JP2014062814A - 抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法及びそれにより製造される免疫蛍光スライド - Google Patents

Abstract

【課題】抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法及びそれにより製造される免疫蛍光スライドを提供する。
【解決手段】Ｃ反応性タンパク質をスライドに固定化するために、３−アミノプロピルトリメトキシシランで改質されたスライドを製造する段階、３−アミノプロピルトリメトキシシランで改質されたスライドを水和する段階、グルタルアルデヒド溶液を使って、改質されたスライドを活性化させる段階、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）にＣ反応性タンパクを０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解して固定化用の抗原溶液を製造する段階、スポッティングガイド上にスライドを含むペトリ皿を載せ、製造した抗原溶液を１〜１００μｌの滴下点にスポッティングする段階、該段階によって準備されたスライドを１〜６時間反応させて抗原を固定化する抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法及びこれによって製造される免疫蛍光スライド。
【選択図】図３

Description

本発明は、Ｃ反応性タンパク質をスライドに固定させてタンパク質チップを製造する段階、分析しようとするタンパク質に特異的に結合する抗体をストレプトアビジンと混合して蛍光ナノ粒子で標識させる段階、前記抗体を混合競争的に免疫反応させる段階、及び蛍光カメラで分析する段階からなる抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法及びそれにより製造される免疫蛍光スライドに関する。

バイオチップ（Ｂｉｏｃｈｉｐ）は、多種のプローブを単位面積の固相支持体の表面に固定化したものであって、このようなバイオチップを利用すれば、少量の試料で疾病の診断、高効率スクリーニング（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ；ＨＴＳ）、酵素活性測定などの実験を大規模で容易に実施することができる。

プローブをスライドやスライドに固定させる方法のほとんどは、コーティング物質で表面を前処理したガラススライド上にプローブを固定させることで製作される。このために、多様な表面化学物質が提案され、代表的に自己組立単分子層（Ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）などの技術が適用される（特許文献１）。

これに対して、固定化されるプローブ量を増大させてプローブの活性を保持するための試みとして、３次元固定化方法が開発された（Ｇｉｌｌ及びＢａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：２８２、２０００）。例えば、パッカードバイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のヒドロゲル^(R)（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ）コーティングスライド、バイオセプト社のポリエチレングリコール系ヒドロゲル、及びＬＧ化学のゾルゲルなどを利用した３次元の固定化方法を例として挙げられる。

免疫センサー用のスライドとしては、ガラス、シリコン、ヒドロゲル、金属、セラミックス、多孔性メンブレンで構成されたグループから選択される。

現在、対応する抗原または抗体の特異的反応性に基づいて、抗体または抗原が基材上に固定化された抗体または抗原プローブプレートが、検出するために広く使われている。このような使用のための３種の代表的キットは、ラピッド（ｒａｐｉｄ）テストキット、ルーチン（ｒｏｕｔｉｎｅ）テストキット及びバイオチップキットである。

これらは、固定化された抗体プローブまたは抗原プローブに対応するターゲット抗原またはターゲット抗体を検出するために使われる。

一部の場合には、多様な反応器が一プローブプレートに組み合わせられるが、前記反応器のそれぞれは、抗原または抗体を検出するテストストリップをそれぞれ含む。

一方、最近、健康機能食品法が発効されながら、国内でも天産物に基づいて食品素材及び加工食品を製造し、これを健康機能食品として認められる門戸が開放された。しかし、そのためには、健康機能食品の機能性、例えば、心血関係疾患予防、老化抑制、癌予防、肥満防止、免疫調節、胃・腸管疾患予防などの健康機能食品の機能性を科学的に立証する資料を提示しなければならないので、食品の機能性評価の重要性は次第に増大しており、その結果として機能性評価分野の事業化可能性も非常に高い実情である。

食品の機能性評価は、前記の６大機能性類型を中心に生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）機能性評価、ラット（ｒａｔ）のような実験動物を利用した生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）機能性評価及び臨床実験を網羅しているが、食品産業の側面から見る時、食品素材及び機能性食品の機能性評価を効率的かつ迅速に行うための実験動物を利用した生体内機能性の検索技術開発の必要性が増大しつつある。

機能性食品として認められるためには、心血関係機能性のような目的する機能性が科学的に立証されなければならないが、食品に対する機能性の評価の重要性は、いくら強調しても強調しすぎることはない（Ｋｉｍなど、直接結合水晶振動子免疫センサーによるＣ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ検出、韓国生物工学会誌、Ｖｏｌ．２２、ｐ．４４３、２００７）。臨床実験に先立って、前段階として行われる実験動物を利用した生体内機能性評価は、従来から体重、血圧、及び器官形態のような身体的要素の変化を測定することであった。しかし、このような方法は、不均一な結果をもたらすだけではなく、評価プロトコルの多様性、熟練された専門家及び高価の分析器具などが必要であるという短所がある。生体内食品機能性に対する均一な評価方法は、ラットのような実験動物体内で特定の疾患や代謝症状と関連した特定のバイオマーカータンパク質の上昇及び下降を測定することである。この場合は、機能性食品として認められようとする食品を含むことを実験動物に投与する。

特許文献２では、食品素材及び機能性食品の心血関係機能性を迅速に検索することができる生体内機能性評価のための新たな方法の１つであって、冠状動脈疾患、高血圧などに対する主要バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）の１つとして知られており、哺乳動物の肝でインターロイキン−６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）及びインターロイキン−１β（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）による誘導刺激で合成される分子質量１１８キロダルトン（ｋｉｌｌｏｄａｌｔｏｎ、ｋＤａ）程度のペンタマータンパク質であるＣ反応性タンパク（Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．１９、ｐ．１１９３、２００４；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．４７、ｐ．４０３、２００１；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖｏｌ．３４０、ｐ．４４８、１９９９；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ、Ｖｏｌ．３２７、ｐ．４２５、１９９７）を水晶振動子免疫センサー（ｑｕａｒｔｚ ｃｒｙｓｔａｌ ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ）を用いて高感度で検出する測定方法について記述した。

前記の方法は、Ｃ反応性タンパクを測定するための既存の方法の１つである酵素免疫分析法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１、ｐ．１５５、２００５；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１、ｐ．６２、２００５；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｖｏｌ．１８、ｐ．２８０、２００４）に比べて、着色物質による測定阻害を受けないながらも、簡便に使うことができる長所があり、測定感度も既存の他のセンサー測定法に比べて、優秀または類似しているレベルで表われた（Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．２２、ｐ．９７３、２００７；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．２１、ｐ．１９８７、２００６；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．２１、ｐ．１６３１、２００６；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．２１、ｐ．１１４１、２００６；Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．３２８、ｐ．２１０、２００４）。

最近、バイオセンサーを利用したセンサー計測に金属コロイド（ｍｅｔａｌｌｉｃ ｃｏｌｌｏｉｄ）、炭素ナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ ｎａｎｏｔｕｂｅ）、蛍光シリカナノ粒子（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、半導体量子点（ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）のようなナノ素材を利用する頻度が増加しており、その適用を通じてセンサー信号の感応性、安定性、選択性などを増進した研究結果が多数報告されている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｖｏｌ．７９、ｐ．６３０〜７０７、２００７；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．２１、ｐ．１９００、２００６；Ｌａｎｇｍｕｉｒ、Ｖｏｌ．２２、ｐ．４３５７、２００６；Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ．５、ｐ．１１３、２００５；Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、Ｖｏｌ．２０、ｐ．２４５４、２００５；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．１００、ｐ．４９８４、２００３；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｖｏｌ．２７４、ｐ．８１７、２０００）。

バイオセンサーによって実験動物の血液中に存在するバイオマーカーとしてのＣ反応性タンパクを測定して、食品の生体内心血関係機能性を評価しようとする時、センサー感度の増大は依然として重要であり、また簡易測定の必要性が絶え間なく提起されてきた。

大韓民国特許公開第２００３−００３８９３２号 大韓民国登録特許１０−９２１２３７号

本発明は、バイオチップの製作及び測定にバイオチップアレイやマイクロアレイスキャナのように複雑な装置の使用なしにユーザがマイクロディスペンシングピペットを使って、スライド上に一定体積の抗原を固定化して分析しようとするタンパク質と抗体及び蛍光ナノ粒子の接合体との間の免疫反応あるいは固定化された抗原と蛍光性ナノプローブ及び特定の標的分子の混合物の免疫反応を免疫蛍光スライド上の抗原コーティング部位で行った後、免疫反応によって特異的にスライドの表面に結合されたナノプローブを蛍光顕微鏡によって簡便に蛍光強度や蛍光粒子数を測定し、その結果として生体指標のような特定の標的分子の濃度が分かるようにするセンサーの感度が高い１回用の免疫センサー用のスライドを提供することである。

本発明は、前記のような課題を解決するために、分析しようとするタンパク質（抗原）をスライドに固定させ、前記抗原と特異的に結合する抗体とを蛍光性物質で標識させ、検体から採取した分析しようとするタンパク質を前記蛍光標識された抗体と混合させ、前記混合された混合物を前記スライドに固定された抗原部位と反応させ、反応されていない抗体と抗原とを蒸留水を使って洗浄させ、前記スライドをインキュベーターに位置させて乾燥した後、蛍光顕微鏡を使って蛍光強度または蛍光粒子数を測定する段階からなる。

試料を分析するために、本発明では、間接競合法（ｉｎｄｉｒｅｃｔ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒｍａｔ）を使うことを見せているが、当業者は、直接競合法（ｄｉｒｅｃｔ−ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒｍａｔ）やサンドイッチ法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ ｆｏｒｍａｔ）によって行うことができるということを容易に理解できるであろう。

本発明で使われる免疫センサー用のスライドは、ガラス、シリコン、ヒドロゲル、金属、セラミックス、多孔性メンブレンで構成されたグループから選択され、２０〜４０Ｘ７０〜８０ｍｍの横／縦の規格を有する。

本発明では、分析しようとする試料としてＣ反応性タンパク（以下、“ＣＲＰ”と称する）を使ったが、当業者は、本発明の方法をその他の食品機能性バイオマーカーである低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）、アンジオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ）、心臓トロポニン（ｃａｒｄｉａｃ ｔｒｏｐｏｎｉｎ）などの心血関係バイオマーカーと老化抑制、癌予防、肥満防止、免疫調節、胃・腸管疾患予防などと関連したバイオマーカータンパク質を使うことができるということを容易に理解できるであろう。

Ｃ反応性タンパク抗体は、ラット（ｒａｔ）、マウス（ｍｏｕｓｅ）、兎、猿、人などの哺乳動物来由のＣ反応性タンパクを使って製造した抗体のうちから選択された何れか１つであるものを使うことができる。

検体から採取される試料は、Ｃ反応性タンパクが反応緩衝溶液に溶解された標準溶液、血液、血清、血漿、唾液、体液、肝などの組職抽出物のうちから選択された何れか１つを使うことができる。

抗原が固定化されたスライドの表面の抗原と反応していない部位をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために使われる溶液としては、１〜５％のＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＲＳＡ（Ｒａｔ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＨＳＡ（Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）、ＭＳＡ（Ｍｏｕｓｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｍｕｍｉｎ）、ＧＳＡ（Ｇｏａｔ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液のうちから選択された何れか１つを使うことができる。

以下、本発明を各段階別に詳しく説明する。

本発明のスライドに抗原であるＣ反応性タンパクの固定化は、下記の２つの方法のうちの１つを選択して実施することができる。

第１に、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ、以下、“ＡＰＴＭＳ”と称する）を用いて抗原を固定化する方法である。この方法を利用するために、まず、ＡＰＴＭＳで改質されたスライドを製造する。前記改質のために、ピラニア溶液（Ｐｉｒａｎｈａ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｈ_２ＳＯ_４：Ｈ_２Ｏ_２＝２：１〜４：１、体積比率）にスライドを５〜１５分浸漬した後、取り出して蒸留水で濯いだ後、蒸留水内で３〜１０分間超音波処理し、８５〜９５℃の熱水で３０〜９０分間水和させて洗浄した後、キムワイプ上にスライドを置いて２０〜１２０分間室温乾燥する。表面洗浄を行った準備されたスライドをアセトンに５〜１５％濃度で溶解されたＡＰＴＭＳ溶液が入れられたペトリ皿に入れて室温で３０〜９０分間反応させる。アセトン、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）、蒸留水でスライドの前／後を３〜４回ずつ順次に濯いで蒸留水が入れられたビーカーで１〜６０分間浸漬させる。これを取り出してキムワイプ上で２０〜１２０分間室温乾燥した後、３０〜１５０℃の対流オーブンで３〜７時間熱処理した後、放冷して使うまでデシケーターに乾燥状態で保管する。

ＡＰＴＭＳで改質されたスライドを蒸留水に１０〜２０分間浸漬して水和させる。浸漬されたスライドを取り出してグルタルアルデヒド１〜４％溶液が入れられたペトリ皿に入れて３０〜９０分間反応させて、スライドの表面にタンパク質が結合できるように活性化させる。３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）で活性化されたスライドの前／後を３〜４回洗浄する。蒸留水が入れられたビーカーにスライドを１〜６０分間浸漬させる。これを取り出してキムワイプ上にスライドを置いて２０〜１２０分間室温乾燥する。

前記で使われるグルタルアルデヒド（Ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）は、４６〜４９ｍｌの蒸留水に３０〜７０％濃度のグルタルアルデヒド１〜４ｍｌを加えて３０〜７０ｍｌに定容して製造する。

分析しようとするタンパク質、例えば、Ｃ反応性タンパクを固定化するために、まず、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）にＣ反応性タンパクを０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解して固定化用の抗原溶液を製造する。格子状のスポッティングガイド（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ）上にグルタルアルデヒド活性化スライドを含むペトリ皿を載せ、あらかじめ製造した抗原溶液１〜１００μｌをスポッティングガイド上の滴下点に該当するスライド部位にスポッティングした後、蓋を覆いで１〜６時間反応させて抗原の固定化を行った後、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）でスライドの表／裏面を３〜４回洗浄し、蒸留水が入れられたビーカーで１分間浸漬させる。抗原の固定化を行ったグルルタルアルデイド活性化スライドの表面の抗原と反応していない部位をブロッキングするために、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）に溶解された１〜５％ＢＳＡ溶液が入れられた小さなプラスチックペトリ皿にスライドを入れ、蓋を覆いで１〜５時間反応させ、反応が終わった後、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）でＢＳＡブロッキングされたスライドの前／後を３〜４回洗浄した後、蒸留水が入れられたビーカーにスライドを１〜６０分間浸漬させる。これを取り出してキムワイプ上にスライドを置いて２０〜１２０分間室温乾燥する。

第２に、ＭＰＴＭＳ−ＧＭＢＳ（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ−Ｎ−ｇａｍｍａ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）方法で固定化する方法を使う。まず、表面洗浄のために、スライドを濃い塩酸（１８〜３６％）とメタノール（５０〜１００％）との混合溶液（ＨＣｌ：ＭｔＯＨ＝１：１〜１：２、体積比率）に１５〜４５分浸漬させた後、蒸留水でスライドの表／裏面を３〜４回濯ぐ。８５〜９５℃の蒸留水でスライドを洗浄した後、キムワイプ上に置いて室温で２０〜１２０分間乾燥する。

このように準備されたスライドをシラン化させるために、１〜３％のトルエン、ジメチルホルムアミド、及びアセトンからなる群から選択される有機溶媒溶液に溶解されたＭＰＴＭＳ溶液５０〜５００ｍｌを準備する。前記溶液が入れられたペトリ皿にスライドを入れて室温で１〜３時間反応させる。前記のＭＰＴＭＳ溶液の調剤に使われた同じ有機溶媒でスライドの表／裏面を３〜４回洗浄した後、キムワイプ上に置いて２０〜１２０分間室温乾燥する。

スライドの表面を活性化させるために、１〜３ｍＭ ＧＭＢＳ溶液を次のように製造する。ＧＭＢＳ試料１４〜４２ｍｇを１００μｌのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ；シグマアルドリッチ社、アメリカ）に溶かした後、エタノール４９．９ｍｌを加える。前記シラン化段階を経たスライドをＧＭＢＳ溶液が入れられたペトリ皿に入れて室温で３０〜９０分間反応させる。蒸留水と３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）とでスライドの表／裏面を３〜４回洗浄する。次いで、スライドをキムワイプに置いて２０〜１２０分間室温乾燥する。

ＣＲＰ抗原の固定化は、次のように実施する。まず、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）にＣ反応性タンパクを０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解して固定化抗原溶液を製造する。前記のスポッティングガイド上にＧＭＢＳ活性化スライドを含むペトリ皿を載せ、あらかじめ製造した抗原溶液１〜１００μｌをスポッティングガイド上の滴下点に該当するスライド部位にスポッティングした後、蓋を覆いで１〜６時間反応させて抗原の固定化を行った後、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）でスライドの表／裏面を３〜４回濯いで蒸留水が入れられたビーカーにスライドを１〜６０分間浸漬させる。分析の正確度を高めるために、１〜５％ＢＳＡ溶液が入れられた小さなプラスチックペトリ皿にスライドを入れて蓋を覆いで１〜５時間反応させる。前記のようなリン酸バッファ溶液を使ってスライドの表／裏面を３〜４回洗浄する。蒸留水が入れられたビーカーに１〜６０分間浸漬させた後、キムワイプ上にスライドを位置させて２０〜１２０分間室温乾燥する。

前記２つの方法を概略的に表わしたものを図１として表わした。

本発明の免疫センサー用のスライドを用いて特定のタンパク質を分析するに当たっては、スライドに固定される抗原と特異的に結合する抗体とを標識させる。前記抗体を標識させることは、敏感性と再現性とが高い蛍光染色法を使い、そのために、本発明では、蛍光シリカナノ粒子（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｓｉｌｉｃａ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ、以下、“ＦＳＮＰ”と称する）を使う。

蛍光シリカナノ粒子（ＦＳＮＰ）を製造する方法について概略的に記述する。抗原と特異的に結合する抗体との標識に使われるＦＳＮＰは、有機蛍光色素をシリカ構造内に含ませる包括法（Ｄｙｅ ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）、活性化有機蛍光色素をアミノシラン（Ａｍｉｎｏ ｓｉｌａｎｅ）化合物と共有結合させた後、これをシリカ構造内に含ませるコアシェル法（Ｃｏｒｅ ｓｈｅｌｌ ｍｅｔｈｏｄ）、有機蛍光色素をシリカ構造内に含ませて形成された粒子を有機シラン（Ｏｒｇａｎｏｓｉｌａｎｅ）化合物と反応させて、官能基を導入して機能化する逆コアシェル法（Ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｃｏｒｅ ｓｈｅｌｌ ｍｅｔｈｏｄ）などによって製造されたものを使うことができる。この際、有機蛍光色素としては、ジクロロトリス（１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（ＩＩ）一水化物（Ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｓ（１，１０−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ（ＩＩ）・ｈｙｄｒａｔｅ）、フルオレセイン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ローダミンＢ（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｂ）、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン（５（６）−Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ）などを使い、活性化有機蛍光色素としては、フルオレセインイソチオシアネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン Ｎ−スクシンイミジルエステル（５（６）−Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）、テトラメチルローダミン５−イソチオシアネート（Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ ５−ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、ビス（２，２’−ビピリジン）−４’−メチル−４−カルボキシビピリジン−ルテニウム Ｎ−スクシンイミジルエステルヘキサフルオロホスフェート（Ｂｉｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）−４’−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｃａｒｂｏｘｙｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ−ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ−ｂｉｓ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ））、ビス（２，２’−ビピリジン）−４，４’−ジカルボキシビピリジン−ルテニウム ジ（Ｎ−スクシンイミジルエステル）ビス（ヘキサフルオロホスフェート）（Ｂｉｓ（２，２’−ｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ）−４，４’−ｄｉｃａｒｂｏｘｙｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅ ｒｕｔｈｅｎｉｕｍ ｄｉ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ）ｂｉｓ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ））などを使い、アミノシラン化合物としては、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（３−Ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）などを使い、有機シラン化合物としては、カルボン酸エチル（Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、アミン（Ａｍｉｎｅ）、アミン／ホスホン酸（Ａｍｉｎｅ／ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）、ポリ（エチレングリコール）（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ））、オクタデシル（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌ）、カルボン酸エチル／オクタデシル（Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ／ｏｃｔａｄｅｃｙｌ）官能基を有した化合物を使うことができる。

ＦＳＮＰを使って抗体を標識させる方法を説明する。まず、ＦＳＮＰをビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）と特異的に結合するストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、以下、“ＳＡ”と称する）で改質することが必要であるが、これは、以下で説明するＳＡが付着されたＦＳＮＰをビオチニル化された抗体と結合させるためである。ＦＳＮＰをＳＡで改質するために、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン（（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ ｓｉｌａｎｅ、以下、“ＭＰＴＭＳ”と称する）と反応させて、チオール−改質されたＦＳＮＰを先に製造する。１０〜７０ｍｌ容量のキャップチューブに前記のＦＳＮＰ１〜５ｍｇとエタノール、メタノール、プロパノールなどのアルコール５〜１５ｍｌを加えてよく振った後、ＦＳＮＰをアルコールに完全に溶解させるために、１０〜３０分間超音波処理する。次いで、キャップチューブにＭＰＴＭＳ３０〜７０〜２００μｌを添加し、室温で３０〜２００ｒｐｍの低速で撹拌しながら、２〜６時間反応させる。反応混合物を３〜１０℃で２０〜４０分間７０００〜１７０００ｒｐｍで遠心分離して得た沈殿物を反応に使われた同じアルコールを使って１〜５回洗浄し、それぞれの洗浄後、同じ条件で遠心分離して沈殿物を得る。チューブのキャップを分離してアルミニウムホイルを軽く覆って室温乾燥する。沈殿物を３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）２〜６ｍｌに再溶解してチオール−改質されたＦＳＮＰ溶液を製造する。

チオール−改質されたＦＳＮＰにマレイミド活性化された（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＳＡを付け加えて、ＳＡが付着されたＦＳＮＰを製造する。より具体的に、１０〜７０ｍｌ容量のキャップチューブにＳＡ−マレイミド０．１〜０．５ｍｇと３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）３〜７ｍｌとを加えて溶解させてＳＡ−マレイミド溶液を製造する。ここに、前記で製造したチオール−改質されたＦＳＮＰ溶液０．５〜２．０ｍｌを加えて３０〜２００ｒｐｍの低速でかき混ぜ続けながら、室温で１〜３時間反応させる。３〜１０℃で２０〜４０分間７０００〜１７０００ｒｐｍで遠心分離して沈殿物を取る。前記段階で取った沈殿物を３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）で１〜５回洗浄し、それぞれの洗浄後、同じ条件で遠心分離して沈殿物を得る。前記段階で洗浄された沈殿物を３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）１〜５ｍｌに再懸濁させる。これをキャップチューブに入れてアルミニウムホイルを取り囲んだ後、冷蔵保管して、以下で説明するビオチニル化された抗体と反応させる。

Ｃ反応性タンパク抗体のビオチニル化は、次の２つの方法のうちの何れか１つを用いて実施することができる。

第１の方法として、Ｃ反応性タンパク抗体に炭酸緩衝溶液（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を加えてＣ反応性タンパク抗体を含む炭酸緩衝溶液を得る段階、有機溶媒であるジメチルホルムアミド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｆｏｒｍａｍｉｄｅ）に溶解したビオチン化試薬であるビオチンアミドヘキサン酸 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏｈｅｘａｎｏｉｃ ａｃｉｄ Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）溶液を前記段階の炭酸緩衝溶液と反応させる段階、前記段階で得た溶液を塩化ナトリウム溶液に透析して未反応ビオチン化試薬を除去する段階からなる方法が挙げられる。

より具体的に、Ｃ反応性タンパク抗体に炭酸緩衝溶液を加えてＣ反応性タンパク抗体の濃度が１．０〜３．０ｍｇ／ｍｌである炭酸緩衝溶液を得る段階、ジメチルホルムアミドに１〜５ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解したＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液３０〜１００μｌを前記段階の炭酸緩衝溶液２５〜７５μｌと１ないし５時間氷水下で反応させる段階、前記段階で得た溶液７５〜１７５μｌを０．１〜０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液で一晩透析して未反応ビオチン化試薬を除去する段階からなる。

第２の方法として、Ｃ反応性タンパク抗体にリン酸緩衝食塩水を加えてＣ反応性タンパク抗体を含むリン酸緩衝食塩水を得る段階、再蒸留水に溶解した水溶性のビオチン化試薬であるスルホスクシンイミジル−６−（ビオチナミド）ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）溶液を前記段階のリン酸緩衝食塩水と反応させる段階、前記段階で得た溶液をリン酸緩衝食塩水に透析して未反応ビオチン化試薬を除去する段階からなる方法が挙げられる。

より具体的に、Ｃ反応性タンパク抗体にリン酸緩衝食塩水を加えてＣ反応性タンパク抗体の濃度が０．５〜３．０ｍｇ／ｍｌであるリン酸緩衝食塩水を得る段階、再蒸留水に２〜２０ｍＭ濃度で溶解したスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液５〜２０μｌを前記段階のリン酸緩衝食塩水３０〜８００μｌと氷水下で１ないし５時間反応させる段階、前記段階で得た溶液５５〜８２０μｌを０．０５〜０．２５Ｍリン酸緩衝食塩水に対して一晩透析して未反応ビオチン化試薬を除去する段階からなる。

次の段階として、ナノ物質が付着された抗体を製造する。前記で製造したＳＡ改質されたＦＳＮＰとビオチン化された抗体とを加えて混合すれば、ビオチンがＳＡと特異的に結合するために、蛍光物質で標識された抗体が製造される。

より具体的に、前記で製造したＳＡ−改質されたＦＳＮＰ溶液を１０〜３０分間超音波処理した後、そのうち、２００〜６００μｌを前記で製造した０．０５〜０．２５ｍｇ／ｍｌ濃度のビオチン化された抗体溶液１〜３ｍｌに加えて３０分間隔で３０〜２００ｒｐｍの低速で２〜７分ずつかき混ぜながら、室温で１〜３時間反応させる。３〜１０℃で２０〜４０分間７０００〜１７０００ｒｐｍで遠心分離して、上澄み液は捨てて沈殿物を取る。前記段階で取った沈殿物を３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）で１〜５回洗浄し、それぞれの洗浄後、前記と同じ条件で遠心分離して沈殿物を得る。前記段階で洗浄された沈殿物を３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）０．４〜１．２ｍｌに再懸濁させる。

本発明のＣＲＰと特異的に結合する抗体とを蛍光性物質で標識する概略的な方法を図２として表わした。

本発明の免疫センサー用のスライドを用いて特定のタンパク質を分析するに当って、検体から採取した分析しようとするタンパク質を前記のように標識された抗体と混合させる。

より具体的に、エペンドルプチューブにある３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）を使って、段階別に希釈して製造したそれぞれの濃度別Ｃ反応性タンパク試料溶液にビオチンとＳＡの特異的結合によって、前記のように製造したナノ物質としてＦＳＮＰが付着されたＣ反応性タンパク抗体溶液を同量加えて混合させた後、室温で５〜３００分間静置させる。

次の段階で、前記のように混合された混合物をスライドに固定された抗原部位と反応させる。

より具体的に、前記のグルタルアルデヒド工程やＭＰＴＭＳ−ＧＭＢＳ工程によって、抗原であるＣ反応性タンパクを固定化し、ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）ブロッキング工程によって、非選択的なタンパク質の吸着を最小化したバイオトランスデューサー（ｂｉｏ−ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）としてのスライドを含むペトリ皿を格子状のスポッティングガイド上に載せ、スライド上の抗原が固定化されている部位に前記のように混合して、室温で５〜３００分間静置させた検体から採取した分析しようとするタンパク質と前記のように標識された抗体の混合物１〜１００μｌを正確にスポッティングした後、蓋を覆いで室温で０．５〜１６時間反応させてＦＳＮＰで標識された抗体及びスライド上に固定された抗原と検体から採取した分析しようとするタンパク質との間の間接競合反応を行う。反応が終わった後、反応されていない抗体と抗原とを蒸留水を使ってスライドの前／後を３〜４回洗浄した後、蒸留水が入れられたビーカーにスライドを１〜６０分間浸漬させて除去する。

本発明のスライドに固定化された抗原と蛍光標識された抗体とが間接競合方式によって結合する方式を説明する形状を図３に表わし、検体から採取したＣ反応性タンパクの代わりに、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）を前記のように標識された抗体と混合した後、スライド上の抗原が固定化されている部位に滴下して経時的な抗原・抗体反応を行った時、スライドに結合された蛍光粒子数の変化を図４に表わした。

前記スライドをインキュベーターに入れて２０〜１２０分間乾燥する。

蛍光顕微鏡を使って蛍光強度及び蛍光粒子数を測定する。検体中のＣＲＰ濃度が高ければ、蛍光標識された抗体と反応を多くするために、スライドに固定化された抗原と蛍光標識された抗体とが結合する数が少なくて蛍光強度と蛍光粒子数とが減るために、蛍光が低く表われる。このようにスライドに固定された抗原と検体中の抗原は、蛍光標識された抗体と競争的な相互作用を通じて蛍光度が異ならせて表われるために、ＣＲＰを短時間内に簡単に測定させうる。

本発明によって冠状動脈疾患、高血圧及び炎症に対する主なバイオマーカーの１つとして知られているＣ反応性タンパクをスライドにコーティングし、蛍光性ナノプローブと結合されている抗体を反応させることによって、ナノモルレベルで測定することができて、特定の生体内食品機能性の指標である当該バイオマーカーを高感度で簡便に測定しうる免疫センサー用のスライドが提供される。

本発明は、Ｃ反応性タンパクの以外に、今後の低密度リポタンパク質（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＬＤＬ）、フィブリノーゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）、アンジオテンシンＩＩ（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ ＩＩ）などの実験動物の血液などに多様な濃度範囲で存在するバイオマーカーに対する超高感度高速同時測定に必要な食品の機能性評価と関連した基盤技術を確立することができる。

Ｃ反応性タンパクを抗原に固定させる２つの方法を示す概路図である。 ＣＲＰと特異的に結合する抗体とを蛍光性物質で標識する方法を示す概路図である。 本発明のスライドに固定化された抗原と蛍光標識された抗体とが間接競合方式によって結合する方式を説明する図である。 検体から採取したＣ反応性タンパクの代わりに、３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）を本発明による標識された抗体と混合した後、スライド上の抗原が固定化されている部位に滴下して経時的な抗原・抗体反応を行った時、スライドに結合された蛍光粒子数の変化を示すグラフである。 ａ、ｂ、ｃは、ピラニア溶液処理前のスライドの表面に存在する不純物などの汚染物質の阻害斑点がピラニア処理を通じて除去されるということを示す図であって、ＡＰＴＭＳによるシラン化を経た後にも、蛍光映像上の阻害斑点が観察されないということを示す図である。ｄは、グルタルアルデヒド２．５％溶液で処理した基板を処理して蛍光映像写真を撮って阻害斑点が発見されないということを示す図である。ｅは、抗原固定化の後、ＢＳＡブロッキングスライドの表面で阻害斑点は発見されないということを示す図である。ｆは、本発明の方法によって間接競合反応を行ったスライドの表面に結合した蛍光シリカナノ粒子標識抗体の蛍光斑点を示す図である。 蛍光分析のための装置を示す図である。 抗原固定化免疫蛍光スライド及びＦＳＮＰ標識抗体基盤Ｃ反応性タンパクの検量線を示すグラフである。

以下、本発明の具体的な方法を実施例を挙げて説明する。しかし、本発明の権利範囲は、これら実施例にのみ限定されるものではない。

本実験で使われる材料は、次の通りである：

マウス骨髄腫細胞株（ＮＳＯ）から発現された組替えヒスチジンタグされたラットＣＲＰ（純粋な状態）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．（ミネアポリス、ＭＮ、アメリカ合衆国）で入手して、本実験の全過程で使った。そのホモペンタメリック（ｈｏｍｏｐｅｎｔａｍｅｒｉｃ）構造は、３つの非共有及び２つの共有結合されたサブユニットからなる。マウス骨髄腫と精製されたＮＳＯ−来由から得られた組替えラットＣＲＰで兔疫されたマウスから得たＢセルを融合したものから出たハイブリドーマから生成された単一クローン抗−ラットＣＲＰ抗体も、前記Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．から入手した。ガラススライドは、Ｃｏｒｉｎｇ Ｉｎｃ．（Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、ＭＥ、アメリカ合衆国）から入手した。水溶性のビオチン化試薬（スルホスクシンイミジル−６−（ビオチナミド）ヘキサノエート（スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）は、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、アメリカ合衆国）から購入した。３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）、グルタルアルデヒド及び牛血清アルブミン（ＢＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ合衆国）から入手した。あらゆる他の化合物は、多様な供給者から保証されたものであり、実験の全過程で二重蒸留水を使った。

実施例１：ＡＰＴＭＳ−ＧＡ処理スライド上での抗原固定化
抗原をスライドに固定することは、次のような過程を経て準備した。すなわち、表面クリーニングのために、スライドをピラニア溶液（Ｈ_２ＳＯ_４：Ｈ_２Ｏ_２＝３：１、体積比率）に１０分間浸漬した後、蒸留水で濯いだ後、蒸留水内で５分間超音波処理して９０℃の熱水で１時間水和させて洗浄した後、キムワイプ上にスライドを置いて３０分間室温乾燥した。

抗原の固定化に必要な反応基であるアミノ基（−ＮＨ_２）をスライドの表面に導入するためのシラン化を行うために、表面洗浄を行った準備されたスライドをアセトンに１０％濃度で溶解されたＡＰＴＭＳ溶液が入れられたペトリ皿に入れて室温で１時間反応させた。アセトン、５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）、蒸留水でスライドの前／後を３回ずつ順次に洗浄し、蒸留水が入れられたビーカーで１分間浸漬させた。これを取り出してキムワイプ上で３０分間室温乾燥した後、１２０℃の対流オーブンで５時間熱処理した後、放冷して蛍光映像写真を撮った（図５のａ、ｂ、ｃ）。図５のａ、ｂ、ｃで見られるように、ピラニア処理前のスライドの表面に存在する不純物などの汚染物質の阻害斑点がピラニア処理を通じて除去されるということが分かり、ＡＰＴＭＳによるシラン化を経た後にも、蛍光映像上の阻害斑点が観察されないということが分かった。

ＡＰＴＭＳで改質されたスライドを活性化させるために、蒸留水に１５分間浸漬して水和させた。浸漬されたスライドを取り出してグルタルアルデヒド２．５％溶液が入れられたペトリ皿に入れて１時間反応させて、スライドの表面にタンパク質が結合できるように活性化させた。５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）で活性化されたスライドの前／後を３回洗浄した後、蒸留水が入れられたビーカーにスライドを１分間浸漬させた。これを取り出してキムワイプ上にスライドを置いて３０分間室温乾燥し、蛍光映像写真を撮って確認した結果、ＧＡ活性化スライドの表面でも、阻害斑点は発見されなかった（図５のｄ）。

抗原（ＣＲＰ、Ｃ反応性タンパク）をスライド上に固定させるために、まず、５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）にＣ反応性タンパクを０．１ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解して固定化用の抗原溶液を製造した。格子状のスポッティングガイド（Ｓｐｏｔｔｉｎｇ ｇｕｉｄｅ）上にグルタルアルデヒド活性化スライドを含むペトリ皿を載せ、あらかじめ製造した抗原溶液２０μｌをスポッティングガイド上の滴下点に該当するスライド部位にスポッティング（滴下、ｓｐｏｔｔｉｎｇ）した後、蓋を覆いで１時間反応させて抗原の固定化を行った後、５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）でスライドの表／裏面を３回洗浄し、蒸留水が入れられたビーカーで１分間浸漬させた。抗原の固定化を行ったグルタルアルデヒド活性化スライドの表面の抗原と反応していない部位をブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）するために、５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）に溶解された１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ）溶液が入れられた小さなプラスチックペトリ皿にスライドを入れて蓋を覆いで１時間反応させた。このスライドを５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）で前／後を３回洗浄し、蒸留水が入れられたビーカーに１分間浸漬させ、キムワイプ上に位置させた後、３０分間室温乾燥し、蛍光映像写真を撮って確認した結果、抗原固定化の後、ＢＳＡブロッキングスライドの表面でも、阻害斑点は発見されなかった（図５のｅ）。

実施例２：ＭＴＳ−ＧＭＢＳ処理スライド上での抗原固定化
抗原をスライドに固定することは、次のような過程を経て準備した。すなわち、表面クリーニングのために、スライドを濃い塩酸（３５％）とメタノール（７０％）とが１：１の体積比率で混合された溶液に３０分間浸漬した後、蒸留水でスライドを３回洗浄した。濃い硫酸に３０分浸漬した後、蒸留水でスライドの表／裏面を３回洗浄し、沸く蒸留水でスライドを洗浄した後、キムワイプ上に置いて室温で３０分間乾燥した。

抗原の固定化に必要な反応基であるチオール基（−ＳＨ）をスライドの表面に導入するためのシラン化を行うために、トルエン９８ｍｌにＭＰＴＭＳ（（３−Ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｙｌ）ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙ ｓｉｌａｎｅ）２ｍｌを添加して、２％ＭＰＴＭＳ溶液を製造した。前記の溶液が入れられたペトリ皿にスライドを入れて室温で２時間反応させた。次いで、トルエンでスライドを３回洗浄した後、キムワイプにスライドを位置させて３０分間室温で乾燥した。

ＭＰＴＭＳで改質されたスライドを活性化させるために、２８ｍｇのＧＭＢＳを１００μｌのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ、ｃｈｒｏｍｏｓｌｌｖｒ^(R)Ｐｌｕｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、アメリカ合衆国、ＨＰＬＣ≧９９．９％）に溶解した後、ここにエタノール４９．９ｍｌを加えて２ｍＭ ＧＭＢＳ溶液を製造した。シラン化されたスライドを２ｍＭ ＧＭＢＳ溶液が入れられたペトリ皿に入れて室温で１時間反応させた。蒸留水と５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）とでスライドの前／後を３回洗浄し、キムワイプで３０分間室温乾燥した。

抗原（ＣＲＰ、Ｃ反応性タンパク）をスライド上に固定させるために、まず、５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）にＣ反応性タンパクを０．１ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解して固定化用の抗原溶液を製造した。前記のスポッティングガイド上にＧＭＢＳ活性化スライドを含むペトリ皿を載せ、あらかじめ製造した抗原溶液２０μｌをスポッティングガイド上の滴下点に該当するスライド部位に滴下した後、蓋を覆いで１時間反応させて抗原の固定化を行った。このスライドを５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）でスライドの表／裏面を３回洗浄し、蒸留水が入れられたビーカーで１分間浸漬させた。抗原の固定化を行ったＧＭＢＳ活性化スライドの表面の抗原と反応していない部位をブロッキングするために、５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）に溶解された１％ＢＳＡ溶液が入れられた小さなプラスチックペトリ皿にスライドを入れて蓋を覆いで１時間反応させた。このスライドを５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）で前／後を３回洗浄し、蒸留水が入れられたビーカーに１分間浸漬させ、キムワイプ上に位置させた後、３０分間室温乾燥させた。

ＭＴＳ−ＧＭＢＳ処理スライド上での抗原固定化過程の各段階である表面クリーニング、シラン化、活性化、抗原固定化及びＢＳＡブロッキングを行ったスライドに対して蛍光映像写真を撮って確認した結果、濃い塩酸とメタノール混合溶液（１：１、体積比率）処理前のスライドの場合を除いては、スライドの表面でセンサー計測を阻害する阻害斑点は発見されなかった。

実施例３：ＳＡで改質されたＦＳＮＰの製造
２５ｍｌ容量のキャップチューブに前記のＦＳＮＰ２ｍｇとエタノール１０ｍｌとを加えてよく振った後、ＦＳＮＰをエタノールに完全に溶解させるために、１５分間超音波処理した。次いで、キャップチューブにＭＰＴＭＳ１００μｌを添加して室温で１００ｒｐｍで低速撹拌しながら、４時間反応させた。反応混合物を４℃で３０分間１３０００ｒｐｍで遠心分離して得た沈殿物をエタノールで３回洗浄し、それぞれの洗浄後、同じ条件で遠心分離して沈殿物を得た。チューブのキャップを分離してアルミニウムホイルを軽く覆って室温乾燥させた。沈殿物を５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）４ｍｌに再溶解して、チオール−改質されたＦＳＮＰ溶液を製造した。

２５ｍｌ容量のキャップチューブにＳＡ−マレイミド０．２５ｍｇと５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）５ｍｌとを加えて溶解させてＳＡ−マレイミド溶液を製造した。ここに、前記のチオール−改質されたＦＳＮＰ溶液１ｍｌを加えて１００ｒｐｍの低速でかき混ぜ続けながら、室温で２時間反応させた。４℃で２０分間１００００ｒｐｍで遠心分離して沈殿物を取った。前記段階で取った沈殿物を５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、それぞれの洗浄後、前記と同じ条件で遠心分離して沈殿物を得た。前記段階で洗浄された沈殿物を５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）２ｍｌに再懸濁させた。これをキャップチューブに入れてアルミニウムホイルを取り囲んだ後、冷蔵保管して、以下で説明するビオチニル化された抗体と反応させた。

実施例４：抗体のビオチニル化
冷蔵保管する水溶性のビオチン化試薬であるスルホスクシンイミジル−６−（ビオチナミド）ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−６−（ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン）１ｍｇバイアル（ｖｉａｌ）を実験の当日に冷蔵庫から取り出して室温条件で移し、単一クローン抗−ラットＣＲＰ抗体３０〜７００μｇバイアルに０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）３０〜７００μｌを加えて溶解させた。前記のスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン１ｍｇバイアルに蒸留水１８０μｌを加えて１０ｍＭスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン溶液を製造した後、そのうち、６．６７μｌを前記の抗体溶液に加えてビオチンと抗体との分子比率を２０：１に調整した。反応混合物が入れられたバイアルを軽く振って混ぜた後、エペンドルプチューブラックに入れて氷水に入れて２時間反応させた。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ｌｙｚｅｒ ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ）に反応混合物を入れた後、０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．２）に対して一晩透析して未反応試薬を除去し、透析膜内の内容物を回収した後、同じリン酸緩衝食塩水を使って総体積を１ｍｌに調節してビオチニル化抗体を製造した。

実施例５：ナノ物質が付着された抗体の製造
ＳＡ−改質されたＦＳＮＰ溶液を１５分間超音波処理した後、そのうち、４００μｌを０．１ｍｇ／ｍｌ濃度のビオチン化された抗体溶液２ｍｌに加えて３０分間隔で１００ｒｐｍの低速で５分ずつかき混ぜながら、室温で２時間反応させた。４℃で２０分間１００００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液は捨てて沈殿物を取った。前記段階で取った沈殿物を５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）で３回洗浄し、それぞれの洗浄後、前記と同じ条件で遠心分離して沈殿物を得た。前記段階で洗浄された沈殿物を５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）０．８ｍｌに再懸濁させた。

実施例６：検体溶液と標識抗体との混合
エペンドルプチューブにある５０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ７．４）を使って段階別に希釈して製造したそれぞれの濃度別Ｃ反応性タンパク試料溶液にビオチンとＳＡの特異的結合によって、前記のように製造したナノ物質としてＦＳＮＰが付着されたＣ反応性タンパク抗体溶液を同量加えて混合させた後、室温で１時間静置させた。

実施例７：間接競合反応
前記の実施例１と実施例２とによって抗原であるＣ反応性タンパクを固定化し、ＢＳＡブロッキング工程によって非選択的なタンパク質の吸着を最小化したバイオトランスデューサーとしてのスライドを含むペトリ皿を格子状のスポッティングガイド上に載せ、スライド上の抗原が固定化されている部位に、前記のように混合して室温で１時間静置させた検体から採取した分析しようとするタンパク質と前記のように標識された抗体の混合物２０μｌを正確に滴下した後、蓋を覆いで室温で２時間反応させてＦＳＮＰで標識された抗体及びスライド上に固定された抗原と検体から採取した分析しようとするタンパク質との間の間接競合反応を行った。反応が終わった後、反応されていない抗体と抗原とを蒸留水を使ってスライドの前／後を３回洗浄した後、蒸留水が入れられたビーカーにスライドを１分間浸漬させて除去した。

実施例８：蛍光映像の分析
間接競合反応を行った実施例７のスライドをインキュベーターに入れて乾燥した。乾燥したスライドを蛍光顕微鏡を使って蛍光映像の分析を行い、蛍光強度及び蛍光粒子数を測定した。図６は、蛍光分析のための装置を示し、蛍光映像写真を撮って確認した結果、間接競合反応を行ったスライドの表面に結合したＦＳＮＰ標識抗体の蛍光斑点を確認することができた（図５のｆ）。図７は、ＦＳＮＰ標識抗体を利用したＣ反応性タンパクの濃度依存的蛍光映像から相対蛍光度を測定して作成した検量線を示すが、検体中のＣＲＰ濃度が増加すれば、標識抗体との反応程度が高くなるので、スライドに固定化された抗原と標識抗体との結合程度は減って蛍光が低く表われ、非常に低いＣ反応性タンパクの濃度範囲で直線性を見せて、本免疫蛍光スライドによるＣＲＰ計測時の検出限界が０．１〜１．０ｎｇ／ｍｌに至る程度に感度が非常に高いということが分かった。

実施例９：免疫蛍光スライドの製造
実施例１ないし実施例８の方法を適用して、３０Ｘ７０ｍｍの横／縦の規格を有した透明な顕微鏡用のスライドを使って１回用の３−アミノプロピルトリメトキシシランまたは３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン−Ｎ−ガンママレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステルでスライドの表面が改質され、０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度であるＣ反応性タンパクを１〜１００μｌ含む免疫蛍光スライドを製造した。
（産業上の利用可能性）

本発明は、抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法及びそれにより製造される免疫蛍光スライドに関連する分野に適用可能である。

Claims (3)

1. Ｃ反応性タンパク質をスライドに固定させてタンパク質チップを製造する段階、前記Ｃ反応性タンパク質に特異的に結合する抗体を蛍光ナノ粒子で標識させる段階、及び検体から採取した前記Ｃ反応性タンパク質を前記蛍光標識された抗体と混合させ、前記混合された混合物を前記スライドに固定された抗原部位と反応させ、蛍光顕微鏡を使って蛍光強度または蛍光粒子数を測定して分析する段階において、
   前記Ｃ反応性タンパク質をスライドに固定化するために、
   ３−アミノプロピルトリメトキシシランで改質されたスライドを製造する段階と、
   ３−アミノプロピルトリメトキシシランで改質されたスライドを水和する段階と、
   グルタルアルデヒド溶液を使って、前記改質されたスライドを活性化させる段階と、
   ３０〜７０ｍＭリン酸バッファ溶液（ｐＨ６．５〜７．８）に前記分析しようとするタンパク質を０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解して固定化用の抗原溶液を製造する段階と、
   スポッティングガイド上に前記スライドを含むペトリ皿を載せ、前記製造した抗原溶液を１〜１００μｌの滴下点にスポッティングする段階と、
   前記段階によって準備されたスライドを１〜６時間反応させて抗原を固定化することを特徴とする抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法。
2. 請求項１の方法によって製造される３−アミノプロピルトリメトキシシランまたは３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン−Ｎ−ガンママレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステルでスライドの表面が改質され、０．０１〜０．５ｍｇ／ｍｌの濃度であるＣ反応性タンパクを１〜１００μｌ含む免疫蛍光スライド。
3. 請求項２による免疫蛍光スライドを使って検体中のＣ反応性タンパク質を測定する方法。

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