RU2291436C1

RU2291436C1 - Способ диагностики потребления наркотических веществ

Info

Publication number: RU2291436C1
Application number: RU2005133108/15A
Authority: RU
Inventors: гкова Марина Александровна М (RU); Марина Александровна Мягкова
Original assignee: Общество с ограниченной ответственностью "ДИАМЕДИКА"
Priority date: 2005-10-28
Filing date: 2005-10-28
Publication date: 2007-01-10

Abstract

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и медицине и касается способа диагностики потребления наркотических веществ. Изобретение может найти применение в диагностике ранних стадиий употребления наркотических и психотропных веществ, относящихся к классам: опиаты, эфедрины, барбитураты, каннабиноиды, амфетамины, кокаин, бензодиазепины, в отсутствие клинических признаков состояния зависимости. Изобретение также решает проблему установления времени (периода, срока), в течение которого происходило употребление наркотика. Поставленная задача решается способом диагностики потребления наркотических веществ методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью определения наличия антител в сыворотки крови, включающим инкубацию анализируемой пробы с конъюгатом гаптен: макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердой фазе, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотки крови, и установление факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе, отличающимся тем, что в сыворотке крови определяют антитела к эндогенным биорегуляторам, при этом в качестве конъюгата используют конъюгат, в котором гаптен относится к группе опиоидных пептидов из ряда бета-эндорфин, дерморфин, энкефалины или биогенных аминов из ряда катехоламины, серотонин, гистамин, а в качестве макромолекулярного носителя берут поли(4-нитрофенил)акрилат, при этом соотношение гаптен : макромолекулярный носитель составляет в мол.% (10-15):1.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности наркологии, и может найти применение в диагностике ранних стадиий употребления наркотических и психотропных веществ, относящихся к классам: опиаты, эфедрины, барбитураты, каннабиноиды, амфетамины, кокаин, бензодиазепины и др., в отсутствие клинических признаков состояния зависимости.

Известен способ диагностики факта потребления наркотических веществ-опиатов в сыворотки крови по определению содержания иммуноглобулинов класса М против морфина твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА), в котором образцы сыворотки больных и доноров инкубируют с конъюгатом гаптен : макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердую фазу. В качестве макромолекулярного носителя используют лизоцим, а в качестве гаптена - морфин, а конъюгированный антиген имеет соотношение гаптен : макромолекулярный носитель, равное 14:1. При увеличении показателя оптической плотности OD492 относительно нормы диагностируют факт злоупотребления опиатами. Однако недостатком указанного выше способа является то, что в нем отсутствует выявление антител класса G, а также недостаточный процент выявления лиц, злоупотребляющих опиатами (Гамалея Н.Б., Елагина Э.Н., Леви М.И., Паршин А.Н. Вопросы наркологии, 1991, №3, с.10-13).

Известен способ выявления антител против эфедрина в сыворотке крови больных эфедроновой наркоманией, основанный на использовании ИФА, в котором образцы сыворотки больных и доноров инкубируют с конъгатом гаптен : макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердую фазу. В качестве макромолекулярного носителя используют бычий сывороточный альбумин, в качестве гаптена-модифицированную молекулу эфедрина, имеющую карбоксипропильный заместитель у атома азота в роли спейсера, формулы

CH₃N(CH₂)₃COONa

а конъюгированный антиген имеет соотношение гаптен : макромолекулярный носитель равное 12:1. Уровень специфических антител против эфедрина определяют с помощью антивидовых антител к иммуноглобулинам класса М и G человека, меченных ферментом (пероксидазой хрена), измеряя величину оптической плотности OD₄₉₂, и по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб, содержащих сыворотки крови с наличием и без наркотиков, и устанавливают факт потребления последних в случае, если определяемое значение OD₄₉₂ превышает сумму среднего значения OD₄₉₂ сывороток группы доноров и двух стандартных отклонений (Мягкова М.А., Лушникова М.В., Полевая О.Ю., Гамалея Н.Б. «Антитела к эфедрину у больных эфедроновой наркомании», Вопросы наркологии, 1991, №2, с.10-13).

Однако указанный выше способ приводит к ложноположительным результатам, что снижает процент выявления лиц, употребляющих наркотические вещества.

Известен принятый за прототип способ диагностики факта потребления наркотических веществ методом твердофазного иммуноферментного анализа определения наличия антител к производным метаболитов анализируемых наркотических веществ в сыворотки крови, включающий инкубацию анализируемой пробы с иммобилизованным на твердой фазе конъюгатом, в котором гаптен является производным метаболита анализируемого наркотического вещества, а макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, овальбумина и лизоцима, при соотношении гаптен : макромолекулярный носитель в мол.% (3-12):1, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотки крови, и установления факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе (RU С1, МКИ G 01 N 33/547 №2250467, опуб. 2005.04.20).

Однако описанный способ позволяет устанавливать лишь сам факт потребления наркотиков.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является не только дальнейшее совершенствование установления факта потребления наркотических веществ в отдаленные сроки при отсутствии следов метаболитов употребляемых наркотических веществ, а также и установление времени (периода, срока) в течение которого происходило употребление наркотика.

Техническим результатом, который может быть получен при осуществлении изобретения, является определение антител к эндогенным биорегуляторам.

Поставленная задача решается способом диагностики потребления наркотических веществ методом твердофазного иммуноферментного анализа определения наличия антител в сыворотки крови, включающим инкубацию анализируемой пробы с конъюгатом гаптен : макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердой фазе, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотки крови, и установление факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробе, отличающимся тем, что в сыворотке крови определяют антитела к эндогенным биорегуляторам, при этом в качестве конъюгата используют конъюгат, в котором гаптен относится к группе опиоидных пептидов или биогенных аминов, макромолекулярный носитель выбран из ряда поли- или олигоакрилатов, а соотношение гаптен : макромолекулярный носитель составляет в мол.% (10-15):1.

В качестве опиоидных пептидов используют соединение из ряда бета-эндорфин, дерморфин, энкефалины.

В качестве биогенных аминов используют соединение из ряда катехоламины, серотонин, гистамин.

В случае использования в качестве гаптена гистамина наилучшие результаты получают при использовании в качестве макромолекулярного носителя поли(4-нитрофенил)акрилат.

Проведенные исследования показали, что определение антител к указанным выше веществам позволяет установить время (период, срок), в течение которого происходило употребление наркотика. Если обнаружены антитела к опиоидным пептидам, то человек мог употреблять наркотик, по крайней мере, 1 год. Если обнаружены антитела к биогенным аминам, то употребление наркотика продолжалось более длительное время - 3 года и более.

Конъюгаты гаптен : макромолекулярный носитель получают известными способами, описанными, в частности, в прототипе.

Возможность осуществления изобретения с реализацией заявляемого назначения и получением технического результата подтверждается, но не исчерпывается следующими примерами.

Определение антител к эндогенным биорегуляторам, в качестве которых использовали опиоидных пептиды или биогенные амины, проводили в сыворотке крови больных наркоманией с различным сроком употребления наркотиков. Стаж наркотизации составлял от 1 до 7 лет.

Пример 1. Получение конъюгата гистамина на основе полимерной матрицы.

Синтез конъюгированного антигена гистамина (ГА) на основе поли(4-нитрофенил)акрилата выполняли следующим образом. К раствору 6 мг (0,036 ммоль) поли(4-нитрофенил)акрилата в 1 мл ДМФАабс. добавляли 1,1 мг (0,009 ммоль) ГА и выдерживали реакционную смесь в течение суток при температуре 20°С, затем добавляли для инактивации непрореагировавшего активированного эфира 5% раствор аммиака. Растворитель упаривали в вакууме. Оставшееся масло многократно промывали эфиром и растворяли в 1 мл ДМФАабс., оставляли на хранение при температуре минус 20°С.

Количество молей ГА, связавшихся с полимерной матрицей, определяли спектрофотометрически по выделяющемуся в процессе реакции п-нитрофенолу. В синтезированном конъюгате содержалось 13 моль ГА на моль полимерного носителя.

Пример 2. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к гистамину в сыворотке крови человека.

Предлагаемый способ осуществляют на 96 луночных полистирольных планшетах. На твердую фазу иммобилизируют конъюгат гистамина, полученный в примере 1, для чего вносят в лунки по 100 мкл его раствора в концентрации 3 мкг/мл в 0,02М карбоматном буфере рН 9,5 и выдерживают 18 часов при 4°С.

После сорбции планшет отмывали трижды (3·100 мкл) 0.005% раствором твин-20 в ЗФР (рН 7.2). В качестве исследуемой сыворотки были взяты и вносили в лунки в двух повторах по 100 мкл исследуемой сыворотки в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), содержащем 0.01% твин-20, в разведении 1/200. Планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С.

После инкубации планшет отмывали, как описано выше, и добавляли в лунки по 100 мкл раствора конъюгатов антивидовых антител против IgM человека, меченных пероксидазой хрена в разведении 1/2000. Планшет инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С.

После инкубации планшет промывали, как описано выше, и заполняли (по 100 мкл в лунку) субстратной смесью, содержащей 0.4% о-фенилендиамина и 0.4% H₂O₂ в 0.05М фосфатно-цитратном буфере. Планшет инкубировали в течение 20 минут в темноте.

После инкубации останавливали ферментативную реакцию добавлением в лунки по 50 мкл 10% H₂SO₄ и измеряли оптическую плотность (OD₄₉₂) на спектрофотометре при длине волны 492 нм.

На основании результатов ИФА проводили анализ содержания иммуноглобулинов класса М (IgM) в индивидуальных сыворотках больных и доноров, определяя достоверное изменение уровня антител.

За величину порогового уровня, разделяющего сыворотки доноров и больных, имеющих повышенный либо пониженный уровень антител к исследуемым антигенам, принимали значение OD₄₉₂ в ИФА, отличающееся от среднего значения OD₄₉₂ в ИФА для группы доноров, на величину трехкратного стандартного отклонения. Полученные данные обработали статистически по критерию Стьюдента.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 4-7 лет, совпадение результатов по срокам употребления составило 70%.

Пример 3. Получение конъюгата β-эндорфина на основе полимерной матрицы

Синтез конъюгированного антигена β-эндорфина на основе поли(4-нитрофенил)акрилата выполняли аналогично примеру 1. В реакции использовали 6 мг (0,036 ммоль) полимера и 4 мг (0,001 ммоль) пептида. В синтезированном конъюгате содержалось 15 молей β-эндорфина на 1 моль полимерного носителя.

Пример 4. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к β-эндорфину

Иммуноферментный анализ проводили так же, как в примере 2, только планшет сенсибилизировали раствором конъюгата β-эндорфина, полученным по описанию в примере 3, в концентрации 1 мкг/мл в 0,02 М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Далее проводили стадии отмывки и вносили исследуемую сыворотку в разведении 1:400. Инкубировали и добавляли антивидовой конъюгат в разведении 1:1000. Учет результатов проводили аналогично описанному выше.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 1-2 года, совпадение результатов по срокам употребления составило 85%.

Пример 5. Получение конъюгата дерморфина на основе полимерной матрицы

Синтез конъюгированного антигена дерморфина на основе поли(4-нитрофенил)акрилата выполняли аналогично примеру 1. Содержание исходных компонентов в реакционной смеси составляло: 3 мг (0,036 ммоль) полинитрофенилакрилата и 2 мг (0,0025 ммоль) дерморфина. В синтезированном конъюгате содержалось 14 моль дерморфина на 1 моль полимерного носителя.

Пример 6. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к дерморфину

Иммуноферментный анализ проводили аналогично описанному в примере 2, при этом планшет сенсибилизировали раствором конъюгата дерморфина, полученным по методу в примере 5, используя концентрацию 2 мкг/мл в 0,02 М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Далее проводили все стадии, касающиеся процедуры ИФА. Исключением составляла операция с анализируемой пробой: исследуемую сыворотку вносили в разведении 1:400.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 1-2 года, совпадение результатов по срокам употребления составило 87%.

Пример 7. Получение конъюгата норадреналина на основе полимерной матрицы

Синтез конъюгированного антигена норадреналина на основе поли(4-нитрофенил) акрилата выполняли аналогично примеру 1. К раствору 6 мг (0,072 ммоль) полимера в 2-х мл ДМФ добавили 3 мг (0,0045 ммоль) норадреналина. Реакционную смесь выдерживали сутки. Добавляли 0,5 мл этаноламина и через 2 часа растворитель упаривали, остаток многократно промывали эфиром. Полученное вещество хранили при -20°С. В синтезированном конъюгате содержалось 15 моль норадреналина на 1 моль полимерного носителя.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 3-5 лет, совпадение результатов по срокам употребления составило 74%.

Пример 8. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к норадреналину

Иммуноферментный анализ проводили по методике, представленной в примере 2, только планшет сенсибилизировали раствором конъюгата норадреналина, полученным в примере 7, в концентрации 100 нг/мл в 0,02 М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Отмывали и исследуемую сыворотку вносили в разведении 1:800. Далее проводили все стадии ИФА, описанные выше.

Пример 9. Получение конъюгата адреналина на основе полимерной матрицы

Синтез конъюгированного антигена адреналина на основе поли(4-нитрофенил) акрилата выполняли аналогично примеру 7. Определение содержания адреналина, связавшегося с полимерной матрицей проводили спектрофотометрически (пример 1). В синтезированном конъюгате содержалось 18 моль адреналина на 1 моль полимерного носителя.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 3-5 лет, совпадение результатов по срокам употребления составило 70%.

Пример 10. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к адреналину

Иммуноферментный анализ проводили, как описано в примере 2, только планшет сенсибилизировали раствором конъюгата адреналина, полученным в примере 9, в концентрации 3 мкг/мл в 0,02М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Исследуемую сыворотку вносили в разведении 1:400. Учет результатов и ИФА проводили, как описано в примере 2.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 3-5 лет, совпадение результатов по срокам употребления составило 75%.

Пример 11. Получение конъюгата серотонина на основе полимерной матрицы

Синтез конъюгированного антигена серотонина на основе поли(4-нитрофенил) акрилата выполняли аналогично примеру 1. В синтезированном конъюгате содержалось 12 моль серотонина на моль 1 полимерного носителя.

Пример 12. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к серотонину

Иммуноферментный анализ проводили по аналогии, как в примере 2, только планшет сенсибилизировали раствором конъюгата серотонина, полученным в примере 11, в концентрации 0,3 мкг/мл в 0,02М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Исследуемые образцы сыворотки вносили в разведении 1:400.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 3-7 лет, совпадение результатов по срокам употребления составило 82%.

Пример 13. Получение конъюгата дофамина на основе полимерной матрицы

Синтез конъюгированного антигена дофамина на основе поли(4-нитрофенил) акрилата выполняли аналогично примеру 7. Соотношение реагентов в растворе ДМФ было на 50% больше по сравнению с использованными для норадреналина. В синтезированном конъюгате содержалось 14 моль дофамина на 1 моль полимерного носителя.

Пример 14. Иммуноферментный анализ (ИФА) определения антител к дофамину

Иммуноферментный анализ проводили, как в примере 2. Планшет сенсибилизировали раствором конъюгата дофамина, полученным в примере 13, в концентрации 100 нг/мл в 0,02М карбонатном буфере (рН 9,5) в течение 18 часов при температуре 4°С. Исследуемую сыворотку вносили в разведении 1:200. Далее выполняли все операции, описанные выше.

В группе испытуемых из 30 человек, употребляющих наркотики 3-5 лет, совпадение результатов по срокам употребления составило 80%.

Как видно из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяет с довольно высокой вероятностью устанавливать сроки потребления различных классов наркотиков и психотропных веществ (опиатов, эфедринов, амфетаминов, бензодиазепинов и др.) по наличию антител к эндогенным биорегуляторам, которые сохраняются в организме человека в течение длительного времени (1-7 лет) после самого факта потребления, что является актуальным в современных условиях для выявления ранней стадии заболевания.

Claims

Способ диагностики потребления наркотических веществ методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью определения наличия антител в сыворотки крови, включающий инкубацию анализируемой пробы с конъюгатом гаптен:макромолекулярный носитель, иммобилизованным на твердой фазе, последующую инкубацию образовавшегося иммунного комплекса с конъюгатом антител против иммуноглобулинов класса М и G человека, меченных ферментом, и выявление уровня специфических антител по разнице значений оптической плотности анализируемого образца с аналогичными показателями эталонных проб с наличием и без наркотиков, содержащихся в сыворотки крови, и установления факта потребления последних в случае совпадения или превышения уровня антител в анализируемой и эталонной пробах, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют антитела к эндогенным биорегуляторам, при этом в качестве конъюгата используют конъюгат, в котором гаптен относится к группе опиоидных пептидов из ряда бета-эндорфин, дерморфин, энкефалины или биогенных аминов из ряда катехоламины, серотонин, гистамин, а в качестве макромолекулярного носителя берут поли(4-нитрофенил)акрилат, при этом соотношение гаптен:макромолекулярный носитель составляет в мол.% (10-15):1.