比較するためのイムノアッセイ
を実施するために上記第１８項記載の装置を使用する方
法。

２０、前記受容ウェル中の標的抗体に結合する前記第１
抗体および第２抗体の各々の親和性は正規化されている
、上記第１９項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明のアッセイ装置の好ましい実施態様の
斜視図である。 第２図は、第［図のアッセイ支持体の受容ウェル区画の
後側面図である。 第３図は、平らな表面上に水平に静止するときの、第１
図の好ましいアッセイ支持体の側面図である。 第４図は、支持体がお互いに分離可能に一緒にされてい
る、ｌ続きで示す複数のアッセイ支持体である。 第５図、ｉ６図および第７図は、本発明のアッセイ支持
体の別の実施態様を示す。 第８図は、被覆剤を含有する浴中に垂直浸漬することに
よって平らな系列の予備被覆の１つの実ｍ態様を示す。 第９図は、第８図の線９−９に沿って取った断面図であ
る。 １０　単一のアッセイ支持体装置 １０Ｂ　　別の実施態様 １０ｃ　　別の実施態様 １０Ａ　　別の実施態様 ＩＩ　　　平らな系列 １２　　試料受容ウェル区画 １２Ａ　　受容ウェル区画 １２Ｂ　　試料受容ウェル区画 １２ｃ　　試料受容ウェル区画 ２５′ 接続区画 握り区画 受容ウェル 受容ウェル 安定化脚 ダム手段 スペーサー突起 三角形の表示部分 水平化突起 小さいノブ 三角形の表示部分 結合 円筒形部分 表示区域 荒くした表面 数字 浴 被覆溶液 浸漬支持棒

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、アッセイ支持体であって、前記アッセイ支持体は、
   略平らな、細長い形状を有し、そして握り区画、試料受
   容ウェル区画、およびそれらの間の接続区画からなり、
   前記区画の各々は縦軸に沿って整列しており、 前記試料受容ウェル区画は少なくとも２つの間隔を置い
   て位置する受容ウェルからなり、前記ウェルの各々は、
   前記支持体の第１面に開いた端、前記支持体中に凹状に
   延びる凹状内表面、および前記支持体の反対の面から凸
   状に突起する凸状外表面を有し、 前記ウェルの少なくとも１つの前記凸状外表面は、平ら
   な表面上に配置するとき、前記ウェルの回転を防止でき
   る、少なくとも１つの安定化脚を有し、 前記アッセイ支持体は水平化突起を有し、前記水平化突
   起は、前記反対の面から延び、前記少なくとも１つ安定
   化脚と共働して、平らな表面に配置するとき、前記支持
   体を水平に維持することができ、 前記試料受容区画は、また、前記ウェルの間の空間に位
   置しかつ前記支持体の第１面から延びる、ダム手段を有
   し、前記ダム手段は前記ウェルの１つから他のウェルへ
   の液状試料の流れを防止することができる、 ことを特徴とするアッセイ支持体。 ２、アッセイ支持体の各々が、略平らな、細長い形状を
   有し、そして握り区画、試料受容ウェル区画およびそれ
   らの間の接続区画からなり、前記区画の各々は縦軸に沿
   って整列しており、 前記試料受容ウェル区画は少なくとも２つの間隔を置い
   て位置する受容ウェルからなり、前記ウェルの各々は、
   前記支持体の第１面に開いた端、前記支持体中に凹状に
   延びる凹状内表面、および前記支持体の反対の面から凸
   状に突起する凸状外表面を有し、 前記ウェルの少なくとも１つの前記凸状外表面は、平ら
   な表面上に配置するとき、前記ウェルの回転を防止でき
   る、少なくとも１つの安定化脚を有し、 前記アッセイ支持体は水平化突起を有し、前記水平化突
   起は、前記反対の面から延び、前記少なくとも１つ安定
   化脚と共働して、平らな表面に配置するとき、前記支持
   体を水平に維持することができ、 前記試料受容ウェル区画は、また、前記ウェルの間の空
   間に位置しかつ前記支持体の第１面から延びる、ダム手
   段を有し、前記ダム手段は前記ウェルの１つから他のウ
   ェルへの液状試料の流れを防止することができる、 ことを特徴とする複数の分離可能なアッセイ支持体。 ３、生物学的試料中のＩｇＧ対ＩｇＭ抗体の比のイムノ
   アッセイの決定を実施するとき有用なアッセイ支持体で
   あって、前記支持体は、略平らな、細長い形状を有し、
   そして握り区画、試料受容ウェル区画、およびそれらの
   間の接続区画からなり、前記区画の各々は縦軸に沿つて
   整列しており、前記試料受容ウェル区画は２つの間隔を
   置いて位置する受容ウェルからなり；前記ウェルの各々
   は、前記支持体の第１面に開いた端、前記支持体中に凹
   状に延びる凹状内表面、前記内表面は同心円をもつ、お
   よび前記支持体の反対の面から凸状に突起する凸状外表
   面を有し、 前記ウェルの少なくとも１つの前記凸状外表面は、平ら
   な表面上に配置するとき、前記ウェルの回転を防止でき
   る、少なくとも１つの安定化脚を有し、 前記アッセイ支持体は水平化突起を有し、前記水平化突
   起は、前記反対の面から延び、前記少なくとも１つ安定
   化脚と共働して、平らな表面に配置するとき、前記支持
   体を水平に維持することができ；前記試料受容区画は、
   また、前記ウェルの間の空間に位置しかつ前記支持体の
   第１面から延びる、ダム手段を有し、前記ダム手段は前
   記ウェルの１つから他のウェルへの液状試料の流れを防
   止することができ、 前記ダム手段は、さらに、表示部分を含み、前記表示部
   分はダムと隣接し、そして前記支持体の前記第１面から
   前記ダム手段の高さに等しい高さに延び；前記表示部分
   は略三角形の形状をもち、その頂点は１つの受容ウェル
   に向かって延びている、 ことを特徴とするアッセイ支持体。 ４、前記受容ウェル区画は抗体に結合できるタンパク質
   で予備被覆されている、上記第３項記載の装置。 ５、工程： ａ）等しいアリコートの生物学的試料を第１受容ウェル
   および第２受容ウェルに、十分な時間の間、加えて、前
   記試料中に含有される標的抗体を前記ウェルの各々にお
   ける予備被覆したタンパク質に結合させ、 ｂ）未反応の試料を前記受容ウェルから洗浄し、ｃ）第
   １抗体のための標識試薬のアリコートを前記第１受容ウ
   ェルに、そして第２抗体のための標識試薬の等しいアリ
   コートを前記第２受容ウェルに、約１１０〜約１３０秒
   のインキュベーション時間の間、加え；ここで前記標識
   試薬は酵素接合抗体であり、 ｄ）未反応の標識試薬を前記ウェルから洗浄し、ｅ）前
   記ウェルの各々に、前記酵素接合抗体のための基質の等
   しい濃度を約１１０〜約１３０秒のインキュベーション
   時間の間加え；前記基質は前記酵素と反応して色を生成
   することができ、ｆ）そのように生成した色を前記イン
   キュベーションの終わりに検出し、そして前記第１受容
   ウェルにおいて生成した色濃度を前記第２受容ウェルに
   おいて生成したそれと、前記第１抗体および前記第２抗
   体の相対的量の決定として、比較する、からなることを
   特徴とする、第１抗体および第２抗体の存在を決定し、
   そしてそれらの相対的量を比較するためのイムノアッセ
   イを実施するために上記第４項記載の装置を使用する方
   法。