HU220777B1 - Több anyag szimultán elemzésére szolgáló eszközök és berendezések - Google Patents

Több anyag szimultán elemzésére szolgáló eszközök és berendezések Download PDF

Info

Publication number
HU220777B1
HU220777B1 HU9800920A HUP9800920A HU220777B1 HU 220777 B1 HU220777 B1 HU 220777B1 HU 9800920 A HU9800920 A HU 9800920A HU P9800920 A HUP9800920 A HU P9800920A HU 220777 B1 HU220777 B1 HU 220777B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
ligands
reaction
analyte
carrier
biological
Prior art date
Application number
HU9800920A
Other languages
English (en)
Inventor
El Ouard Benchikh
Stephen Peter Fitzgerald
John Victor Lamont
Robert Ivan Mcconnell
Original Assignee
Randox Laboratories Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Randox Laboratories Ltd. filed Critical Randox Laboratories Ltd.
Publication of HU9800920D0 publication Critical patent/HU9800920D0/hu
Publication of HUP9800920A1 publication Critical patent/HUP9800920A1/hu
Publication of HU220777B1 publication Critical patent/HU220777B1/hu

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S977/00—Nanotechnology
    • Y10S977/902—Specified use of nanostructure
    • Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
    • Y10S977/924—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis using nanostructure as support of dna analysis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

A találmány tárgya több anyag szimultán elemzésére szolgáló eszközökre és berendezésekre vonatkozik.
Hagyományosan, a strukturálisan különböző anyagok elemzésére specifikus eljárásokat használnak, mint például a HPLC, a gázkromatográfia, enzimatikus és a kolorimetriás módszerek. Ezekre a módszerekre jellemző, hogy elsődlegesen egyszerre csak egy anyagot elemeznek, egy vizsgálati eljárással.
Az analitikai módszerek automatizálása általában az adagelemzéses és random hozzáférésű analizátorokra korlátozódik, amelyekben az egyedi tesztminták többszöri analízisét egymás után elvégzett egyedi vizsgálati módszerekkel végzik. Ez szükségessé teszi egyedi tesztkészletek többféle csomagját. Ráadásul az elemzésekhez különböző típusú felszerelések szükségesek, mint például klinikai kémiai analizátorok, HPLC, GCMS, automatikus immunmérési műszerek vagy atomabszorpciós berendezések.
Egy szimultán elemzésre szolgáló rendszernek (a multi-analyte rendszernek) tartalmaznia kell egy eszközt, mely biztosítja egyetlen minta több komponensének analízisét. Ezzel az analízissel olyan eredményeket kaphatunk, amelyek azonosítják az egyedi anyagokat és lehetővé teszik az egyes anyagok mennyiségi meghatározását a több összetevőt tartalmazó tesztmintában. A multi-analyte analízis módszerére gyakran jogot formálnak, de ezek a módszerek általánosságban az összes kritériumnak nem felelnek meg.
Egy multi-analyte rendszerben egy tipikus hordozó tartalmazza az egyedi tesztreakcióhelyek sokaságát, melyek mindegyikéhez egy megfelelő kötőligand társul. A tesztminta kapcsolódik mindegyik reakciózónához, és ezután a kimutatási technikák sorozata valósul meg az anyagok azonosítása érdekében. Fontos szempont, hogy a felhasznált kimutatási módszer lehetővé tegye mindegyik egyedi anyag mennyiségi meghatározását.
Egy hordozón a multi-analyte elrendezés kialakításához, azaz a biológiailag aktív ligandok térbeli elkülönülésének megteremtéséhez, a legáltalánosabb megközelítési mód a fotolitográfiás technikákon alapul. Ekkor a hordozó fedve van fotolabilis összekötővel. Elméletileg ez az összekötő csak a kötőliganddal szemben reaktív, miután alkalmas hullámhosszúságú fénnyel besugároztuk. A térbeli felbontást úgy érjük el, hogy egy fizikai maszkot (általában krómból készítik) helyezünk a hordozóra. A maszkon lévő lyukak mintázata meghatározza a hordozó kötőrégióinak mintázatát.
A biológiai ligandok immobilizálásához a következő lépéseket tartalmazó általános séma használatos: az első helyek besugárzása, a besugárzott hordozó inkubálása az első rögzítésre váró liganddal, mosás a gyengén kötődött ligandok eltávolítására, a besugárzási lépéssel aktivált nem reagáló helyek blokkolása és azon régiók besugárzása, melyekhez várható a második biológiai ligand bekötődése, az ezután következő lépések megegyeznek az első ligandra leírtakkal. A térbeli felbontást a besugárzási helyzet szabályozásával érhetjük el, akár a besugárzási helyre irányított szabályozott koherens UV fénnyel, melyet egy lézer bocsát ki, akár több fizikai maszk segítségével, ha inkoherens fényforrást alkalmazunk. A biológiai ligandok sokaságának immobilizálása ezzel a módszerrel igen időigényes. A fotolitografikus módszer másik hátránya az, hogy vagy drága fizikai maszkra van szükség vagy egy lézer fényforrásra. Továbbá számolni kell nagymértékű nem specifikus kötődéssel is.
Például az aril-azidok használatakor a fluoro-arilazid és a benzofenonok nagyfokú nem specifikus kötődést mutatnak. A magas nem specifikus kötődés eredményeként a háttér nagy a vizsgálati eljárásban, mely jelentősen csökkenti a multi-analyte vizsgálati módszer dinamikai tartományát. A nem specifikus kötődés főleg a molekulák passzív adszorpciójával magyarázható, mely a nem aktivált fotolabilis kötőfelszínen ionkölcsönhatások, Van dér Waals erők stb. alapján valósul meg.
A WO-A-9516204 szabadalomban leírnak egy fotolitográfiás megközelítési formát a magas nem specifikus kötődéssel társuló problémák csökkentésére. Ebben a megközelítési formában a felülethez kapcsolódó molekula avidin volt, és fotolabilis molekulaként fotobiotint vagy annak származékát használták. Bár igényt támasztottak a csökkent nem specifikus kötődésre, mégis ez a technika a fentiekben vázolt időigényes lépéseket tartalmazza. 20 különböző biológiai ligand immobilizálásához összesen 80 lépésre lenne szükség, elfogadva a besugárzási, kötési, blokkolási és mosási lépések alapvető szükségességét minden egyes immobilizálandó ligand esetén.
A térbeli felbontás elérhető passzív adszorbcióval is. Például az US—A-5432099 számú szabadalom közzéteszi a ligand kötődését a hordozó felszínéhez ionos kölcsönhatások, hidrofób hatások és Van dér Waals erők kombinációjaként. A passzív adszorpciós folyamatok függnek a pH-, a hőmérséklet-, az ionerősség-változásoktól és a felhasznált hordozó típusától, melyek a kötési folyamatot nehezen szabályozhatóvá tehetik. Ezzel a megközelítési formával a legnagyobb gond a vizsgálatokban és a vizsgálatok között eredményül kapott szegényes pontosság, mely a deszorbálódó gyengén immobilizált ligand érzékenységére vezethető vissza a biológiai vizsgálati módszer mosási vagy inkubálási lépéseinek végrehajtása alatt.
A glutáraldehidet több publikációban használták keresztkötő ágensként. Ez a keresztkötő szer számos hátránnyal rendelkezik, beleértve a fehérjék keresztkötési hajlamát, mely nagy valószínűséggel megváltoztatja a fehéijék funkcióját. Egy további hátránya az, hogy a kapcsolódási folyamatban redukciós lépésnek is kell lennie, ami időigényes és potenciálisan nagyon kockázatos, például, ha például nátrium-ciano-boro-hidridet használunk redukáló ágensként. Bifunkcionális kötőszereket is használtak, de több alkalommal ez magában foglalta a kötődésre szánt fehérjén a szabad szulfhidrilcsoportok szükségességét. Ez az immobilizációt megelőzően elkerülhetetlenné teszi a fehéije módosítását.
Egy multi-analyte vizsgálati módszerben kívánatos mind a minőségi, mind a mennyiségi eredmények biztosítása. Például rendelkezésünkre állnak multi-analyte vizsgálati módszerek antibiotikumok elemzésére. Ezek alapvetően mikrobiális gátlási módszereken alapulnak.
HU 220 777 BI
A mintában jelen lévő antibiotikum gátolja a bakteriális növekedést, és így kialakít egy tisztulási zónát, mely nagysága arányos a minta antibiotikum-koncentrációjával. Ennek ellenére ezzel az eljárással nem lehet megállapítani az antibiotikum milyenségét és pontos koncentrációját. Ezenkívül a mikrobiális gátlási eljárások nagyon lassúak, a teljes folyamat több napig tart.
A kémiai szűrési módszerek, mint például a HPLC vagy a gáz/folyadékkromatográfiás tömegspektrometria (GCMS/LCMS) nehezen birkózik meg mindegyik antibiotikumcsoport, úgymint a penicillinek, szulfonamidok, amino-glükozidok, tetraciklinek stb. strukturális diverzitás/polaritás különlegességeivel. Ráadásul a kromatográfiás eljárások elkerülhetetlenné teszik az alapos mintaelőkészítést azért, hogy a jel-zaj arány elérje a szükséges kimutathatósági szintet.
A rendelkezésre álló több komponens együttes kimutatására szolgáló készülékek közé tartozik a Triage [Clinical Chemistry 38 (9), 1678-1684 (1992)] és az Advisor [Clinical Chemistry 39 (9), 1899-1903 (1992)]. Ezek a készülékek csak minőségi analízisre alkalmasak.
A Triage készülék a humán vizeletből képes szimultán kimutatni 7 különböző függőséget kialakító szert. Mindegyik készülék csak egy vizeletmintát képes analizálni. A folyamat végén a készülék kezelője vizuálisan kiértékeli a mindegyik szene jellemző specifikus kimutatási zónát, figyelembe véve a vörös sávot. A készülék kezelője a vizsgálati eljárás minden egyes lépését manuálisan végzi el. Nincs lehetőség a teszteredmények gépi rögzítésére sem.
Az Advisor készülék használatában hasonló, mint a Triage készülék. Az Advisor készülék öt különböző típusú kábítószer szűrését végzi. A készülék agglutinációs vizsgálati elven alapul, külön-külön csatornát használ mindegyik szer esetén. Az eljárás minden lépését a készülék kezelőjének kell elvégeznie. A negatív mintákban agglutinált részecskék vannak, míg a drogot tartalmazó minták a részecskék aggregálatlan mintázatát tartalmazzák.
A bioszenzorok/mikrotechnikával készített készülékek legtöbbjét biológiai alkalmazásokban szilikonhordozóval használják. Mások üveget vagy kvarcot használnak hordozóként. A szilikonnak nagyon szabályos kristályfelépítése van, jól meghatározott kristálysíkokkal. A szilikonhordozó egységessége miatt ideális választást jelent a több komponenst kimutató tesztkészülékekben.
Az olyan hordozók, mint a szilikon, úgynevezett sötéttest hatást adnak. Fluoreszcenciás kimutatáskor, amikor a fluorofort gerjesztjük adott hullámhosszúságú fény felhasználásával, egy sötét hordozó abszorbeálhatja a beeső geijesztési fény energiáját, így lecsökkentve a fluorofor emisszióját.
A jelen találmány szerinti több komponens szimultán elemzésére képes eszköz tartalmaz egy hordozót és azon a különálló reakcióhelyek sokféleségét, melyek mindegyike a hordozóhoz kovalensen kötve hordoz egy ligandot, és amelyen a reakcióhelyek között a hordozó felszíne inért a vizsgálandó anyaggal szemben, így ez a találmány biztosít egy szilárd állapotú multianalyte eszközt, melynek nem specifikus kötése kismérvű vagy egyáltalán nincs.
A találmány egy eszközét előállíthatjuk egy megfelelő hordozó felszínének aktiválásával, és egy olyan ligandumelrendezést alkalmazva, mely különálló helyeket ad a felszínen. Ha szükséges, a további aktív területeket blokkolhatjuk. A ligandok alkalmazhatók vizes rendszerben, és előnyben részesítjük a többi hely hidrofóbbá tételét. A ligandum a hordozóhoz egy kötőágensen keresztül kapcsolódhat. Az előnyben részesített formában az aktivált felszín egymás után reagál szerves szilánnal, egy bifunkcionális összekötővel és a ligandummal.
A találmány részeként bifunkcionális keresztkötőket használunk azért, hogy biztosítsuk a mikroeljárással készített szilikonon vagy kerámiahordozókon az erőteljes kapcsolódást a kovalensen immobilizált szerves szilánok között. így egy multi-analyte elrendezésben immobilizálhatók a biológiai ligandumok.
A találmány megszünteti a sokféle egyedi tesztreagenskészlet iránti igényt, valamint szükségtelenné tesz több készüléktípust is, ezzel elősegítve egyetlen minta többféle anyagra nézve történő szimultán analízisét. A találmány gondoskodik egy önálló integrált analizátorról, amely képes a vegyületek széles spektrumának szimultán kimutatására. Továbbá a tesztreagensek beszerezhetők a vizsgálandó anyagok adott kombinációjának figyelembevételével.
A találmány részeként a biológiai ligandumok sokasága térbelileg meghatározott pontok vagy vonalak mintázataként immobilizálódik egy mikrocseppfolyósító elosztóeszköz hatására a kémiailag aktivált hordozón. A biológiai ligandum kovalensen kötődik a hordozóhoz. A biológiai ligandum kapcsolódási hatékonysága lehetővé teszi a kémiai reakció lezajlását néhány percen belül. Az immobilizálási eljárás biztosítja azt, hogy a biológiai ligandum megtartsa biológiai aktivitását mind rövid, mind hosszú időtartamra.
A jelen találmány gondoskodik egy integrált analizáló rendszerről is az elemzendő anyagok széles tartományának szimultán kimutatására egy multi-analyte elrendezésben. Az analizáló rendszer tervezésekor maximálisan figyelembe vettük a végfelhasználó kényelmét, mindez társul azzal a képességgel, ami lehetővé teszi mindegyik tesztmintában több komponens szimultán azonosítását és mennyiségi meghatározását. Az előnyben részesített analizáló rendszer egy X-Y transzlációs munkafelület, egy mintaadagoló egység, folyadékkezelő/áramlási kontrolleszköz, egy hőmérséklet-szabályozott sötétdoboz, egy CCD kamera és egy képfeldolgozó program kombinációja. A munkafelület kapcsolódhat egy léptetőmotorhoz azért, hogy az analitikai folyamat minden egyes lépésében elérjük a mondjuk 10 μτη-es pontosságú szerkezeti pozicionálást.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat.
Az 1. ábra bemutatja egy nem egyenletes hordozófelszín kialakítását.
A 2. ábra bemutatja a csoportok kémiai aktiválását a hordozó felszínén.
HU 220 777 Bl
A 3., 5. és 6. ábra bemutatja egy ligandum kovalens immobilizálását egy hordozó felszínén.
A 4. ábra bemutatja latexrészecskék használatát egy hordozó felszínén.
A 7-11. ábrák illusztrálják a találmány megvalósítási formáiban szereplő hordozók beépítésére szolgáló eszközöket.
A 12-14. ábrák sematikusan ábrázolják a találmány szerinti készüléket, mely alkalmas minták analízisére.
A 15. ábra bemutatja a találmány eszközeivel vizsgált anyagok kalibrációs görbéit.
A jelen találmány szerinti készülékben használt hordozó lehet például szilikon, kvarc, üveg vagy kerámia. A kerámiahordozók (alumínium-oxid) egy kiváló alternatíváját nyújtják a szilikonhordozóknak, mivel sikeresen megvalósíthatók velük mind a fluoreszcens, mind a kemolumineszcens kimutatási technikák. Ez egy meglepő felismerés, mivel a kerámiaanyagok kristálytana alapján nem választhatók közvetlen hordozónak.
Egy bizonyos kerámiahordozót előállíthatunk úgy, hogy ezzel biztosítsunk egy széles szemcseméret-tartományt (1-30 pm). A használt kerámiahordozók előnyben részesített szemcsemérete ebben a találmányban kevesebb mint 20 pm, előnyösen kevesebb mint 10 pm. A csökkentett szemcseméret sokkal egységesebbé teszi a felületet, amely így biztosítja a biológiai vizsgálat tökéletesebb végrehajtását. A kerámiahordozók további fontos jellemzői közé tartoznak: a felületi topográfiai tűrés, porozitás, vákuum-vízhatlanság és a vízabszorpció hiánya.
Az előnyben részesített kerámiaanyagok 94% timföldet (A12O3) tartalmaznak, melynek szemcsemérete 4-8 pm tartományba esik. Az anyag vákuumbiztos, és őrléssel a felület egyenletlensége 0,6-0,8 pm között van. A felszín egységességét megnövelhetjük csiszolással azért, hogy 0,4-0,5 pm legyen csak az eltérés a szemcsék között. További tökéletesítést jelent a hullámfürdőben történő csiszolás, mellyel a szemcsék közötti eltérést 0,05-0,1 pm tartományba szoríthatjuk le.
Bizonyos kerámiahordozók teljesítményéről azt állapították meg, hogy az a szemcseméret jellemzőitől függ. A vizsgálatokban kitűnő teljesítményt kaptak kerámiahordozókkal, ha azok szemcsemérete 8 pm-ig terjedt, például 4-8 pm között volt. A nagyobb szemcseméretű anyagokkal kapott eredmények nem voltak kielégítőek. A hozzávetőleg 1 pm szemcseméretű kerámiahordozókat is megvizsgálták, de nem adtak jobb eredményeket, mint a 4-8 mm-es hordozók. Ez előnyös, mivel az anyagköltség figyelemreméltóan magasabb (hozzávetőleg ötszörös) a nagyon kis méretű kerámiarészecskéknél .
Alkalmas szilikonhordozókat készítettek egy pontos vastagságú oxidfilmmel, például egy 100 nm-es oxidfilmmel, melynek tűréshatára ±2 nm. Az oxidfilm vastagsága 50-500 nm között lehet, előnyösen 200 nm, előnyösebben a használati régióban 100 nm.
A hordozó kialakítható egy szilárd állapotú mikroeljárással, mikrogépekkel előállított eszköz részeként, melyet az állatorvosi és klinikai diagnosztikai alkalmazások széles körű tesztelésére fejlesztettek ki. Mindegyik szilárd teszteszköz rendelkezik adott elrendezésű reakcióterületekkel. Mindegyik reakcióterület specifikus egy adott elemzendő anyagra nézve. A reakcióterület formája lehet pontszerű, csatomaszerű, gödröcskeszerű, árokszerű, kútszerű vagy kamraszerű. A biológiai minták hordozóra történő immobilizálásával alakulnak ki a reakcióterületek.
Tipikusan a találmány eszköze 1 cm2 területig terjed. Mindegyik reakcióhely területe általában kevesebb mint 1 mm2.
A szilárd hordozót előnyösen úgy készítjük, hogy biztosítsa a kapuk, kamrák, csatornák, lyukak, gödröcskék stb. bonyolult hálózatát. Előnyös lehet oszlopokat is kialakítani a csatornák vagy lyukak belsejében. Az ilyen szabálytalanságok segíthetik a kötött biológiai ligandok és a tesztreagensek közötti kölcsönhatásokhoz szükséges maximális felszínméret elérését, ezzel nagymértékben csökkentve a kompetitív és a szendvics immunvizsgálati módszerek, valamint hasonló módszerek inkubációs idejét.
A szilikon- vagy kerámiahordozón alternatívaként, vagy ráadásul, csatornák vagy gödröcskék alakíthatók ki azért, hogy felvegyenek nanolitertől mikroliterig terjedő mennyiséget a keverőkamrákba, tárolókba, csatornákba. Például a szilikonfelszínt először oxidáljuk, hogy kialakuljon egy oxidréteg. Ezután egy fotoellenálló réteget viszünk fel, melyből a kívánt mintázatot kialakítjuk. Miután kialakítottuk a mintázatot, az oxidrétegről a fotoellenálló réteget eltávolítjuk. A szilikont ezután maratjuk, például HF felhasználásával, és az oxidfilmet eltávolítjuk. Végül egységesen oxidfilmet növesztünk a teljes szilikonlapkára.
Az eljárás egy illusztratív példáját az 1. ábrán mutatjuk be. Az (i) lépésben egy 1 szilikonlapkát oxidálunk a 2 oxidréteg kialakítása érdekében; a (ii) lépésben 3 fotoellenálló réteget viszünk fel; a (iii) lépésben fény alkalmazásával egy mintázott oxidréteget hozunk létre; a (iv) lépésben a fotoellenálló réteget eltávolítjuk; az (v) lépésben az ostyát kimarjuk; a (vi) lépésben az oxidfilmet eltávolítjuk; és a (vii) lépésben a folytonos 2a oxidréteget újraképezzük.
Előnyben részesítjük a biológiai ligandok kovalens immobilizálását. Passzív adszorbciós kölcsönhatások alkalmazhatók, de ezek érzékenyek a pH-ban, a hőmérsékletben és az ionerősségben bekövetkező változásokra, és lehet, hogy az inkubálás során és a mosási lépésekben néhány esetben a gyengén kötődött ligandumok felszabadulását eredményezik, ezzel hozzájárulva a szegényes ismételhetőséghez. Természetesen kívánatos, hogy a biológiai ligand megtartsa maximális aktivitását az immobilizációs folyamat után is.
Bármilyen kémiai aktiválás előtt a hordozók felszínét alaposan le kell tisztítani. A tisztítás első lépésében előnyben részesítjük a szonikálást lúgos detergensben, melyet követ egy kimerítő mosás kétszer ionmentesített desztillált vízzel. A hordozót ezután kezeljük krómsavoldattal. A krómsavoldat tovább tisztítja a felületet, valamint megnyitja a felszíni epoxicsoportokat, ahogy azt a 2. ábrán bemutattuk. Az epoxicsoportok felnyithatók más eszközökkel is, mint például 1 óráig tartó szonikálással.
HU 220 777 Bl
Az így képződött felületi hidroxilcsoportok ezután már képesek származékképzésre. Például, mint ahogy azt a 3. ábrán bemutattuk, a reakciók egymásutánisága tartalmaz egy szerves szilánt, ezután a nagymértékben reaktív köztitermék kialakításához egy bifunkcionális keresztkötőt (Z-R-Y) és végül a kovalens immobilizáláshoz egy funkcióval rendelkező ligandot.
Részletesebben, a szerves szilán [(RO)3-Si-(CH2)n-X] képletében mindegyik R egy alkil- vagy más szénhidrogéncsoport, úgymint -CH3 vagy -CH2CH3; n egy egész szám, mely lehet 1-18-ig; és X jelentése egy funkcionális csoport, úgymint epoxiciklohexil, -NH2, -CHO, -OH, -SH, p-klór-benzil, m-klór-benzil, -Br, -Cl, -NH-CH2-CH2-NH2, 2,3epoxi-propoxi, -N=C=O, -N=C=S vagy p-klór-szulfonil-fenil. Ezeket a szerves szilánokat úgy lehet kiválasztani, hogy akár egy reaktív végcsoportot adjanak, mely képes egy biológiai molekulával kovalens kötést kialakítani, akár egy kevésbé reaktív csoportot tartalmazzanak, úgymint az -NH2-t, amikor is a megfelelő végcsoport kialakításához további aktiválás szükséges egy bifunkcionális összekötővel. A szerves szilánokra jellemző, hogy elektrofil funkcionális végcsoporttal rendelkeznek, melyek nem kívánnak aktivációt a bifunkcionális keresztkötőhöz történő kapcsolódáskor, mivel a biológiai ligandumokat kovalensen immobilizálni lehet a biológiai ligandumon lévő nukleofil csoporttal.
A nukleofil csoportokkal rendelkező szerves szilánoknál bármely bifunkcionális keresztkötő alkalmazható a nagyon reaktív csoport biztosításához, mellyel a biológiai molekula vagy ligandum kovalensen hozzákapcsolható. Ez a találmány magában foglalja bifunkcionális kötőágensek használatát, melyek felhasználhatók a kémiailag aktivált hordozók tömegtermeléséhez és kellően stabilisak ahhoz, hogy lehetővé tegyék a hosszú ideig tartó tárolást a biológiai molekulák vagy a kötőligandum kovalens kapcsolódása előtt. Az előnyben részesített kötőágensek természetes körülmények között inertek, bár kielégítően reaktívak a röviddel azelőtt immobilizált (tipikusan kevesebb mint 10 perc) biológiai ligandum funkcionális csoportjával történő kovalens kötés kialakításához.
A bifunkcionális kötők lehetnek például: foszgén, tiofoszgén, Ν,Ν-diszukcinimidil-karbonát, xililén-diamid, 1,6-diamino-hexán, 1,12-diamino-dodekán, 1,6-diizocianát-hexán, 1,12-diizocianát-dodekán, 1,4-fenilénditio-izocianát, cianur-klorid, tereftál-aldehid, p-nitrobenzoil-klorid, szulfanilsav, 2-fluoro-metil-piridinium, p-toluolszulfonát, 3-amino-fenil-boronsav, p-bróm-fenil-boronsav, dietil-pirokarbonát, etil-kloroformát, pbróm-anilin, p-bróm-fenil-hidrazin, p-bróm-benzaldehid, a bróm-benzaldehid 1,2-etilénglikolja, N,N’-karbonil-diimidazol, tereftál-klorid, epiklórhidrin, 1,4-dijódbenzol, 1,4-dibróm-benzol, vagy az N-hidroxi-szukcinimid származékai, mint például a p-amino-benzoesav, p-bróm-benzoesav, p-bróm-fenil-ecetsav, p-bróm-etilbenzoesav, p-bróm-metil-benzoesav, p-formil-benzoesav, p-hidroxi-metil-benzoesav, a formil-benzoesav 1,2etilénglikolja, p-bróm-fenil-propionsav vagy a p-hidroxi-fenil-propionsav. Egy fotolabilis keresztkötő felhasználható azért, hogy részt vegyen egy nukleofil vagy elektrofil végcsoportot tartalmazó szerves szilán reakciójában. A keresztkötő lehet például a p-azido-benzoesav vagy a p-amino-benzofenon N-hidroxi-szukcinimidje.
A bifunkcionális kötőágenseken kívül, vagy azokat kiegészítve, latexrészecskék egy rétegét szintén előnyös kovalensen immobilizálni. Előnyösen a latexrészecskék átmérője kevesebb mint 500 nm, előnyösebben kevesebb mint 150 nm. A latexrészecskék a funkcionális csoportok, úgymint -CH2C1, -CHO, p-klórfenil, p-klór-sztiril, -N=NH, -NH-NH2 vagy -NH2, hatótávolságában lehetnek. A latexrészecskéket hozzávetőleg 0,5-1 vegyes% koncentrációban lehet inkubálni a módosított hordozókkal, a megfelelő szerves szilánnal, az előzőekben leírt bifunkcionális kötővel vagy anélkül.
A 4. ábra bemutat két reakciósémát a latex immobilizálására. Ezt követheti akár a latex aktiválása a második kötőágenssel és egy biológiai molekula immobilizációja, vagy közvetlen kovalens immobilizációja, mondjuk egy ellenanyaggal.
A polisztirén latexrészecskék használatának alternatívája az, amikor a biológiai ligandumokat kovalensen aktiváljuk polietilénglikol-származékokhoz, melyeket már hozzákapcsoltunk egy szilanizált hordozóhoz. Például a kiválasztott hordozón, a két elektrofil csoporttal, úgy mint epoxi vagy karbonil-imidazol, rendelkező PEG-származékokat reagáltatjuk végükön -NH2-csoporttal rendelkező szilánnal, mint amilyen például az APTES. Egy alkalmas reakciósorozatot az 5. ábrán mutatunk be.
Előnyös lehet a biológiai ligandumot kovalensen immobilizálni közvetlenül a szilánréteghez, így elkerülhető a szilán aktiválásának szükségessége a polimer anyagokkal vagy bifunkcionális kötőágensekkel. A biológiai ligandumon a szerves szilánoknak érzékenynek kell lenniük egy kémiai csoport (például -NH2, -SH, -OH vagy -NH=NH2) nukleofil támadására. A közvetlen biológiai ligand kapcsolására alkalmas szerves szilánok rendelkezhetnek halogenid, epoxi, izocianát, aldehid vagy tozilát funkcionális csoportokkal. Egy ilyen reakciót mutatunk be a 6. ábrán, ahol E a szerves szilánon lévő elektrofil csoport. Például az E lehet: -Br, -Cl, -O-CH2-CH=CH2, -NCO, -CHO és p-klórszulfonil-fenil.
A szerves szilánok elektrofil csoportokkal rendelkeznek, mint például glicid-oxi-csoporttal, valamint megvan az az előnyük is, hogy a szilanizálási folyamat alatt kevésbé érzékenyek a polimerizációra, mivel nem áll rendelkezésre nukleofil csoport a szerves szilánok metoxi vagy etoxi funkciós csoportjainak támadására. Ezért a hordozó felszínének nem kell tartalmaznia polimerizált szerves szilánt.
A felszínek kémiai felépítése biztosít egy eszközt a térbeli felbontás elérésére, a kovalens kötések kialakulásának gyors kinetikája alapján, a felszín funkcionális csoportjai és az immobilizálandó biológiai molekula térbelileg előnyös helyzetben lévő alkalmas kémiai csoportja között. Előnyösen a biológiai molekulát a hordo5
HU 220 777 Bl zó felszínére egy mikrocsepp-adagolóval juttatjuk egyedi cseppecskék formájában vagy a cseppecskék sorozataként, mely így egy vonalat képez. Az adagolási térfogat 1-100 ni tartományba esik, előnyösen kevesebb mint 50 ni, például közel van 10 nl-hez. A kovalens kötések kialakulásának gyorsasága olyan, hogy a kovalens immobilizációt perceken belül eléijük, mielőtt az adagolt cseppecske vagy vonal elpárolog a felületről. A folyadékcseppecskék vagy -vonalak felviteli pontosságának közelítőleg el kell érnie a ±20 pm tűréstartományt.
Különösen akkor, ha a ligandumot vízben alkalmazzuk, kívánatos lehet egy olyan felszín kialakítása, mely hidrofób, azért, hogy megakadályozzuk a felvitt cseppecskék vagy vonalak oldalirányú diffúzióját. Ez a tulajdonság hozzájárul a kiváló cseppminőséghez és az ismételhetőséghez, valamint lehetővé teszi, hogy a biológiai molekulákat tartalmazó cseppecskékből egységnyi felületre nagyobb mennyiséget kovalensen immobilizáljunk.
A jelen találmány megoldja a hagyományos fotolitográfíás módszernél fellépő problémákat, lehetővé téve a biológiai ligandumok térbelileg elkülönülő foltjainak kialakulását anélkül, hogy szükség lenne UV fényre vagy fizikai maszkra. Ahogy azt az előzőekben már jeleztük, a térbeli felbontás elérhető mikroadagolási technikákkal. A kovalens kapcsolási reakció gyors kinetikája fontos tényező, mivel ezzel biztosíthatjuk a biológiai ligandum nagyon hatékony kapcsolódását egy térbelileg elkülönülő régióban, kiküszöbölve az immobilizált biológiai ligandum oldalirányú terjedését.
A hordozón lévő nemreagált kémiai csoportokat ezután blokkolhatjuk, például felhasználva a szakirodalomból ismert blokkoló molekulákat. Ilyen molekulák közé tartoznak a fehéijék, úgymint kazein, boíjú-szérumalbumin, laktalbumin stb., vagy az alacsony molekulasúlyú blokkolók, úgymint a glicin, a glutamin stb.
Kötőágensként fotolabilis anyagokat is használhatunk. Például a hordozó felületén lévő szerves szilánok sötétben reagálnak fotolabilis kötőágenssel (például benzofenonnal, aril-aziddal stb.). Ezután a felszínre felvisszük a kívánt biológiai ligandumokat tartalmazó cseppeket, majd kovalens kötődést alakítunk ki rövid időtartamú UV fénnyel vagy hosszabb ideig alkalmazott látható fénnyel történő besugárzással. A hordozó felszínének megmaradó részeit blokkoljuk UV fénnyel vagy látható fénnyel hasonló blokkoló molekulákat használva, mint amilyeneket a fentiekben leírtunk.
A hordozón immobilizált biológiai molekulákat stabilizálhatjuk például egy cukoroldatban (trehalóz) történő rövid idejű (1 óra) inkubálással, majd megszárítjuk 37 °C-on 16 óráig. A stabilizált hordozót ezután lezárhatjuk fóliával, a fóliazacskóba nedvszívót teszünk és tároljuk. Az immobilizált biológiai molekulák stabilisak több mint 6 vagy 12 hónapig, például tovább mint 2 év, ha +2-+8 °C között tároljuk.
Az így kialakított eszközök ráhelyezhetők különböző keretekre, melyekre jellemző, hogy a tesztreagensek hatékony keverését szabályozott körülmények között teszik lehetővé. A folyékony tesztreagensek áramlása megvalósítható a kapilláris vonzóerő alapján, valamint centrifugálással, vákuummal vagy elektroozmotikus áramlással. Az elektroozmotikus áramlás használata szükségtelenné teszi szelepek alkalmazását, így tehát nem kellenek mozgó mechanikai alkatrészek.
Zárt csatornákat alakíthatunk ki, ha a mikroeljárásokkal kialakított felszínre vékony üveglemezt kötünk. Az üveglemez kötése előtt a biológiai molekulákat kovalensen immobilizáljuk a felszínre. A kötési folyamatok többsége, mint például az anódos kötés, magas hőmérsékleten megy végbe, így lerombolhatja a biológiai molekulát. Ezért olyan kötési folyamatot kell alkalmazni, mely az immobilizált biológiai molekulát nem denaturálja. Egy ilyen módszer a közvetett kötés, ilyenkor a lapkát üveglemezhez kötjük megfelelő ragasztóval, például epoxiragasztóval.
Az eszközöket ezután behelyezhetjük egy alkalmas keretbe. A 7. és a 8. ábrákon különböző kereteket mutatunk be. Példaként a 8. ábrán bemutatott eszköz 48,62 χ 48,62 mm-es, a benne lévő lyukak belső átmérője 10 mm és a külső átmérője 12,82 mm. Két vízszintesen vagy függőlegesen elhelyezkedő lyuk középpontja közötti távolság 15,36 mm.
Az eszközök jellemzője lehet, hogy elősegítik a tesztreagensek, minták stb. keveredését. Ezt mutatjuk be a 9. ábrán, ahol az eszköz rendelkezik 11 reagensbeadási hellyel, 12 reagenscsatomával és 13 tesztreakcióhellyel.
A 10. ábrán lévő eszköz tartalmaz 21 reagenstárolót, 2 szállító elosztócsövet, 23 reagenst szállító csatornát teszthelyekkel és 24 felesleggyűjtőt. All. ábrán bemutatunk egy négycsatomás rendszert hasonló részekkel.
A jelen találmány gondoskodik egy teljesen integrált rendszerről, mely képes széles molekulatömeg-, strukturális és polaritástartományban az anyagok szimultán kvantitatív meghatározására. Analitikai építőelemeket biztosítunk a megfelelő klinikai/állatorvosi diagnózisokhoz és a kábítószerek szűréséhez.
A kötőligandumokat az elemzendő anyagoktól függően választjuk ki. A szakemberek számára ezek nyilvánvalóak. Az elemezhető anyagok körébe tartoznak: az antibiotikumok, mint például a tetraciklinek, szulfonamidok, ionoforok, amino-glükozidok, penicillinek és a fluorokinolinok;
a hormonok, mint például a luteinizáló hormon (LH), prolactin (PL), a tüszőérést stimuláló hormon (TSH); a szívsérülések jelzésére szolgáló anyagok, mint például a mioglobin, karbonsav-anhidráz, troponin I, glikogén-foszforiláz BB, CK-MB, zsírsavkötő fehérje vagy a troponin T;
a fertőző betegségek markerei;
az allergia markerei;
a drogok;
az enzimek;
a vírusok;
a nukleotidok; és a peptidek.
Például az egyik terület a szulfonamid antibiotikumok kimutatására szolgál. Ez a találmány gondoskodik
HU 220 777 Β1 egy szimultán mennyiségi és azonosítási eljárásról, mely mondjuk 20 különböző szulfonamidig alkalmazható. A további példák magukban foglalják a szívvel, a termékenységgel és a fertőző betegségekkel kapcsolatos területeket.
A találmány lehetővé teszi mondjuk 20 strukturálisan eltérő mintáig a szimultán kimutatást. A tesztelésre szánt minták eredete lehet a szérum, a vérplazma, a vizelet, az epe, az ürülék, a testnedvek és a táplálék. A minták szükséges térfogata igen kicsiny, tipikusan kevesebb mint 1,5 μΐ/mintánként. A tesztreagensek, mint például az enzimmel jelölt ellenanyagok, az enzimmel jelölt haptének, a fluoreszcensen jelölt ellenanyagok, fluoreszcensen jelölt haptének, mindegyike egyetlen reagenstárolóban lehet, ezzel drámaian csökkentve a folyadék kezelése iránti igényt.
A szendvics vizsgálati módszerekben, mint például a luteinizáló hormon, a tüszőérést stimuláló hormon, a prolaktin, a tiroid stimuláló hormon stb. mérésekor, a mintát a vizsgálati pufferrel együtt adjuk és inkubáljuk egy rövid ideig, ez az időtartam tipikusan kevesebb mint 30, előnyösebben kevesebb mint 10 perc. A mosási lépést követően a jelölt kimutatási ellenanyagok keverékét adjuk, és egy ideig tovább inkubáljuk. Ez az időtartam tipikusan kevesebb mint 30 és előnyösebben kevesebb mint 10 perc. Ezután a nemkötöttjei eltávolítása érdekében mossuk az eszközt, majd meghatározzuk a jel nagyságát.
Egyes vizsgálati módszereknél előnyös lehet a mikroeljárásokkal készített eszközbe az interferáló komponensek, úgymint a reumatoid faktor, eltávolíthatósági lehetőségének beépítése. A reumatoid faktor eltávolítása megvalósítható akkor, ha a tesztmintát kontaktusba hozzuk az immobilizált immunoglobulint tartalmazó területtel, például a tesztminta reakciótérbe juttatása előtt.
Az interferencia egy másik példája a HAMA (humán anti-egér ellenanyagok); ezek az ellenanyagok komoly problémát képesek okozni monoklonális egér ellenanyagok alkalmazásakor a vizsgálat végrehajtásában. A hagyományos megoldásban drága adalék anyagokat adunk a tesztreagensekhez a probléma ellensúlyozására. Ebben a találmányban az előny a HAMA interferencia eltávolításában van, ezt úgy érjük el, hogy a mintát csak azután hozzuk kapcsolatba a mikroeljárással készített eszköz régióival miután eltávolítottuk ezeket az ellenanyagokat a reakciótérből.
Általánosabban, a ligandumokról gondoskodhatunk az eszköz egy olyan részében, mely köti a szennyezőket. Ez különösen ott értékes, ahol a korlátozott szétterülés megengedett az eszköz felszínén, például a csatornákban. Az interferáló komponensek eltávolításának képessége növeli a létrehozott eredmények pontosságát.
A kimutatási jeleket immobilizálhatjuk a faszerűen elágazó (dendrimer) molekulák felszínén is. A faszerűen elágazó molekulák polimer természetűek, az ilyen molekulákat kis építőegység ismételt összekapcsolásával állítják elő. A kereskedelemben beszerezhetők az Aldrich Chemicals cégtől egy adott molekulatömeg-tartományban, adott funkcionális végcsoportokkal, például ez lehet: -NH2 vagy -COOH. Ezek után bifunkcionális összekötőket lehet felhasználni a hagyományos kapcsolási reakciókkal együtt a kimutatási jel elkészítéséhez. Kis haptén molekuláknál, például β-antagonistáknál, anabolikus szteroidoknál vagy antibiotikumoknál, előnyben részesítjük egy kicsiny dendrimer (előnyösen nem több mint 16 felszíni csoporttal) kapcsolását egy nagy dendrimerhez (tipikusan több mint 64 felszíni csoporttal). A kis molekulatömegű haptént (kevesebb mint 1000 Dalton) kapcsoljuk a kis dendrimeren lévő kémiai csoportokhoz, majd ezt követi a detektálójel kovalens kapcsolása. A dendrimer konjugátumokat tisztíthatjuk dialízissel és gélkromatográfiával.
A tesztreagensek többféle vegyületet tartalmaznak (például enzimmel jelölt ellenanyagokat, fluoreszcensen jelölt ellenanyagokat, latexen immobilizált ellenanyagokat, dendrimer ellenanyag-fluorofor-konjugátumokat, dendrimer ellenanyag-enzim-konjugátumokat, enzimmel jelölt hapténeket, fluoreszcensen jelölt hapténeket stb.), melyek megfelelnek az adott kimutatási eljárásnak. A kimutatási eljárások nagyon eltérőek és a klinikai diagnózis (vagy állatorvosi diagnózis) alapján választhatók meg. Például nagy szükség van a fertőző betegségek (például hepatitis, HÍV, szifilisz stb.) kimutatására. A további kimutatási területek közé tartoznak a nemi hormonok, a szívmarkerek, az allergiában szereplő fehéijék stb. Éppúgy mint a klinikai paraméterek kimutatásához, a drogmaradékok kimutatásához is megvannak az eszközeink.
A jelen találmány lehetővé teszi egyedi vegyületek, mint például az antibiotikumok azonosítását. Például szimultán mennyiségi eredmények kaphatók 20 antibiotikumig 1 cm2 felületű eszközön, tipikusan perces időtartam alatt, jobb érzékenységgel, mint HPLC/CMGS módszereknél, és ez az eredmény összevethető a hagyományos egyetlen paraméterű enzim-immunvizsgálati módszerekkel. Ezt a megközelítési módot könnyen ki lehet teijeszteni anabolikus szteroidokra, béta-antagonistákra, béta-blokkolókra, peszticidekre, gyógyszerekre stb.
Az analízis megvalósítható kemilumineszcenciával, biolumineszcenciával vagy fluoreszcenciával. Az előnyben részesített kimutatási rendszer egy „charge-coupled device” (CCD) kamerán alapul, melyet felszereltünk mind a fluoreszcens, mint a kemilumineszcens fény mérésére. Röviden, a CCD kamera összegyűjti a mikroeljárásokkal készített eszköz tesztterületéről érkező fényjeleket és átalakítja relatív fotométeregységgé (RLU).
A fluoreszcencián alapuló kimutatási rendszerekben az értékeket közvetlenül le lehet olvasni megfelelő optikai szűrőket használva a fluorofor jelölésére.
Egy megfelelő kemolumineszcenciás reagens a luminol, melyet 433-445 nm-es hullámhossz tartományban lehet analizálni. Kemolumineszcenciát figyelhetünk meg alkalikus foszfatázzal jelölt biológiai molekuláknál is 1,2-dioxi-etánt használva.
Az elemzendő anyagok kimutatásának elősegítésére ez a találmány előnyben részesíti a kemolumineszcenciás kimutatási rendszert CCD alkalmazásával. Előnyben részesítjük a befogási hatékonyságjavítása ér7
HU 220 777 Β1 dekében a hátulról megvilágított kamerát a kemolumineszcens fényreakció által létrehozott fény hullámhosszán (luminolnál ez hozzávetőleg 433-445 nm között van).
A teljes rendszert működtetheti egy személyi számítógép, egy olyan speciális programmal, mely szabályozza az X-Y asztalt, az adagolóegységet, a mintakezelőt, a hőmérsékletet, az inkubációs időt és a CCD kamerát. Egy ilyen rendszer felépítése látható a 12-14. ábrákon.
A 12. ábra sematikusan bemutatja a két 31, 32 szabályozóegységgel rendelkező személyi számítógép (PC) kapcsolatait. A 31-es egység kommunikál egy 33 CCD leképező rendszerrel. A 32-es egység kommunikál az adagolóegységgel és a mintatálcát tartalmazó 34, 35 X-Y transzlációs asztallal.
A 13. ábra az X-Y transzlációs asztal sematikus bemutatása. Ez a rajz bemutat egy 41 mintatartó tálcát, melyet egy 42 lineáris működtetőszervre erősítettünk fel. Az X-Y transzlációs asztalt 43,44 léptetőmotorok szabályozzák, melyek kapcsolatban vannak két 45, 46 meghajtóval. A mozgást behatárolja két 47,48 alaphelyzet-érzékelő.
A jelölt biológiai molekulák és bizonyos jelöletlen biológiai molekulák fényérzékenysége szükségessé teszi a mérés sötétben való elvégzését. A fénymentességet úgy érhetjük el, ha a készülék dobozát fényszigeteltre készítjük. A fénymentes környezetben előnyös a hőmérséklet szabályozása is a mérés pontossága és hitelessége érdekében, például ±0,2 °C vagy előnyösebben ±0,1 °C pontossággal.
A 14. ábra a készülék térbeli ábrázolása, részletterve és keresztmetszeti képe. Részletesebben, a 14A. ábra bemutatja az 51 reagenstárolót, az 52 fénymentesen záró ajtót és az 53 kameratestet az 54 mozdítható fedővel. A kamera fő része a burkolaton kívül lehet. A kameralencsét a burkolaton lévő lencsenyílásra helyezzük.
A 14B. ábra vázlatosan bemutatja az 55 mintatartó tálcán lévő mintákat, körvonalasan az 56 elhasznált anyagok gyűjtésére szolgáló részt és a megfigyelési területet. Az 53 kamera erre a területre van beállítva. A 14C. ábra bemutatja az 51 tartályon kívül az 53 kamerát, a 41 X-Y asztalt és a 43 léptetőmotort, valamint egy 58 adagolópumpát.
A rendszer tervrajza, amit a 14. ábrán mutatunk be, egy 3 χ 3-as mintatartó kereten alapul, ezekből egyszerre 20 lehet. Ez azt jelenti, hogy ha 20 egyedi reakciórégió van az 1 cm1 2-es mikroelj árassal készített eszközön, akkor 3600 analízist lehet szimultán végrehajtani egyetlen mintán. Alternatívaként 180 mintát lehet szimultán analizálni 20 különböző tesztparaméterre nézve.
Ahogy azt a fentiekben jeleztük, az elemzendő anyagokat lehet jelölni. A ligandot szintén jelölhetjük, lehetővé téve az analízist a szakaszos foglaltság útján. A következő példák illusztrálják a találmányt.
1. példa
A szulfonamid vizsgálati módszer
Ebben a példában egyedi 12 ellenanyagot, melyek mindegyike specifikus egy szulfonamidra, immobilizáltunk kovalens kötéssel, kontaktust biztosító kölcsönhatásokkal egy lapos kerámia (alumínium-oxid) kémiailag módosított felszínének különálló régióira. A kompetitív immunmérési módszernek megfelelő multi-analyte vizsgálatot végeztünk.
Részletesebben, a kerámiahordozókat (lxl cm) ultrahanggal tisztítottuk lúgos detergensben (RBS35, 5 térfogat%), majd ezután kétszer ionmentesített vízzel mostuk, ezt követően 16 órára 6 M HCl-be tettük. Az eszközöket ultrahanggal kezeltük 1 óráig krómsavoldatban.
A hordozókat kimerítően mostuk kétszer ioncserélt vízzel, acetonnal és ezután megszárítottuk 120 °C-os szárítószekrényben 2 órán át. Ezen előkezelés után a hordozókat szilanizáltuk, felhasználva a vízmentes toluolban, 4-dimetil-amino-piridinolban (1,25 g/1) és trietil-aminban (1 térfogat%) oldott szerves szilánt: gamma-glicid-oxi-propil-trimetoxi-szilánt. Ezt a keveréket refluxáltuk 4 óráig és utána szobahőmérsékleten tartottuk egy éjszakán át. A hordozókat mostuk toluollal és acetonnal, majd 4 órán át 120 °C-on kezeltük.
A megkeményedett hordozókat tárolókba helyeztük és szobahőmérsékleten tároltuk a szulfonamid ellenanyagok felviteléig. A szulfonamid ellenanyagok felvitelét BIODOT XY3000-es mintaadagolóval végeztük el. A következő 12 szulfonamidot vizsgáltuk: szulfadoxin, szulfametizol, szulfaklór-piridazin, szulfametoxipiridazin, szulfamerazin, szulfapiridin, szulfizoxazol, szulfatiazol, szulfametazin, szulfakinoxalin, szulfadimetoxin és szulfadiazin.
Hozzávetőleg 20 nl-t alkalmaztunk mindegyik szulfonamid ellenanyagból. A szulfonamid 12 ellenanyagot, mely 12 darab különálló régiót alkotott az 1 cm2-es felületen, 2 óráig 37 °C-on inkubáltuk. A hordozókat mostuk foszfáttal puffereit sóoldatban (PBS, pH=7,2), mely tartalmazott 2 vegyes% kazeint, és ezután blokkoltuk ugyanebben a pufferben egy éjszakán át ±2 °C-on. A PEG 300-at (0,05 térfogat%) tartalmazó PBS-es mosás után az eszközöket behelyeztük a keretbe.
A többféle szulfonamidstandardot tartalmazó oldatot (200 μΐ) és a tormaperoxidázos szulfonamidkonjugátumokat tartalmazó oldatot (100 μΐ) hozzáadtuk a megfelelő eszközt tartalmazó reakciólyukakhoz, és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A standard sorozatok mind a 12 szulfonamidra nézve 5, 10, 50 és 100 ng/μΐ szulfonamidot tartalmaztak.
Ezek után a többféle szulfonamidot tartalmazó eszközt mostuk PBS/PEG pufferrel a reagensek eltávolításának érdekében és 300 μΐ kemilumineszcens szert [luminol (1,4 mM)/urea hidrogén-peroxid (9,6 mM)] adtunk az eszközbe. Az eszközt CCD kamerával exponáltuk 4 percig. A standard görbéket megkaptuk mind a 12 egyedi szulfonamidra nézve. A 12 egyedi szulfonamid mindegyikének kalibrációs görbéit a 15. ábrán mutattuk be. Az y tengelyen feltüntetett % B/Bo értékek a zéró standard érték (relatív fotométeregység, RLU) %-ában kifejezett gátlást reprezentálják mindegyik egyedi szulfonamidstandardnál (amelyeket az x tengelyen tízes alapú logaritmus függvényében ábrázoltuk).
HU 220 777 Bl
2. példa
A hormonvizsgálati módszer
Ebben a példában multi-analyte vizsgálatot hajtottunk végre 3 nagy molekulatömegű hormonnal, úgymint a prolaktinnal (PL), a tüszöérést stimuláló hormonnal (FSH) és a luteinizáló hormonnal (LH). Ez a példa képviseli egy szendvics immunvizsgálati módszer multi-analyte megfelelőjét. Jelentős keresztreaktivitást nem tudtunk megfigyelni, amikor a három hormont ugyanabban a mezőben vizsgáltuk.
A kémiai előkezelés és a szilanizálási eljárás pontosan megegyezik az 1. példában leírtakkal. Az egyedi PL, FSH vagy LH monoklonális ellenanyagokat (hozzávetőleg 20 ni ellenanyagot adagoltunk) immobilizáltuk a kémiailag módosított hordozó egymástól elkülönülő részeire. A multi-analyte módszert mind szilikon-, mind kerámiahordozókon végrehajtottuk egy epoxidfelszínen, ahogy azt az 1. példában leírtuk.
A vizsgálati módszerben 150 μΐ LH/PL/FSH szérumalapú standardot és 150 μΐ hígító vizsgálati puffért adtunk az eszközhöz és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A mosási lépés után egyetlen 300 μΐ-es LH-HRPO/PL-HRPO/FSH-HRPO konjugátum koktélt adtunk a rendszerbe és 15 percig inkubáltuk. Ezek után az eszközöket mostuk a reagensek feleslegének eltávolítása érdekében és 300 μΐ kemilumineszcens hordozót [luminol (1,4 mM)/urea hidrogén-peroxid (9,6 mM)] adtunk az eszközökbe. Az eszközöket CCD kamerával exponáltuk 4 percig. Mindegyik hormon standard görbéjét a képvizsgálat után grafikusan ábrázoltuk.
3. példa
A szulfonamid vizsgálati módszer
Az 1. példával szemben, ebben a példában mikrocsatomás multi-analyte szulfonamidvizsgálatot hajtottunk végre. Az eszközt all. ábrán mutatjuk be. Ebben a példában a 21 reagenst hígító tároló 2x2 mm-es területű és 300 pm mély (térfogata 1,2 pl), a csatornák (23) mindegyike 5 mm hosszú, 200 pm széles és 100 pm mély (térfogata 100 ni), és a tároló (24) 1,9 χ 8,6 mm-es területű, és 300 pm mély (térfogata 4,9 pl).
A felület kémiai módosítását az 1. példában leírtaknak megfelelően hajtottuk végre. Mindegyik csatornába beleadtuk az ellenanyagot, és 2 óráig 37 °C-on inkubáltuk. A hordozót ezután blokkoltuk és mostuk az 1. példában leírtak szerint.
Egy multi-szulfonamid-standardot (200 pl) és a tormaperoxidázzal konjugált szulfonamidokat (100 pl) összekevertük, az eredményül kapott reagens 1 μΐ-ét a szulfonamidok részére ellenanyaggal fedett tárolókba külön-külön belepipettáztuk. A standardok mindegyik szulfonamidból 10 és 100 ng/ml-t tartalmaztak, ahogy az helyénvaló.
A reagens áramlását a kapilláriserő biztosította. 2 perces inkubáció után az eszközt ötször mostuk PBS/PEGgel és kemolumineszcenciás reagenst adtunk hozzá [luminol (1,4 mM)/urea hidrogén-peroxid (9,6 mM)].
Az eszközöket CCD kamerával exponáltuk 4 percig. A %-os B/Bo értékeket a 4 szulfonamidra nézve az
1. táblázatban adtuk meg.
1. táblázat
Szulfonamid % B/Bo
0 ng/ml 10 ng/ml 100 ng/ml
Szulfametazin 100 14 7
Szulfametoxipiridazin 100 28 15
Szulfakinoxalin 100 56 24
Szulfamerazin 100 40 22
Ezen találmány hasznosíthatóságát, összevetve a fotolitográfiás eljárással, a biológiai molekulák egy fotolabilis hordozón (benzofenonnal kezelt) mutatkozó nem specifikus adszorpciójának mértéke jellemzi. Az eredményeket a 2. táblázatban adtuk meg.
2. táblázat
Egér-IgG Besugárzás UVlámpával (10 perc) Szürke átlag (RLU)
X X 22 368 24 022
X 17 586 20 531
Az egér-IgG kimutatásához anti-egér HRPO-konjugátumot használunk, valamint a kimutatáshoz egy CCD kamerát. Az immobilizált benzofenon fotolabilis kötőágenssel rendelkező szilikon- vagy kerámiahordozóknak nem kellene kötniük az egér-IgG-t, amikor sötétben reagáltatjuk. Mégis előfordul nem specifikus kötődés, mivel hozzávetőleg a szürke átlag RLU 80%-a elérhető, amikor az egér IgG kötődést UV fényben végezzük, ez a passzív kötődési kölcsönhatásoknak köszönhető. A találmány szerinti kovalens kölcsönhatásokon keresztül immobilizált biológiai molekulák egy elrendezése bizonyíthatóan jobban különbözik ettől.
A kovalens kapcsolódás bizonyítékát szolgáltatják az alábbiakban megvitatott példák. Az első esetben a kerámiahordozót szilanizáltuk APTES-sel és ezután reagáltattuk biotin-LC-szulfát NHS-sel. A kontrollkerámia hordozóit nem szilanáltuk APTES-sel; terminális nukleofil -NH2-csoportok nem álltak rendelkezésre a biotinszármazék szukcinimidil-észterével történő reakciójához. A hordozókat ezután reagáltattuk egy avidinFITC-konjugátummal, és a fluoreszcenciát CCD kamerával határoztuk meg. Az eredményeket a 3. táblázatban adtuk meg.
3. táblázat
Biotin-LC-NHS APTES hordozó RLU (1 másodperces expozíció) Kontrollhordozó RLU (1 másodperces expozíció)
0 2,488 NS
100 pg/ml 8,881 NS
500 pg/ml 7,922 NS
NS=fluoreszcenciás jelet nem kaptunk.
HU 220 777 Bl
Ez egyértelműen demonstrálja a biotin-LC-NHS specifikus immobilizációt. A biotin-LC-NHS maximális koncentrációja hozzávetőleg 100 pg/ml volt, mivel az 500 pg/ml hordozó RLU értéke nem nőtt meg.
Egy további példában az APTES-sel szilanizált kerá- 5 miahordozót reagáltattuk dihidrazid kötőágenssel.
A szulfonamid ellenanyagokat kezeltük nátrium-perjodáttal a hidrazinkötővel szembeni reaktivitásuk kialakítása érdekében. A kontroll szulfonamid ellenanyagokat egyszerűen dializáltuk nátrium-acetát-pufferrel (pH=5,5) szemben. Az RLU-értékeket a 4. (nem kezelt) és 5. (peijodát módszerrel kezelve) táblázatokban mutatjuk be. Az eredmények nyilvánvalóan mutatják, hogy a hidrazid kötőágens sikeresen kapcsolódott a kerámia felszínéhez. A kontroll ellenanyagok (nincs perjodátos aktiválás) nagyon szegényes standard görbéket adtak, amikor összehasonlítottuk a kovalensen immobilizált szulfonamid ellenanyagokkal.
A kovalens vagy passzív kölcsönhatások miatt kialakult kötési %-okat összehasonlítottuk a 6. és 7. táblázatokban. A kovalens kölcsönhatások átlagban 10 81,8%-ban járultak hozzá a teljes kötődés kialakulásához, nyilvánvalóvá téve a szulfonamid ellenanyagok kötődését.
4. táblázat
Szulfonamid 0 ng/ml 10 ng/ml % B/Bo 100 ng/ml % B/Bo
Szulfadoxin 2825 1456 51 NS -
Szulfametizol 3531 1257 36 NS -
Szulfaklór-piridazin 6476 1585 24 NS -
Szulfametoxi-piridazin 1099 928 84 NS -
Szulfamerazin 2177 1137 52 1224 56
Szulfazoxazol 4879 1108 23 NS -
Szulfatiazol 2932 814 28 NS -
Szulfametazin NS NS - NS -
Szulfakinoxalin 1041 828 79 968 93
Szulfadimetoxin 804 NS - 781 97
5. táblázat
Szulfonamid 0 ng/ml 10 ng/ml % B/Bo 100 ng/ml % B/Bo
Szulfadoxin 10 520 3 240 31 2135 20
Szulfametizol 17 141 5 689 33 4882 28
Szulfaklór-piridazin 24 944 7 565 30 2096 8
Szulfametoxi-piridazin 14 082 10 509 74 5687 40
Szulfamerazin 12 594 5 521 43 3240 26
Szulfazoxazol 24 419 6 686 27 2270 9
Szulfatiazol 14 279 4 602 32 2353 16
Szulfametazin 3 644 2 810 77 2213 61
Szulfakinoxalin 10 575 6112 58 5588 53
Szulfadimetoxin 5 526 2 554 46 1983 36
6. táblázat
Szulfonamid A szulfonamid ellenanyag kötődésszázaléka
Kovalens kölcsönhatás Passzív kölcsönhatás
Szulfadoxin 73,1 26,9
Szulfametizol 79,4 20,6
Szulfaklór-piridazin 74,0 26,0
Szulfametoxi-piridazin 92,2 7,8
Szulfamerazin 82,7 17,3
Szulfonamid A szulfonamid ellenanyag kötődésszázaléka
Kovalens kölcsönhatás Passzív kölcsönhatás
Szulfazoxazol 80,0 20,0
Szulfatiazol 79,4 20,6
Szulfametazin - -
Szulfakinoxalin 90,2 9,8
Szulfadimetoxin 85,4 14,6
Átlag 81,8 18,2
HU 220 777 Bl
7. táblázat
Szulfonamid RLU
Kovalens Passzív
0 10 ng/ml 0 10 ng/ml
Szulfadoxin 32 756 11 131 1950 904
Szulfametizol 39 020 11 132 2782 1359
Szulfaklór-piridazin 39 632 8 434 4410 1051
Szulfametoxi-piridazin 29 489 13 408 1793 770
Szulfamerazin 28 455 11 077 2011 988
Szulfazoxazol 38 486 5 774 4083 1031
Szulfatiazol 28 837 8 087 2010 675
Szulfametazin 11331 7 535 802 574
Szulfakinoxalin 13 838 8 716 951 548
Szulfadimetoxin 13 062 5 832 910 581
Kovalens immobilizáció: közvetlen felvitel a glicidoxi-szilán-felszínre.
Passzív immobilizáció: közvetlen felvitel a diklór-dimetil-szilánnal reagáltatott felszínre.
Nyilvánvaló, hogy a kovalens módszerrel kapott eredmények jobbak, mint a passzív eljárással nyertek. A passzív eljárás eredményeit hozzávetőleg kétszeresre lehet növelni a szulfonamid ellenanyagok savas előkezelésével, de még így is gyengébb a kovalens eljárásnál.
A megerősítő elemzéseket röntgensugár fotonspektroszkóppal (XPS) kémiailag módosított szilikon és kerámiahordozókon is elvégeztük. A spektrumok felvételét mindegyik hordozóminta két véletlensze25 rűen választott területén végeztük el, az így nyert adatokból meghatároztuk felszíneik kémiai összetételét. Az eredményeket lásd a 8. táblázatban (atom%-ban van megadva).
8. táblázat
Minta Terület C O Si Al N Cl Cs
Szilikonhordozó 1 21,9 52,7 25,4 - - - -
(kezeletlen) 2 23,0 51,0 26,0 - - - -
Szilikonhordozó 1 55,5 23,3 10,5 - 10,2 0,5 -
2 55,6 22,5 10,9 - 10,5 0,5 -
APTS-sel 1 51,3 25,6 13,0 - 7,2 2,9 -
szilanált 2 52,5 25,0 12,3 - 7,5 2,7 -
APTS szilikonhordozó 1 58,7 25,0 9,6 - 6,1 0,5 -
FITC-vel kezelt 2 58,8 24,7 9,8 - 6,0 0,8 -
Kerámiahordozó 1 27,2 46,3 U,3 13,3 - 1,4 0,5
(kezeletlen) 2 27,1 46,6 9,6 14,8 - 1,1 0,7
Kerámia hordozó APTES-sel 1 47,0 31,6 13,4 2,6 5,4 - -
szilanált 2 45,9 31,7 13,7 3,3 5,3 - -
APTES kerámiahordozó 1 52,0 29,3 11,3 2,4 5,0 - -
FITC kezelt 2 51,0 30,6 11,7 2,3 4,5
Az automatikusan mért összetétel-eredmények egy nagyon jó szilikon- és kerámiahordozó-átalakítást mutatnak az APTES szerves szilánokkal, valamint jól reprodukálható felszíni összetételt adnak mindegyik minta két vizsgált területén. A FITC-vel jelölt szilikon- és kerámiahordozók 70%-os, illetőleg 75%-os jelölést mutattak.
A fluoreszcencia mérésének kvantitatív eljárásait ösz55 szehasonlítottuk egy sötét szilikonhordozón és egy fehér kerámia (alumínium-oxid)-hordozón. A hordozókhoz kovalensen kötődő fluoreszcens molekulák (FITC) CCD-vel mért RLU eredményeit összehasonlítottuk mennyiségi módszerekkel, miután a FITC-molekulákat leválasztottuk [Hook és munkatársai: Langmuir 7, 142-151 (1991)].
HU 220 777 Bl
9. táblázat
Hordozó CCD expozíciós idő (s) Szürke átlag Az eltávolított FITC molekulák száma/hordozó
1 oldal 2 oldal
Kerámia 0,1 7483 7063 4,548 xlO15
Szilikon 10 753 612 1,412x10’«
A hordozorol leválasztott FITC-jellel kapott fluoreszcens jel kvantitatív eredménye és a CCD kamerával mértjei mérése azt mutatja, hogy az 1000-szeres növekedés ellenére, melyet a kerámiajel mutat a szilikonnal szemben, ténylegesen jelentősen több FITC-molekula van jelen a szilikonhordozón.
Ennek a jelenségnek további példáit a 10. táblázat eredményei mutatják, melyet egy prolaktin vizsgálati módszerrel végeztünk szilikon- és kerámiahordozókon, kimutatási rendszerként felhasználva fluoreszcens latexrészecskéket a prolaktint detektáló ellenanyaghoz kötötten. Az RLU-értékeket a 10. táblázatban adtuk meg (20 másodperces expozíció).
10. táblázat
[Prolaktin] standard RLU
szilikonhordozó kerámiahordozó
550 MIU/ml 814 8 594
2200 MIU/ml 799 16 735
Ebben a fluoreszcenciás kimutatási eljárásban a kerámia teljesítménye felülmúlta a szilikonét. Továbbá a fluoreszcens eljárás alkalmazásakor a szilikonon fellépő sötéttest hatás problémája megoldható kemolumineszcenciás kimutatási eljárással. Ha összehasonlítjuk az FSH vizsgálati módszert szilikonon és kerámián kemolumineszcenciás módszert alkalmazva, akkor megállapítható, hogy az előbbi kétszer hosszabb expozíciós időt igényel, mint a kerámia, azonos RLU-érték eléréshez.
Ebben a leírásban a következő rövidítéseket használtuk:
APTES=amino-propil-trietoxi-szilán;
CK-MB=kreatin-kináz MB egység;
HRPO=tormaperoxidáz;
LC-szulfo-NHS=hosszú láncú szulfo-N-hidroxi-szukcinimid;
FITC=fluoreszcein-izotiocianát.

Claims (21)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Szilárd állapotú eszköz multi-analyte vizsgálatok elvégzéséhez, mely tartalmaz egy hordozót és az egyedi reakcióhelyek sokféleségét, melyek mindegyike tartalmaz egy, a hordozóhoz kötött ligandot, azzal jellemezve, hogy az eszközben a hordozó felszíne a reakcióhelyek között inért a vizsgálandó anyagokra nézve.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy a hordozó felszíne nem egyöntetű, miáltal egy nö10 veit jel kapható a ligand és az elemzendő anyag kölcsönhatásából.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy tartalmazza a reakciócsatomák, kiemelkedések, oszlopok, pettyek, kamrák, gödröcskék, lyukak vagy
    15 mélyedések egy elrendezését.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eszköz, melyben a hordozó anyaga kerámia, üveg, kvarc vagy szilikon.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eszköz, 20 azzal jellemezve, hogy területe kisebb mint 1 cm2.
  6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy mindegyik reakcióhely kisebb mint 1 mm2.
  7. 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti esz25 köz, azzal jellemezve, hogy a reakcióhelyeket úgy kaphatjuk meg, hogy a hordozó felszínét aktiváljuk, és a ligandumokat egymástól függetlenül helyezzük el a felszínen.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti eszköz, azzal jellemezve, 30 hogy az eszközben a végbemenő folyamat tartalmazza a további aktív régiók blokkolását is.
  9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy az eszközben a végbemenő folyamat a többi régiót hidrofóbbá teszi, és a ligandumokat vízben ad35 juk a rendszerbe.
  10. 10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy az eszközben a ligandumok alkalmazása magában foglal egy kezdeti lépést, mellyel a szerves szilán az aktivált felszínre kerül.
    40
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy az eszközben a szerves szilán képlete: (RO)3Si-(CH2)n-X, ahol R jelentése szénhidrátcsoport, n jelentése egész szám, és X jelentése funkcionális csoport.
    45
  12. 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy az abban végbemenő folyamat magában foglalja egy bifünkcionális fotolabilis keresztkötő használatát, azért, hogy a biológiai ligandumok kovalens kötődését a szerves szilánhoz elősegítsük.
    50
  13. 13. A 10-12. igénypontok bármelyike szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy a fotolabilis keresztkötőt, melynek nukleofil vagy elektrofíl végcsoportja van, használjuk a szerves szilánnal végzett reakcióban.
  14. 14. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti esz55 köz, azzal jellemezve, hogy a ligandumoknak egy olyan felszínhez való immobilizálásával állítható elő, mely a ligandumok kovalens kötődését elősegítő makromolekulákkal derivált, úgymint polisztirén-latex-részecskék, dendrimerek vagy polietilénglikolt tartalmazó ké60 miai csoportok.
    HU 220 777 Bl
  15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eszköz, azzal jellemezve, hogy tartalmaz olyan anyagokhoz kötődő ligandumokat, melyek jelenléte interferál egy elemzendő anyag vizsgálatával.
  16. 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti készülék alkalmazása multi-analyte vizsgálatban.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az alkalmazás tartalmazza a helyek megfigyelését, melyekhez egy elemzendő hozzákötődik és/vagy nem kötődik, és ez az információ összefüggés- 10 ben van a lígandokkal.
  18. 18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az magában foglalja egy hátulról megvilágított Charge Coupled Device (CCD) képanalizáló használatát, mely alkalmas egy kemolumin- 15 eszcens fényreakció kimutatására, és ahol a kimutatandó fény hullámhossza kisebb mint 450 nm.
  19. 19. A 16-18. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy abban az elemzendő anyagokat a következő csoportból választjuk ki: antibiotikumok, hormonok, szívsérülések markerei, fertőző
    5 betegségek markerei, allergiamarkerek, kábítószerek, enzimek, vírusok, nukleotidok és peptidek.
  20. 20. A 16-19. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy abban az elemzendő mintákat a teljes vér, a szérum, a plazma, a vizelet, az ürülék, az epe, a szövet vagy a táplálék képezi.
  21. 21. Rendszer multi-analyte analízisre, azzal jellemezve, hogy tartalmaz az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti eszközt, egy transzlációs munkafelületet, egy mintaadagoló rendszert, egy folyékony reagenst szállító rendszert, egy hőmérséklet-szabályzóit sötétdobozt, egy CCD kamerát és egy képfeldolgozó berendezést.
HU9800920A 1997-04-21 1998-04-20 Több anyag szimultán elemzésére szolgáló eszközök és berendezések HU220777B1 (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97302707 1997-04-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9800920D0 HU9800920D0 (en) 1998-06-29
HUP9800920A1 HUP9800920A1 (hu) 1998-10-28
HU220777B1 true HU220777B1 (hu) 2002-05-28

Family

ID=8229307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9800920A HU220777B1 (hu) 1997-04-21 1998-04-20 Több anyag szimultán elemzésére szolgáló eszközök és berendezések

Country Status (32)

Country Link
US (1) US6498010B1 (hu)
JP (1) JP4209494B2 (hu)
KR (1) KR100585548B1 (hu)
CN (1) CN1178063C (hu)
AR (1) AR015110A1 (hu)
AT (1) ATE289684T1 (hu)
AU (1) AU713388B2 (hu)
BR (1) BR9800655A (hu)
CA (1) CA2235183C (hu)
CZ (1) CZ297165B6 (hu)
DE (1) DE69829089T3 (hu)
EG (1) EG22471A (hu)
ES (1) ES2238750T5 (hu)
GB (1) GB2324866B (hu)
GE (1) GEP20022846B (hu)
HK (1) HK1012202A1 (hu)
HR (1) HRP980215A2 (hu)
HU (1) HU220777B1 (hu)
ID (1) ID20179A (hu)
MY (1) MY114814A (hu)
NO (1) NO981766L (hu)
NZ (1) NZ330227A (hu)
PL (1) PL325914A1 (hu)
PT (1) PT874242E (hu)
RU (1) RU2168174C2 (hu)
SG (1) SG87765A1 (hu)
SK (1) SK283340B6 (hu)
TR (1) TR199800737A1 (hu)
TW (1) TWI225928B (hu)
UA (1) UA54400C2 (hu)
YU (1) YU49328B (hu)
ZA (1) ZA983345B (hu)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9800655A (pt) * 1997-04-21 1999-08-10 Randox Lab Ltd Dispositivo de estado sólido para efetuar ensaios com múltiplos analisados seu uso e e sistema para análise de múltiplos analisados
US20060029926A1 (en) * 1998-05-06 2006-02-09 Metrika, Inc. Blocking compositions for immunoassays
JP4261661B2 (ja) * 1999-01-28 2009-04-30 キヤノン株式会社 プローブ結合基板、プローブ結合基板の製造方法、プローブアレイ、標的物質の検出方法、サンプル中の一本鎖核酸の塩基配列を特定する方法、及びサンプル中の標的物質の定量方法
US6326083B1 (en) * 1999-03-08 2001-12-04 Calipher Technologies Corp. Surface coating for microfluidic devices that incorporate a biopolymer resistant moiety
CA2378742C (en) * 1999-07-14 2010-06-01 Spectral Diagnostics, Inc. Preparation of spheres for diagnostic tests
AUPR005600A0 (en) * 2000-09-12 2000-10-05 University Of Sydney, The Diagnostic assay
GB0027064D0 (en) * 2000-11-06 2000-12-20 Randox Lab Ltd Multi-analyte immunoassay
US6649078B2 (en) * 2000-12-06 2003-11-18 The Regents Of The University Of California Thin film capillary process and apparatus
GB0102357D0 (en) * 2001-01-30 2001-03-14 Randox Lab Ltd Imaging method
AU2002322458A1 (en) 2001-07-13 2003-01-29 Nanosphere, Inc. Method for immobilizing molecules onto surfaces
GB0120202D0 (en) 2001-08-18 2001-10-10 Psimedica Body fluid collection and analysis
US7097882B2 (en) * 2001-08-21 2006-08-29 Samsung Sdi Co., Ltd. Substrate for immobilizing physiological material, and method of fabricating same
GB0124338D0 (en) * 2001-10-10 2001-11-28 Randox Lab Ltd Biochips
US6780602B2 (en) * 2001-11-01 2004-08-24 Microbiosystems, Limited Partnership Taxonomic identification of pathogenic microorganisms and their toxic proteins
KR100450191B1 (ko) * 2001-12-28 2004-10-02 삼성에스디아이 주식회사 생체물질 고정용 기판 및 이의 제조방법
EP1495326A1 (de) * 2002-04-12 2005-01-12 Micronas GmbH Verfahren zum immobilisieren von molekülen auf oberflächen
US20030208936A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-13 Lee Charles Hee Method for manufacturing embroidery decorated cards and envelopes
US20040115830A1 (en) * 2002-09-25 2004-06-17 Igor Touzov Components for nano-scale Reactor
US7070922B2 (en) * 2002-12-04 2006-07-04 International Business Machines Corporation Surface treatment
US20040129676A1 (en) * 2003-01-07 2004-07-08 Tan Roy H. Apparatus for transfer of an array of liquids and methods for manufacturing same
US6972148B2 (en) * 2003-06-23 2005-12-06 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Glove having improved donning characteristics
US7998435B2 (en) 2003-09-19 2011-08-16 Life Technologies Corporation High density plate filler
US7695688B2 (en) * 2003-09-19 2010-04-13 Applied Biosystems, Llc High density plate filler
US8277760B2 (en) 2003-09-19 2012-10-02 Applied Biosystems, Llc High density plate filler
US9492820B2 (en) 2003-09-19 2016-11-15 Applied Biosystems, Llc High density plate filler
US7407630B2 (en) 2003-09-19 2008-08-05 Applera Corporation High density plate filler
EP1682261B1 (en) 2003-11-12 2012-08-15 BIO-RAD Haifa Ltd. Method for carrying out multiple binding reactions in an array format
WO2005064331A1 (en) * 2003-12-31 2005-07-14 Council Of Scientific And Industrial Research Method and kit for pesticide analysis
US20090010819A1 (en) * 2004-01-17 2009-01-08 Gyros Patent Ab Versatile flow path
US8592219B2 (en) 2005-01-17 2013-11-26 Gyros Patent Ab Protecting agent
US7723124B2 (en) * 2004-02-09 2010-05-25 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method for the rapid diagnosis of targets in human body fluids
US20140031249A1 (en) * 2004-07-20 2014-01-30 Sqi Diagnostics Systems Inc. Multiplex measure of isotype antigen response
US7229782B1 (en) 2004-08-03 2007-06-12 Labone, Inc. Antibodies specific to multiple beta blockers and methods for their use
EP1657235B1 (en) 2004-11-10 2011-09-21 Randox Laboratories Ltd. Phenethanolamine-derived haptens, immunogens and conjugates comprising them and antibodies recognising said immunogenes and conjugates
FR2879483B1 (fr) * 2004-12-20 2007-04-27 Commissariat Energie Atomique Procede pour augmenter l'hydrophobicite d'un revetement externe d'un dispositif d'analyse, tel qu'une biopuce, un tel dispositif et procedes pour sa fabrication
US7396689B2 (en) * 2005-02-04 2008-07-08 Decision Biomarkers Incorporated Method of adjusting the working range of a multi-analyte assay
US8445293B2 (en) * 2005-02-09 2013-05-21 Rapid Pathogen Screening, Inc. Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays
EP1712914A1 (fr) * 2005-04-14 2006-10-18 Unisensor S.A. Procédé in vitro pour la detection et l'identification simultanées d'antibiotiques de classes differentes et trousse de diagnostic correspondante
EP1787699A1 (en) * 2005-11-17 2007-05-23 Vicam, L.P. Multi-analyte affinity column
KR100722321B1 (ko) 2005-12-28 2007-05-28 성균관대학교산학협력단 모세관력 리소그래피와 자기조립단분자막을 이용한 단백질패턴 형성 방법 및 이를 이용하여 제조된 단백질칩
US8084765B2 (en) * 2007-05-07 2011-12-27 Xerox Corporation Electronic device having a dielectric layer
US9121843B2 (en) 2007-05-08 2015-09-01 Trustees Of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
JP5255247B2 (ja) * 2007-09-04 2013-08-07 富士フイルム株式会社 基質の結合と反応生成物を同時に検出できるバイオセンサー
CN101939636B (zh) 2008-05-08 2013-05-08 株式会社日立高新技术 自动分析装置
WO2010009307A2 (en) 2008-07-16 2010-01-21 Children's Medical Center Corporation Organ mimic device with microchannels and methods of use and manufacturing thereof
US9562905B2 (en) 2009-07-29 2017-02-07 Radox Laboratories Limited Method for detection of, or the risk of, bladder cancer
WO2011040996A1 (en) 2009-09-30 2011-04-07 Quantapore, Inc. Ultrafast sequencing of biological polymers using a labeled nanopore
US20140199764A1 (en) * 2011-05-09 2014-07-17 President And Fellows Of Harvard College Microfluidic module and uses thereof
US9566560B2 (en) 2011-10-06 2017-02-14 Illumina, Inc. Array domains having rotated patterns
US9725687B2 (en) 2011-12-09 2017-08-08 President And Fellows Of Harvard College Integrated human organ-on-chip microphysiological systems
GB201214440D0 (en) 2012-08-13 2012-09-26 Randox Lab Ltd Kidney disease biomarker
US20140072959A1 (en) 2012-09-12 2014-03-13 Force Diagnostics, Inc. Rapid tests for insurance underwriting
GB201218570D0 (en) 2012-10-16 2012-11-28 Randox Lab Ltd Method
US9651539B2 (en) 2012-10-28 2017-05-16 Quantapore, Inc. Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment
CA2910019A1 (en) 2013-05-24 2014-11-27 Quantapore, Inc. Nanopore-based nucleic acid analysis with mixed fret detection
BE1022360B1 (fr) * 2013-11-19 2016-03-24 Tekinvest Sprl Puits de microplaque, support de maintien et procede pour la detection d'analytes
US10288618B2 (en) * 2014-04-09 2019-05-14 Randox Laboratories Ltd. Diagnosis of cancer by detecting dimeric IL-18
WO2015161219A1 (en) * 2014-04-17 2015-10-22 SFC Fluidics, Inc. Microdialysis platform
ES2686736T3 (es) 2014-07-01 2018-10-19 Randox Laboratories Ltd. Combinaciones de biomarcadores para su uso en la detección del cáncer de páncreas
AU2015330841B2 (en) 2014-10-10 2019-08-15 Quantapore, Inc. Nanopore-based polymer analysis with mutually-quenching fluorescent labels
EP3209800B1 (en) 2014-10-24 2022-02-16 Quantapore, Inc. Efficient optical analysis of polymers using arrays of nanostructures
CN107847933B (zh) 2015-07-15 2021-02-05 Hycor生物医学有限责任公司 可定制仪器
GB201519142D0 (en) 2015-10-29 2015-12-16 Randox Lab Ltd Method
GB201520341D0 (en) * 2015-11-18 2015-12-30 Randox Lab Ltd And Randox Teoranta Improvements relating to substrates for the attachment of molecules
WO2018002362A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Randox Laboratories Ltd Measurement of fabp for diagnosis
EP3482196B1 (en) 2016-07-05 2022-02-23 Quantapore, Inc. Optically based nanopore sequencing
GB201818744D0 (en) 2018-11-16 2019-01-02 Randox Laboratories Ltd Detection of bladder cancer
GB201910730D0 (en) 2019-07-26 2019-09-11 Randox Teoranta Bovine Pathogen Array
GB201916186D0 (en) 2019-11-07 2019-12-25 Randox Laboratories Ltd Biomarkers for aiding in the diagnosis of mental disorders
GB202014755D0 (en) 2020-09-18 2020-11-04 Randox Laboratories Ltd Methods to determine coronavirus infectivty status
GB202019663D0 (en) 2020-12-14 2021-01-27 Randox Laboratories Predictive biomarkers for risk of bladder cancer in diabetes patients
GB202104287D0 (en) 2021-03-26 2021-05-12 Randox Laboratories Method for determining prognosis of chronic kidney disease
GB202111635D0 (en) 2021-08-13 2021-09-29 Randox Laboratories Risk prediction model for prostate cancer
GB202114088D0 (en) 2021-10-01 2021-11-17 Randox Laboratories Detection of bladder cancer in males
GB202203639D0 (en) 2022-03-16 2022-04-27 Randox Laboratories Ltd Standardisation method for glycosylation arrays
GB202204413D0 (en) 2022-03-29 2022-05-11 Randox Laboratories Ltd Markers for progression of inflammatory liver disease

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AR231590A1 (es) * 1981-04-29 1984-12-28 Ciba Geigy Ag Dispositivo de analisis inmunologico y procedimiento para obtenerlo
SE431620B (sv) 1982-07-07 1984-02-20 Stojan Popovic Suganordning, speciellt avsedd att anvendas som tennsug vid lodningsarbeten
US4591570A (en) * 1983-02-02 1986-05-27 Centocor, Inc. Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens
GB8314523D0 (en) * 1983-05-25 1983-06-29 Lowe C R Diagnostic device
US4745075A (en) * 1984-09-06 1988-05-17 Burroughs Wellcome Co. Diagnostic test methods
US4829010A (en) * 1987-03-13 1989-05-09 Tanox Biosystems, Inc. Immunoassay device enclosing matrixes of antibody spots for cell determinations
GB8803000D0 (en) * 1988-02-10 1988-03-09 Ekins Roger Philip Determination of ambient concentrations of several analytes
SU1696399A1 (ru) 1988-07-01 1991-12-07 Государственный научно-исследовательский и проектный институт по обогащению руд цветных металлов "Казмеханобр" Способ очистки сточных вод от ионов т желых металлов
WO1990001564A1 (en) * 1988-08-09 1990-02-22 Microprobe Corporation Methods for multiple target analyses through nucleic acid hybridization
US5077210A (en) * 1989-01-13 1991-12-31 Eigler Frances S Immobilization of active agents on substrates with a silane and heterobifunctional crosslinking agent
US5120662A (en) * 1989-05-09 1992-06-09 Abbott Laboratories Multilayer solid phase immunoassay support and method of use
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
FR2693740B1 (fr) 1992-07-17 1994-10-14 Univ Joseph Fourier Procédé de détection tissulaire ou cellulaire mettant en Óoeuvre des réactifs chimiluminescents.
EP0653065B1 (en) 1992-08-03 2002-10-30 Marconi Optical Components Limited Separation method
JPH06148188A (ja) * 1992-11-13 1994-05-27 Olympus Optical Co Ltd 免疫学的再検査方法
WO1994023298A1 (en) * 1993-03-30 1994-10-13 Terrapin Technologies, Inc. Determination of concentration by affinity titration and competitive displacement in drug delivery
ATE209782T1 (de) * 1993-05-18 2001-12-15 Univ Utah Res Found Vorrichtung und verfahren fuer homogene multianalyt-immuno-assays
GB9325100D0 (en) * 1993-12-07 1994-02-02 Univ Court Of The University O Device
US5814565A (en) * 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
US5624711A (en) * 1995-04-27 1997-04-29 Affymax Technologies, N.V. Derivatization of solid supports and methods for oligomer synthesis
EP0768530A1 (en) * 1995-10-16 1997-04-16 Nippon Paint Co., Ltd. Process for assaying biological substance
BR9800655A (pt) * 1997-04-21 1999-08-10 Randox Lab Ltd Dispositivo de estado sólido para efetuar ensaios com múltiplos analisados seu uso e e sistema para análise de múltiplos analisados
EP0874242B2 (en) * 1997-04-21 2009-06-03 Randox Laboratories Ltd. Device and apparatus for the simultaneous detection of multiple analytes

Also Published As

Publication number Publication date
CA2235183A1 (en) 1998-10-21
HUP9800920A1 (hu) 1998-10-28
DE69829089T3 (de) 2009-11-26
UA54400C2 (uk) 2003-03-17
CZ116998A3 (cs) 1998-11-11
AU713388B2 (en) 1999-12-02
AU6198898A (en) 1998-10-22
HU9800920D0 (en) 1998-06-29
JP4209494B2 (ja) 2009-01-14
NO981766D0 (no) 1998-04-20
ID20179A (id) 1998-10-22
HRP980215A2 (en) 1999-02-28
JPH10319011A (ja) 1998-12-04
GB2324866B (en) 2001-11-14
YU49328B (sh) 2005-07-19
SK283340B6 (sk) 2003-06-03
EG22471A (en) 2003-02-26
PL325914A1 (en) 1998-10-26
DE69829089T2 (de) 2005-12-29
NO981766L (no) 1998-10-22
CN1178063C (zh) 2004-12-01
BR9800655A (pt) 1999-08-10
CA2235183C (en) 2009-08-11
NZ330227A (en) 1999-10-28
TWI225928B (en) 2005-01-01
CN1215167A (zh) 1999-04-28
TR199800737A1 (xx) 1998-11-23
SK51098A3 (en) 1998-11-04
KR100585548B1 (ko) 2007-07-06
KR19980081571A (ko) 1998-11-25
ATE289684T1 (de) 2005-03-15
US6498010B1 (en) 2002-12-24
AR015110A1 (es) 2001-04-18
GB9808309D0 (en) 1998-06-17
RU2168174C2 (ru) 2001-05-27
ZA983345B (en) 1999-04-21
GB2324866A (en) 1998-11-04
CZ297165B6 (cs) 2006-09-13
MX9803102A (es) 1998-12-31
SG87765A1 (en) 2002-04-16
MY114814A (en) 2003-01-31
YU17498A (en) 1999-11-22
ES2238750T3 (es) 2005-09-01
DE69829089D1 (de) 2005-03-31
ES2238750T5 (es) 2009-11-03
PT874242E (pt) 2005-06-30
HK1012202A1 (en) 1999-07-30
GEP20022846B (en) 2002-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220777B1 (hu) Több anyag szimultán elemzésére szolgáló eszközök és berendezések
EP0874242B1 (en) Device and apparatus for the simultaneous detection of multiple analytes
CN100386627C (zh) 过滤型蛋白芯片
EP2541248B1 (en) Preparation method of antigen-immobilized immunofluorescence slide, and immunofluorescence slide prepared thereby
US4689310A (en) Methods for attaching ligands or anti-ligands to a solid phase
US7947461B2 (en) Colloidal silica particle containing light-absorbing substance, nano light-absorbing material, absorption labeling nanobead kit, and method for detection or quantification of biological molecule using the colloidal silica particle containing light-absorbing substance
US4791069A (en) Methods for attaching ligands or anti-ligands to a solid phase
JP2002530661A (ja) 光学分析用の改善された感度を有するマルチウェルアセンブリ
AU1364300A (en) Quantitative determination of analytes in a heterogeneous system
JP2000065832A (ja) フィルター状生物学的特異反応測定用担体およびそれを用いた測定方法
EP0483309A1 (en) Solid support having antibodies immobilized thereon
JP2014062814A (ja) 抗原固定化免疫蛍光スライドの製造方法及びそれにより製造される免疫蛍光スライド
MXPA98003102A (es) Dispositivo y aparato para la deteccion simultanea de analitos multiples
US20100021930A1 (en) Application of surface plasmon resonance technology to maternal serum screening for congenital birth defects
JP2024500122A (ja) 分析物を検出する方法
WO2006041392A1 (en) Preparation and use of a reactive solid support surface
Burdick Evanescent-wave biosensors

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees