JP2003505695A

JP2003505695A - 病気、病理学的状態、並びに病態生理学的及び生理学的測定単位の診断方法

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Publication number: JP2003505695A
Application number: JP2001512293A
Authority: JP
Inventors: ノヴァク、ゲッツ; ブーヒャ、エルケ
Original assignee: ヘモジュスゲーエムベーハー
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 2000-04-25
Publication date: 2003-02-12
Also published as: DE19918569A1; CA2359716A1; EP1173762A1; US20020127732A1; WO2001007916A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、病気、病理学的状態並びに生理学上の測定単位の診断方法に関し、特別なリンカーにより、認識構造を特定の機能性高分子表面に固定化させることを基礎とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、生体の病理学的状態並びに病態生理学的及び生理学的データの簡単
で迅速な測定方法に関し、ＰＣＴ９８／４６６４８に記載されているように、特
定リンカーを有する機能性プラスチック表面の相互作用を利用する方法である。

【０００２】生体内で部分的にナノグラム量又はピコモル濃度でしか存在しない診断するべ
きパラメータを定量化するために現在使用されている処置は、ますます費用がか
かるようになっており、ここで使用される方法は、かなりの費用と時間を要する
。例えば、長年使用されているＥＬＩＳＡ及びこれに由来する技術の特徴として
は、これらが相対的に少ない物質量を検出するのに、法外な費用と時間を必要と
することである。

【０００３】その理由としては特に、検出するべき成分が、人間の身体外部の生体において
人間のタンパク質のような物質に対して生成された特定の抗体により、特定的に
認識されなければならないからである。この物質特有の外部タンパク質抗体の検
出は、例えば、対応認識構造が結びついた動物のタンパク質に対して向けられた
不特定の別の抗体により、最新の検出方法を用いて、本質的に放射性方法ではあ
るが、スペクトル測光により検出可能な測定方法によっても、定量化される。検
出には、例えば、ＥＬＩＳＡリーダー、スペクトル測光器、液体シンチレーショ
ンカウンターなどの費用のかかる診断機器が使用され、それに加えて操作及び整
備に相対的に高い人件費及び経費が必要とされる。

【０００４】従って、本発明の目的は、特定の相互作用形態により半定量的、さらに定量的
な検出方法であって、数分間の間に結果を出し、その正確さが上記の方法に匹敵
し、故にベッドサイド診断の新しいクオリティーが期待できる方法を提供するこ
とである。そのため、本発明にかかる方法は、高分子表面上でリンカーを用いて
、ＰＣＴ９８／４６６４８に記載の例えば抗原、特定抗体のような特定の認識構
造を固定化させる原理、並びに酵素又は酵素の阻害物質を固定化させる原理を利
用している。

【０００５】この原理を考慮に入れることにより、病気、身体機能障害並びに生理学的又は
病態生理学的測定データの新規な診断方法を展開させることができた。このよう
な身体機能の機能を果たす能力又は障害の測定は、人間医学の実験化学的、微生
物学的、又は酵素学的診断に利用され、さらに動物医学並びに生物学においても
利用される。

【０００６】記載されている認識構造の固定化により、以下に詳細に説明される一つの競争
メカニズムを用いて、物質の迅速な半定量化が可能となる。驚くことに、この方
法による固定化の結果として、診断するべき物質が異常に高い占有密度を有する
ことが見出された。この結果、例えばＵＶ／Ｖｉｓ又はＩＲ吸収分光法のような
一般に用いられている吸収方法の利用が、はるかに容易になる。

【０００７】ＰＣＴ９８／４６６４８に記載のように、本発明の目的のために、診断するべ
き物質と高特定相互作用を有することができる分子認識構造は、水素ブリッジ結
合が可能な構造要素を含んでいるリンカーに結合している。

【０００８】開示の方法に使用可能なリンカーは、少なくとも二つの官能基Ｌ１及びＬ２を
有する分子である。これらの官能基の一つ（Ｌ１）は、水素ブリッジを形成する
ことにより、リンカーを高分子表面に結びつける能力がなければならない。官能
基Ｌ２は、リンカーと固定化するべき物質との間に結合が生じ得るように選ばれ
る。高分子表面に複数の物質を同時に塗布するためには、異なる基Ｌ２を有する
複数のリンカーを同時に使用することができる。しかし、同じ又は異なる複数の
基Ｌ２を有するタイプのリンカーを使用することも可能である。同様に、複数の
同じ又は異なる基Ｌ１を有するリンカーを使用することもできる。Ｌ１とＬ２は
、アルキル鎖又はポリエーテルによって結合されているのが好ましい。

【０００９】構造要素Ｌ１は、好ましくは、例えばＯＨ、ＳＨ、ＮＨ又はＰＨ結合に存在す
るような対極的な水素原子である。この構造要素は、更に構造要素Ｌ２を担って
いるリンカーとして、十分水に溶ける化合物として存在するのが好ましい。特に
好ましいのは、Ｌ１がリンカーの末端に置かれているものである。

【００１０】物質を、好ましくは共有結合によりリンカー（Ｌ２）に結びつけることができ
る官能基は、例えばスクシンイミジルスクシナート、スクシンイミジルプロピオ
ナート、ニトロフェニル炭酸塩、トリシレート、エポキシド、アルデヒド、イソ
シアネート又はマレインイミドである。

【００１１】好ましいリンカー類を、物質に結びつけるために変更することができる官能基
類Ｌ２は、例えば、米国のシアウオーターポリマー社（Shearwater Polymers, I
nc., 2307 Spring Branch Rd., Huntsville, Al 35801）のカタログに記載され
ている。

【００１２】リンカーとして好ましく使用されるのは、ポリアルキレングリコール類、ポリ
アルキレンイミン類又はポリアルキレン硫化物類、並びにポリオキサチレンであ
り、ポリアルキレングリコール類が特に好ましい。特に好ましく用いられるのは
、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。上記化合物は、０．５〜５０ｋＤ
ａの分子量を有するのが好ましい。

【００１３】本発明の方法に利用可能な機能性高分子表面もまた、ＰＣＴ９８／４６６４８
に記載されている。使用されるのは、ホモ重合体又は共重合体であり、これらの
製造には、少なくとも一つの単量体タイプが用いられ、この単量体タイプは、重
合可能な二重結合又は重縮合可能な官能基と並んで、重合反応に参加しない別の
カルボニル基を、ケトン又はカルボン酸誘導体の形で含有する。高分子は、化学
式（Ａ）の構造要素を含むのが好ましい。

【００１４】

【化１】

【００１５】ここで、残基Ｒは同じでも異なっていてもよく、アルキル基若しくはアリール
基又は水素原子でもよい。アルキル基は、直線的でも枝分かれしていてもよく、
１〜２０個の炭素原子からなるのが好ましい。アリール基は、６〜１８個の炭素
原子からなるのが好ましく、６〜１２個が特に好ましい。Ｘは任意であり、Ｏ、
Ｎ、ＣＨ₂を意味する。Ｘ＝Ｎの場合、Ｎは、化学式（Ａ）に示されているのに
加えて、さらに基Ｒを有し、これはその他の基Ｒに依存することなく上記のよう
に規定されている。

【００１６】特に好ましいアルキル基類は、直鎖又は枝分かれしているものであり、場合に
よっては、置換Ｃ_1-18−アルキル基、例えばメチル基、エチル基又はプロピル基
である。場合によっては存在する置換基類の例には、一つ以上のハロゲン原子が
含まれ、例えば、フルオロ原子、クロロ原子、ブロム原子若しくはイオド原子、
又はハイドロキシ基類、Ｃ_1-6アルキル基類若しくはＣ_1-6アルコキシル基類若し
くはアルキルチオール基である。アリール基で特に好ましいのは、単環式又は二
環式の、場合によっては一つ以上のヘテロ原子を含む置換アリール基である。こ
のようなアリール基類の例としては、フェニル、１−又は２−ナフチル、インデ
ニル基又はイソインデニル基がある。ヘテロ原子を含有するアリール基類の例と
しては、酸素原子、硫黄原子又は窒素原子から選ばれるヘテロ原子を含有するＣ _3-9 ヘテロアリール基類である。単環式ヘテロアリール基類に含まれるのは、例
えば、ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、Ｎ−メチルイミダゾリル、
Ｎ−エチルイミダゾリル、ベンゾチアゾリル、キナゾリニル、ナフチルピリジニ
ル、キノリイニル、イソキノリニル、及びテトラゾリルである。

【００１７】このような基類を含有する高分子として好ましいのは、好ましくは１〜６個の
Ｃ原子を含むアルキル基を有するポリメタクリル酸アルキル（ＰＡＭＡ）であり
、例えば、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）、ポリメタクリル酸エチル（Ｐ
ＥＭＡ）、又はポリメタクリル酸プロピルなどがある。更に、ポリ酢酸ビニル、
ポリメタクリル酸シクロヘキシル又はポリメタクリル酸フェニルを用いることも
できる。特に好まれて使用されるのは、ポリメタクリル酸メチルである。

【００１８】前記高分子の任意の部分からなる共重合体又は高分子混合物もまた、上記のも
の同士で、又は一つ以上の別の高分子成分、例えばポリスチロール、ポリアクリ
ロニトリル又はポリアミドと共に、使用することができる。構造要素（Ａ）を含
む単量体がこのような混合高分子で占める部分は、少なくとも２０％が好ましく
、少なくとも４０％がより好ましく、少なくとも６０％が特に好ましい。

【００１９】本発明の診断方法を実施するため、前記の高分子からなる診断分析機器用のマ
イクロタイタープレート、キュベット又は計測チューブが使用される。これらの
試験レセプタクルの表面には、リンカーと強固に結びつく構造が存在する。驚く
ことに、リンカーが高分子表面に接触しただけで結合が起こり、温度の上昇、又
は触媒若しくはその他の反応促進試薬を必要としない。ここで生じた結合は、安
定性に優れ、ｐＨ値を２〜１３の範囲に変化させることにより、水溶液で分解で
きなくなる。結合は、イオン強度の高い塩溶液を用いたすすぎ洗いに対しても（
２ｎグリシン、２ｎ尿素）、抵抗力がある。従って、抗原、抗体、酵素又はその
他の特殊な相手などリンカー結合の特定の認識構造を、診断するべき物質に対し
て、高分子表面に塗布することができる。このとき、表面における単位面積の結
合密度は著しく高い。ＰＡＭＡ及びＰＥＧを使用するとき、使用される各ＰＥＧ
鎖の長さにより、１００〜３００ｎｍの厚さの層が形成される（図１を参照）、
これらの層は、使用されるポリメタクリル酸アルキル材料の透明性を損わないた
め、通例は、可視、紫外線又は赤外線の光の透過を妨げない。最終的にリンカー
に結合する特定の認識構造もまた、光透過性に大きな影響を及ぼすものではない
。結合した生体分子の表面密度が高いため、血液、血漿又はその他の体液の中で
検出するべき物質を、直接的に正確に測定可能である。その結果、吸収測定を用
いて、診断するべき物質に特徴的であり、ＵＶ、可視又はスペクトルのＩＲ領域
内にあるはずの波長で測定を行うことができる。

【００２０】使用される新しい診断方法は、更に独特の検出プロセスを可能にする。使用す
るべき試験液を得た後又は試料の調合中に、検出するべき物質の規定量が測定試
料に付加される。この付加検出物質には、特殊な標識及び検出手段が結合されて
いる。通例、これらは、強力な生体染料又は放射性マーカーであり、肉眼で、又
は測光器、スペクトル測光器、蛍光測定装置、発光測定装置並びに液体シンチレ
ーションカウンター又はγカウンターのある一定の波長によって性質が検出され
る。標識のある相互作用相手の付加規定量は、リンカー及び認識構造と共に覆わ
れている高分子表面上において存在している結合サイトの一定部分を占有するべ
きである。これにより、血液中に存在する検出するべき物質の未知量と、特別な
染色のなされた検出物質とが、結合サイトの占有を争うことが保証される。この
競争メカニズムは、正確に定量化でき、通常値の少なくとも２５〜２００％の範
囲で直線相関になっているため、付加された検出物質の求められる濃度は、結果
として２５〜２００％の間になり得る。検出するべき結合相手が試験体液中に多
く存在すればするほど、付加の標識の相互作用相手との結合は少なくなる。この
方法により、上記の検出方法により量的な試験プロセスを実施することと、非常
に速く半定量試験をカラーコンパレーター試験という形で提供することが可能で
ある。このベッドサイド適用のために、上記のように同じ基板上に被覆されるの
は、マイクロタイタープレート又は反応レセプタクルではなくなり、機能性高分
子からなるパドル、ワーブ、へら又はそれに類する物などの攪拌装置が使用され
る（図２）。更に、ポリメタクリル酸アルキル（(５〜２００μｍ）などのこれ
らのプラスチック類からなる単分散微粒子を使用することができ、適切な接着剤
、好ましくはモノアクリル酸接着剤により、単層で、いかなるプラスチック表面
にも接着される。このプロセスは、上記の機能性高分子からなるものではないが
、追加の方法工程で初めてこのような高分子に被覆される反応レセプタクル、マ
イクロタイタープレート又は攪拌装置への使用にも適している。

【００２１】容易な分析を実現するために、平らな表面を有することが好ましい攪拌装置に
は、製造中又はそれが使用される前に、リンカー結合の認識構造を備えつける。
その際、これらの結合相手の規定量を、表面に塗布しなければならない。可視の
範囲に色により標識をつけられた（赤、青又は黒が好ましい）結合相手を、試料
に付加する。この事前分析プロセスの後、被覆されたへらなどは、規定の時間の
間、体液（血液、血漿、尿など）の中で攪拌、旋回又は可動的に汚されて、その
後、洗浄又はすすぎ工程により、存在しているかもしれない血液成分又はじゃま
になる色変化を除去する。引き続き、攪拌装置の染色された測定表面を、カラー
コンパレーター試験（色比較試験）（図３）により、検出色の強度という点で比
較する。その前に、システムの色強度ゲージングにより、段階的なカラースケー
ルが定量化されている。これによって、検出するべき物質の良好な段階的な量工
程が、カラーコンパレーター試験から得られると共に、液体中の物質量について
、問題なく迅速に広く量的な表明を行うことができる。

【００２２】ベッドサイド診断のためには、この使用に重要な領域（治療量以下的、治療的
、有毒性又は致命的有毒性）が、３つ、多くても４つの色段階によって分析可能
なことが保証されていなければならない。或いは、診療環境に合わせたその他の
量工程が、試験に含まれていてもよい。この半定量方法は、対応初期液の簡単な
希釈工程を実施するだけといういかなる不熟練者でも実施可能な方法であり、数
分間の間に、単一又は一つの工程からなる方法として、補助手段を用いることな
く、どこででも実施できる設計になっている（ポイントオブケア技術）。

【００２３】このような単一段階診断プロセス並びに使用設備の提供について、ポリエチレ
ングリコール／ポリメタクリル酸アルキルシステムを参照しながら更に説明する
。

【００２４】１）ポリエチレングリコール結合の方法：抗体、抗原、作用物質、核酸又はＤ
ＮＡ、ｒＤＮＡ、ｍＤＮＡの一部、及び診断対象となる他の作用物質のポリエチ
レングリコール結合の方法は、例えば、Ｊ．ミルトン・ハリス（Ed.）、ポリエ
チレングリコール化学、１９９２年プレナムプレス、ニューヨーク、又はザリプ
スキー・Ｓ、生物学上の活性分子とポリエチレングリコール共役の化学、応用薬
物デリバリーレビュー１６、１５７−１８２、１９９５、（J. Milton Harris (
Ed.): Polyethylene glycol chemistry, 1992 Plenum Press, New York; Zaplis
ky S: Chemistry of polyethylene glycol conjugates with biologically acti
ve molecules, Advanced Drug Delivery Reviews 16: 157-182, 1995）に記載さ
れている。

【００２５】２）診断学に使用されるレセプタクルの製造又はコーティング（キュベット、
反応レセプタクル）、及び攪拌装置、へら、スライドガラスなど。

【００２６】ポリメタクリル酸メチルは、機能性高分子材料として好ましい。なぜなら、こ
の材料からなる全てのレセプタクルは、市販されており、ほとんどの場合、即座
に、さらに処理をすることなく使用可能だからである。しかし、特殊な適用にお
いては、ポリエチレングリコール結合の物質をこのＰＭＭＡ表面上により良く結
合させるために、表面を、公知のプラズマエッチングプロセスによって追加で変
更させることができる。しかし、通常、ＰＭＭＡ材料の滑らかな無変化の表面を
使用すれば十分である。もしもその他の高分子又はガラスを使用する場合には、
微粒子の固定化により表面を被覆する方法が選ばれる。このため、多孔質の単分
散ポリメタクリル酸アルキル粒子が用いられるが、ポリメタクリル酸メチル粒子
又はポリメタクリル酸ブチル粒子を用いるのが好ましい。規定の流動性を得るよ
うに高揮発性溶剤で処理された通常のモノアクリル酸接着剤を、被覆するべき表
面に塗布し、その後、微粒子の一つの単層が、流動層又は粉末移動方法により被
覆される（図２参照）。この方法の利点は、接着剤の規定の表面塗布により、正
確な数のポリメタクリル酸アルキル微粒子が付着され、故に結合プロセスのため
の正確に限定した表面割当てを実現することができる。認識構造の既知量を、微
粒子層上のポリメタクリル酸アルキルの特定結合サイトに付着でき、ポリエチレ
ングリコール結合の結合相手に対する適切な添加剤（例えば、純ポリエチレング
リコール）により、完全に飽和されることになる。

【００２７】３）分析０．２ｍｌの３％クエン酸ナトリウムを血液採取シリンジ又はモノベットに充
填する。更に、検出するべきタンパク質を５０ｎｍｏｌ含有し、アクリジン赤な
どで染色されているリン酸緩衝液を２ｍｌ付加する。１ｍｌの純血を取って前記
試料と混合したら、事前分析は完了する。引き続き、測定プロセスに必要な量の
試料混合物を、量的又はベットサイドプロセスのいずれかに使用する。量的測定
プロセスでは、適切な量の試料混合物を、測光器用の反応チューブ内のマイクロ
タイタープレートの各空洞中に充填するか、上記方法のいずれかの方法により事
前に特定の処理をされたスペクトル測光器用のキュベットに充填する。使用され
た抗体の量、例えばフィブリノゲンに対する抗体の量は、定量化可能な反応記録
を作成するために、ＰＭＭＡ測定機器上で具体的に規定されることが重要である
。規定時間の間、シェーク及び混合した後、計測キュベット又はマイクロタイタ
ープレートを緩衝液ですすぎ洗いする。マイクロタイタープレートの場合は通常
３回すすぎ洗いを行い、キュベット及び計測チューブの場合には、使用された検
出量に基づき、約１０倍の量で少なくとも２回すすぎ洗いが行われるべきである
。

【００２８】引き続き、対応コンパチブル検出方法（マイクロタイタープレートリーダー、
自動分析機、測光器）が使用できる。実験配置の定量化のために、通常の投与量
−作用−測定可能性が使用可能である（キャリブレーションカーブ、デジタル測
定値記録及びデータ処理）。

【００２９】ベッドサイドでの使用に適した一段階方法における半定量直接測定は、次のよ
うに実施される。試料混合物を、適切な反応レセプタクルに充填する。その後、
特定の反応相手が強力に結合しているＰＡＭＡが被覆された攪拌装置（へら、攪
拌棒、スライドガラスなど）を、この試料混合物の中で５（１０）分間動かし、
その後、すすぎ洗い又は洗浄を行うための緩衝液槽の中に入れる。そこで洗浄さ
れ、最後にカラーコンパレーターにより定量化される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明の方法の一実施例を示す図である。

【図２】図２は、本発明の方法のその他の実施例を示す図である。

【図３】図３は、本発明の方法のさらにその他の実施例を示す図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年７月６日（２００１．７．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/52 33/52 Ａ 33/53 33/53 Ｚ 33/545 33/545 ＺＦターム(参考） 2G054 AA06 CA21 EA06 GA03 GE01 4B063 QA19 QQ03 QQ21 QQ79 QQ95 QQ96 QR01 QR48 QR82 QS12 QS32 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試験するべき液体試料を、液体の特定成分に結びつくことがで
きる認識構造が固定化された高分子の表面に接触させることを含む診断方法であ
って、高分子表面は、カルボニル基をケトン基又はカルボン酸誘導体の形で含み
、認識構造がリンカーにより固定化されていることを特徴とする方法。
【請求項２】高分子が、ポリメタクリル酸アルキル、ポリ酢酸ビニル、ポリ
メタクリル酸シクロヘキシル又はこれらの高分子の単位を含む共重合体である請
求項１に記載の方法。
【請求項３】表面が、マイクロタイタープレート、キュベット又は計測チュ
ーブの表面である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】リンカーが、ポリアルキレングリコール、ポリアルキレンイミ
ン、ポリアルキレンアミン又はポリアルキレン硫化物である請求項１〜３のいず
れかに記載の方法。
【請求項５】認識構造が、抗原、特定の抗体、酵素又は酵素の阻害物質であ
る請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】試料が、血液、尿、血漿又は精液の中から選ばれる体液である
請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】高分子が、任意材料の表面に塗布される粒子の形で存在してい
る請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】認識構造により同様に結びつくことができる標識物質を試料に
付加することをさらに含む方法であって、付加が、試料を高分子表面に接触させ
る前に行われる請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】表面が、試料レセプタクルに投入される攪拌装置の表面である
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】標識物質が、可視領域で検出可能な色である請求項８又は９
に記載の方法。
【請求項１１】検出するべき成分を、コンパレータースケールを用いた色比
較により定量化することを更に含む請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】検出するべき成分を、適切な検出方法により定量化すること
を更に含む請求項１〜７のいずれかに記載の方法。