DE19918569A1 - Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, pathologischen Zuständen und pathophysiologischen sowie physiologischen Messgrößen - Google Patents
Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, pathologischen Zuständen und pathophysiologischen sowie physiologischen MessgrößenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, pathologischen Zuständen sowie physiologischen Messgrößen, das auf der Immobilisierung von Erkennungsstrukturen mittels spezieller Linker auf spezifischen funktionellen Polymeroberflächen beruht.
Description
Gegenstand der Erfindung sind Verfahren zur einfachen und schnellen Messung
krankhafter Zustände, aber auch pathophysiologischer und physiologischer Daten
des Organismus, die die Wechselwirkung funktioneller Kunststoffoberflächen mit
spezifischen Linkem ausnützen, wie sie in WO 98/46648 beschrieben ist.
Das augenblicklich angewandte Management zur Quantifizierung von zu
diagnostizierenden Parametern, welche im Organismus z. T. nur in ng-Mengen bzw.
picomolaren Konzentrationen vorkommen, wird immer aufwendiger, und die hierbei
benutzten Methoden sind kosten- und zeitintensiv. Zum Beispiel sind die seit
längerem im Gebrauch befindlichen ELISA's und hiervon abgeleitete Techniken
dadurch gekennzeichnet, dass sie zwar relativ geringe Stoffmengen nachweisen,
aber einen unverhältnismäßig großen Kosten- und Zeitaufwand erfordern.
Das ist vor allem darin begründet, dass mit Hilfe von spezifischen Antikörpern, die in
Organismen außerhalb des menschlichen Körpers gegen proteinartige Substanzen
des Menschen erzeugt wurden, der nachzuweisende Stoff spezifisch erkannt werden
muss. Die Detektion dieses stoffspezifischen Fremdeiweißantikörpers erfolgt dann
z. B. mit Hilfe eines unspezifischen, gegen das Eiweiß des Tieres gerichteten
weiteren Antikörpers, an dem eine entsprechende Erkennungsstruktur gebunden
wurde, die mit Hilfe modernster Detektionsmethoden, im wesentlichen radioaktiven
Methoden, aber auch spektralphotometrisch erfassbaren Messmethoden,
quantifiziert wird. Zur Detektion werden kostenaufwendige Diagnosegeräte benutzt,
wie ELISA-Reader, Spektralphotometer, Liquid-Szintillation-Counter u. a., die zudem
einen relativ hohen Personal- und Kostenaufwand zur Betreibung und Wartung
erfordern.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es daher, mit Hilfe einer spezifischen
Interaktionsform halbquantitative, aber auch quantitative Detektionsverfahren
bereitzustellen, die innerhalb von wenigen Minuten Ergebnisse liefern, deren
Exaktheit mit den oben beschriebenen Methoden vergleichbar ist und die somit eine
neue Qualität der bed-side-Diagnostik erwarten lassen. Die erfindungsgemäßen
Verfahren nützen dazu das in der WO 98/46648 beschriebene Prinzip der
Immobilisierung von spezifischen Erkennungsstrukturen wie z. B. Antigenen,
spezifischen Antikörpern, aber auch von Enzymen oder Inhibitoren von Enzymen,
mittels eines Linkers auf Polymeroberflächen.
Unter Einbeziehung dieses Prinzips konnten neuartige Methoden der Diagnostik von
Erkrankungen, Körperfunktionsstörungen, aber auch von physiologischen bzw.
pathophysiologischen Messdaten entwickelt werden. Solche Messungen zur Funk
tionsfähigkeit oder Störung der Körperfunktion werden in der laborchemischen,
mikrobiologischen oder enzymologischen Diagnostik in der Humanmedizin, aber
auch in der Veterinärmedizin sowie in den biologischen Wissenschaften eingesetzt.
Die beschriebene Immobilisierung von Erkennungsstrukturen erlaubt eine schnelle,
halbquantitative Bestimmung von Substanzen mittels eines im Folgenden detaüiert
beschriebenen Kompetitionsmechanismusses. Überraschenderweise wurde aber
auch gefunden, dass die Immobilisierung nach diesem Verfahren eine
außerordentlich hohe Belegungsdichte mit der zu diagnostizierenden Substanz zur
Folge hat. Dadurch wird der Einsatz von gängigen Absorptionsmethoden wie z. B.
UV/Vis oder IR-Absorptionsspektroskopie wesentlich erleichtert.
Wie in WO 98/46648 beschrieben, werden für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung molekulare Erkennungsstrukturen, die zu hochspezifischen
Wechselwirkungen mit zu diagnostizierenden Substanzen fähig sind, an einen
Linker gebunden, der ein zur Wasserstoffbrückenbindung fähiges Strukturelement
aufweist.
Linker, die für die offenbarten Verfahren eingesetzt werden können, sind Moleküle,
die mindestens zwei funktionelle Gruppen L1 und L2 aufweisen. Eine dieser
funktionellen Gruppen (L1) muss zur Bildung von Wasserstoffbrücken fähig sein und
so die Bindung des Linkers an die Polymeroberfläche ermöglichen. Die funktionelle
Gruppe L2 wird so gewählt, dass eine Bindung zwischen dem Linker und der zu
immobilisierenden Substanz hergestellt werden kann. Um mehrere Substanzen
gleichzeitig auf der Polymeroberfläche aufbringen zu können, ist die gleichzeitige
Verwendung mehrerer Linker mit unterschiedlichen Gruppen L2 möglich. Jedoch
besteht auch die Möglichkeit, Linker eines Typs einzusetzen, die mehrere Gruppen
L2 besitzen, die gleich oder unterschiedlich sind. Gleichermaßen können auch
Linker eingesetzt werden, die mehrere gleiche oder unterschiedliche Gruppen L1
aufweisen. Bevorzugt sind L1 und L2 durch eine Alkylkette oder einen Polyether
verbunden.
Strukturelement L1 ist bevorzugt ein polares Wasserstoffatom, wie es beispielsweise
in OH-, SH-, NH- oder PH-Bindungen vorliegt. Dieses Strukturelement befindet sich
bevorzugt an einer ausreichend wasserlöslichen Verbindung als Linker, der weiter
das Strukturelement L2 trägt. Besonders bevorzugt ist L1 endständig am Linker
angebracht.
Die funktionelle Gruppe, mittels derer die Substanz, bevorzugt kovalent, an den
Linker gebunden werden kann (L2) ist beispielsweise ein Succinimidylsuccinat,
Succinimydylpropionat, Nitrophenylcarbonat, Trisylat, Epoxid, Aldehyd, Isocyanat
oder ein Maleinimid.
Funktionelle Gruppen L2, mittels derer die bevorzugten Linker zur Anbindung einer
Substanz modifiziert werden können, sind z. B. im Katalog der Firma Shearwater
Polymers, Inc., 2307 Spring Branch Rd., Huntsville, AL 35801 (USA) beschrieben.
Bevorzugt werden als Linker Polyalkylenglykole, Polyalkylenimine, Polyalkylenamine
oder Polyalkylensulfide, sowie Polyoxazilline eingesetzt, wobei Polyalkylenglykole
besonders bevorzugt sind. Insbesondere bevorzugt werden Polyethylenglykole
(PEG) eingesetzt. Die genannten Verbindungen besitzen vorzugsweise ein
Molekulargewicht von 0,5-50 kDa.
Funktionelle Polymeroberflächen, die für die erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden können, sind ebenfalls in WO 98/46648 beschrieben. Zum
Einsatz kommen Homo- oder Copolymere, zu deren Herstellung mindestens ein
Monomertyp eingesetzt wird, der neben einer polymerisierbaren Doppelbindung
oder einer polykondensierbaren funktionellen Gruppe eine weitere Carbonylgruppe
in Form eines Ketons oder eines Carbonsäurederivats enthält, die nicht an der
Polymerisationsreaktion teilnimmt. Bevorzugt enthält das Polymer ein Struktur
element der Formel (A):
wobei die Reste R gleich oder verschieden sein können und einen Alkyl- oder
Arylrest oder ein Wasserstoffatom darstellen. Der Alkylrest kann linear oder
verzweigt sein und besteht bevorzugt aus 1 bis 20 Kohlenstoffatomen. Der Arylrest
besteht bevorzugt aus 6 bis 18, besonders bevorzugt aus 6 bis 12 Kohlen
stoffatomen. Der Rest X ist fakultativ und bedeutet O, N oder CH2 Für den Fall X = N
trägt N zusätzlich zu dem in Formel (A) vermerkten einen weiteren Rest R, der
unabhängig von den anderen Resten R wie vorstehend definiert ist.
Besonders bevorzugt als Alkylrest ist ein geradkettiger oder verzweigter,
gegebenenfalls substituierter C1-8-Alkylrest, beispielsweise ein Methyl-, Ethyl- oder
Propylrest. Beispiele für gegebenenfalls vorhandene Substituenten umfassen ein
oder mehrere Halogenatome, z. B. Fluor-, Chlor-, Brom- oder Iodatome oder
Hydroxylgruppen, C1-6-Alkylreste oder C1-6-Alkoxyreste oder C1-6-Alkylthiolreste. Der
Arylrest ist besonders bevorzugt ein monocyclischer oder bicyclischer,
gegebenenfalls substituierter Arylrest, der gegebenenfalls ein oder mehrere Hetero
atome enthalten kann. Beispiele für solche Arylreste sind Phenyl, 1- oder 2-
Naphthyl, Indenyl- oder Isoindenylreste. Beispiele für heteroatomhaltige Arylreste
sind C3-9-Heteroarylreste, die Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff-, Schwefel-
oder Stickstoffatomen, enthalten. Monocyclische Heteroarylreste umfassen
beispielsweise Pyrolyl-, Furyl-, Thienyl-, Imidazolyl-, N-Methylimidazolyl-, N-
Ethylimidazolyl-, Benzothiazolyl-, Chinazolinyl-, Naphthylpyridinyl-, Chinolyinyl-, Iso
chinolinyl- und Tetrazolylreste.
Ein bevorzugtes Polymer, das solche Gruppen enthält, ist ein Polyalkylmethacrylat
(PAMA) mit einem Alkylrest, der vorzugsweise 1-6 C-Atome umfasst, wie z. B.
Polymethylmethacrylat (PMMA), Polyethylmethacrylat (PEMA) oder Polypropylmeth
acrylat. Weiterhin können Polyvinylacetat, Polycyclohexylmethacrylate oder
Polyphenylmethacrylat eingesetzt werden. Besonders bevorzugt wird Polymethyl
methacrylat eingesetzt.
Auch Copolymere oder Polymermischungen aus beliebigen Anteilen der vorstehend
genannten Polymere untereinander oder mit einer oder mehreren weiteren
Polymerkomponenten, beispielsweise Polystyrol, Polyacrylnitril oder Polyamiden
können eingesetzt werden. Bevorzugt beträgt der Anteil der Monomere, die ein
Strukturelement (A) aufweisen an solchen Mischpolymeren mindestens 20%,
besonders bevorzugt mindestens 40% und ganz besonders bevorzugt mindestens
60%.
Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren werden
Mikrotiterplatten. Küvetten oder Messprobenröhrchen für diagnostische
Analysegeräte aus den beschriebenen Polymeren verwendet. An der Oberfläche
dieser Probenbehältnisse sind Strukturen vorhanden, die mit den Linkem feste
Bindungen eingehen. Erstaunlicherweise tritt die Bindung bei bloßem Kontakt der
Linker mit der Polymeroberfläche auf, ohne dass erhöhte Temperaturen oder der
Einsatz von Katalysatoren oder anderer reaktionsbeschleunigender Reagentien
nötig wäre. Die entstehende Bindung ist von ausgezeichneter Stabilität und kann in
wässrigen Lösungen durch Verschiebungen des pH-Werts in einem Bereich von 2-
13 nicht gelöst werden. Auch gegen das Spülen mit Salzlösungen hoher Ionenstärke
(2n Glycin, 2n Harnstoff) ist die Bindung resistent. So können Linker-gekoppelte
spezifische Erkennungsstrukturen wie Antigene, Antikörper, Enzyme oder andere
spezielle Gegenspieler für eine zu diagnostizierende Substanz auf die
Polymeroberfläche aufgebracht werden. Die flächenseitige Bindungsdichte auf der
Oberfläche ist dabei bemerkenswert hoch. Bei Verwendung von PAMA und PEG
bilden sich je nach verwendeter PEG-Kettenlänge Schichten von 100-300 nm Stärke
(s. Abb. 1). Diese Schichten beeinträchtigen nicht die Transparenz des verwendeten
Polyalkylmethacrylatmaterials, so dass in der Regel die Transmission von
sichtbarem, ultraviolettem oder infrarotem Licht nicht gestört wird. Auch die
endständig an die Linker gebundenen spezifischen Erkennungsstrukturen haben
keinen signifikanten Einfluss auf die Lichttransmission. Bedingt durch die hohe
Flächendichte der gebundenen Biomoleküle ist eine direkte exakte Messung der zu
detektierenden Substanzen im Blut, Plasma oder anderen Körperflüssigkeiten
möglich. Die Messung kann demzufolge mittels Absorptionsmessungen bei einer
Wellenlänge erfolgen, die für die zu diagnostizierende Substanz charakteristisch ist
und die im UV, sichtbaren oder IR-Bereich des Spektrums liegen sollte.
Das zur Anwendung kommende neue Diagnoseverfahren ermöglicht einen weiteren
originellen Detektionsvorgang. Nach der Gewinnung der zu verwendenden
Probenflüssigkeit bzw. während der Probenaufbereitung wird der Messprobe eine
definierte Quantität des zu detektierenden Stoffs zugesetzt. An diesen zugesetzten
Detektionsstoff sind spezielle Markierungs- oder Detektionsmittel gebunden. In der
Regel sind dies Farbstoffe, bevorzugt intensive Vital-Farbstoffe oder radioaktive
Marker, die entweder mit dem unbewaffneten Auge oder bei bestimmten
Wellenlängen in Photometern, Spektralphotometern, Fluoreszenz-Messgeräten,
Lumineszenz-Messgeräten, aber auch in Liquid-Szintillation-Countern oder γ-
Countern, qualitativ erfasst werden. Die zugesetzte definierte Menge des markierten
Interaktionspartners sollte einen bestimmten Teil der vorhandenen Bindungsplätze
auf der mit Linkem und Erkennungsstrukturen belegten Polymeroberfläche
besetzen. Dadurch ist gewährleistet, dass die im Blut vorhandenen unbekannten
Quantitäten des zu detektierenden Stoffes mit dem speziell gefärbten Detektionsstoff
um die Besetzung der Bindungsstellen konkurrieren. Dieser Kompetitions
mechanismus ist exakt quantifizierbar und in Bereichen mindestens zwischen 25 und
200% des normalen Wertes linear korreliert, so dass die gesuchte Konzentration
des zugegebenen Detektionsstoffs demzufolge zwischen 25 bis 200% liegen kann.
Je mehr der nachzuweisende Bindungspartner in der untersuchten Körperflüssigkeit
vorhanden ist, umso weniger wird von dem zugegebenen markierten
Interaktionspartner gebunden. Durch dieses Verfahren ist es möglich, sowohl
quantitative Untersuchungsverfahren mit Hilfe der oben genannten
Nachweismethoden zu führen, als auch ultraschnelle, halbquantitative Tests in Form
eines Farbkomparatortests bereitzustellen. Für diese bed-side-Anwendung wird auf
der gleichen Grundlage wie oben beschrieben nun nicht mehr eine Mikrotiterplatte
oder ein Reaktionsgefäß beschichtet, sondern Rührgeräte, wie Paddel, Quirl, Spatel
o. ä., die aus funktionellem Polymer bestehen, benutzt (Abb. 2). Es können weiterhin
auch monodisperse Mikropartikel aus diesen Kunststoffen, z. B. aus
Polyalkylmethacrylat (∅ 5-200 µm), die mit Hilfe von geeigneten Klebern, bevorzugt
Monoacrylatkleber, einlagig auf jede beliebige Kunststoffoberfläche geklebt werden
verwendet werden. Dieses Verfahren eignet sich auch zur Verwendung von
Reaktionsgefäßen, Mikrotiterplatten oder Rührwerkzeugen, die nicht aus den
vorstehend beschriebenen funktionellen Polymeren bestehen, sondern erst im
einem zusätzlichen Arbeitsschritt mit solchen Polymeren beschichtet werden.
Die Rührwerkzeuge, die vorzugsweise plane Flächen haben sollten, um eine
einfache Auswertung zu ermöglichen, werden während der Produktion oder vor ihrer
Anwendung mit Linker-gekoppelten Erkennungsstrukturen versehen. Dabei muss
eine definierte Menge dieser Bindungspartner auf die Oberfläche aufgebracht
werden. Der Probe wird der im sichtbaren Bereich farblich markierte
Bindungspartner (vorzugsweise rot, blau oder schwarz) in definierter Menge
zugegeben. Nach diesem präanalytischen Prozess wird der beschichtete Spatel o. ä.
in der Körperflüssigkeit (Blut, Plasma. Urin u. ä.) für eine definierte Zeit gerührt,
geschwenkt oder beweglich kontaminiert und danach mittels eines Wasch- bzw.
Spülschrittes von eventuell vorhandenen Blutbestandteilen oder störenden
Farbveränderungen befreit. Anschließend wird die gefärbte Messfläche des
Rührgeräts mit Hilfe eines Farbkomparatortests (Farbvergleichstest) hinsichtlich
Intensität der Detektionsfarbe verglichen (Abb. 3). Die abgestufte Farbskala ist
vorher durch eine Farbintensitätseichung des Systems quantifiziert worden. Man
erhält damit gut abgestufte Quantitätsschritte des zu detektierenden Stoffs im
Farbkomparatortest und kann problemlos und rasch eine weitgehend quantitative
Aussage über den Stoffgehalt in der Lösung treffen.
Für eine bed-side Diagnostik sollte sichergestellt sein, dass mit drei, maximal vier
Farbschritten die für diese Anwendung wesentlichen Bereiche (subtherapeutisch,
therapeutisch, toxisch bzw. kritisch toxisch) zu erfassen sind. Alternativ können auch
andere den klinischen Gegebenheiten angepasste Quantitätsschritte in den Test
aufgenommen werden. Diese halbquantitative Methode ist als bed-side-Methode so
konzipiert, dass sie innerhalb weniger Minuten als single- bzw. one-step-Methodik
ohne Benutzung von Hilfsmitteln, nur unter Durchführung eines einfachen und von
jedem Ungeübten auch realisierbaren Verdünnungsschritts der entsprechenden
Ausgangslösung überall durchführbar ist ("point of care-Technik").
Solche single-step-Diagnoseverfahren wie auch die Bereitstellung der verwendeten
Vorrichtungen werden im Folgenden beispielhaft an einem Polyethylenglykol/
Polyalkylmethacrylat-System verdeutlicht.
1. Methoden zur Polyethylencilykol-Kopplunp von Antikörpern, Antigenen, Wirkstoffen, Nukleinsäuren oder Teilen von DNA, rDNA, mDNA und anderen zur Diagnostik vorgesehenen Wirkstoffen werden z. B. bei J. Milton Harris (Ed.):
Polyethylene glycol chemistry, 1992 Plenum Press, New York, oder bei Zalipsky S. Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules, Advanced Drug Delivery Reviews 16: 157-182, 1995 beschrieben.
2. Herstellung bzw. Beschichtung von in der Diagnostik verwendeten Behältnissen (Küvetten, Reaktionsgefäße), aber auch Rührern, Spateln, Slides u. a.
Bevorzugtes funktionelles Polymermaterial ist Polymethylmethacrylat, da alle Behältnisse aus diesem Material kommerziell erhältlich und meistens sofort und ohne weitere Bearbeitung benutzbar sind. Für spezielle Anwendungen kann man aber auch mit Hilfe von bekannten Plasmaätzverfahren die Oberfläche noch modifizieren, um so eine bessere Bindung von Polyethylenglykol-gebundenen Stoffen auf dieser PMMA-Oberfläche zu ermöglichen. Im Normalfall reicht es aber aus, die glatte unveränderte Oberfläche der PMMA-Materialien zu verwenden. Falls andere Polymere, aber auch Glas benutzt werden, wird der Weg über die Oberflächenbeschichtung mit Hilfe der Immobilisierung von Mikropartikeln gewählt. Hierzu werden poröse, monodisperse Polyalkylmethacrylat-Partikel verwendet, vorzugsweise jedoch sollten Polymethylmethacrylat- oder Polybutylmethacrylat partikel zur Anwendung kommen. Auf die zu beschichtende Oberfläche wird ein gängiger Monoacrylatkleber, der mit Hilfe von leichtflüchtigen Lösungsmitteln auf eine definierte Fließfähigkeit gebracht wird, aufgetragen und danach im Wirbelstrom- bzw. Schüttverfahren mit einer einlagigen Schicht von Mikropartikeln beschichtet (s. Abb. 2). Diese Methode hat den Vorteil, dass durch den definierten Flächenauftrag des Klebemittels eine exakte Anzahl von Polyalkylmethacrylat- Mikropartikeln aufgebunden wird und dadurch auch eine genau begrenzte Flächenzuweisung für den Bindungsvorgang erfolgen kann. Durch geeignete Zusätze zu den Polyethylenglykol-gekoppelten Bindungspartnern (z. B. reines Polyethylenglykol) kann man bekannte Mengen von Erkennungsstrukturen bei voller Sättigung der spezifischen Bindungsstellen des Polyalkylmethacrylats auf der Mikropartikelschicht aufbinden.
3. Analytik:
In eine Blutabnahmespritze bzw. Monovette werden 0,2 ml 3% Na-Citrat vorgelegt. Zusätzlich werden 2 ml eines Phosphatpuffers zugesetzt, der 50 nmol des zu detektierenden Proteins enthält, das mit Acridinrot o. ä. gefärbt wurde. Nach Entnahme von 1 ml Vollblut und Vermischen mit der genannten Probenvorlage ist die Präanalytik abgeschlossen. Anschließend wird die für den Messvorgang notwendige Menge Probengemisch entweder für quantitative oder bed-side-Verfahren benutzt. Bei quantitativen Messverfahren wird eine geeignete Menge des Probengemisches in die entsprechenden Vertiefungen der Microtiter-Platte in ein Reaktionsröhrchen für ein Photometer oder in eine Küvette für ein Spektralphotometer eingefüllt, die nach einem der oben beschriebenen Verfahren vorher speziell bearbeitet wurde. Dabei ist es wichtig, dass die aufgegebene Antikörpermenge, z. B. gegen Fibrinogen, auf der PMMA-Messvorrichtung genau definiert ist, um ein quantifizierbares Interaktionsprotokoll zu erstellen. Nach einer definierten Schüttel- oder Mischzeit wird die Messküvette bzw. die Mikrotiterplatte mit Puffer gespült, in der Regel bei Mikrotiterplatten 3 ×, bei Küvetten und Messröhrchen sollte zumindest eine zweifache Spülung mit dem etwa zehnfachen Volumen, bezogen auf die eingesetzte Detektionsmenge, erfolgen.
1. Methoden zur Polyethylencilykol-Kopplunp von Antikörpern, Antigenen, Wirkstoffen, Nukleinsäuren oder Teilen von DNA, rDNA, mDNA und anderen zur Diagnostik vorgesehenen Wirkstoffen werden z. B. bei J. Milton Harris (Ed.):
Polyethylene glycol chemistry, 1992 Plenum Press, New York, oder bei Zalipsky S. Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically active molecules, Advanced Drug Delivery Reviews 16: 157-182, 1995 beschrieben.
2. Herstellung bzw. Beschichtung von in der Diagnostik verwendeten Behältnissen (Küvetten, Reaktionsgefäße), aber auch Rührern, Spateln, Slides u. a.
Bevorzugtes funktionelles Polymermaterial ist Polymethylmethacrylat, da alle Behältnisse aus diesem Material kommerziell erhältlich und meistens sofort und ohne weitere Bearbeitung benutzbar sind. Für spezielle Anwendungen kann man aber auch mit Hilfe von bekannten Plasmaätzverfahren die Oberfläche noch modifizieren, um so eine bessere Bindung von Polyethylenglykol-gebundenen Stoffen auf dieser PMMA-Oberfläche zu ermöglichen. Im Normalfall reicht es aber aus, die glatte unveränderte Oberfläche der PMMA-Materialien zu verwenden. Falls andere Polymere, aber auch Glas benutzt werden, wird der Weg über die Oberflächenbeschichtung mit Hilfe der Immobilisierung von Mikropartikeln gewählt. Hierzu werden poröse, monodisperse Polyalkylmethacrylat-Partikel verwendet, vorzugsweise jedoch sollten Polymethylmethacrylat- oder Polybutylmethacrylat partikel zur Anwendung kommen. Auf die zu beschichtende Oberfläche wird ein gängiger Monoacrylatkleber, der mit Hilfe von leichtflüchtigen Lösungsmitteln auf eine definierte Fließfähigkeit gebracht wird, aufgetragen und danach im Wirbelstrom- bzw. Schüttverfahren mit einer einlagigen Schicht von Mikropartikeln beschichtet (s. Abb. 2). Diese Methode hat den Vorteil, dass durch den definierten Flächenauftrag des Klebemittels eine exakte Anzahl von Polyalkylmethacrylat- Mikropartikeln aufgebunden wird und dadurch auch eine genau begrenzte Flächenzuweisung für den Bindungsvorgang erfolgen kann. Durch geeignete Zusätze zu den Polyethylenglykol-gekoppelten Bindungspartnern (z. B. reines Polyethylenglykol) kann man bekannte Mengen von Erkennungsstrukturen bei voller Sättigung der spezifischen Bindungsstellen des Polyalkylmethacrylats auf der Mikropartikelschicht aufbinden.
3. Analytik:
In eine Blutabnahmespritze bzw. Monovette werden 0,2 ml 3% Na-Citrat vorgelegt. Zusätzlich werden 2 ml eines Phosphatpuffers zugesetzt, der 50 nmol des zu detektierenden Proteins enthält, das mit Acridinrot o. ä. gefärbt wurde. Nach Entnahme von 1 ml Vollblut und Vermischen mit der genannten Probenvorlage ist die Präanalytik abgeschlossen. Anschließend wird die für den Messvorgang notwendige Menge Probengemisch entweder für quantitative oder bed-side-Verfahren benutzt. Bei quantitativen Messverfahren wird eine geeignete Menge des Probengemisches in die entsprechenden Vertiefungen der Microtiter-Platte in ein Reaktionsröhrchen für ein Photometer oder in eine Küvette für ein Spektralphotometer eingefüllt, die nach einem der oben beschriebenen Verfahren vorher speziell bearbeitet wurde. Dabei ist es wichtig, dass die aufgegebene Antikörpermenge, z. B. gegen Fibrinogen, auf der PMMA-Messvorrichtung genau definiert ist, um ein quantifizierbares Interaktionsprotokoll zu erstellen. Nach einer definierten Schüttel- oder Mischzeit wird die Messküvette bzw. die Mikrotiterplatte mit Puffer gespült, in der Regel bei Mikrotiterplatten 3 ×, bei Küvetten und Messröhrchen sollte zumindest eine zweifache Spülung mit dem etwa zehnfachen Volumen, bezogen auf die eingesetzte Detektionsmenge, erfolgen.
Anschließend kann ein entsprechend kompatibles Detektionsverfahren (Mikrotiter
plattenreader, Analysenautomat, Photometer) eingesetzt werden. Für die Quanti
fizierung der Versuchsanordnungen stehen die üblichen Dosis-Wirkungs-
Messmöglichkeiten zur Verfügung (Eichkurven, digitale Messwerterfassung und
Datenverarbeitung).
Bei der halbquantitativen direkten Messung in dem bed-side-fähigen one-step-
Verfahren wird folgendermaßen verfahren: Das Probengemisch wird in ein
geeignetes Reaktionsgefäß überführt. Danach wird das PAMA-beschichtete
Rührgerät (Spatel, Rührstabchen, Slide o. ä.), auf dem der spezielle
Reaktionspartner fest aufgebunden ist, in diesem Probengemisch für 5 (10) min
bewegt, anschließend in ein Pufferreservoir überführt, welches zur Spülung bzw.
Waschung vorgesehen ist, dort gewaschen und abschließend mittels
Farbkomparator quantifiziert.
Claims (12)
1. Diagnoseverfahren, umfassend das in Kontakt bringen einer zu untersuchenden
flüssigen Probe mit der Oberfläche eines Polymers, auf der
Erkennungsstrukturen immobilisiert sind, welche spezifische Inhaltsstoffe der
Flüssigkeit binden können, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymeroberfläche
Carbonylgruppen in Form von Ketogruppen oder Carbonsäurederivaten aufweist
und dass die Erkennungsstrukturen mittels eines Linkers immobilisiert sind.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Polymer Polyalkylmethacrylat,
Polyvinylacetat, Polycyclohexylmethacrylat ist, oder ein Copolymer, das
Einheiten dieser Polymere enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Oberfläche die Oberfläche einer
Mikrotiterplatte, einer Küvette oder eines Messprobenröhrchens ist.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Linker ein
Polyalkylenglykol, Polyalkylenimin, Polyalkylenamin oder Polyalkylensulfid ist.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Erkennungsstruktur
ein Antigen, ein spezifischer Antikörper, ein Enzym oder ein Inhibitor von
Enzymen ist.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Probe eine
Körperflüssigkeit, ausgewählt aus Blut, Urin, Plasma oder Sperma ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polymer in Form von
Partikeln vorliegt, die auf der Oberfläche eines beliebigen Materials aufgebracht
sind.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, weiter umfassend die Zugabe
einer markierten Substanz, die ebenfalls durch die Erkennungsstruktur gebunden
werden kann, zu der Probe, wobei die Zugabe vor dem in Kontakt bringen der
Probe mit der Polymeroberfläche erfolgt.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die Oberfläche die Oberfläche eines
Rührgeräts ist, das in den Probenbehälter eingebracht wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei die markierte Substanz im sichtbaren
Bereich farblich detektierbar ist.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, weiter umfassend die
Quantifizierung der zu bestimmenden Inhaltsstoffe mittels Farbvergleich mit einer
Komparatorskala.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, weiter umfassend die
Quantifizierung der zu bestimmenden Inhaltsstoffe mittels eines geeigneten
Detektionsverfahrens.
Priority Applications (6)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19918569A DE19918569A1 (de) | 1999-04-23 | 1999-04-23 | Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, pathologischen Zuständen und pathophysiologischen sowie physiologischen Messgrößen |
PCT/EP2000/003690 WO2001007916A1 (de) | 1999-04-23 | 2000-04-25 | Verfahren zur diagnose von krankheiten und pathologischen zuständen |
JP2001512293A JP2003505695A (ja) | 1999-04-23 | 2000-04-25 | 病気、病理学的状態、並びに病態生理学的及び生理学的測定単位の診断方法 |
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