MXPA98003102A - Dispositivo y aparato para la deteccion simultanea de analitos multiples - Google Patents

Abstract

Se describe un dispositivo de estado sólido para llevar a cabo análisis de analitos múltiples, que comprende un sustrato y una multiplicidad de sitios de reacción discretos, cada uno lleva un ligando enlazado covalentemente al sustrato, en donde la superficie del sustrato entre los sitios de reacción es inerte con respecto al analito. Tal dispositivo se puede obtener mediante un proceso de activación de la superficie del sustrato y la aplicación de arreglo de ligandos sobre lasáreas discretas sobre la superficie. En esta especificación, las siguientes abreviaturas son:APTES=Aminopropiltrietoxisilano, CK-MB=Sub-unidad MB cratinacinasa, HRPO=peróxido de rábano, LC-sulfo-NHS=sulfo-N-hidroxisuccinimida de cadena larga, FITC:Isotiocarbamato fluorescína.

Description

DISPOSITIVO Y APARATO PARA LA DETECCIÓN SIMULTANEA DE ANALITOS MÚLTIPLES DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona con un dispositivo y aparato para la detección simultánea de analitos múltiples. Tradicionalmente, los analitos diferentes estructuralmente se han analizado por medio de métodos específicos, por ejemplo pruebas inmunológicas de enzimas, cromatografía líquida de alto desempeño, cromatografía de gases, métodos enzimáticos y métodos clorimétricos . Estos métodos son de manera predominante métodos de un analito de una prueba. La automatización de los métodos analíticos se ha enfocado en general en los analizadores de acceso aleatorio y por lotes, en donde se llevan a cabo múltiples análisis sobre muestras de prueba individuales utilizando métodos de prueba individuales secuenciales. Esto necesita el uso de múltiples paquetes de juegos o conjuntos de pruebas individuales. Además, en el análisis se requiere el empleo de varios tipos de equipo, por ejemplo analizadores de química clínicos HPLC,GC S e instrumentos de pruebas inmunológicas automatizados o instrumentos de absorción atómica. Un sistema de analitos múltiples debe involucrar un medio para proporcionar un análisis simultáneo de varios analitos en una muestra de prueba. Este análisis debe proporcionar resultados, los cuales identifiquen los analitos individuales y permitan la - cuantificación de cada analito individual en aquella muestra de prueba. Un método de análisis de analitos múltiples es frecuen emente reivindicado, pero los criterios dados no se satisfacen en general plenamente. En un sistema de analitos múltiples, un sustrato típico contiene una pluralidad de sitios de reacción de prueba individuales, cada uno posee un ligando de enlace diferente. La muestra de prueba se pone en contacto con cada una de las zonas de reacción y después de esto se incrementa un rango de técnicas de detección para identificar el analito presente. Es importante que el método de detección utilizado * permita la cuantificación de cada analito individual. Con el fin de producir arreglos de analitos múltiples de áreas espacialmente distintas de ligandos biológicamente activos sobre un sustrato, el procedimiento más común ha sido por medio de técnicas fotolitográficas. El sustrato es recubierto con un agente enlazante fotolábil . En teoría, este agente enlazante debe volverse reactivo solamente hacia un ligando de unión después de irradiación con una luz de una longitud de onda apropiada. La resolución espacial se obtiene mediante la colocación de una máscara física (normalmente fabricada de cromo) sobre el sustrato. La figura geométrica o configuración de los orificios en la máscara determina la configuración de las regiones de enlace sobre el sustrato. Para cada ligando biológico al ser inmovilizado, el protocolo general es : irradiación de los primeros sitios, incubación de sustrato irradiado con un primer ligando al ser inmovilizado, lavado para retirar el ligando enlazado holgadamente, bloqueo de los sitios que no reaccionaron activados mediante la etapa de irradiación e irradiación de las regiones en donde el segundo ligando biológico va a ser inmovilizado, con las etapas subsecuentes repetidas como para el primer ligando. La resolución espacial es determinada mediante el control del sitio de irradiación, ya sea al controlar el sitio de irradiación por medio de una fuente de luz UV coherente de un láser o mediante una diversidad de máscaras físicas y una fuente de luz incoherente. Esto hace a la tarea de inmovilizar una pluralidad de ligandos biológicos un proceso que toma mucho tiempo. Otra^ desventaja del procedimiento fotolitográfico es la necesidad de máscaras físicas caras o una fuente de luz a base de láser. Además, hay un alto grado de enlace no especifico. Por ejemplo, el uso de arilazidas, floro-arilazidas y benzofenonas ha estado asociado con un alto de grado de enlace no específico. Un alto enlace no especifico se tiene como resultado en un fondo de análisis que es alto, lo que reduce significativamente el rango dinámico de análisis de analitos múltiples. El enlace no específico se debe en gran medida a la absorción pasiva de las moléculas a la superficie del agente enlazante fotolábil no activado a través de las interacciones iónicas, las fuerzas de Vander Waals, etc. La WO-A-9516204 describe un procedimiento fotolitográfico para reducir los problemas asociados con el enlace altamente no especifico. En este procedimiento, la molécula enlazante de la superficie fue avidina y la molécula fotolábil fue fotobiotina o una derivada de la misma. En tanto que se reivindica el enlace no especifico reducido, esta técnica todavía requiere las secuencias que llevan mucho tiempo resumidas anteriormente. La inmovilización de una pluralidad de 20 ligandos biológicos separados, requeriría un « total de 80 etapas, suponiendo que el requerimiento básico de irradiación, enlace, bloqueo y etapas de lavado para cada ligando separado va ser inmovilizado. También se puede obtener la resolución espacial mediante adsorción pasiva. Por ejemplo, la US-A-5432099 describe el enlace por el ligando a la superficie del sustrato a través de una combinación de interacciones iónicas, interacciones hidrofóbicas y fuerzas de Vander Waals. Los procesos de adsorción pasiva son dependientes de los cambios en el pH, la temperatura, la fuerza iónica y del tipo del sustrato utilizado, lo que hace al proceso de enlace más difícil de controlar. La desventaja principal con este procedimiento es la susceptibilidad de una proporción del ligando débilmente inmovilizado para ser desabsorbido durante la etapa de lavado o etapas de incubación de la prueba biológica, para dar como resultado una precisión intra e inter-análisis deficiente. Un agente formador de enlaces cruzados o enlazador en cruz utilizado en muchas publicaciones, ha sido el glutaraldehido. Este enlazador presenta muchas desventajas, en las que se incluyen la tendencia de las proteínas a formar enlaces cruzados los cual es probable que altere la función de la proteína. Una desventaja adicional es que el procedimiento de acoplamiento debe incluir una etapa de reducción, la cual toma mucho tiempo y es potencialmente muy peligrosa, por ejemplo, si se utiliza cianoborohidruro de sodio como el agente reductor. Enlazadores bifuncionales han sido utilizados, pero en muchos casos, estos involucran la necesidad de grupos sulfhidrilo libres en la proteína al ser enlazada. Esto necesita la modificación de la proteína antes de la inmovilización. En un análisis de analitos múltiples es deseable proporcionar resultados cualitativos y cuantitativos. Análisis de analitos múltiples han estado disponibles para los antibióticos, por ejemplo. Estos están basados extensamente en análisis de inhibición microbianos, en donde un antibiótico presente en la muestra, inhibe el crecimiento microbiano y forma una zona de separación, la cual es proporcional a la concentración del antibiótico presente en la muestra. Sin embargo, este método no puede proporcionar ninguna indicación en cuanto a la identidad del antibiótico o una determinación exacta de su concentración. Los métodos de inhibición microbiana también son muy lentos, el proceso completo lleva varios días. Los métodos de selección química tales como cromotografía líquida de alto desempeño (HPLC) o espectometría de masas de cromatografía de gas/líquido (GCMS/LCMS) se esfuerzan por acomodar o compensar los extremos de diversidad/polaridad estructural de cada grupo antibiótico, por ejemplo, penicilinas, sulfonamidas, * aminoglucosidos, tetraciclinas, etc. Además, los métodos cromatográficos necesitan una extensa separación de la muestra con el fin de que las relaciones señal a ruido sean de tal manera que se puedan obtener los límites de detección requeridos . Los dispositivos de analitos múltiples disponibles incluyen el Triage (véase Clinical Chemistry 38 (9) : 1678-1684 (1992)) y Advisor (véase Clinical Chemistry 39(9): 1899-1903 (1993)). Estos dispositivos son sólo apropiados para el análisis cualitativo. El dispositivo Triage es para la detección simultánea de un panel de adicción a siete fármacos en la orina humana. Cada dispositivo es solamente capaz de analizar una muestra de orina. Al final del procedimiento, el operador examina visualmente cada una de las zonas de prueba especificas del medicamento en cuanto a la presencia de una barra roja. Todas las etapas del protocolo del análisis se deben llevar a cabo manualmente por el operador. Tampoco hay ningún original del resultado de prueba disponible. El dispositivo Advisor es similar en su aplicación a aquel del dispositivo Triage. El dispositivo Advisor selecciona cinco clases diferentes de adicciones a fármacos. El dispositivo opera utilizando los principios de análisis de aglutinación, con canales individuales para cada medicamento. Todas las etapas del protocolo del análisis se llevan a cabo por el operador. Las muestras negativas tienen partículas aglutinadas, mientras que las muestras de medicamento positivas proporcionan una configuración de partículas no agregadas . La mayoría de los dispositivos biodetectores/microfabricados para la aplicación biológica han empleado el silicio como el sustrato. Otros utilizan sustratos de vidrio o cuarzo. El silicio tiene una estructura cristalográfica muy controlada con planos cristalinos bien definidos. La uniformidad del sustrato de silicio lo hace una elección ideal para el desarrollo de un dispositivo de pruebas de analitos múltiples.

Sin embargo, los sustratos oscuros tales como el silicio dan los llamados efectos del cuerpo negro. En el caso de detección mediante fluorescencia, en la cual un fluoróforo es excitado utilizando la luz de una longitud de onda particular, un sustrato oscuro puede absorber la energía de luz de excitación incidente, para disminuir así la emisión de luz del fluoróforo. De acuerdo con la presente invención, un dispositivo para llevar a cabo análisis de analitos múltiples, comprende un sustrato y una multiplicidad de sitios de reacción discretos, cada uno lleva un ligando enlazado covalentemente al sustrato y en el cual la superficie del sustrato entre los sitios de reacción es inerte con respecto al analito. Así, esta invención proporciona un dispositivo para analitos múltiples de estado sólido, el cual exhibe poco o ningún enlace no específico. Un dispositivo de la invención puede ser preparado mediante la activación de la superficie de un sustrato apropiado y la aplicación de un arreglo de ligandos sobre los sitios discretos sobre la superficie. Si se desea, las otras áreas activas pueden ser bloqueadas. Los ligandos pueden ser aplicados en un sistema acuoso y se prefiere si las otras áreas se vuelven hidrofóbicas. Los ligandos se pueden enlazar al sustrato vía un enlazador. En particular, se prefiere que la superficie activada se haga reaccionar sucesivamente con un organosilano, un enlazador bifuncional y el ligando. Como parte de esta invención, los agentes formadores de enlaces cruzados bifuncionales, han sido utilizados para proporcionar técnicas de acoplamiento altamente eficiente entre los organosilanos inmovilizados covalentemente entre sustratos de silicio o cerámica microfabricados . Los ligandos biológicos pueden así ser inmovilizados en los arreglos de analitos múltiples. Esta invención elimina la necesidad de tipos de reactivos de pruebas individuales múltiples y también varios tipos de instrumentos, para facilitar de esta manera la detección simultánea de análisis múltiples en una sola muestra. La invención proporciona un analizador integrado individual capaz de proporcionar la detección simultánea de un alto rango de compuestos químicos. Además, los reactivos de prueba pueden ser suministrados en un formato combinado para un panel particular de analitos. Como parte de esta invención, una pluralidad de ligandos biológicos se inmovilizan en una configuración espacialmente definida de puntos o líneas por medio del surtido microfluido del ligando sobre un sustrato activado químicamente. El ligando biológico se une covalentemente al sustrato. La eficiencia de acoplamiento del ligando biológico puede ser de tal manera que la reacción química se consume en el transcurso de unos pocos minutos. El procedimiento de inmovilización puede asegurar que el ligando biológico retenga su actividad biológica ya sea a corto o a largo plazo. Esta invención también proporciona un sistema analizador integrado para la detección simultánea de un amplio rango de analitos en un formato de analitos múltiples.

El sistema analizador está diseñado para una máxima conveniencia del usuario final, con la capacidad de obtener identificación de analitos múltiples y la cuantificación de analitos múltiples a partir de cada muestra de prueba. El sistema analizador preferido consiste de una combinación de una plataforma de translación X-Y, una unidad de manipulación * de la muestra, medios de control de manipulación /flujo de líquido, una caja oscura controlada mediante la temperatura, una cámara CCD y elementos de programación para el procesamiento de imágenes. La plataforma puede estar asociada con un motor de velocidad gradual o de paso a paso, para obtener una exactitud posicionada digamos de 10 µm para la colocación del dispositivo o dispositivos en cada etapa del procedimiento analítico. DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos anexos: la Figura 1 muestra la formación de una superficie de sustrato no uniforme; la Figura 2 muestra la activación química de los grupos sobre la superficie de un sustrato,- la Figura 3, 5 y 6 muestran la inmovilización covalente de un ligando en la superficie de un sustrato,- la Figura 4 muestra el uso de partículas de látex en la superficie de un sustrato; las Figuras 7-11 ilustran dispositivos para la incorporación de los sustratos que incrementan la invención; las Figuras 12-14 son vistas esquemáticas de un sistema apropiado para el análisis de un dispositivo de la invención; la Figura 15 muestra las curvas de calibración para los analitos sometidos a análisis por medio de la invención. El sustrato que se utiliza en un dispositivo de esta invención, puede ser por ejemplo de silicio, cuarzo, vidrio o cerámica. Los sustratos de cerámica (oxido de aluminio) proporcionan una alternativa excelente a los sustratos de silicio, puesto que se puede emplear exitosamente la detección fluorescente y quimioluminiscente. Estos hallazgos fueron inesperados, puesto que la cristalografía de los materiales de cerámica no los haría una elección de sustrato inmediata. Un sustrato de cerámica puede ser fabricado para proporcionar un rango de tamaño de grano (1 a 30 µm)-. El tamaño de partículas preferida del sustrato utilizado en esta invención es menor a 20 µm, de preferencia menor a 10 µm. El tamaño de partículas reducido imparte mucha uniformidad superficial mejorada, lo cual a su vez proporciona desempeño mejorado de los análisis biológicos. Otras características importantes de los sustratos de cerámica, incluyen tolerancia de la topografía superficial, porosidad, hermeticidad al vacío y absorción cero de agua. El material de cerámica preferido consiste de 94% de alúmina (A1203) con un tamaño de partícula en el rango de 4-8 µm, el material es hermético al vacío y tiene una topografía superficial de 0.6 a 0.8 µm cuando se somete a molienda. La uniformidad superficial puede ser mejorada mediante un proceso de pulido, para producir una superficie * con variación de 0.4-0.5 µm. Una mejora adicional se obtiene mediante rectificación y pulido, para producir una superficie con una variabilidad de 0.05-0.1 µm. Se ha encontrado que el desempeño de ciertos sustratos de cerámica es dependiente de las características del tamaño de grano. Se ha encontrado un desempeño de análisis superior para materiales de cerámica que tienen un tamaño de grano de hasta 8 µm, por ejemplo 4-8 µm. No se ha encontrado que los resultados para los materiales de tamaño de grano más altos sean satisfactorios. Los sustrato de cerámica con tamaños de grano de aproximadamente 1 µm fueron evaluados y no proporcionaron resultados mejorados, con respecto a aquellos obtenidos para el sustrato de 4-8 µm. Esto es ventajoso puesto que el costo del material es considerablemente más alto (aproximadamente 5 veces) para la cerámica de partícula muy pequeña. Se producen sustratos de silicio apropiados con un óxido de película de un espesor exacto, por ejemplo una tolerancia de ±2 nm para una película de 100 nm. La película de óxido puede ser de 50-500 nm de espesor, de preferencia menor de 200 nm, de mayor preferencia en la región de 100 nm. El sustrato puede ser formado como parte de un dispositivo microfabricado, micromaquinado, de estado sólido desarrollado para un amplio rango de pruebas de panel para aplicaciones de diagnóstico veterinario y clínico. Cada dispositivo de prueba de estado sólido tiene un arreglo de regiones de reacción. Cada región de reacción es especifica para una analito individual. La región de reacción puede estar en forma de un punto, canal de precio, pozo, cavidad, o cámara. Las regiones de reacción son fabricadas mediante la inmovilización de moléculas biológicas sobre el sustrato. Normalmente, un dispositivo de la invención es de hasta 1 cm2 de área. El área de cada sitio de reacción será usualmente menor de 1 mm2. El sustrato sólido es fabricado de preferencia para proporcionar una red intrincada de orificios, cámaras, canales, pozos, depresiones, etc. También puede ser ventajoso crear pilares o columnas dentro del canal o cavidad. Tales irregularidades pueden ayudar a obtener una máxima interacción de área superficial entre los ligandos biológicos enlazados y los reactivos de prueba para reducir extensamente los tiempos de incubación para las pruebas inmunológicas competitivas y las pruebas inmunológicas emparedadas semejantes . Como una alternativa o además de las depresiones o canales en el sustrato de silicio o cerámica, la superficie puede también ser microfabricada para incorporar cámaras/recipiente/canales de mezclado de nanolitros o microlitros. Por ejemplo, la superficie de silicio se oxida primero para formar una capa de óxido. Luego se deposita una capa de recubrimiento fotoprotector de la cual se crea la configuración deseada. Después de la formación de la configuración sobre la capa de óxido, se retira la capa fotoprotectora. Luego el silicio se ataca mediante ácido, por ejemplo HF y la película de óxido se retira. Finalmente, la película de óxido se cultiva uniformemente sobre toda la plaqueta u oblea de silicio. Un proceso ilustrativo se muestra en la Figura 1. En la etapa (i) , una. plaqueta u oblea 1 de silicio se oxida para proporcionar una capa 2 de óxido; en la etapa (ii) , se deposita una capa 3 fotoprotectora; en la etapa (iii) , la aplicación de luz proporciona una capa de óxido configurada o con figura geométrica; y la etapa (iv) la capa fotoprotectora -se retira; y en la etapa (v) , la oblea o plaqueta 1 se ataca mediante ácido, en la etapa (vi) , la película de óxido se retira; y en la etapa (vii) , se vuelve a formar una película 2a de óxido continua. Se prefiere en la inmovilización covalente de los ligandos biológicos. Se pueden utilizar interacciones de adsorción pasiva, pero son susceptibles a los cambios en el pH, la temperatura y la fuerza iónica y pueden dar como resultado en algunos casos la liberación de los ligandos enlazados débilmente durante las etapas de incubación y lavado, para contribuir así a una reproducibilidad del análisis deficiente. Es por supuesto deseable que el ligando biológico retenga máxima actividad, después del procedimiento de inmovilización. Antes de cualquier activación química, la superficie de los sustratos debe ser limpiada completamente. La primera etapa involucra de preferencia la limpieza de la superficie mediante sonicación en un detergente alcalino, - seguida por el lavado exhaustivo con agua doblemente desionizada. Luego los sustratos se tratan con una solución de ácido crómico. La solución de ácido crómico limpia adicionalmente la superficie y abre los grupos de epóxidos superficiales, como se muestra en la Figura 2. Los grupos epóxidos pueden también ser abiertos mediante otros medios, por ejemplo sonicación durante 1 hora. Luego, los grupos hidroxilos de la superficie así formados, están disponibles para su derivación. Por ejemplo, como se muestra en la Figura 3, la secuencia de reacciones comprende el uso de un organosilano, luego un agente formador de enlaces cruzados bifuncional Z-R-Y, para formar un intermediario altamente reactivo y finalmente un ligando funcional, para proporcionar la inmovilización covalente. Con mayor detalle, en los organosilanos de la fórmula (RO) 3Si- (CH2)n-X, cada R es un grupo alquilo u otro grupo hidrocarbilo tal como CH3 o CH2CH3; n es un entero por ejemplo de 1 a 18; y X es un grupo funcional tal como epoxiciclohexilo, NH2, CHO, OH, SH, p-clorobencilo, m-clorobencilo, Br, Cl, -NH-CH2-CH2-NH2, 2, 3-epoxipropoxi, -N=C=0, -N=C=S o p-clorosulfonilfenilo. Estos órganosilanos se pueden escoger para proporcionar ya sea un grupo terminal reactivo, capaz de forman un enlace covalente con una molécula biológica o una porción menos reactiva, tal como NH2, en donde la activación adicional con un enlazador bifuncional es necesaria para proporcionar un grupo final apropiado. Los órganosilanos que poseen grupos funcionales electrofílicos terminales no requieren activación con un agente formador de enlaces cruzados bifuncional, puesto que los ligandos biológicos pueden ser inmovilizados covalentemente por medio de grupos nucleofílicos sobre el ligando biológico. En el caso de los órganos silanos que poseen grupos nucleofílicos, cualquiera de una multitud de formadores de enlaces cruzados bifuncionales pueden ser utilizados entonces para proporcionar un grupo químico muy reactivo por medio del cual una molécula biológica o ligando puede ser unida covalentemente. Esta invención incluye el uso de enlazadores bifuncionales los cuales pueden ser usados en la producción en masa de sustratos activados químicamente y son suficientemente estables para permitir el almacenamiento a largo plazo antes de la unión covalente de la molécula biológica o ligando enlazante. Los enlazadores preferidos son « inertes a las condiciones atmosféricas normales, en tanto que también son suficientemente reactivos para formar enlaces covalentes con grupos funcionales ligando biológico al ser inmovilizado en un periodo de tiempo muy corto (normalmente < 10 minutos) . El enlazador bifuncional puede ser por ejemplo, - fosgeno, tiofosgeno, (N,N-disuccinidimilcarbonato, xililendiamina, l, 6-diaminohexano, 1, 12-diaminododecano, 1,6- disuccionatohexano, 1, 12-diisocianatododecano, 1,4- fenilenditioisocianato, cloruro cianúrico, tereftaldeido, cloruro de p-nitrobenzoilo, ácido sulfanílico, p- toluensulfonato de 2-fluorome ilpiridinio, ácido 3- IX a inofenilborónico, ácido p-bromofenilborómico, dietilpirocarbonato, cloroformiato de etilo, p-bromonilina, p-bromofenilhidrazida, p-bromobenzaldehido, 1, 2-etilenglicol de p-bromobenzaldehido, N,N' -carbonildimidazol, cloruro de tereftaloilo, epilclohidrina, 1, 4-diyodobenceno, 1,4- dibromobenceno o un derivado de N-hidroxisuccidimida, por ejemplo de ácido p-aminobenzoico, ácido p-bromobenzoico, ácido p-bromofenilacético, ácido p-bromoetilbenzoico, ácido p-bromometilbenzoico, ácido p-formilbenzoico, ácido p- hidroximetilbenzoico, 1, 2-etilenglicol del ácido p- formilbenzoico, ácido p-bromofenilpropiónico o ácido p- hidroxifenilpropiónico. Un agente formador de enlaces cruzados fotolábil puede ser utilizado para reaccionar con un organosilano que tiene un grupo terminal nucleofílico o electrofílico. El agente formador de enlaces cruzados es por ejemplo la N-hidroxisuccidimida del ácido p-azidobenzoico o p-aminobenzofenona . En lugar de, o además de, el uso de enlazadores bifuncionales, también es ventajoso e para inmovilizar - covalentemente una capa de partículas de látex. El diámetro de las partículas de látex es de preferencia menor de 500 nm, y de mayor preferencia menor de 150 nm. Las partículas de látex pueden tener un rango de grupos funcionales, por ejemplo -CH2C1, -CHO, p-clorofenilo, p-cloroestirilo, -N=NH, -NH-NH2 o -NH2. Las partículas de látex pueden ser incubadas a una concentración de aproximadamente 0.5 a 1% p/v, con sustratos modificados con el organosilano apropiado, con o sin la presencia de un enlazador bifuncional como se describe anteriormente . La Figura 4 muestra dos esquemas de reacción para la inmovilización del látex. Cualquiera puede ser seguido por la activación del látex con un enlazador secundario y la inmovilización de una molécula biológica o la inmovilización covalante directa de por ejemplo, un anticuerpo, Una alternativa para el uso de las partículas de látex polietileno, es la inmovilización covalente de los ligandos biológicos a los derivados de polietilenglicol ya asegurados sobre un sustrato con función de silano. Por « ejemplo, derivados de PEG con dos grupos electrofílieos tales como epoxi o carbonilimidazol se hacen reaccionar con un silano que tiene un grupo -NH2 terminal, tal como APTES, sobre un sustrato de elección. Una secuencia de reacción apropiada se muestra en la Figura 5. También puede ser ventajoso inmovilizar covalentemente el ligando biológico directamente a la capa de silano, para evitar así la necesidad de la activación del silano con materiales poliméricos o enlazadores bifuncionales. Los organosilanos deben ser receptivos al ataque nucleofílico por un grupo químico (por ejemplo NH2, SH, OH o NH=NH2) sobre el ligando biológico. Los organosilanos que son apropiados para la unión del ligando biológico directo, pueden poseer grupos funcionales haluro, epoxi, isocianato, aldehido o tosilato. Tal reacción se muestra en la Figura 6, en donde E es un grupo electrofílico sobre el órganosila o. Ejemplos de E son Br, Cl, -0-CH2- CH=CH2, -NCO y p-clorosulfonilfenilo. Los organosilanos que poseen grupos electrofílieos, por ejemplo glicidoxi, también tienen la ventaja de ser menos susceptible a la polimerización durante el procedimiento de separación, debido a la ausencia de grupos nucleofílicos disponibles para el ataque de la función metoxi o etoxi del organosilano. Por consiguiente, la superficie del sustrato no debe contener organosilano polimerizado. » La química de las superficies proporciona un medio para obtener resolución especial en virtud de la rápida cinética de la formación de los enlaces covalentes entre el grupo funcional químico de la superficie y un grupo químico apropiado presente en una posición estáticamente favorable sobre la molécula biológica al ser inmovilizada. La molécula • biológica se presenta de preferencia a la superficie del sustrato mediante un surtidor microfluido en forma de una gota individual o una serie de gotas las cuales forman una línea. El volumen suministrado es del orden de 1 a 100 ni, de preferencia menor a 50 ni, por ejemplo cercano a 10 ni. La rapidez de la formación de los enlaces covalentes es tal que la inmovilización covalente se obtiene en minutos, antes de que la gota surtida o línea se evapore sobre la superficie. La exactitud posicional a la cual la gota o línea de líquido se alimenta debe tener una tolerancia de ±20 µm. Especialmente si los ligandos se aplican en agua, también es deseable desarrollar una superficie la cual sea hidrofóbica, para impedir cualquier difusión lateral de la gota o línea surtida. Esta propiedad contribuye a una excelente calidad y reproducibilidad de la gota y permite que un mayor número de puntos de moléculas biológicas sean inmovilizadas covalentemente por áreas de superficie unitaria. La presente invención supera los problemas * asociados con la fotolitografía convencional al permitir la formación de puntos espacialmente distintos de ligandos biológicos, sin el requerimiento de luz ultravioleta o máscaras físicas. Como se indica anteriormente, la resolución espacial se puede obtener mediante técnicas de microsurtido. Un factor importante es la cinética rápida de la reacción de acoplamiento covalente para asegurar un acoplamiento altamente eficiente del ligando biológico de una región espacialmente distinta, para eliminar la disgregación lateral del ligando biológico inmovilizado. Luego, las porciones químicas que no reaccionaron, sobre el sustrato, se pueden bloquear, por ejemplo al utilizar moléculas de bloque conocidas para aquellos expertos en la técnica. Tales moléculas apropiadas incluyen proteínas tales como caseína, albúmina de suero bovino, lactalbúmina etc. 0 bloqueadores de bajo peso molecular tales como glicina, glutamina, etc. También se pueden utilizar enlazadores fotolábiles. Por ejemplo, el organosilano sobre la superficie del sustrato se hace reaccionar en la oscuridad con un enlazador fotolábil (por ejemplo, benzofenona, arilazidas, etc) . Luego la superficie se mancha con los ligandos biológicos como se desee y la unión covalente se obtiene después de un corto periodo de irradiación con luz ultravioleta o un periodo más largo con luz visible. Las regiones restantes de la * superficie del sustrato se bloquean, al utilizar agentes de bloqueo similares a aquellas moléculas descritas anteriormente en presencia de luz ultravioleta o visible. Las moléculas biológicas inmovilizadas en el sustrato se pueden inmovilizar, por ejemplo mediante incubación en una solución de azúcar (por ejemplo trealosa) por un corto tiempo (1 hora) , seguido por secado a una temperatura de 37°C durante 16 horas. Luego los sustratos estabilizados se pueden sellar en sacos de lámina delgada con desecador y se pueden almacenar. Las moléculas biológicas inmovilizadas son estables durante más de 6 a 12 meses, por ejemplo hasta más de 2 años cuando se almacenan de +2 a +8°C.

Los dispositivos se pueden colocar en un rango de portadores diferentes, los cuales incorporan características que controlan la eficiencia de mezclado de los reactivos de prueba. El flujo de los reactivos de prueba líquidos se puede obtener mediante atracción capilar, fuerza centrifuga, fuerza de vacío o flujo electro-osmótico. El uso de flujo electro-osmótico puede evitar la necesidad de válvulas, de tal manera que no se utilice ninguna parte mecánica móvil. Los canales cerrados se pueden formar mediante pegado o unión de una placa de vidrio a la superficie microfabricada. Las moléculas biológicas se inmovilizan covalentemente sobre la superficie antes de la unión a la placa de vidrio. Muchos procedimientos de unión, por ejemplo « unión o enlace anódico, involucran temperaturas elevadas que pueden destruir una molécula biológica. Por consiguiente, las técnicas de unión deben ser no desnaturalizantes a las moléculas biológicas inmovilizadas . Un método apropiado es la unión indirecta, por ejemplo en donde la plaqueta u oblea se une a una placa de vidrio mediante un pegamento apropiado, por ejemplo pegamento epoxi. Luego los dispositivos se pueden colocar en un portador apropiado. Varios portadores se ilustran en las Figuras 7-8. A manera de ejemplo, las dimensiones del dispositivo mostrado en la Figura 8 son de 48.62 mm X 48.62 mm, que incluyen las cavidades que tienen un diámetro interno de 10 mm y un diámetro externo de 12.82 mm. La separación o espaciamiento de centro a centro de las cavidades es de 15.36 mm. Los dispositivos pueden incorporar características para incorporar el mezclado de los reactivos de prueba, las muestras, etc. Esto se ilustra en la Figura 9 en donde el dispositivo incluye un sitio 11 para la adición del reactivo, canales 12 para el reactivo y sitios 13 de reacción de prueba . En la Figura 10, el dispositivo incluye recipientes 21 para el reactivo, un múltiple 22 de alimentación, sitios 23 de prueba de canal de alimentación de reactivo y un depósito o recipiente 24 de desperdicio. La Figura 11 muestra « una estructura de prueba de 4 canales con partes similares. Esta invención proporciona un sistema completamente integrado para la detección cuantitativa simultánea de analitos de un amplio rango de pesos moleculares, diversidad estructural y polaridad. Se disponen los paneles como sean apropiado para el diagnostico clínico/veterinario o selección de medicamentos . En consecuencia, dependiendo de los analitos, los ligandos de enlace se escogen. Estos se encuentran dentro de la experiencia y conocimiento de aquellos expertos en la técnica. En los analitos apropiados se incluyen: antibióticos, por ejemplo, tetraciclinas, sulfonamidas, ionóforos, ~ aminoglicosidos, penicilinas o fluoroquinolonas,- hormonas, por ejemplo, Hormona Luteinizante (LH) , Prolactina (PL) Hormona Estimulante del Folículo (FSH) u Hormona Estimulante de la Tiroides (TSH) ¡ marcadores de los daños cardiacos, por ejemplo mioglobina, anhidrasa carbónica, troponina I, glicógeno fosforilasa BB, CK-MB proteína enlazante del ácido graso o troponina T; marcadores de la enfermedad infecciosa; marcadores de alergia,- adicción a fármacos,- enzimas; virus; nucleótidos; y péptidos. Por ejemplo. Un panel es para la detección de antibióticos de sulfonamida. Esta invención proporciona un método para la identificación cuantitativa simultánea de por ejemplo hasta 20 sulfonamidas individuales. Otros ejemplos incluyen paneles de enfermedades cardiacas, de la fertilidad e infecciosas. La invención hace posible detectar simultáneamente hasta, por ejemplo 20 analitos los cuales pueden no tener similaridad estructural. Las matrices de muestra que pueden ser sometidas a prueba incluyen suero, plasma, orina, bilis, heces, tejidos, agua y alimentos. El volumen de muestra requerida es muy bajo, normalmente menor de 1.5 microlitros/analitos . Los reactivos de prueba, por ejemplo anticuerpos marcados por enzimas, haptenos marcados con enzima, anticuerpos marcados fluorecentemente o haptenos marcados fluorecentemente, pueden todos estar contenidos en un solo recipiente de reactivo, para reducir considerablemente los requerimientos de manipulación del líquido. El análisis de emparedado, por ejemplo de hormona lutenizado, la hormona estimulante del folículo, prolactina, * hormona estimulante de la tiroides, etc, la muestra se agrega junto con una solución reguladora del pH del análisis y se incuba durante un corto periodo de tiempo, el cual es normalmente menor a 30 y de preferencia menor a 10 minutos. Después de una etapa de lavado el cóctel de anticuerpos detectores marcados se agrega y se incuba por un periodo de tiempo adicional. De nuevo, este periodo es típicamente menor a 30 y de preferencia menor a 10 minutos. Después, el dispositivo se lava, para retirar cualquier etiqueta o marcador no enlazado y la señal se cuantifica. Puede ser ventajoso para ciertos análisis incorporar un equipo dentro del dispositivo microfabricado para eliminar los interferentes potenciales tales como la interferencia del factor reumatoide. La eliminación del factor reumatoide se puede obtener al poner en contacto la muestra de prueba con una área de inmunoglobulina inmovilizada, por ejemplo antes de que la muestra de prueba se ponga en contacto con la región de reacción. Un ejemplo adicional es la interferencia HAMA (Anticuerpos Anti-Ratón Humano) ; estos anticuerpos puede provocar problemas graves en el desempeño de los análisis que utilizan anticuerpos de ratón monoclonales. La solución tradicional es incluir aditivos caros en los reactivos de prueba para contrarrestar el problema. En esta invención, se tiene la ventaja de eliminar la interferencia de HAMA al poner en contacto la muestra con regiones sobre el dispositivo microfabricado para eliminar estos anticuerpos, antes de que la muestra alcance la región de reacción. De manera más general, los ligandos se pueden proporcionar sobre parte del dispositivo que se une a los contaminantes . Esto es especialmente valioso en donde la difusión definida se permite sobre la superficie del dispositivo, por ejemplo en los canales. La capacidad de eliminar los componentes que interfieren, mejora la exactitud de los resultados generados. Los marcadores de detección también se pueden inmovilizar sobre la superficie de las moléculas del dendrímero. Las moléculas del dendrímero son poliméricas por naturaleza, sintetizadas mediante el acoplamiento repetitivo de pequeñas moléculas acumuladas. Están disponibles comercialmente de Aldrich Chemicals en un rango de pesos moleculares, con una elección de grupos funcionales terminales, por ejemplo NH2 o COOH. Luego se pueden utilizar enlazadores bifuncionales junto con la química de acoplamiento convencional para preparar los conjugados de marcación de detección. Para las moléculas de hapteno pequeñas, por ejemplo ß-agonistas, esteroides analógicos o antibióticos, se prefiere que un dendrímero pequeño (de preferencia no más 16 grupos superficiales) se acople con un dendrímero grande (normalmente más de 64 grupos « superficiales) . El hapteno de peso molecular pequeño (menor de 1000 Daltons) se acopla a los grupos químicos sobre el dendrímero pequeño, seguido por la unión covalente del marcador de detección. El conjugado del dendrímero se puede purificar mediante diálisis y cromatografía de permeación en gel. Los reactivos de prueba contienen múltiples componentes (por ejemplo anticuerpos marcados por enzimas, anticuerpos marcados por fluorecencia, anticuerpos inmovilizados en látex, conjugados anticuerpo de dendrímero-fluoróforo, conjugados de anticuerpo de dendrímero-fluoróforo, conjugados de anticuerpo de dendrímero-enzima, haptenos marcados por enzimas, haptenos marcados mediante fluorecencia, etc) como sea apropiado para los paneles de pruebas particulares. Los paneles de prueba posibles son muy diversos y se pueden escoger con base en el diagnóstico clínico (o diagnóstico veterinario) como sea apropiado. Por ejemplo, un panel deseable es para la detección de enfermedades infecciosas (por ejemplo hepatitis, VIH, sífilis, etc) . Otros paneles incluyen hormonas de la fertilidad, marcadores cardiacos, proteínas de alergia, etc. También como parámetros clínicos, se encuentra la capacidad para detectar paneles grandes de residuos de medicamentos. La presente invención permite la identificación de compuestos individuales tales como antibióticos. Por ejemplo, « se puede obtener un resultado cuantitativo de hasta 20 antibióticos sobre un dispositivo de área superficial de un cm2 en forma simultánea, en un marco de tiempo normalmente de minutos, con una sensibilidad superior a aquella para los. métodos de HPLC/GCMS y comparable a aquella para las pruebas inmunológicas de enzima de parámetro individual ' convencionales. Este procedimiento puede ser fácilmente extendido a esteroides anabólicos, meta-agonistas, beta- bloqueadores, pesticidas, medicamentos terapéuticos, etc. Para el análisis la quimioluminiscencia, bioluminicencia o fluorecencia pueden ser apropiados. El sistema de detección consiste de preferencia de una cámara de dispositivo de carga acoplada (mezclas CCD) equipada para medir la luz fluorescente y quimioluminiscente. Brevemente, la cámara de CCD recolecta la señal de luz generada de las áreas de prueba sobre el dispositivo microfabricado y convierte esta a unidades de luz relativas (las RLU) . Los sistemas de detección a base de fluorescencia pueden ser leídos directamente, al utilizar filtros ópticos apropiados para el fluoróforo de marcación. Un reactivo quimioluminiscente apropiado el luminol, el cual puede ser analizado a una longitud de onda de 433-445 nm. También se puede observar la quimioluminiscencia con base en la detección de las moléculas biológicas marcadas mediante fosfatasa alcalina al utilizar 1, 2-dioxetano. Para facilitar la detección de los analitos, esta invención utiliza de preferencia un sistema de detección quimioluminiscente, al utilizar un CCD. Una cámara con iluminación de fondo es preferida, para mejorar la eficiencia de captura a la longitud de onda de la luz generada mediante la reacción de luz quimioluminiscente (aproximadamente 433-445 nm en el caso del luminol) . Todo el sistema se puede poner en operación mediante una computadora personal, en donde un programa diseñado específicamente controla la tabla X-Y, la unidad surtidora, la manipulación de la muestra, el control de la temperatura, los tiempos de incubación y la cámara CCD. Las Figuras 12-14 muestran la organización de tal sistema. La Figura 12 ilustra esquemáticamente la interacción de una computadora personal (PC) que tiene dos unidades de control 31,32. La unidad 31 está en comunicación con un sistema de formación de imagen CCD representado en 33. La unidad 32 está en comunicación con unidad surtidora y una tabla de traslación de X-Y con una bandeja de muestreo en 34 y 35 respectivamente. La Figura 13 es una representación esquemática de la tabla de traslación X-Y. Este dibujo muestra una plataforma 41 de muestreo monta sobre un accionador lineal 42. La traslación X-Y se encuentra bajo el control de motores de velocidad gradual o de paso a paso 43,44 conectados a accionadores respectivos 45, 46. La traslación está limitada por los detectores 47,48 de la "posición inicial". La sensibilidad de las moléculas biológicas marcadas y ciertas moléculas biológicas no marcadas a la luz, hace necesario llevar a cabo los análisis en ausencia de luz. La ausencia de luz se obtiene mediante la construcción del estuche de una manera hermética a la luz. El ambiente hermético a la luz es también de preferencia de temperatura controlada, por ejemplo de ±0.2°C o de preferencia ±0.1°C para asegurar una precisión y exactitud satisfactorios del análisis.

La Figura 14 muestra el aparato en vista parcial en perspectiva y lateral en corte. En particular, la Figura 14A muestra el recipiente 51 para el almacenamiento del reactivo, una puerta 52 hermética a la luz y un cuerpo 53 de cámara con una cubierta 54 separable. La parte principal de la cámara puede ser externa al exterior del estuche. La lente de la cámara se coloca en el orificio del estuche. La Figura 14B muestra en contorno las muestras sobre una bandeja 55 de muestras y en contorno, el área 56 de desperdicio y un área 57 de formación de imagen. La cámara 53 se coloca sobre estas áreas. La Figura 14C muestra, además del recipiente 51, la cámara 53, la tabla X-Y 41 y el motor 43 de velocidad gradual, un bomba 58 surtidora. * El diseño del sistema mostrado en la Figura 14 está basado en portadores de muestras de 3x3 de los cuales 20 pueden ser retenidas a la vez. Esto significa que, si 20 regiones de reacción individuales están localizadas en cada cm2 del dispositivo microfabricado, un total de 3600 análisis se pueden llevar a cabo simultáneamente en una sola muestra. Alternativamente, 180 muestras pueden ser analizadas simultáneamente en cuanto a 20 parámetros de pruebas diferentes . Como se indica anteriormente, puede marcarse el analito. El ligando puede también marcarse para permitir el análisis mediante ocupación fraccional.

Los siguientes ejemplos ilustran la invención. Ejemplo 1 Análisis de Sulfonamida En este ejemplo, 12 anticuerpos individuales, cada anticuerpo específico para una sola sulfonamida fueron inmovilizados mediante unión covalente mediante interacciones de contacto sobre regiones discretas de un sustrato de cerámica plano (óxido de aluminio) que tiene una superficie modificada químicamente. Se llevo a cabo un análisis de analitos múltiples utilizando un formato de prueba inmunológica competitiva. Con mayor detalle, los sustratos de cerámica (1 cm X 1 cm) se limpiaron ultrasónicamente al utilizar un detergente alcalino (RBS35, 5% v/v) seguido por agua doblemente desionizada y luego se colocaron en HCL 6M durante 16 horas. Posteriormente, los sustratos se colocaron en ácido crónico durante una hora en un baño ultrasónico. Los sustratos se lavaron exhaustivamente con agua doblemente desionizada y acetona y luego se secaron en un horno a una temperatura de 120°C durante 2 horas. En seguida de este tratamiento, los sustratos obtuvieron función de silano utilizando el organosilano Y-glicidoxipropil-trimetóxisilano (10% v/v) en tolueno anhidro, 4-dimetilaminopiridina (1.25 g/L) y trietilamina (1% v/v). Esta mezcla fue sometida a reflujo durante 4 horas y luego se dejó reposar durante toda la noche a temperatura ambiente. Los sustratos fueron lavados con tolueno y acetona antes del curado durante 4 horas a 120°C. En seguida de la etapa de curado, los sustratos fueron colocados en recipientes y almacenados a temperatura ambiente hasta que son requeridos para el manchado de anticuerpos de sulfonamida. Los anticuerpos de sulfonamida fueron manchados utilizando un surtidor BIODOT XY3000. Las 12 sulfonamidas sometidas a análisis fueron sulfadoxina, sulfametizol, sulfacloropiridazina, sulfametoxipiridazina, sulfamerazina, sulfapiridina, sulfisoxazol, sulfatiazol, sulfametazina, sulfaquinaxadina, sulfadimetoxina y sulfadiazina. Se emplearon volúmenes « surtidos de aproximadamente ni para cada anticuerpo de sulfonamida. Los 12 anticuerpos de sulfonamida que formaron 12 áreas discretas sobre el sustrato de 1 cm2 se incubaron durante 2 horas a 37°C. Los sustratos se lavaron con solución salina de pH regulado de fosfato (PBS) (pH 7.2) que contiene 2% de caseína (p/v) y luego bloqueados en la misma solución reguladora del pH ' durante toda la noche a una temperatura de +2-8°C. Después del lavado con PBS que contienen PEG300 (0.05% v/v) los dispositivos se colocaron en un portador. Estándares de muítisulfonamida (200 µ) y un cóctel de conjugados de peroxidasa de rábano sulfonamida (100 µl) se agregaron a los pozos de reacción que contienen el dispositivo como era apropiado y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. Los estándares contenían 5, 10, 50 y 100 ng/ml para cada una de las 12 sulfonamidas. Después de esto, los dispositivos de multisulfonamidas se lavaron con solución reguladora del pH PBS/PEG para separar los reactivos en exceso y 300 µl de sustrato quimioluminiscente [luminol (1.4 mM) /urea peróxido de hidrógeno (9.6 nM) ] por dispositivo fue introducido. Los dispositivos se imprimieron utilizando una cámara CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Se obtuvieron curvas estándares para cada una de las 12 sulfonamidas individuales. Las curvas de calibración para cada una de las 12 sulfonamidas individuales se representan gráficamente en la Figura 15. El valor de % B/Bp graficado sobre el eje Y representa el por ciento de inhibición del valor de RLU estándar cero (Unidad de Luz Relativa) provocado por cada estándar sulfonamida , individual (graficado sobre el eje X como log10) . Ejemplo 2 Análisis de Hormonas En este ejemplo, un análisis de analitos múltiples se llevó a cabo para 3 hormonas de peso molecular grande, esto es Prolactina (PL) Hormona Estimulante del Folículo (FSH) y Hormona Luteinizante (LH) este ejemplo representa un análisis de analitos múltiples para una prueba inmunológica a base de emparedado. No se observa ninguna reacción cruzada cuando las tres hormonas fueron determinadas en el mismo panel. El pretratamiento químico y los procedimientos de formación de la funcionalidad silano fueron exactamente como se describe en el Ejemplo 1. Anticuerpos monoclonales individuales de PL, FSH o LH (aproximadamente 20 ni de anticuerpo surtido) se inmovilizaron sobre áreas discretas del sustrato modificado químicamente. Los análisis de analitos múltiples se llevaron a cabo sobre sustratos de silicio y cerámica con una superficie de epóxido como se describe en el Ejemplo 1. En el análisis, 150 µl de un estándar a base de suero de LH/PL/FSH múltiple y 150 µl de una solución reguladora del pH del análisis diluyente, se agregaron al dispositivo y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente. En seguida de una etapa de lavado, 300 µl de un cóctel de un sólo conjugado de conjugados LH-HRPO/PL-HRPO/FSH-HRPO se agregaron y se incubaron durante 15 minutos. Después de esto, los dispositivos se lavaron para separar los reactivos en exceso y se introdujo el reactivo quimioluminiscente [luminol (1.4 nM) /urea peróxido de hidrógeno (9.6 mM) ] . Los dispositivos se imprimieron utilizando una cámara de CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Curvas estándar para cada una de las hormonas se graficaron después que las imágenes se procesaron. Ejemplo 3 Análisis de Sulfonamida En contraste con el Ejemplo 1, un análisis de múltiples sulfonamidas también se ha llevado a cabo utilizando microcanales. El diseño del dispositivo se ilustra en la Figura 11. En este ejemplo, los recipientes para la adición del reactivo 21 son de 2 mm x 2 mm, y de 300 µm de profundidad, (volumen de 1.2 µl) , los canales 23 son cada uno de 5 mm de largo, 200 µm de ancho y 100 µm de profundidad (volumen de 100 ni), y el recipiente 24 es de 1.9 mm x 8.6 mm y 300 µm de profundidad (volumen de 4.9 µl) . La modificación química de la superficie fue llevada a cabo como se describe en el Ejemplo 1. El anticuerpo fue agregado a cada uno de los canales e incubado durante 2 horas a una temperatura de 37 °C. Luego los sustratos fueron bloqueados y lavados como en el Ejemplo 1. Un estándar de múltiples sulfonamidas (200 µl) y conjugados de peroxidasa de rábano de sulfonamida (100 µl) se mezclaron. 1 µl del reactivo resultante fue agregado mediante pipeta a cada uno de los recipientes para suministrar al canal recubierto con anticuerpo para cada sulfonamida. De manera apropiada, los estándares contenían 10 ó 100 ng/ml de todas las sulfonamidas.

El reactivo fluyó mediante acción capilar. Después de la incubación durante 2 minutos, el dispositivo fue lavado veces con PBS/PEG y se agregó el reactivo quimioluminiscente [luminol (1.4 mM) /urea peróxido de hidrógeno (9.6 mM) ] . Los dispositivos se imprimieron al utilizar una cámara de CCD con un tiempo de exposición de hasta 4 minutos. Los valores de % B/Bo para las 4 curvas de sulfonamida se dan en la Tabla 1. Tabla 1 La utilidad de esta invención en comparación con la fotolitografía fue demostrada por el grado de adsorción no específica de las moléculas biológicas sobre un sustrato fotolábil (tratado mediante benzofenona) . Los resultados se muestran en la Tabla 2 Tebla El IgG de ratón fue detectado utilizando el conjugado HRPO anti-ratón al utilizar detección quimioluminiscente mediante cámara de CCD. Los dispositivos de silicio o cerámica que tiene enlazador fotolábil de benzofenona inmovilizado, no deben enlazarse al IgG de ratón cuando se reaccionar en ausencia de luz. Sin embargo, se « presenta un enlace no específico, puesto que aproximadamente el 80% del RLU gris promedio se obtiene cuando el enlace IgG de ratón se lleva a cabo bajo luz UV, debido a las interacciones de enlace pasivas. Se demuestra que un arreglo de moléculas biológicas inmovilizadas por medio de interacciones coherentes de acuerdo a está invención es muy distinto. La evidencia de la unión covalente se proporciona en los ejemplos discutidos a continuación. En primera instancia, los sustratos cerámicos obtuvieron función silano con APTES y luego se hicieron reaccionar con biotina-LC-sulfo NHS. Por consiguiente, el sustrato cerámico de control no es silanado con APTES; ningún grupo nucleofilico-NH2 estuvo disponible para reaccionar con el succinidimiléster del derivado de biotina. Después, los sustratos se hicieron reaccionar con el conjugado de avidina-FITC y la fluorescencia se determinó mediante la cámara de CCD. Los resultados se dan en la Tabla 3. Tabla 3 NS= Ninguna señal fluorescente detectada. Esto demuestra claramente la inmovilización específica de biotina-LC-NHS. La concentración máxima de biotina-LC-NHS inmovilizada fue de aproximadamente 100 µg/ml, puesto que el resultado RLU para el sustrato de 500 µg/ml no se incrementó. En un ejemplo adicional, los sustratos cerámicos silanados con APTES se hicieron reaccionar con un enlazador de dihidrazida. Los anticuerpos de sulfonamida fueron tratados con peryodato de sodio para volverlos reactivos hacia el enlazador de hidrazida. Los anticuerpos de sulfonamida de control fueron simplemente dializados contra la solución reguladora del pH de acetato de sodio de pH 5.5. Los resultados de RLU se muestran en las tablas 4 (no tratado) y 5 (tratados mediante el método de peryodato) los resultados muestran claramente que el enlazador de hidrazida había sido enlazado exitosamente a la superficie de cerámica. Los anticuerpos de control (sin activación mediante peryodatos) proporcionaron curvas estándar muy deficientes cuando se compararon con los anticuerpos de sulfonamida inmovilizados covalentemente. El por ciento de enlace debido a las interacciones covalentes o pasivas, se comparan en la Tabla 6 y 7. La interacción covalente contribuyó en promedio con 81.8% al enlace global, lo que indica claramente el enlace covalente de los anticuerpos de sulfonamida.

Inmovilización Covalente: Manchado directo sobre superficie de glicidoxisilano. Inmovilización Pasiva: Manchado directo sobre superficie que se hace reaccionar con diclorodimetilsilano.

Claramente, el método covalente produce resultados superiores - en comparación con el método pasivo. Los resultados para el método pasivo pueden ser incrementados aproximadamente el doble mediante el pretratamiento mediante ácido de los anticuerpos de sulfonamida, pero esto es todavía inferior al procedimiento covalente. También se llevaron a cabo análisis de configuración sobre los sustratos de silicio y cerámica modificados químicamente utilizando espectroscopia de fotones de rayos X (XPS) se registra en espectros de estudio a partir de dos áreas aleatorias de cada muestra de sustrato, a partir de las cuales se determinaron sus composiciones químicas superficiales. Véase Tabla 8 para los resultados (proporcionados en % atómico) . !______ Los resultados de la composición atómica muestran una conversión muy buena de los sustratos de silicio y cerámica originales con APTES organosilano, con buena ' reproducibilidad en la composición superficial indicada para las dos áreas de prueba en cada muestra. Los sustratos marcados con FITC mostraron 70% y 77% de marcación del silicio y cerámica respectivamente. Métodos cuantitativos de medición de la fluorescencia sobre un sustrato de silicio oscuro se han comparado con aquellos sobre un sustrato de cerámica blanco (oxido de aluminio) . Los resultados de RLU de la detección mediante CCD para las moléculas fluorescente (FITC enlazadas covalentemente a cada sustrato, se compararon con el método cuantitativo después que las moléculas de FITC se separaron mediante el método de Hook et aKLangmuir 1991, vol 1 , 142- 151) . Tabla 9 El análisis cuantitativo de la marcación fluorescente obtenida mediante la separación del marcador FITC del sustrato y la medición de la señal mediante la cámara de CCD muestra que a^ pesar del incremento de 1000 veces en señal de la cerámica con respecto al silicio, hay en realidad significativamente más moléculas de FITC presentes - en el sustrato de silicio. Un ejemplo adicional de este fenómeno se demuestra por los resultados en la Tabla 10 de un estudio de prolactina llevado a cabo sobre sustratos de silicio y cerámica utilizando partículas de látex fluorescentes enlazadas a un anticuerpo detector de prolactina como el sistema de detección. Se dan los valores de RLU (20 segundos de exposición) . Tabla 10 El desempeño de la cerámica proporcionó resultados superiores al silicio al utilizar este método de detección fluorescente. Además, los problemas del efecto del cuerpo oscuro sobre el silicio al utilizar fluorescencias se puede resolver al emplear la quimioluminiscencia como el método de « detección. En una comparación entre análisis idénticos en cuanto a FSH llevados a cabo sobre el silicio y cerámica, utilizando detección quimioluminiscente, el primero requirió un tiempo de exposición dos veces más largo que aquel para la cerámica para obtener el mismo valor de RLU.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES 1. Un dispositivo de estado sólido para llevar a cabo análisis de analitos múltiples, caracterizado porque comprende un sustrato y una multiplicidad de sitios de reacción discretos, cada uno lleva un ligando enlazado covalentemente al sustrato, en donde la superficie del sustrato entre los sitios de reacción es inerte con respecto al analito.
2. 2. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la superficie del sustrato es no uniforme, mediante lo cual se puede obtener una señal mejorada de la interacción ligando-analito.
3. 3. El dispositivo de conformidad con la * reivindicación 2, caracterizado porque comprende un arreglo de canales, resaltos, pilares o columnas, puntos, cámaras, depresiones, cavidades o pozos de reacción.
4. 4. El dispositivo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el sustrato es de cerámica, vidrio, cuarzo o silicio.
5. 5. El dispositivo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque tiene un área de menos de 1 cm2.
6. 6. El dispositivo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el área de cada sitio de reacción es menor de un m2.
7. 7. El dispositivo de conformidad con cualquier ^reivindicación precedente, caracterizado porque es obtenible mediante un proceso de activación de la superficie del sustrato y la aplicación de un arreglo de ligandos sobre las áreas discretas sobre la superficie.
8. 8. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el proceso comprende adicionalmente bloquear otras áreas activas.
9. 9. El dispositivo de conformidad la reivindicación 7 o la reivindicación 8, el proceso está caracterizado porque comprende volver a las otras áreas hidrofóbicas y los ligandos se aplican en agua.
10. 10. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la aplicación de los ligandos comprende una etapa inicial de contacto de la superficie activada con un organosilano.
11. 11. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el organosilano tiene la formula (RO) 3Si- (CH2)n-X, en donde cada R es un grupo hidrocarbilo, n es un entero y X es un grupo funcional.
12. 12. El dispositivo de conformidad con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, caracterizado porque el proceso incluye el uso de una agente de formación de enlaces cruzados bifuncional, para facilitar la unión covalente de los ligandos biológicos a los organosilano.
13. 13. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque se utiliza un agente de formación de enlaces cruzados fotolábil, para reaccionar con el organosilano que tiene un grupo terminal nuecleofílico o electrofílico.
14. 14. El dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se puede obtener mediante inmovilización de los ligandos sobre la superficie, derivados con macromoléculas tales como partículas de látex poliestireno, dendrímeros o grupos químicos que contienen polietilenglicol, los cuales facilitan la unión covalente de los ligandos.
15. 15. El dispositivo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque comprende adicionalmente ligandos que se enlazan a materiales cuya presencia interfiere con el análisis de un analito.
16. 16. ?l uso de un dispositivo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque se emplea para un análisis de analitos múltiples.
17. 17. El uso de acuerdo a la reivindicación 16, caracterizado porque comprende observar el arreglo de sitios en los cuales un analito se enlaza y/o no se enlaza y correlacionar aquélla información con los lígandos.
18. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 16 o la reivindicación 17, que comprende la formación de imagen o impresión con un dispositivo de carga acoplada (CCD) de una tipo de iluminación de fondo apropiada para la detección de luz de una reacción de luz quimioluminiscente en donde la longitud de onda de la luz al ser detectada es menor de 450 nm.
19. 19. El uso de conformidad con cualquiera de la reivindicaciones 16 a 18, en el que los analitos se seleccionan a partir de antibióticos, hormonas, marcadores de daños cardiacos, marcadores de enfermedades infecciosas, marcadores de alergia, enzimas de adicción a fármacos, virus, nucleótidos y péptidos.
20. 20. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que los analitos se « encuentran en una muestra de sangre entera, suero, plasma, orina, heces, bilis, tejido o alimento.
21. 21. Un sistema para el análisis de analitos múltiples, caracterizado porque comprende un dispositivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, una plataforma de translación, un sistema de manipulación de - la muestra, un sistema de suministro del reactivo líquido, una caja oscura de temperatura controlada, una cámara de CCD y un aparato de procesamiento de imagen.