RU2593787C2 - Способ многоаналитного иммуноанализа - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине, в частности может быть использовано для детектирования присутствия и/или количества наркотических или психотропных веществ в биологических жидкостях человека. Предлагаемый способ позволяет детектировать в крови и моче малые количества опиатов, никотина, кокаина, марихуаны, фентанила, метадона, бензодизепинов, барбитуратов и амфетаминов при проведении диагностики ранних стадий употребления. Сущность способа заключается в том, что на дне лунок микропланшета иммобилизуют в виде по крайней мере двух микрообластей растворы конъюгатов бензоилэкгонина, тетрагидроканнабинола, амфетамина, морфина, фентанила, метамфетамина, метилендиокситамфетамина, метадона, бензодиазепина, барбитурата и котинина с белком, при проведении анализа в часть лунок микропланшета вносят мультианалитные калибровочные пробы, содержащие смесь указанных конъюгатов наркотиков с белком в буферном растворе, причем для исследования образцов мочи и сыворотки крови используют одни и те же мультианалитные калибровочные пробы, а в остальные лунки вносят исследуемые образцы мочи и/или крови, во все лунки добавляют раствор в реакционном буфере смеси биотинилированных мышиных моноклональных антител к искомым наркотикам для получения меченных биотином иммунных комплексов на дискретных микрообластях, детектируют излучение фосфоресценции на каждой дискретной области во всех лунках одновременно, строят калибровочные кривые, с которыми сравнивают измеренные значения фосфоресценции. 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 7 пр.

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине, в частности может быть использовано для детектирования присутствия и/или количества наркотических или психотропных веществ в биологической жидкости человека.

Распространение заболеваний наркоманией за рубежом и в России сделало актуальной задачу создания новых методов для выявления следовых количеств наркотиков в образцах биологической жидкости, взятых у обследуемых лиц. Методы лабораторных исследований, используемые при диагностике наркомании и контроле за больными на стадии лечения и реабилитации, при медицинском освидетельствовании лиц различных категорий населения для выявления факта потребления наркотических и психотропных средств без назначения врача, при контроле крови доноров, при социально-гигиеническом мониторинге для изучения распространения наркомании и немедицинских средств среди различных социальных групп населения, должны быть точными, быстрыми и недорогими. При этом важное место занимает проблема выявления наркотиков на ранней стадии потребления.

Известен способ конкурентного многоаналитного иммуноанализа, использующий био-нано-чип для скрининга лекарств на поверхности (международная заявка WO №2012154306, МПК G01N 33/543). При осуществлении способа на поверхности картриджа антитела смешиваются с образцом, и смесь наносится на ряды частиц чипа на картридже. На рядах находятся частицы, покрытые конъюгатом бычьего сывороточного альбумина (БСА) с наркотиками, а контрольные частицы покрыты только БСА. При отсутствии наркотика в образце меченые антитела активно распознаются и связываются с сенсорными частицами, специфичными к наркотикам, при этом возникает сигнал флуоресценции вокруг и на частицах, которые представляют собой полимерные частицы размером 50-300 нм. В присутствии наркотика в образце, который конкурирует с наркотиками на частицах за связывание метки, сигнал на частицах, нагруженных конъюгатом БСА-наркотик, увеличивается пропорционально дозе наркотика, для детектирования используются флуоресцентные или фосфоресцентные метки. Способ может быть использован для детектирования диазепама, амфетамина, метамфетамина, метадона, морфина, кокаина и других наркотиков в биологических жидкостях.

Недостатком способа является полуколичественное измерение, кроме того, способ не может быть использован для проведения массового скрининга населения.

Известен способ твердофазного многоаналитного анализа (заявка США №20110118138, НКИ 506/9), используемый для детектирования кокаина, амфетамина, метамфетамина, канабиноидов, героина, кодеина, морфина и других наркотиков в биологическом образце. Способ может быть использован для детектирования двух и более аналитов, требует мало времени, обладает пониженной стоимостью по сравнению с известными способами. Способ включает связывание по крайней мере двух искомых аналитов с твердой фазой, в качестве которой может быть использовано дно лунки микротитровальной платы, контактирование твердой фазы с антителами, специфическими к определяемому аналиту, и с исследуемым образцом, определение наличия искомого аналита в пробе, при этом антитела связаны с флуоресцентной, люминесцентной и др. метками, наличие аналита в образце определяется путем сравнения сигнала, испускаемого антителами, связанными с аналитами на твердой фазе в присутствии образца, с контрольными сигналами антител образца, не содержащего искомый аналит. В качестве исследуемых образцов могут быть использованы любые биологические жидкости. Если определяется несколько аналитов одновременно, используется столько же меток, при этом спектры возбуждения и эмиссии меток не должны перекрываться.

Недостатком способа является использование нескольких меток для детектирования нескольких аналитов, так как очень сложно подобрать метки, спектры эмиссии которых не перекрываются. Кроме того, образовавшиеся комплексы на твердой фазе расположены хаотично, т.е. измеряется интегральный сигнал от каждого определяемого аналита, что приводит к снижению чувствительности измерений.

Наиболее близким является способ многоаналитного иммуноанализа (патент России №2184970, МПК G01N 33/53), который предназначен для многоаналитного анализа образцов сухих пятен крови. Сущность способа заключается в том, что на дне лунок микротитровальной платы иммобилизуют первые биоспецифические компоненты в виде дискретных микрообластей, вносят в лунки исследуемый образец биологической жидкости, добавляют вторые биоспецифические компоненты, меченные Pt копропорфирином, реакцию биоспецифического связывания первых биоспецифических с меченными Pt копропорфирином вторыми биоспецифическими компонентами проводят в дискретных микрообластях на дне лунок, в качестве первых биоспецифических компонентов используют либо антитела к определяемым аналитам, либо конъюгаты белковых носителей с аналитами, в качестве вторых биоспецифических компонентов используют либо конъюгаты белковых носителей с антителами к определяемым аналитам, либо конъюгаты антител к определяемым аналитам с биотином и стрептавидином или авидином, меченные Pt копропорфирином, эмиссию фосфоресценции метки, связанной с каждым определяемым аналитом, детектируют в режиме временного разрешения излучения фосфоресценции путем последовательного сканирования каждой микрообласти сфокусированным световым лучом.

Способ предназначен для исследования сухих пятен крови с использованием заданного по составу матрикса реакционной смеси и не может быть использован для исследования биологических жидкостей. Кроме того, способ не предназначен для выявления малых количеств наркотиков в биологических жидкостях.

Задачей является создание многоаналитного способа анализа для одновременного детектирования наркотических и психотропных веществ в биологических жидкостях.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность детектирования в крови и моче малых количеств наркотических и психотропных веществ при проведении диагностики ранних стадий употребления.

Поставленная задача решается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе многоаналитного иммуноанализа, включающем иммобилизацию на дне лунок микропланшета первых биоспецифических компонентов, специфичных к определяемым аналитам, в виде дискретных микрообластей, внесение в лунки образца, содержащего искомые аналиты, и вторых биоспецифических компонентов, состоящих из конъюгатов антител к определяемым аналитам с биотином и стрептавидином, меченным Pt копропорфирином, проведение реакции биоспецифического связывания между первыми и вторыми биоспецифическими компонентами и детектирование в режиме временного разрешения излучения фосфоресценции метки, связанной с искомыми аналитами, путем сканирования каждой дискретной микрообласти сфокусированным световым лучом, для одновременного детектирования множества наркотических и/или психотропных веществ в крови и/или моче пациента в качестве первых биоспецифических компонентов используют растворы конъюгатов бензоилэкгонина, тетрагидроканнабинола, амфетамина, морфина, фентанила, метамфетамина, метилендиоксиметамфетамина, метадона, бензодиазепина, барбитурата и котинина с белком, которые в различных сочетаниях иммобилизуют в виде по крайней мере двух микрообластей, при проведении анализа в часть лунок микропланшета вносят мультианалитные калибровочные пробы, содержащие смесь указанных конъюгатов наркотиков с белком в буферном растворе, причем для исследования образцов мочи и сыворотки крови используют одни и те же мультианалитные калибровочные пробы, в остальные лунки вносят исследуемые образцы мочи и/или крови, во все лунки добавляют раствор в реакционном буфере смеси биотинилированных мышиных моноклональных антител к искомым наркотикам для получения меченных биотином иммунных комплексов на дискретных микрообластях, при этом образцы во всех лунках разводят не менее чем в четыре раза, детектируют излучение фосфоресценции на каждой дискретной микрообласти во всех лунках одновременно, по результатам измерений мультианалитных калибровочных проб строят калибровочные кривые, с которыми сравнивают измеренные значения фосфоресценции в микрообластях остальных лунок.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат морфин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления опиатов.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат котинин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления никотина.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат бензоилэкгонин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления кокаина

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат тетрагидроканнабинол - бычий сывороточный альбумин используют для выявления марихуаны.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат фентанил - бычий сывороточный альбумин используют для выявления фентанила.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат метадон - бычий сывороточный альбумин используют для выявления метадона.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат бензодиазепин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления бензодиазепинов.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгат барбитурат - бычий сывороточный альбумин используют для выявления барбитуратов.

Сущность изобретения заключается в том, что конъюгаты амфетамин - бычий сывороточный альбумин, метамфетамин - бычий сывороточный альбумин и метилендиоксиметамфетамин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления амфетаминов.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, подобную заявляемой, следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию новизны.

Известны мультиплексные способы выявления наркотических веществ в биологических жидкостях (патент России №2291436, международная заявка WO №2012154306, заявка США №20110118138 и др.). В указанных аналогах конъюгаты исследуемых аналитов с белками используются для иммобилизации на твердую фазу, в предлагаемом изобретении белковые конъюгаты наркотических соединений используются также и для создания калибровочных проб. Для измерения точных значений концентраций малых количеств наркотических веществ в исследуемом образце строят калибровочные кривые, получаемые в результате анализа калибровочных проб, который проводят одновременно с анализом исследуемых образцов. В качестве биоспецифических компонентов используют смесь белковых конъюгатов наркотических соединений, что позволяет использовать набор реагентов без присутствия наркотических веществ. Это снижает уровень требований к безопасности как при использовании набора реагентов, так и при транспортировке набора к месту проведения обследования. Авторы также считают, что многие наркотические соединения в конъюгированной форме более устойчивы при длительном хранении. Это позволяет обеспечить стабильность получаемых результатов анализа, что имеет большое значение при измерении низких концентраций наркотических веществ в биологических жидкостях. Как показано, в примерах 1, 4, 5, 6 предлагаемое изобретение позволяет достоверно измерять низкие уровни наркотических веществ как за счет использования калибровочных кривых, построенных на основании анализа калибровочных проб, так и за счет того, что при построении последних используются не чистые наркотики, а их конъюгаты. Предлагаемый способ позволяет исследовать различные биологические жидкости человека, мочу или сыворотку крови, используя один набор мультианалитных калибровочных проб. Возможность этого обеспечивается использованием разведения исследуемого образца не менее чем в четыре раза непосредственно в иммунореакционной смеси. Разведение исследуемого образца также снижает влияние на результаты анализа неспецифических компонентов биологических жидкостей человека, что повышает точность мультиплексной детекции малых количеств наркотических соединений. На основании вышесказанного авторы считают, что указанный технических результат достигается за счет новых средств, следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию технический уровень.

Способ может быть использован при диагностике ранних стадий употребления наркотических и психотропных веществ, включая опиаты, амфетамины, каннабиноиды, кокаин, метадон, фентанил и другие при отсутствии клинических признаков состояния зависимости, что позволит осуществлять медицинское освидетельствование лиц различных категорий населения (военнослужащих, мигрантов, заключенных, лиц, получающих водительские права, или лиц, связанных с источниками повышенной опасности, учащихся и т.д.), контролировать кровь доноров, проводить социально-гигиенический мониторинг для изучения распространения и немедицинского потребления наркотических и психотропных средств различными социальными группами населения. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует критерию промышленной применимости.

На фиг. 1 представлена схема проведения детектирования наркотических соединений в образцах биологических жидкостей, где 1 - лунка 96-луночного микропланшета, 2 - дно лунки, 3-10 - микрообласти, специфические к восьми наркотическим соединениям, 11 - исследуемые наркотические соединения из образца, 12 - меченные биотином антитела к наркотическим соединениям и 13 - конъюгат стрептавидин-Pt-копропорфирин; на фиг. 2 представлена калибровочная кривая для определения концентрации амфетамина; на фиг. 3 представлена калибровочная кривая для определения концентрации метадона, на фиг. 4 представлены кривые зависимости процента ингибирования регистрируемых сигналов на микрообластях, содержащих 14 - фентанил, 15 - метамфетамин, 16 - МДМА и 17 - метадон, от концентрации фентанила в моче человека.

Способ осуществляется следующим образом.

Наркотические вещества количественно детектируют в образцах биологической жидкости человека (моче, сыворотке крови и др.) твердофазным методом мультиплексного фосфоресцентного иммуноанализа с использованием иммуночипов в формате многолуночного микропланшета.

Способ позволяет выявлять случаи злоупотребления различными наркотическими и психотропными веществами, включая опиаты, амфетамины, каннабиноиды, кокаин, метадон, фентанил, бензодиазепины, барбитураты, никотин и другие.

Схема детектирования маркеров показана на фиг. 1. В 96-луночном микропланшете на дне 2 каждой лунки 1 формируют иммуночип для одновременного выявления нескольких наркотических веществ, представляющий собой, например, 16 дискретных микрообластей 3-10, специфичных к различным наркотическим соединениям. Количество микрообластей в одном иммуночипе ограничено размером дна лунки стандартного 96-луночного планшета, а также необходимостью разнесения различных микрообластей друг от друга для предотвращения перекрестных взаимодействий. Иммуночип может быть сформирован в нескольких модификациях, предназначенных для одновременного выявления различных сочетаний наркотиков, в зависимости от целей обследования. Для снижения вариабельности и повышения точности результатов количественного анализа наркотических веществ в биологических жидкостях для выявления каждого из аналитов иммобилизуют несколько одинаковых микрообластей в иммуночипе. Таким образом, из-за пространственных ограничений иммуночип может содержать, например, микрообласти для определения четырех наркотиков (по 4 одинаковые микрообласти для каждого) или восьми наркотиков (по 2 одинаковые области для каждого). Микрообласти создают путем нанесения в строго отведенные точки дна лунки микропланшета микрокапель растворов наркотических соединений в виде конъюгатов с белками с помощью прибора для печатания чипов. Далее планшет промывают для удаления не связавшихся реагентов, обрабатывают блокирующим раствором и высушивают.

Сенсибилизированный таким образом микропланшет используют для проведения мультиплексного анализа образцов биологической жидкости человека. Для количественной оценки содержания наркотических соединений в часть лунок планшета вносят мультианалитные калибровочные пробы. Пробы готовят смешением в буферном растворе ряда различных (в зависимости от модификации иммуночипа) наркотических соединений, ковалентно связанных с бычьим сывороточным альбумином (БСА). Для выявления кокаина используют конъюгат метаболита кокаина бензоилэкгонина (БЗЭ-БСА), для выявления каннабинолов - конъюгат тетрагидроканнабинола (ТГК-БСА), для выявления амфетаминов - конъюгаты амфетамина (АМФ-БСА), метамфетамина (мАМФ-БСА) и метилендиоксиметамфетамина (МДМА-БСА), для выявления опиатов - конъюгат морфина (МРФ-БСА), для выявления никотина - конъюгат его метаболита котинина (КОТ-БСА), для выявления фентанила - конъюгат ФЕН-БСА, для выявления метадона - конъюгат МТД-БСА, для выявления бензодиазепинов - БЗО-БСА и для выявления барбитуратов - БАР-БСА. В остальные лунки планшета помещают образцы исследуемой биологической жидкости. Далее во все лунки планшета добавляют смесь меченных биотином моноклональных антител к выявляемым аналитам и инкубируют при перемешивании. Соотношение объемов вносимых растворов антител и исследуемых образцов подбирают таким образом, чтобы разбавление образцов в реакционной смеси в лунках планшета было не менее чем в 4 раза (например, 15 мкл пробы и 45 мкл антител или 20 мкл пробы и 60 мкл антител). В процессе инкубации присутствующие в образце наркотические вещества 11 конкурируют за места связывания специфических антител 12 с наркотическими соединениями, иммобилизованными на соответствующих микрообластях 3-10 иммуночипа.

Для проявления иммунных комплексов, образующихся на специфических микрообластях иммуночипа, в лунки добавляют детектирующий раствор, содержащий конъюгат 13 стрептавидина с Pt-копропорфирином, который образует фосфоресцирующие биотин-стрептавидин комплексы (например, комплекс 10-12-13). Затем микропланшет отмывают и высушивают. Детектирование эмиссии фосфоресценции проводят в режиме временного разрешения путем последовательного сканирования микрообластей в лунках микропланшета сфокусированным световым лучом. Интенсивность сигнала, регистрируемого на специфической микрообласти, обратно пропорциональна количеству соответствующего наркотического вещества в исследуемом образце.

Используя значения интенсивности сигнала специфической микрообласти, получаемые по результатам анализа мультианалитных калибровочных проб, для каждого исследуемого наркотика строят калибровочную кривую, по которой проводят измерение концентрации наркотика в исследуемых образцах. Предложенный способ позволяет достоверно определять концентрации наркотиков в исследуемых образцах с использованием мультианалитных калибровочных проб, содержащих смесь белковых конъюгатов наркотических соединений, которые предварительно откалиброваны в иммуноанализе по иммунореактивному уровню каждого наркотического соединения. Это обеспечивается использованием структуры наркотических конъюгатов, сохраняющей стерическую доступность соответствующих антигенных детерминант наркотических соединений для специфического связывания с соответствующими антителами к наркотикам в сочетании с очень высокой специфичностью используемых моноклональных антител. Применение для создания калибровочных проб конъюгатов вместо непосредственно наркотических соединений позволяет скомпоновать набор реагентов для анализа без присутствия наркотических соединений, что снижает требования безопасности при использовании и транспортировке набора. Кроме того, многие наркотические соединения в конъюгированной форме более устойчивы при длительном хранении, особенно в смеси, поэтому проведение количественного анализа наркотиков предложенным способом с использованием мультианалитных калибровочных проб из конъюгатов наркотиков позволяет получать стабильные результаты мультиплексных исследований образцов биологических жидкостей.

Проведение анализа на микроколичествах улавливающих реагентов на твердой фазе, в сочетании с использованием высокоаффинных моноклональньгх специфических антител, усиленных образованием биотин-стрептавидиновых комплексов, а также применение в качестве метчика длительно люминисцирующего комплекса Pt-копропорфирина, приводит к достижению очень низких пределов детектирования наркотических веществ, что обеспечивает возможность одновременного точного детектирования наркотиков в смеси различных наркотических и/или других соединений при проведении анализа из малого объема исследуемой пробы.

Достигаемые значения пределов детектирования позволяют использовать при проведении иммуноанализа значительное разбавление образца в реакционной смеси. Экспериментально доказано, что при разбавлении образца не менее чем в 4 раза не требуется введение дополнительной стадии предварительной обработки образцов для предотвращения связываний с неспецифическими компонентами биологических жидкостей человека, а также можно использовать один набор мультианалитных калибровочных проб, приготовленных на буферном растворе, при исследовании образцов мочи или сыворотки крови. Таким образом, предложенный способ может быть использован для исследования различных биологических жидкостей человека.

Предложенным способом можно проводить мультиплексный анализ различных наркотических веществ и/или их метаболитов: морфина, амфетамина, метамфетамина и метилендиоксиметамфетамина, каннабиноидов, бензоилэкгонина, метадона, фентанила, бензодиазепинов, барбитуратов и котинина в различных сочетаниях, в зависимости от целей обследования населения.

Предложенный способ характеризуется простотой процедуры постановки анализа. Иммуноанализ проводится в одну стадию с небольшим временем анализа, без предварительной обработки исследуемых образцов. Способ не требует специального оборудования, так как проводится в стандартных 96-луночных микропланшетах и позволяет обследовать до 90 пациентов одновременно, при этом количественное выявление количества восьми различных наркотических соединений проводят в каждом исследуемом образце. Возможность одновременного мультиплексного обследования многих пациентов при простоте процедуры анализа делает перспективным разработку на основе предлагаемого способа технологии массовых обследований населения для изучения распространения наркомании и немедицинского потребления наркотических и психотропных средств.

Пример 1. Построение калибровочных кривых для одновременного детектирования кокаина, каннабиноидов, амфетамина, морфина, метамфетамина и метадона.

На поверхности дна лунки полистиролового 96-луночного микропланшета (Labsystems, кат. №95029140) иммобилизуют иммуночипы, содержащие специфические дискретные микрообласти для выявления шести наркотических веществ - кокаина, каннабиноидов, амфетамина, морфина, метамфетамина и метадона. Для этого на дно каждой лунки микропланшета с помощью прибора для печатания чипов наносят в строго отведенные точки микрокапли объемом по 25 нл растворов 0,1 мг/мл конъюгатов наркотических соединений с бычьим сывороточным альбумином: БЗЭ-БСА, ТГК-БСА, АМФ-БСА, мАМФ-БСА, МРФ-БСА и МТД-БСА. Для детектирования каждого аналита иммобилизуют по две идентичные микрообласти диаметром 0,5 мм, всего 12 микрообластей на дне каждой лунки. Для снижения скорости высыхания капель в раствор для сорбции добавляют 5% глицерина (Sigma). Микропланшет инкубируют в течение 18 часов при 4°С, промывают и обрабатывают блокирующим раствором 15 мМ фосфатного буфера, содержащего 1% БСА (бычий сывороточный альбумин), в течение 1 часа при комнатной температуре, удаляют блокирующий раствор и высушивают.

Для проведения анализа в лунки сенсибилизированного микропланшета вносят по 20 мкл мультианалитных калибровочных проб. В качестве калибровочных проб (всего 5 проб) используют физиологический раствор, а также четыре двукратных разведения в нем смеси шести конъюгатов: БЗЭ-БСА, ТГК-БСА, АМФ-БСА, мАМФ-БСА, МРФ-БСА и МТД-БСА. Мультианалитные пробы откалиброваны по уровню каждого исследуемого наркотика. Затем в лунки микропланшета добавляют по 60 мкл раствора смеси 6 биотинилированных мышиных моноклональных антител к анализируемым наркотикам в реакционном буфере (15 мМ трис-буфер, рН 7,75, 0,05% твин 20, 5% БСА (все реагенты Sigma, США)). Для соединения биотиновой метки с антителами используют реакцию с биотин-N-гидроксисукцинимидным эфиром (Sigma, США, кат. №H 1759). Микроланшет инкубируют при встряхивании при температуре 18-25°С в течение 1 часа и промывают.

В лунки микропланшета добавляют по 25 мкл раствора конъюгата стрептавидина с Pt-копропорфирином в реакционном буфере и инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре. Микроланшет промывают и высушивают. Конъюгат синтезируют через N-гидроксисукцинимид Pt-копропорфирина, полученный карбодиимидным методом (De Haas R.R. et. al., J. Histochem. & Cytochem. 1997. - 45. - 1279-1292).

Детектирование эмиссии фосфоресценции осуществляют путем последовательного сканирования дна лунки сухого микропланшета световым лучом с длиной волны возбуждения 365 нм и регистрации сигнала фосфоресценции Pt-копропорфирина на длине волны 653 нм в режиме временного разрешения. По результатам сканирования для каждого исследуемого аналита рассчитывают значение интенсивности результирующего сигнала, определяемое как среднее число фотоимпульсов по всем микрообластям, специфическим для этого аналита. С использованием этих значений строят 6 калибровочных кривых для каждого наркотического соединения. В качестве примера приведены получаемые калибровочные кривые для определения амфетамина (фиг. 2) и метадона (фиг. 3).

На основании изучения полученных калибровочных кривых определяют аналитические характеристики предложенного способа анализа, суммированные в таблице 1. Как видно из приведенных в таблице 1 данных, предлагаемый мультианалитный способ обеспечивает значения чувствительности анализа, в 5-100 раз превышающие принятые значения пороговых уровней, применяемые в современной диагностической клинической практике для подтверждения факта употребления данных наркотических соединений обследуемыми пациентами. При этом предлагаемый способ позволяет проводить измерения в широком рабочем диапазоне концентраций наркотических соединений. Таким образом, полученные аналитические характеристики способа анализа полностью соответствуют требованиям, предъявляемым к тестам на данные наркотические соединения.

Пример 2. Исследование специфичности детектирования кокаина, каннабиноидов, амфетаминов и морфина.

На поверхности дна лунок 96-луночного микропланшета способом, описанным в примере 1, иммобилизуют иммуночип для детектирования кокаина, каннабиноидов, амфетаминов и морфина, содержащий микрообласти соответственно БЗЭ-БСА, ТГК-БСА, АМФ-БСА и МРФ-БСА. Для детектирования каждого аналита иммобилизуют по 4 одинаковые микрообласти.

В лунки планшета последовательно помещают по 50 мкл растворов в реакционном буфере четырех биотинилированных антител, специфических к каждому исследуемому аналиту. Далее проводят иммуноанализ, как описано в примере 1.

Результаты сканирования фосфоресценции планшета после проведения иммуноанализа, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что на специфических для каждого антитела областях иммуночипа регистрируют высокие значения интенсивности сигналов, при этом сигналы на неспецифических для этих антител микрообластях находятся в пределах фоновых значений, т.е. перекрестное взаимодействие антител с другими наркотическими соединениями, введенными в иммуночип, отсутствует. Таким образом, предложенный способ анализа позволяет проводить специфичное детектирование отдельных наркотиков в смеси наркотических соединений.

Пример 3. Исследование чувствительности и специфичности детектирования фентанила в моче человека.

На поверхности дна лунки 96-луночного микропланшета иммобилизуют способом, описанным в примере 1, иммуночип, содержащий специфические дискретные микрообласти ФЕН-БСА, мАМФ-БСА, МДМА-БСА и МТД-БСА. Для детектирования каждого аналита иммобилизуют по 4 одинаковые микрообласти.

Для проведения анализа в лунки планшета вносят в дубликатах по 20 мкл растворов фентанила в моче человека, с уровнем фентанила: 0, 1,5, 10, 50 и 100 нг/мл, и добавляют во все лунки по 60 мкл раствора в реакционном буфере смеси четырех биотинилированных мышиных моноклональных антител к фентанилу, метамфетамину, МДМА и метадону. Далее анализ проводят, как описано в примере 1.

По результатам сканирования микрообластей на дне лунок планшета рассчитывают величины средних (по дубликатам) значений интенсивности сигнала на микрообластях, специфических к каждому из четырех детектируемых наркотиков. На фиг. 4 приведены полученные зависимости процента ингибирования регистрируемых сигналов на микрообластях, содержащих фентанил (поз. 14), а также метамфетамин (поз. 15), МДМА (поз. 16) и метадон (поз. 17) от концентрации фентанила в моче человека. Как следует из приведенных данных, уровни регистрируемых сигналов, полученные в результате связывания меченых антител к мАМФ, МДМА и метадону с соответствующими микрообластями, не изменяются в присутствии в исследуемой пробе фентанила (поз. 14). Кривая зависимости ингибирования фентанилом, находящимся в пробе мочи, связывания антифентаниловых антител с соответствующей микрообластью иммуночипа имеет линейный характер (поз. 14). Демонстрируемые на фиг. 4 характеристики способа детектирования фентанила - рабочий диапазон (0-100 нг/мл) и высокая чувствительность (0,4 нг/мл) - позволяют надежно выявлять его в клинических образцах мочи с учетом величины порогового уровня 20 нг/мл фентанила в моче, принятого в настоящее время для диагностики немедицинского потребления данного соединения.

Пример 4. Одновременное детектирование бензодиазепинов, барбитуратов и никотина в моче человека.

На поверхности дна лунок 96-луночного микропланшета иммобилизуют описанным в примере 1 способом иммуночип, содержащий специфические дискретные микрообласти конъюгатов КОТ-БСА, БЗО-БСА и БАР-БСА.

Для проведения анализа в часть лунок микропланшета помещают по 20 мкл мультианалитных калибровочных проб. В качестве калибровочных проб используют двукратные разведения в физиологическом растворе смеси трех конъюгатов КОТ-БСА, БЗО-БСА и БАР-БСА, откалиброванных по уровню бензодиазепинов, барбитуратов и котинина (пять калибраторов с концентрациями от 0 до 400 нг/мл). В другие лунки микропланшета помещают по 20 мкл контрольного образца в нескольких разведениях (в 2, 4 и 8 раз). Международный контрольный образец мочи (DETECTABUSE ™ Liquid Control Urine, Biochemical Diagnostic, Inc., США) содержит смесь различных наркотических веществ, в том числе 375 нг/мл оксазепама, 1250 нг/мл нортриптилина и 375 нг/мл секобарбитала. Затем во все лунки микропланшета добавляют по 60 мкл раствора смеси трех биотинилированных мышиных моноклональных антител к КОТ, БЗО и БАР в реакционном буфере. Далее анализ проводят, как описано в примере 1.

По результатам сканирования лунок, в которых был проведен анализ мультианалитных калибровочных проб, строят, как описано в примере 1, три калибровочные кривые, по которым проводят определение уровней бензодиазепинов, барбитуратов и котинина в контрольном образце. Полученные результаты анализа контрольного образца и его разведений в физиологическом растворе соответствуют ожидаемым значениям. Таким образом, предложенный способ позволяет достоверно оценивать уровень каждого из этих наркотических соединений при исследовании их в смеси.

Пример 5. Одновременное детектирование кокаина, каннабиноидов, амфетамина и морфина в образцах сыворотки крови человека.

На поверхности дна лунок 96-луночного микропланшета иммобилизуют описанным в примере 1 способом иммуночип, содержащий специфические дискретные микрообласти конъюгатов БЗЭ-БСА, ТГК-БСА, АМФ-БСА и МРФ-БСА. Для детектирования каждого аналита иммобилизуют по четыре одинаковые микрообласти. Для проведения анализа в часть лунок микропланшета помещают по 15 мкл пяти мультианалитных калибровочных проб, содержащих различные концентрации смеси конъюгатов БЗЭ-БСА, ТГК-БСА, АМФ-БСА и МРФ-БСА в физиологическом растворе. В остальные лунки вносят по 20 мкл исследуемых образцов сыворотки крови. В качестве исследуемых проб используют клинические образцы сыворотки крови двадцати восьми пациентов, для которых зафиксировано употребление определенных наркотических веществ. Каждый образец исследуют в двух повторах. Затем во все лунки планшета добавляют по 50 мкл раствора смеси биотинилированных мышиных моноклональных антител к БЗЭ, ТГК, АМФ и МРФ в реакционном буфере. Далее анализ проводят, как описано в примере 1.

По результатам мультиплексного анализа сывороток крови были выявлены пять образцов, содержащих опиаты (ингибирование регистрируемого сигнала до значений 1-5%), а также по одному образцу, содержащему кокаин (ингибирование сигнала до 11%), каннабиниоды (20%), метадон (10%) и метамфетамин (1%). Полученные результаты, в основном, соответствуют исходным клиническим данным пациентов, включающим наименование употребляемых наркотиков и динамику их приема. Таким образом, предложенный способ обеспечивает детектирование кокаина, каннабиноидов, амфетамина и морфина в образцах сыворотки крови человека.

Пример 6. Мультиплексное исследование образцов мочи от пациентов, употребляющих кокаин, каннабиноиды, амфетамины, опиаты и/или метадон.

На поверхности дна лунок 96-луночного микропланшета иммобилизуют описанным в примере 1 способом иммуночип, содержащий специфические дискретные микрообласти восьми конъюгатов БЗЭ-БСА, ТГК-БСА, АМФ-БСА, мАМФ-БСА, МДМА-БСА, МРФ-БСА, ФЕН-БСА и МТД-БСА. Для детектирования каждого аналита иммобилизуют по две идентичные микрообласти.

Для проведения анализа в часть лунок микропланшета помещают по 15 мкл пяти мультианалитных калибровочных проб, содержащих различные концентрации восьми конъюгатов БЗЭ-БСА, ТГК-БСА, АМФ-БСА, мАМФ-БСА, МДМА-БСА, МРФ-БСА, ФЕН-БСА и МТД-БСА. В остальные лунки вносят по 20 мкл исследуемых образцов мочи человека. В качестве исследуемых проб используют клинические образцы мочи десяти пациентов, для которых зафиксировано употребление одного или нескольких веществ: кокаина, каннабиноидов, амфетаминов, опиатов и/или метадона. Каждый образец мочи исследуют в двух повторах. Затем во все лунки микропланшета добавляют по 50 мкл раствора смеси биотинилированных мышиных моноклональных антител к восьми анализируемым наркотическим соединениям в реакционном буфере. Далее анализ проводят, как описано в примере 1.

По результатам сканирования лунок, в которых проводился анализ мультианалитных калибровочных проб, строят, как описано в примере 1, восемь калибровочных кривых, по которым проводят определение уровней бензоилэкгонина тетрагидроканнабинола, амфетамина, метамфетамина, метилендиоксиметамфетамина, морфина, фентанила и метадона в исследуемых образцах мочи. В таблице 3 представлены полученные результаты по сравнению со значениями пороговых уровней наркотических соединений, принятых для диагностирования употребления наркотиков, и, в основном, соответствуют клиническим данным. Так, во всех образцах от пациентов, употребляющих героин, получены высокие (значительно превышающие пороговые) значения концентрации морфина. У пациента, употребляющего первитин, выявлен высокий уровень амфетамина и пороговый уровень метамфетамина. Положительные результаты получены также для пациентов, употребляющих соответственно кокаин, метадон и каннабиноиды. При этом определяемые уровни аналитов в образцах пациентов, не употребляющих соответствующий наркотик, получаются ниже предела детектирования метода, то есть ложноположительные результаты при анализе не наблюдаются.

Пример 7. Одновременное детектирование наркотических соединений в образцах мочи и сыворотки крови человека при использовании различных разведений образцов в реакционной смеси.

На поверхности дна различных лунок 96-луночного микропланшета иммобилизуют две модификации иммуночипов, первую, предназначенную для выявления кокаина, каннабиноидов, амфетамина, морфина, фентанила, метамфетамина, МДМА и метадона, получают способом, описанным в примере 6, вторую - для выявления бензодиазепинов, барбитуратов и никотина - способом, описанным в примере 4.

Для проведения анализа на каждой модификации иммуночипов в часть лунок помещают мультианалитные калибровочные пробы, приготовленные на буферном растворе. В остальные лунки вносят исследуемые образцы мочи и сыворотки крови человека. Часть образцов не содержит наркотических соединений, другие - содержат их различные смеси. Каждый образец исследуют в двух повторах. Затем во все лунки микропланшета добавляют раствор в реакционном буфере смеси соответствующих биотинилированных мышиных моноклональных антител. Используют различные соотношения объемов в реакционной смеси: объемы исследуемых образцов варьируют от 10 до 50 мкл при изменении объемов добавляемых антител от 25 до 100 мкл. Таким образом, разведение образца, например, в четыре раза может быть достигнуто смешением 15 мкл образца и 45 мкл антител или 20 мкл образца и 60 мкл антител. Далее анализ проводят, как описано в примере 1.

Результаты, полученные для иммуночипа на восемь аналитов, представлены в таблице 4, в которой приведены значения интенсивности сигнала (кол-во импульсов), регистрируемого на специфических микрообластях иммуночипа для выявления бензоилэкгонина, тетрагидроканнабинола, амфетамина, морфина, фентанила, метамфетамина, метилендиоксиметамфетамина и метадона по результатам исследования образцов, не содержащих наркотических соединений (буферный раствор - КП0, сыворотка - К1 и моча человека К2), при использовании различных разведений образца в реакционной смеси на стадии иммуноанализа в лунке микропланшета с иммуночипом.

Как видно из таблицы 4, при использовании разведения образцов в реакционной смеси на стадии иммуноанализа не менее чем в 4 раза интенсивность регистрируемых сигналов на специфических микрообластях иммуночипа при анализе образцов мочи и сыворотки крови соответствует (в пределах 90-110%) значениям, полученным при анализе калибровочных проб, тогда как при меньшем разведении наблюдается значительное снижение интенсивности сигнала (особенно, в случае анализа морфина и метадона), что может привести к искажению результатов выявления наркотических соединений в образцах различных биологических жидкостей человека.

Таким образом, предложенный способ детектирования с помощью мультианалитных калибровочных проб, содержащих смесь конъюгатов наркотических соединений в буферном растворе, позволяет проводить адекватную количественную оценку уровня наркотиков в моче и сыворотке крови человека.

Claims (10)

1. Способ одновременного детектирования наркотических веществ в биологических жидкостях, включающий иммобилизацию на дне лунок микропланшета первых биоспецифических компонентов, специфичных к определяемым аналитам, в виде дискретных микрообластей, внесение в лунки образца, содержащего искомые аналиты, и вторых биоспецифических компонентов, состоящих из конъюгатов антител к определяемым аналитам с биотином и стрептавидином, меченных Pt копропорфирином, проведение реакции биоспецифического связывания между первыми и вторыми биоспецифическими компонентами и детектирование в режиме временного разрешения излучения фосфоресценции метки, связанной с искомыми аналитами, путем сканирования каждой дискретной микрообласти сфокусированным световым лучом, отличающийся тем, что для одновременного детектирования множества наркотических и/или психотропных веществ в крови и/или моче пациента в качестве первых биоспецифических компонентов используют растворы конъюгатов бензоилэкгонина, тетрагидроканнабинола, амфетамина, морфина, фентанила, метамфетамина, метилендиокситамфетамина, метадона, бензодиазепина, барбитурата и котинина с белком, которые в различных сочетаниях иммобилизуют в виде по крайней мере двух микрообластей, при проведении анализа в часть лунок микропланшета вносят мультианалитные калибровочные пробы, содержащие смесь указанных конъюгатов наркотиков с белком в буферном растворе, причем для исследования образцов мочи и сыворотки крови используют одни и те же мультианалитные калибровочные пробы, в остальные лунки вносят исследуемые образцы мочи и/или крови, во все лунки добавляют раствор в реакционном буфере смеси биотинилированных мышиных моноклональных антител к искомым наркотикам для получения меченных биотином иммунных комплексов на дискретных микрообластях, при этом образцы во всех лунках разводят не менее чем в четыре раза, детектируют излучение фосфоресценции на каждой дискретной микрообласти во всех лунках одновременно, по результатам измерений мультианалитных калибровочных проб строят калибровочные кривые, с которыми сравнивают измеренные значения фосфоресценции в микрообластях остальных лунок.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат морфин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления опиатов.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат котинин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления никотина.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат бензоилэкгонин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления кокаина.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат тетрагидроканнабинол - бычий сывороточный альбумин используют для выявления марихуаны.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат фентанил - бычий сывороточный альбумин используют для выявления фентанила.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат метадон - бычий сывороточный альбумин используют для выявления метадона.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат бензодиазепин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления бензодиазепинов.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгат барбитурат - бычий сывороточный альбумин используют для выявления барбитуратов.

10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что конъюгаты амфетамин - бычий сывороточный альбумин, метамфетамин - бычий сывороточный альбумин и метилендиоксиметамфетамин - бычий сывороточный альбумин используют для выявления амфетаминов.

Images