JPH07260790A - ビオチンシラン化合物及びこれらの化合物を含む結合マトリックス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 酸化物表面を有するキャリア物質と、これに
アンカー基によって共有結合された少なくとも１つの遊
離の反応相手に結合することができる固相反応体と、を
含んでなる結合マトリックスを提供する。該固相反応体
はキャリア物質の表面上に実質的に横方向に均質な希釈
された結合層を形成し、そして該アンカー基はシラン基
であり、スペーサー分子を介して固相反応体に結合され
る。 【効果】 固相反応体の流出ならびにタンパク質の非特
異的結合を軽減し得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酸化物表面を有するキ
ャリア物質と、アンカー基によりそれに共有結合され少
なくとも１の遊離の反応相手と結合できる固相反応体と
を含む結合マトリックスであって、前記固相反応体が、
希釈された結合層を前記キャリア物質表面上に形成して
いる結合マトリックスに関する。本発明はさらに、新規
なシラン化合物、特にビオチンシラン化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】分子認識反応は、共有原子結合の形成な
しに起こる２つの分子の安定な特異的結合を介するもの
である。実用的な目的のためには、固体キャリア物質と
流体環境との界面において起こるこのような反応が特に
重要である。このためには、固体キャリア物質の表面を
固相反応体(solid phase reactant)を含む固定層で被覆
する。そして実際の認識反応はこの固定層上で進行す
る。

【０００３】このような認識反応の例は、固相の上に固
定された抗体を用いて行われる固相イムノアッセイであ
る。この抗体は、種々の洗浄工程の間にもしっかりと固
相表面に固着していなければならず、そしてそれにもか
かわらず適当に高い免疫活性を有していなければならな
い。好ましくはポリスチレンで形成された、プラスチッ
ク表面がイムノアッセイ用の固相として通常使用され
る。分子認識反応のための結合マトリックスとしての固
相の使用可能性については２種の結合が決め手となるも
のであり、即ち、一方では最も高い可能な特異的な抗体
の結合であり、これは例えばポリスチレンに対し吸着的
に塗布されるものであり、もう一方では試料液体の成
分、例えばアルブミンや特にフィブリノーゲンのような
血液及び血清成分の最も低い可能な非特異的結合であ
る。

【０００４】タンパク質の表面に対する非特異的結合
は、疎水性、極性あるいは電荷移動相互作用により、あ
るいは水素架橋結合によって起こり、その結合のある１
つのタイプあるいはその他のタイプはタンパク質の種類
によっては優位を占める。このタンパク質の非特異的結
合が、例えば固相イムノアッセイのような診断試験や医
療用インプラントについて大きな問題となる。過去にお
いて、この非特異的タンパク結合の問題を解決するため
の非常に多くの提案が文献において公表されている。し
かし、記載されたすべての方法は、非特異的結合の部分
的な除去が達成されるか、結合の１つの種類から他のも
のにシフトさせるだけのものである（例えば、Baeyer e
t al., Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 26 (1
980), 309;Gott et al., Federation Proceedings 30
(1977), 5, 1679; Wojciechowski et al., Colloids an
d Surfaces B: Biointerfaces 1 (1993), 107-117 参
照）。

【０００５】Whitesides et al (Science 252 (1991),
1164-1166)は、フィブリノーゲンの金属表面に対する非
特異的結合は、オリゴエチレンオキシド単位により官能
化されたチオールのセルフアセンブリーにより金または
銀表面上で完全に抑制できることを示した。既に言及し
たように、タンパク質の非特異的結合は、診断、特に固
相イムノアッセイにおいて重要な役割を果たす。ビオチ
ンまたはビオチニル化反応体に結合することにより多く
の免疫試験に使用することができるストレプトアビジン
から形成された固定層は、それが普遍的に使用できるこ
とから、そのような用途のための固相として特に有利で
あることが判明している。特に良好な吸着は、重合した
アルブミンに結合されたストレプトアビジンを使用する
ことにより達成された。表面活性剤を添加して、この固
相に対する非特異的結合を抑制することができる(WO88/
07683)。

【０００６】しかし、新しい試験システム、例えば光学
バイオセンサーにおいては、プラスチック表面は固相と
して適当でない場合がよくある。酸化物表面、例えばSi
O₂またはTiO₂を有するキャリア物質はこのような用途に
特に重要である。免疫学的に活性な物質を固定するため
の種々の方法も、これらの固相について記載されてい
る。酸化物表面は通常、直接吸着被覆するためには親水
性すぎるので、表面を疎水性にした後(WO91/16425, Ana
l. Biochem. 145 (1985), 106-112)、光誘導(EP-A-0337
081)により吸着的に、あるいは表面の適当な官能化によ
り共有結合で(Sensor 91, Kongress Vol.IV)被覆され
る。

【０００７】PCT 出願WO92/10757に開示された結合マト
リックスは、キャリア物質と、アンカー基によりそれに
吸着され、少なくとも１の遊離の反応相手(reaction pa
rtner)に結合できる固相反応体とを含み、固相反応体
は、キャリア物質の表面上に、希釈された、実質的に横
方向に均一である結合層を形成している。金のような金
属表面が固相として、ビオチンチオールが固相反応体と
して記載されている。表面上の結合層の希釈は、ビオチ
ンチオールと非ビオチニル化チオールの共吸着により達
成できる。この結合マトリックスは、ビオチン成分と希
釈剤の適当な混合物の場合、４nmの層の厚さのストレプ
トアビジン単分子層を表面に特異的に結合することがで
きる。ストレプトアビジンの非特異的結合は適当な希釈
剤の選択により避けられる。

【０００８】WO92/10757に記載された結合マトリックス
の欠点は、親水性表面上の吸着被覆が非常な困難をもっ
てでないと得られないということである。特に表面活性
剤の存在下において、連続的なタンパク質層の流出(ble
eding)が見られた。これは疎水化表面についてもある程
度同様である。固相イムノアッセイでの用途に加えて、
酸化物表面に対する非特異的タンパク結合は多くの別の
用途においても関連をもっており、特に、例えば、血液
または血液成分と直接接触する血液フィルター及び医療
機器（例えば透析機）中のガラス部品、チタンまたはチ
タン合金あるいはセラミックからなる全ての種類のイン
プラント（例えば股関節ジョイント、心臓弁）の場合、
並びにカニューレ及び手術器具の表面の場合である。タ
ンパク質の非特異的な接着は、インプラントの被包への
第一段階であり、体内でのその滞留期間を約10年に制限
する(Ullmann, "Enzyclopadie der chemischen Techni
k", Vol. 18, p 169 ff) 。

【０００９】酸化物表面に対する非特異的結合はクロマ
トグラフィー材料、ペプチドあるいはオリゴヌクレオチ
ド合成用のキャリア物質及び血液に直接接触する実験室
用ガラス材料（遠心管等）の場合にも関連している。親
水性表面に対する望ましくない吸着の問題は、医学以外
においても存在し、例えば車のフロントガラス、焼物等
にも存在する。

【００１０】酸化物表面に対する吸着を減少させあるい
は抑制するための先に記載した方法は全て上記のような
種々の欠点を有する。特に酸化物表面上での免疫学的試
験は、吸着結合した抗体の流出や、共有結合の場合の制
御されていない化学量論という重大な問題、さらに非特
異的タンパク質吸着の問題を示す。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の基礎を
形成する技術的問題は、タンパク質の非特異的な吸着と
いう問題を除去しあるいは少なくともかなり減少させる
ような方法で酸化物表面を改良することである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本発明の１つの形態は、
酸化物表面を有するキャリア物質をベースとする結合マ
トリックスであって、固相反応体の流出及びタンパク質
の非特異的吸着を減少した結合マトリックスを提供する
ことに関する。全く驚くべきことに、酸化物表面を特定
の反応性シラン化合物で官能化すると、タンパク質の非
特異的結合、特にフィブリノーゲンの非特異的結合が非
常に減じられ、あるいは完全に除去されることが見出さ
れた。この目的のためには、酸化物表面を、固相との反
応のためのアンカー基としての表面反応シラン末端基
と、アルコキシ（オリゴアルキレンオキシド）基あるい
は固相反応体基を有し、前記アンカー基はスペーサ分子
を介して固相反応体基あるいはアルコキシ（オリゴアル
キレンオキシド）基に結合しているものである化合物と
反応させる。

【００１３】さらに、このようにして製造された結合マ
トリックスは、再現可能なように、また制御可能なよう
に規定量の固相反応体で被覆でき、そしてその固相反応
体は、遊離の反応相手の１または数個の層での再現可能
な被覆のための基礎となることができることが見出され
た。このような方法により分析エレメントが得られ、こ
れは結合マトリックスのように、遊離の分析物(analyt
e) を検出するように機能することができる。

【００１４】そして上記結合マトリックスあるいは分析
エレメントは、より大きな表面領域で一定の均質性（マ
クロ均質性）を有しているばかりでなく、非常に小さい
表面領域内でも一定の均質性（ミクロ均質性）を有して
いる。従って、簡単な方法により、区画された(compart
mented) 結合マトリックスあるいは分析エレメントを生
成することが可能であり、これは多数の分析物の検出に
非常に適している。

【００１５】従って、本発明の第１の形態は、酸化物表
面を有するキャリア物質と、アンカー基によりそれに共
有結合され、少なくとも１つの遊離の反応相手と結合で
きる固相反応体とを含む結合マトリックスであって、前
記固相反応体が、希釈された、実質的に横方向に均質な
結合層を前記キャリア物質表面上に形成しており、アン
カー基がシラン基でありスペーサ分子を介して前記固相
反応体に結合していることを特徴とする前記結合マトリ
ックスに関する。

【００１６】好ましい態様においては、希釈された単分
子層は１つの種類の分子で形成されており、その場合、
表面は完全には被覆されていない。「希釈」の尺度であ
る固相反応体による被覆の程度は、観察された単分子層
の厚さを稠密な充填についての理論的な層の厚さにより
割った比率として表される。固相反応体による単分子層
の被覆の程度は 100％未満であり、好ましくは0.1〜90
％、特に好ましくは0.5 〜70％、最も好ましくは１〜40
％である。

【００１７】キャリア物質の表面上の固相反応体の個々
の分子の間の比較的大きな距離により、本発明の結合マ
トリックスは、最新技術の緊密に充填された層と比較し
てより分散した層を含む。本発明の結合マトリックスの
表面上の希釈された単分子層は、流体相からの遊離の反
応相手のより迅速な結合を可能とし、そして驚くべきこ
とに、より高い結合能により区別される。

【００１８】本発明の結合マトリックスのキャリア物質
は酸化物表面を有する。酸化物表面の例としては、金属
または半金属（例えばＢあるいはSi）の酸化物で、純粋
な酸化物あるいはそれらの混合物（例えばガラス）の形
態のものが挙げられる。具体例としてはSiO₂、TiO₂、Al
₂O₃ 、Fe₂O₃ 、Ag₂O、Cr₂O₃ 、Ta₂O₅ 及びこれらの混合
物が挙げられ、この場合、SiO₂、TiO₂及びその混合物が
特に好ましい。

【００１９】固相反応体のキャリア物質の表面に対する
共有結合はアンカー基を介している。アンカー基は、表
面反応性シラン末端基、即ち、酸化物表面と反応できる
置換基を有する１または数個のケイ素原子が存在する基
である。そのような置換基の例としては、アルコキシ、
特にC₁-C₄ アルコキシ基及びハロゲン、特に塩素原子が
挙げられる。特に好ましい反応性末端基は、一般式(I): R¹R²R³Si − (I) （式中、R¹、R²及びR³は同一でも異なってもよく、ケイ
素原子の置換基を示し、但し置換基R¹、R²及びR³の少な
くとも１つは酸化物表面と反応できるものである）を有
するシラン基である。一般式(I) のシラン末端基の具体
例は、モノアルコキシジアルキルシラン、ジアルコキシ
モノアルキルシラン、トリアルコキシシラン、あるいは
トリハロゲンシラン基であり、ここでアルキル及びアル
コキシ残基は好ましくは１〜４個のＣ原子、特に好まし
くは１または２個のＣ原子、最も好ましくは１個のＣ原
子を有する。従って、好ましい具体例は、モノメトキシ
ジメチルシラン、ジメトキシモノメチルシラン、トリメ
トキシシラン及びクロロシラン末端基である。シラン基
(I) は好ましくは３官能基、即ち全ての３つの置換基が
酸化物表面と反応できるものであり、例えばトリメトキ
シシランである。

【００２０】またアンカー基は、酸化物キャリア物質表
面と、一般式(II):

【００２１】

【化３】

【００２２】（式中、R¹、R²、R³及びR⁴は式Ｉで与えら
れた定義に対応するものであり、但し置換基R¹、R²、R³
及びR⁴の少なくとも１つは酸化物表面と共有結合できる
ものである）の表面反応性シラン基との反応により形成
されてもよい。式(II)の反応性シラン末端基の具体例
は、テトラメチルジシラノキシあるいはテトラメトキシ
ジシラノキシ基である。シラン基(II)は好ましくは４官
能基であり、即ち全ての４つの置換基が酸化物表面と反
応できるものであり、例えばテトラメトキシジシラノキ
シである。

【００２３】アンカー基は、固相反応体にスペーサ分
子、好ましくは２〜50、特に４〜40原子の鎖長の柔軟な
直鎖スペーサ分子を介して結合している。スペーサ分子
は特に好ましくは、任意に置換され、または／及びヘテ
ロ原子を含んでいてもよいアルキレン基を含む。酸化物
表面に共有結合できない原子または基、例えばハロゲン
原子あるいは二重結合した酸素原子等のみを置換基とし
て使用するのが好適である。ヘテロ原子の例は特にＮ、
Ｏ及びＳであり、Ｎ及びＯが好ましい。

【００２４】キャリア物質の表面に共有結合したアンカ
ー基はスペーサ分子の一方の側に位置する。その反対
側、即ちキャリア物質ではない方において、スペーサ分
子は１または数個の結合基を含み、これを介して固相反
応体またはその成分がスペーサ分子に結合している。こ
れらの結合基は例えば、アミノあるいはヒドロキシル官
能基であり得、これは例えば固相反応体のカルボキシル
官能基に、エステルまたはアミド基を形成することによ
り結合する。しかし、スペーサ分子はカルボキシル官能
基を結合基として含んでいてもよく、これが今度は固相
反応体の反応性アミノまたはヒドロキシル官能基に結合
する。

【００２５】本発明の結合マトリックスを製造する好ま
しい方法は、スペーサ分子と固相反応体との間に親水性
リンカー基を導入することである。このリンカーは、特
に鎖長４〜15原子の直鎖分子である。この場合、１また
は数個、好ましくは１〜５の親水性エチレンオキシド単
位を含むリンカー基が好ましい。親水性リンカー基は特
に好ましくはアミンまたはヒドロキシル末端化ポリエチ
レンオキシドからなる。1,8-ジアミノ-3,6- ジオキサオ
クタン(DADOO) が特に適したリンカーであることが判明
した。

【００２６】上記に定義したようなスペーサ分子のさら
に別のものを任意に親水性リンカーと固相反応体との間
に導入してもよい。固相反応体の希釈された単分子層を
有する本発明の結合マトリックスを製造するためのいく
つかの可能なものがあることを明らかにしておかなけれ
ばならない。これらの可能なもののいくつかを以下に記
載するが、このリストは本発明を限定することを意図す
るものではない。本発明の希釈された結合マトリックス
を製造する第一の可能性は、好適な被覆条件を選択する
ことである。こうして、パラメーター、例えば、酸化物
表面と接触させられる固相反応体の濃度、反応条件、例
えば、温度、反応期間または固相反応体のアンカー基の
反応性の変化によりキャリア物質の表面で結合層の適当
な希釈を得ることが可能である。これらのパラメーター
に関して、キャリア物質の表面における固相反応体の被
覆物の密度は、固相反応体の濃度、反応温度、反応期間
及びアンカー基の反応性の増大につれて増大し、逆に、
被覆物の密度の低下は、これらのパラメーターを減少す
ることにより達成し得ることが確立される。希釈された
結合マトリックスを製造するのに適した反応条件を、以
下に詳細に記載する。

【００２７】本発明の更に別の実施態様において、固相
反応体の希釈された結合層の生成は固相反応体の分子お
よび希釈剤分子をキャリア物質の表面に同時に結合する
ことにより達成し得る。この実施態様において、本発明
の結合マトリックスはスペーサー分子を更に含み、これ
らはアンカー基を備えているが、固相反応体をそれらに
結合させない。このような化合物はまた、以下に希釈剤
分子と称される。例えば、ビオチニル化されたスペーサ
ー分子とビオチニル化されていないスペーサー分子を1:
10〜1:2の比で使用した場合、遊離反応相手を高比率で
大きな容量により結合し得る希釈されたビオチン単分子
層が得られる。

【００２８】好適な希釈剤分子は、アンカー基およびス
ペーサー成分、並びに、所望により、リンカー分子を含
み、その希釈剤分子のスペーサー分子の鎖長は、固相反
応体に結合されて存在するスペーサー分子の鎖長とは１
−５個以下の原子、好ましくは１−２個以下の原子だけ
異なることが好ましい。また、６個の原子の希釈剤分子
の最小の鎖長（アンカー基および親水性リンカー基を含
まない）を有することが適当であることが判明した。

【００２９】固相反応体に代えて、官能基、例えば、ヒ
ドロキシル基、カルボン酸基、カルボン酸のエチルエス
テル基またはメチルエステル基、カルボン酸アミド基、
１個または２個のメチル基またはエチル基により置換さ
れたカルボン酸アミド基、スルホン酸基、スルホンアミ
ド基またはアルコキシ−オリゴアルキレンオキシド基、
特に、１−10個のアルキレンオキシド単位を有するC₁-C
₄ アルコキシ（C₂-C₄アルキレンオキシド）基が、アン
カー基から離れている希釈剤分子の末端に配置されるこ
とが好ましい。メトキシオリゴアルキレンオキシド基が
特に好ましく、そのアルキレンオキシド基は２〜４個の
Ｃ原子、最も好ましくは２個のＣ原子を有することがで
きる。アルキレンオキシド基の数は１〜10であることが
好ましい。メトキシモノエチレンオキシド基、メトキシ
ジエチレンオキシド基およびメトキシトリエチレンオキ
シド基並びにメトキシテトラエチレンオキシド基が最も
好ましい。こうして、好ましい希釈剤分子は、スペーサ
ー成分の一方の側でキャリア物質と反応性があり、また
他方の側で親水性末端基と反応性があるアンカー基を含
むことが好ましい。

【００３０】本発明の更に別の実施態様において、固相
反応体を含むスペーサーおよび固相反応体を含まないス
ペーサーは共有結合により結合し得る。この結合はSi-O
-Siブリッジにより得ることが好ましい。希釈剤分子
（固相反応体を含まないスペーサー分子）および固相反
応体を含むスペーサー分子を含むこのような混合単分子
層において、固相反応体を含むスペーサー分子の比率は
0.1 〜90モル％、好ましくは0.5 〜50モル％、特に好ま
しくは１〜40モル％であることが適当である。

【００３１】全ての既知の結合フィルムにおいて、固相
反応体は一成分を含む。これはビオチンまたはビオチン
と同様の分子、例えば、デスチオビオチン、イミノビオ
チンまたはストレプトアビジンとも反応するHABA (４−
ヒドロキシフェニル−アゾ−安息香酸）であることが好
ましい。しかしながら、好適な固相反応体の更に別の例
はまた、抗体に結合し得る抗原またはハプテンである。
この場合、固相反応体は100 〜1200の分子量を有するハ
プテンであることが好ましい。例えば、ステロイド（例
えば、ジゴキシン、ジゴキシゲニン、コルチゾル、エス
トリオール、エストラジオール、テオフィリン、ジフェ
ニルヒダントイン、テストステロール、胆汁酸、プロゲ
ステロンおよびアルドステロン）、短鎖ペプチド（例え
ば、アルギプレシン、オキシトシンおよびブラジキニ
ン）；フルオレセインおよびその誘導体；T3、T4、アフ
ラトキシン、アトラジン、植物ホルモン、例えば、ジベ
リリン；並びにアルカロイド（例えば、レセルピンおよ
びアジマリシン）が好適である。また、好適な固相反応
体の更に別の例は、相補配列を有する遊離核酸に結合し
得るオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドであ
る。

【００３２】ビオチンおよびビオチン誘導体、ジゴキシ
ン、ジゴキシゲニン、フルオレセインおよび誘導体並び
にテオフィリンが、ハプテンとして使用されることが特
に好ましい。一方、固相反応体はまた幾つかの成分を含
み得る。これは、特に、固相反応体の内部成分がスペー
サー分子に共有結合し、そして固相反応体の外部成分に
非共有結合することを意味するものと理解するべきであ
る。この場合、固相反応体の外部成分は、次に遊離反応
相手と結合し得る。内部成分は、例えば、ビオチンであ
ってもよく、また外部成分は、例えば、ストレプトアビ
ジンであってもよい。このような結合マトリックスは、
順に、溶液からのビオチニル化反応相手と結合し得る。
何となれば、ストレプトアビジンはビオチンに対し四つ
の結合部位を有し、その少なくとも二つが依然として遊
離しているからである。

【００３３】２成分を含む固相反応体を含む結合層は、
固相反応体の外部成分、即ち、遊離反応相手に結合し得
る外部成分（即ち、この場合にはストレプトアビジン）
が結合マトリックスの表面で希釈層を形成する場合に本
発明の結合マトリックスとなる。固相反応体の内部成分
は、固相反応体の外部成分それ自体が付着して希釈層を
形成し得る結合マトリックスの表面で希釈されていない
層を形成することが好ましい。

【００３４】こうして、100 ％の被覆率を有する最密充
填ビオチン単分子層（それ自体は本発明の結合マトリッ
クスに相当しない）は、低被覆密度でストレプトアビジ
ンと結合する。次にこの希釈ストレプトアビジン層は、
順に、遊離反応相手、例えば、ビオチニル化抗体を結合
して最密充填フィルムを形成し得る本発明の結合マトリ
ックスに相当する。例えば、スペーサーリンカーを有す
る固相反応体を使用することにより生成された希釈ビオ
チン単分子層、及びそれ自体が遊離ストレプトアビジン
と結合するための本発明の結合マトリックスに相当する
希釈ビオチン単分子層が、ストレプトアビジンと結合
し、100 ％の被覆率で最密充填フィルムを形成し得る。
しかしながら、この方法において生じる最密充填ストレ
プトアビジン層は、順に、本発明の結合マトリックスに
相当せず（何となれば、それは柔軟ではないからであ
る）、反応相手（例えば、ビオチニル化抗体）のみを結
合して約10％の被覆フィルムを形成し得る。

【００３５】結合し得る希釈固相反応体の本発明のこの
原理はまた、ビオチン−ストレプトアビジン結合から、
抗体−抗原等の如きその他の結合対へと拡張し得る。結
合マトリックスの表面における固相反応体の被覆の程度
は、結合層の厚さを測定することにより測定し得る。こ
の場合、測定された層の厚さは結合層の被覆の程度につ
れて減少する。

【００３６】驚くことに、本発明の結合マトリックスの
利点は、特に、小さい表面積、例えば、0.5cm²以下、特
に、0.1cm²以下の面積で良く見られる。このようにし
て、固相反応体への遊離反応相手の結合を定性的かつ定
量的の両方で局所分解検出方法を使用して互いに別々に
検出し得る、空間的に分離された領域または区画を有す
る結合マトリックスを製造することが可能である。

【００３７】それ故、本発明はまた複数の空間的に分離
され、または不連続の領域がそれぞれ本発明の結合マト
リックスを含むキャリア物質に配置されていることを特
徴とする区画された結合マトリックスに関する。空間的
に分離された領域またはスポットは、共通のキャリア物
質表面で規則的なパターンで互いに隣接して取付けられ
ることが好ましい。キャリア物質の表面１cm² 当たり10
〜100 のスポットが有利であり、また20〜50のスポット
が特に有利である。スポットの直径は、好ましくは0.1
〜1mm である。個々のスポットの外部限界の間の距離
は、試薬の別々の適用を容易にするために0.1 〜１mmで
あることが好ましい。

【００３８】それぞれが結合マトリックスを含む空間的
に分離された表面領域は、非酸化物表面を有するキャリ
ア物質に取り付けられることが好ましい。領域またはス
ポットは規則的なパターンで取り付けられることが好ま
しい。キャリア物質表面に酸化物スポットの所望のパタ
ーンを得るために、所望のパターンが遊離して残される
スポットが適用される場合にマスクをキャリア物質に配
置し得る。続いて、マスクを気化された酸化性物質で処
理し、またはそれでスパッタリングして非酸化性キャリ
ア物質に酸化物スポットのパターンを形成し得る。

【００３９】また、酸化物スポットは、非酸化性物質が
酸化性物質の個々のスポット間に中間の領域を形成する
ような方法で酸化物表面を非酸化性物質で被覆すること
により調製し得る。続いて、酸化物スポットを本発明の
希釈結合マトリックスでキャリア表面に被覆する。本発
明の実施態様において、空間的に分離された酸化物スポ
ットは、それぞれが同じ固相反応体を有する結合マトリ
ックスを含み、この場合、個々のスポットの固相反応体
の希釈度は所望により変化し得る。一方、個々の空間的
に分離された酸化物スポットはまた、異なる固相反応体
を有する結合マトリックスを含み得る。

【００４０】本発明の更に別の局面は、希釈結合マトリ
ックスを含む分析エレメントであり、この場合、固相反
応体が反応相手の一つまたは幾つかの追加の層で被覆さ
れる。驚くことに、第一の遊離反応相手は、本発明の結
合マトリックスの固相反応体に非常に再現性よくかつ均
一に結合し得ることがわかった。驚くことに、反応相手
の量さえもが、固相反応体の希釈の程度により広範囲に
わたって変化し得る。

【００４１】特定量の第一の遊離反応相手が結合マトリ
ックスに結合された後に、得られる分析エレメントは、
順に、更に別の層中の更に別の特定の反応相手と非常に
容易かつ再現性よく結合し得る。こうして、例えば、固
相反応体としてビオチンを含む本発明の結合マトリック
スは、ストレプトアビジンで再現性よく被覆でき、そし
てこのストレプトアビジン層を、順に、ビオチニル化遊
離結合相手の層で非常に再現性よく被覆し得る。固相反
応体の結合可能な反応相手は、試料液中に存在する遊離
分析物を検出するのに使用し得るバイオアフィニティー
を有する特異的結合相手であることが好ましい。好適な
結合可能な反応相手の例は、例えば、抗体、抗原、ハプ
テンまたは核酸である。

【００４２】一実施態様において、それぞれが固相反応
体の希釈結合層を含む複数の空間的に分離されたスポッ
トを含む区画された結合マトリックスを、同じまたは異
なる反応相手の一つまたは幾つかの更に別の層の再現可
能な適用に直接使用し得る。別の実施態様において、個
々のスポットの希釈結合層は、それぞれ更に別の結合層
により被覆される。本発明のこの被覆は非常に小さい面
積でさえも再現可能であるので、これらの結合層は、分
析エレメント中で同じであってもよく、またはスポット
間で異なっていてもよい反応相手による第三の結合層の
調節可能な量の再現可能な被覆に非常に良く適してい
る。

【００４３】両方の実施態様において、分析エレメント
のそれぞれのスポットを、非特異的結合がこの被覆を妨
害することなく、特定量の反応相手で別々に被覆し得
る。たとえスポットが非常に小さな寸法を有していて
も、均一な被覆を得ることが可能である。この手段によ
り、非常に小さな空間中に反応相手の一定かつ均一な被
覆を有する複数のスポットを含む分析エレメントを製造
することが可能である。さらに、反応相手による種々の
スポットの被覆は、異なる結合層の希釈度により簡単か
つ再現性よく調節でき、その結果、それぞれのスポット
を、検出すべき分析物に関して、またこれに必要である
感度に関して個々に調節し得る。

【００４４】従って、本発明の好ましい実施態様は、試
料中の多数の分析物または小空間中の異なる試料中の一
種の分析物の同時の定性的または／かつ定量的な測定を
可能にし、そして非常に少量の試薬のみを必要とし、そ
の結果、血液成分および血清成分、例えば、フィブリノ
ーゲンの非特異的結合によりこれらの測定の妨害が非常
にごくわずかである、区画された結合マトリックスに基
づく多重分析エレメントである。通常の多パラメーター
分析エレメント、例えば、マイクロタイタプレートと比
較して、この場合には所定の面積に極めて多数の分析領
域を配置することが可能である。こうして、１cm² 当た
り100 までの結合マトリックススポットを難なく配置し
得る。

【００４５】本発明の区画された分析エレメントは、同
じまたは異なる固相反応体を含む結合マトリックスをベ
ースとし得る。好ましい実施態様は、各スポットに同じ
固相反応体を含む一つの結合マトリックスをベースとす
る区画された分析エレメントである。それぞれのスポッ
トは、順に、任意に異なる遊離反応相手の空間的に制限
され、かつ再現可能な、均一の結合に使用し得る。

【００４６】さらに、本発明は、区画された結合マトリ
ックスを含む試料中の異なる分析物の測定のための分析
エレメントに関するものであり、そのマトリックス中で
個々の空間的に分離された結合マトリックス領域が固相
反応体に結合し得る、異なる反応相手でそれぞれ覆われ
ている。本発明の更に別の物体は、区画された結合マト
リックスを含む異なる試料中の同じ分析物を測定するた
めの分析エレメントであり、そのマトリックス中で個々
の空間的に分離された結合マトリックス領域が固相反応
体に結合し得る同じ反応相手でそれぞれ覆われている。

【００４７】本発明の多種分析物分析エレメントは、表
面が追加の反応相手の一つまたは幾つかの層で覆われて
いる結合マトリックスをそれぞれ含む空間的に分離され
た領域で規則的なパターンで覆われている積層キャリア
物質を含むことが好ましい。さらに、本発明は、本発明
の結合マトリックスの製造方法に関する。本発明の結合
マトリックスの異なる性質のために、製造方法の詳細も
また異なる。これらの製造方法の幾つかの好ましい別法
が操作の例に記載されている。一般に、本発明の方法
は、反応溶液によるキャリア物質のインキュベーション
を含み、その溶液中に、本発明の結合マトリックスの結
合層を形成する分子が存在する。これらの分子の両側は
アンカー基および固相反応体を含む（本発明の幾つかの
実施態様において、結合層の全ての分子は固相反応体に
結合されるべきであるとは限らないが）。固相反応体を
スペーサー分子を介してアンカー基に結合することが好
ましい。本発明の結合マトリックスを形成するための溶
液からのキャリア物質へのアンカー基の結合は、自然プ
ロセスである。

【００４８】シランによる酸化物表面の被覆は、シラン
化合物またはシラン化合物の混合物の溶液を、前もって
洗浄した酸化物表面と接触させることにより行われる。
酸化物表面の洗浄は、強無機酸、例えば、HNO₃、H₂S
O₄ 、HCl 、特に好ましくは王水(H₂SO₄/HCl) 中で沸騰
させることにより行うことが好ましい。続いて、酸化物
表面を洗浄して酸を除去し、乾燥する。次に、このよう
にして洗浄した表面をシラン化合物の溶液と接触する。
無水有機溶媒、例えば、メタノール、クロロホルムまた
はこれらの混合物が溶媒として適している。さらに、結
合層を保護ガス、例えば、N₂のもとに適用することが好
ましい。

【００４９】酸化物表面のシラン化が、シラン希釈剤を
使用しないで固相反応体の希釈結合層を生成するのに不
完全である場合、固相反応体−シラン化合物の濃度は、
好適な溶媒中で10^-4〜10^-2重量％であることが好まし
く、5 x 10^-3重量％〜5 x 10^-2重量％であることが特に
好ましい。反応期間は10〜60分であることが好ましく、
20〜40分であることが特に好ましく、また反応の温度は
10〜50℃であることが好ましく、室温であることが特に
好ましい。

【００５０】酸化物表面をビオチンシランとシラン希釈
剤の組み合わせで被覆することが意図されている場合、
溶媒中のシラン化合物の濃度は0.1 〜５重量％であるこ
とが好ましく、0.5 〜２重量％であることが特に好まし
く、その場合、個々の化合物をそれぞれの所望の比率で
使用し得る。反応期間は１〜８時間であることが好まし
く、３〜５時間であることが特に好ましい。温度は10〜
50℃であることが好ましく、室温であることが特に好ま
しい。

【００５１】反応を行った後、続いて表面を、好ましく
はシランを適用するのに使用された溶媒ですすぎ、そし
て所望により真空下で高温、例えば、60〜140 ℃で20分
〜８時間の期間にわたってオーブン中で状態調節する。
所望により、特に、固相反応体が互いに非共有結合され
ている幾つかの成分を含む場合、更に別の物質を、第二
の反応溶液によるインキュベーションにより第二工程で
付着し得る。反応条件は第二の層および任意の更に別の
層の適用に重要ではなく、その結果、それは保護ガスを
使用せず、溶媒として水を使用して行い得る。

【００５２】本発明の方法により製造された結合層は顕
微鏡的に均一であり、これは導波管測定または白色光干
渉法の如き適当な方法により試験し得る。さらに、本発
明は、区画された結合マトリックスの製造方法に関する
ものであり、この方法において、酸化物表面を有するキ
ャリア物質の空間的に分離された領域を、表面活性シラ
ン末端基を含み、そしてそれによりスペーサー分子を介
して同じまたは異なる固相反応体に結合する分子を含む
同じまたは異なる反応溶液でインキュベートする。酸化
物表面を含む空間的に分離された領域は、例えば、マス
クを適用し、そして気化またはスパッタリングされた酸
化性物質で処理することにより、非酸化物表面でキャリ
ア物質に付着することが好ましい。

【００５３】区画された結合マトリックスの領域または
スポットが同じであることが意図される場合、キャリア
エレメントは、所望の結合マトリックスを生成するのに
必要な分子を含む反応溶液中に単に浸漬し得る。しかし
ながら、個々の領域の結合マトリックスが異なることが
意図される場合、異なる反応溶液が個々の酸化物スポッ
トに適用され、そのスポットのそれぞれがその他の固相
反応体を含む。これに代えてまたはそれに加えて、例え
ば、異なるスポットに適用される個々の反応溶液中に存
在する希釈剤分子の異なる比率により、種々のスポット
上に結合マトリックスの異なる希釈度を生じることがま
た可能である。反応溶液のこの空間的に別々の適用は、
通常の方法、例えば、ピペッティング技術、スタンピン
グ技術または印刷技術、例えば、インクジェットにより
行い得る。

【００５４】本発明の更に別の主題は、分析エレメント
の製造方法であり、この方法において、本発明の結合マ
トリックスが、結合マトリックスに結合し得る更に別の
反応相手の分子を含む少なくとも一種の反応溶液でイン
キュベートされる。区画された分析エレメントは異なる
方法で製造し得る。最も簡単な場合、同じまたは異なる
反応相手の溶液を、例えば、ピペットを用いて、希釈結
合層で覆われているそれぞれの異なる結合マトリックス
スポットに適用する。これらの反応相手は区画された結
合マトリックスの表面で固相反応体に結合できなければ
ならない。従って、結合体を、固相反応体に結合し得る
基を含む反応相手として使用することが好ましい。この
ような結合体の例は、ビオチンにカップリングされてい
る抗体である。希釈ビオチン−シラン結合マトリックス
そしてそれに結合されたストレプトアビジン結合層で覆
われている異なる酸化物スポットでは、同じまたは異な
るビオチニル化抗体を個々のスポットに適用することが
可能であり、次にこれらのスポットは個々のストレプト
アビジン層に結合する。この方法で、最小の空間中に異
なる領域を有する分析エレメントが得られ、これらの領
域は、所望により、多くの異なる遊離分析物を結合し得
る。

【００５５】同じビオチニル化抗体をそれぞれのスポッ
トに適用する場合、固相に結合した抗体と反応性をもつ
分析物を含む分析エレメントで、幾つかの試料を同時に
測定することが可能である。異なる反応相手をそれぞれ
のスポットに適用する更に別の可能性は印刷技術または
スタンピング技術、特に、インクジェットまたはマイク
ロタイター・プレートへの異なる試薬の適用と同様のマ
イクロマルチピン・プレートによる適用である。

【００５６】さらに、本発明は、バイオアフィニティー
を有する少なくとも２種の反応体（その一つは固相に結
合されて存在し、そしてその他の１または複数種の相手
が遊離している）の間の特異的結合反応による試料溶液
中の分析物の測定方法に関するものであり、その方法に
おいて、本発明の結合マトリックスの成分である固相反
応体が使用される。

【００５７】このような方法において、固相反応体への
遊離反応相手の結合の検出は、遊離結合相手がマーカー
基を有するという事実により促進し得る。特に、酵素ま
たは蛍光成分もしくは発光成分で標識することは一般的
である。これが促進する結合の間接的な光学的観察が、
正確な定量的検出を可能にする。原則として、結合は光
学的手段または電気化学的手段そして更には熱トナリテ
ィ(tonality)または塊の形成により検出し得る。電気化
学的技術の場合、電位差滴定法または電流滴定法、例え
ば、“バイオセンサー", Turner, Karube, Wilson(編
集), Oxford Press, 1987 またはBergveld, Biosensors
＆Bioelectronics 6, 55-72 (1991)に記載されているよ
うな方法が、特に考慮される。導電率またはキャパシタ
ンスの変化による測定がまた、電気化学的技術として可
能である。

【００５８】しかしながら、結合の検出が光学技術、特
に、光反射技術により行われることが好ましく、この場
合、遊離結合相手の結合により生じたキャリア上に固定
された反応体を含む極めて薄い層の、層の厚さの増加を
観察し得る。これらの技術の総説が、Sadowski: “イム
ノセンシングにおける光学的方法の総説", SPIE, 954巻
Optical testing and Metrology II (1988), 413-419
に示されている。

【００５９】特に好ましい光反射方法は、導波管測定お
よび白色光干渉法による結合の検出である。導波管測定
法がAnal.Let. 23 (3), 411-424 (1990)に記載されてお
り、レーザー光がセンサーの回折格子上で導波層にカッ
プリングされるという事実に基いている。カップリング
条件（角度）は、導波層の界面の状態に依存する。こう
して、表面の結合層の厚さがカップリング条件の変化か
ら推定し得る。

【００６０】本発明の結合マトリックスの層の厚さを測
定するための更に別の好適な方法は白色光干渉法であ
る。このような測定システムは、ドイツ、オベルコッヘ
ンにあるカール・ザイス(Carl Zeiss)社により市販され
ている。白色光干渉法のための測定システムは、ダイオ
ードアレイスペクトロメーター、照明装置、好ましく
は、一端で集められ統計上混合される２光伝導束を有す
るＹ光導管、そしてまた反射光システムを含む。

【００６１】区画された結合マトリックスまたは区画さ
れた分析エレメントが使用される場合、試料溶液中の異
なる分析物、即ち、少なくとも２種の分析物の同時測
定、または異なる試料溶液中の一種の分析物の同時測定
が可能である。従って、本発明の主題は、試料溶液を区
画された結合マトリックスまたは区画された分析エレメ
ントと接触させ、試料溶液中の異なる分析物の存在また
は／およびその量を個々の空間的に分離された結合マト
リックス領域で局所分解測定(locally resolvingmeasur
ement)により測定することを特徴とする試料溶液中の異
なる分析物の同時測定方法である。

【００６２】個々の隣接スポットで分析物の結合を定性
的に、そしてまた定量的に検出するために、検出の局所
分解測定法が使用される。好ましい方法は共焦点蛍光顕
微鏡検査である。この方法において、標識に使用される
蛍光色素は、適当な波長を放出するレーザーの助けによ
りそれぞれのスポットで個々に蛍光まで励起される。放
出された光が感度の良い検出器、例えば、集積CCD カメ
ラにより記録し、そしてそれを画像分析に適したコンピ
ューターソフトウェアーで定量化する。蛍光顕微鏡検査
のその他の方法もまた、その分析に適している。この場
合、幾つかのスポットが画像の一部分で同時に観察され
る。次に個々のスポットを、例えば、適当な画像分析ソ
フトウェアーの助けにより連続的に分析する。

【００６３】さらに、その分析はまた既に記載された光
反射技術の助けにより行い得る。その他の局所分解検出
方法、例えば、電気化学的方法、導電率測定または放射
能標識の測定が可能である。異なる分析物につき試料を
分析するために、試料は、区画された結合マトリックス
もしくは区画された分析エレメントの大きな領域にわた
って、または個々のスポットで別々に適用し得る。ま
た、必要により、測定すべき分析物の更に別の標識結合
相手を添加する。この場合、分析エレメントを、固相に
結合した標識分析物の測定の前に洗浄し、未結合のマー
カー分子を除くことが好ましい。

【００６４】また、区画された結合マトリックスまたは
区画された分析エレメントは、異なる試料中の分析物の
同時測定に使用し得る。従って、本発明の主題はまた、
それぞれの場合に、試料溶液を区画された結合マトリッ
クスまたは分析エレメントの個々の領域と接触させ、そ
してそれぞれの試料溶液中の分析物の存在または／およ
びその量を個々の空間的に分離された結合マトリックス
領域で局所分解測定により測定することを特徴とする異
なる試料溶液中の一種の分析物の同時測定方法である。
その測定は、固相に結合された分析物結合相手への分析
物の特異的結合反応により、そして、個々の結合マトリ
ックス領域の別々の測定により行うことが好ましい。こ
の場合、種々の試料溶液は、通常の適用技術、例えば、
ピペッティング技術、印刷技術もしくはスタンピング技
術またはマルチピンプレートにより適用し得る。この方
法で、多くの試料を非常に小さい領域で同時に測定する
ことが可能である。

【００６５】こうして、本発明の結合マトリックスおよ
び本発明の分析エレメントは、多重分析物検出、即ち、
多くの分析物の同時検出または多くの試料中の一種の分
析物の同時検出、特に、イムノアッセイ、例えば、アレ
ルギー診断または、例えば、特別な配列を有する核酸に
ついて試料をスクリーニングするためのDNA 診断に極め
て良好に使用し得る。

【００６６】本発明の更に別の主題は、一般式(III) ま
たは(IV)の一つを有するシラン化合物である。 Ｒ¹ Ｒ² Ｒ³ Si−Sp−Ｘ¹ (III) または

【００６７】

【化４】

【００６８】（式中、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ 、Ｒ⁴ は同じで
あってもよく、また異なっていてもよく、そして式(II
I) 中の置換基Ｒ¹ 、Ｒ² およびＲ³ の少なくとも一つ
または式(IV)中の置換基Ｒ¹ およびＲ² またはＲ³ およ
びＲ⁴ の少なくとも一つが酸化物表面に共有結合し得る
ことを条件としてSi原子の置換基を表し、Spは２〜50の
原子の鎖長を有する可撓性線状スペーサー分子であり、
かつＸ¹ 、Ｘ² 、Ｘ³ はスペーサー分子に共有結合する
固相反応体または／およびC₁-C₄ アルコキシ（オリゴC₂
-C₄ アルキレンオキシド）基である） 化合物(III) および(IV)のシラン基中の残基Ｒ¹ 、
Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴ は、C₁-C₄ アルキル基、C₁-C₄ ア
ルコキシ基、ヒドロキシ基、アミノ基またはハロゲン原
子であることが好ましい。Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴
はC₁-C₂ アルコキシ基であることが特に好ましく、メト
キシ基であることが最も好ましい。

【００６９】Ｘ¹ 、Ｘ² 、Ｘ³ が固相反応体を表す場
合、それらはビオチンまたはビオチン誘導体であること
が好ましい。Spは、所望により、置換されており、また
は／かつヘテロ原子を含むアルキレン基を含むことが好
ましい。驚くことに、酸化物表面へのタンパク質、例え
ば、フィブリノーゲンの非特異的結合は、その表面への
本発明のシラン、特に、メトキシオリゴエチレングリコ
ール末端基を有するシランの共有結合により抑制し得
る。

【００７０】従って、本発明の更に別の主題は、酸化物
表面を本発明の一種または数種のシラン（式(III) また
は(IV)中のＸ¹ 、Ｘ² 、Ｘ³ はC₁-C₄ アルコキシ（オリ
ゴC₂-C₄ アルキレンオキシド）基である）で処理するこ
とを特徴とする酸化物表面への非特異的タンパク質結合
の減少方法である。アルコキシ基はC₁-C₂ アルコキシ基
であることが好ましく、メトキシ基であることが特に好
ましい。C₂-C₄ アルキレンオキシド基はエチレンオキシ
ド基および／またはプロピレンオキシド基であることが
好ましく、エチレンオキシド基であることが特に好まし
い。アルコキシオリゴアルキレンオキシド基は１〜10の
アルキレンオキシド単位を有することが好ましく、１〜
６のアルキレンオキシド単位を有することが特に好まし
い。

【００７１】さらに、酸化物表面は一般式(III) のシラ
ン、即ち、Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ Si末端基を有するシラン化
合物で処理されることが好ましい。式(III) および(IV)
中の全ての置換基Ｒ¹ 、Ｒ² 、Ｒ³ およびＲ⁴ は、この
ような反応性原子または酸化物表面と反応し得る基、特
に、C₁-C₄ アルコキシ基、最も好ましくはメトキシ基で
あることが好ましい。

【００７２】最後に、本発明はまた、一般式(III) およ
び(IV)（式(III) または(IV)中のＸ ¹ 、Ｘ² 、Ｘ³ はC₁
-C₄ アルコキシ（オリゴC₂-C₄ アルキレンオキシド）基
である）を有する本発明の一種または複数のシランと、
表面との反応により形成される結合層によって、少なく
とも一部覆われていることを特徴とする酸化物表面を有
する物体に関する。

【００７３】結合層は飽和層、即ち、シランで最密充填
されている層であることが好ましい。本発明の物体は、
血液またはその他の体液との直接的接触を目的としてい
る医療物品であることが好ましい。本発明により改良さ
れた酸化物表面は、特に、医療移植体、例えば、人工の
股関節、心臓弁に使用でき、そしてタンパク質の非特異
的付着を抑制するため、生体中に保持し得る期間は既知
の製品に較べてかなり長い。更にまた、このような表面
は、血液または血液成分と直接接触する医療装置、例え
ば、透析装置、カニューレ、外科手術装置等、クロマト
グラフィー材料、化学的なペプチドまたはオリゴヌクレ
オチド合成用の担体材料等、及びタンパク質の非特異的
結合を防止することを意図するその他の物体に使用し得
る。

【００７４】本発明を下記の実施例により更に詳しく説
明することが意図される。

【００７５】

【実施例】

〔実施例１〕ビオチンシラン１の合成

【００７６】

【化５】

【００７７】ビオチノイル−ε−アミノカプロン酸−Ｎ
−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−Ｘ−
ＯＳｕ）2.0 g をメタノール 40 mlに懸濁した。６−
（アミノヘキシルアミノプロピル）−トリメトキシシラ
ン 1.0 gを滴下し、この溶液を室温で１時間半攪拌し
た。次いで、メタノールを蒸留により除去した。生成物
をカラムクロマトグラフィーで精製したところ、白色の
固体 1.3 gが得られた。

【００７８】〔実施例２〕ビオチンシラン２の合成

【００７９】

【化６】

【００８０】2.1 ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ドデカン酸
−ＯＳｕエステルの合成 ＤＭＦ 30 mlにビオチン−ＤＡＤＯＯ 560 mg を溶解
し、これをトリエチルアミン 150 ml とともにドデカン
酸ビス−ＯＳｕエステル 6.36 g の溶液に滴下した。こ
の溶液を室温で３時間攪拌した後、大半の溶媒を除去
し、残留物をセファデックスでクロマトグラフィーにか
けた。

【００８１】2.2 ビオチンシラン２の合成 単離したビオチン−ＤＡＤＯＯ−ドデカン酸ＯＳｕエス
テル 280 mg をメタノール 5 ml に溶解した。この溶液
にアミノブチルジメチルメトキシシラン 80 mgを滴下
し、１時間攪拌した。次に、この溶液にジエチルエーテ
ル 30 mlを加え、沈殿した固体を吸引濾過した。NH₂-シ
リカゲルによるクロマトグラフィーで精製したところ、
生成物 50 mgが得られた。

【００８２】〔実施例３〕ビオチンシラン３の合成

【００８３】

【化７】

【００８４】ビオチン−ＤＡＤＯＯ−ドデカン酸ＯＳｕ
エステル 680 mg をメタノール 7 ml に溶解した。この
溶液にアミノプロピルトリメトキシシラン 215 mg を滴
下し、１時間攪拌した。次に、この溶液をNH₂-シリカゲ
ルカラムで精製した。生成物画分を濃縮し、ジエチルエ
ーテル 50 mlと混合し、沈殿した固体を吸引濾過した。
収量は420 mgであった。

【００８５】〔実施例４〕シラン希釈剤４の合成

【００８６】

【化８】

【００８７】4.1 トリエチレングリコールモノメチル
エーテルトシレートの合成 ピリジン 400 ml 中にトリエチレングリコールモノメチ
ルエーテル 53.2 mlを溶解した溶液に塩化トシル 69.6
g を−５℃で徐々に加えた。これを０℃で３時間、室温
で１時間攪拌した。この混合物を水 400 ml と混合し、
次に酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル相からトシレー
ト 90 g(収率85％) を単離した。

【００８８】4.2 トリエチレングリコールモノメチル
エーテルフタルイミドの合成 トシレート 9.55 g をＤＭＦ 20 mlに溶解し、ＤＭＦ 8
0 ml中にフタルイミドのカリウム塩 6.11 g を溶解した
溶液に滴下した。この混合物を120 ℃で４時間攪拌し、
水で希釈した後酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル相か
ら油状の生成物4.7 g (53％) を単離した。

【００８９】4.3 １−アミノ−トリエチレングリコー
ルモノメチルエーテルの合成 4.2 より単離した生成物 1.53 g をメタノール 25 mlに
溶解した。80％のヒドラジン水化物溶液 0.32 mlを滴下
し、50℃で３時間還流下に加熱し、その後15分間加熱し
た。冷却後、混合物を塩酸で酸性化して濾過した。濾液
を中和した後クロロホルムで抽出した。クロロホルム相
から油状の生成物１−アミノ−トリエチレングリコール
モノメチルエーテル 740 mg (87 ％) を単離した。

【００９０】4.4 スベリン酸−１−ＯＳｕ−エステル
−１２−アミド−トリエチレングリコールモノメチルエ
ーテル スベリン酸ビス−ＯＳｕエステル 15.8 g をトリエチル
アミン 0.6 ml とともにＤＭＦ 20 ml中に溶解した。こ
の溶液にＤＭＦ 10 ml中の4.3 より単離した生成物 700
mg を加えた。混合物を室温で４時間攪拌し、その後Ｄ
ＭＦを留去した。残留物を水 20 mlと混合して濾過し
た。濾液から溶媒を除き、シリカゲルのカラムで精製し
たところ、油状の生成物 750 mg (42 ％) が得られた。

【００９１】4.5 シラン希釈剤４の合成 4.4 から得られた生成物 270 mg をジエチルエーテル 5
ml とメタノール 1 ml の混合物に溶解した。トリエチ
ルアミン 0.09 mlを加え、次にアミノブチル−ジメチル
モノメトキシシラン 115 mg を滴下した。この混合物を
室温で１時間攪拌し、生成物をクロマトグラフィーで精
製した。190 mg (63％) のシラン希釈剤４が得られた。

【００９２】〔実施例５〕5.1 シラン希釈剤５の合成

【００９３】

【化９】

【００９４】4.4 から得られた生成物 270 mg をジエチ
ルエーテル 5 ml とメタノール 1 ml の混合物に溶解し
た。トリエチルアミン 0.09 mlを加え、次にアミノブチ
ルトリメトキシシラン 127 mg を滴下した。この混合物
を室温で１時間攪拌し、生成物をクロマトグラフィーで
精製した。190 mg (61％) のシラン希釈剤５が得られ
た。

【００９５】5.2 シラン希釈剤６の合成

【００９６】

【化１０】

【００９７】このシランの合成はシラン希釈剤４の合成
について先に記載したとおりに行った。出発物質とし
て、トリエチレングリコールモノメチルエーテルの代わ
りにテトラエチレングリコールモノメチルエーテルを使
用した。

【００９８】5.3 シラン希釈剤７の合成

【００９９】

【化１１】

【０１００】このシランの合成はシラン希釈剤５の合成
について先に記載したとおりに行った。出発物質とし
て、トリエチレングリコールモノメチルエーテルの代わ
りにテトラエチレングリコールモノメチルエーテルを使
用した。

【０１０１】〔実施例６〕さらに、次のシラン化合物を
製造した：6.1 ビオチンシラン化合物８

【０１０２】

【化１２】

【０１０３】6.2 ビオチンシラン化合物９

【０１０４】

【化１３】

【０１０５】6.3 ビオチンシラン化合物10

【０１０６】

【化１４】

【０１０７】6.4 ビオチンシラン化合物11

【０１０８】

【化１５】

【０１０９】6.5 ビオチンシラン化合物12

【０１１０】

【化１６】

【０１１１】6.6 ビオチンシラン化合物13

【０１１２】

【化１７】

【０１１３】ビオチン−Ｘ−ＯＳｕ 1.7 gをメタノール
20 ml中に懸濁し、これに６−（アミノヘキシルアミノ
プロピル）−トリメトキシシラン 1.28 g を滴下した。
この溶液を1.5 時間攪拌し、その後アミノ−シリカゲル
カラムでクロマトグラフィーにかけた。白色の固体 2.1
gが得られた。

【０１１４】6.7 ビオチンシラン化合物14

【０１１５】

【化１８】

【０１１６】6.8 ビオチンシラン化合物15

【０１１７】

【化１９】

【０１１８】ビオチン−Ｘ−ＯＳｕ 850 mg をメタノー
ル 10 ml中に懸濁し、この懸濁液に４−アミノブチルジ
メチルメトキシシラン 280 mg を滴下した。この溶液を
室温で４時間攪拌し、その後アミノ−シリカゲルカラム
で精製した。白色の固体 700mg が得られた。

【０１１９】6.9 ビオチンシラン化合物16

【０１２０】

【化２０】

【０１２１】6.10 ビオチンシラン化合物17

【０１２２】

【化２１】

【０１２３】ビオチン−Ｘ−ＯＳｕ 800 mg をメタノー
ル 20 ml中に懸濁した。これに（２−アミノエチルアミ
ノ）プロピルメチルジメトキシシラン 300 mg を滴下
し、2.5 時間攪拌した。その後、この混合物をアミノ−
シリカゲルカラムで精製したところ、生成物 650 mg が
得られた。

【０１２４】6.11 ビオチンシラン化合物18

【０１２５】

【化２２】

【０１２６】6.12 ビオチンシラン化合物19

【０１２７】

【化２３】

【０１２８】6.13 ビオチンシラン化合物20

【０１２９】

【化２４】

【０１３０】6.14 ビオチンシラン化合物21

【０１３１】

【化２５】

【０１３２】6.15 ビオチンシラン化合物22

【０１３３】

【化２６】

【０１３４】6.16 ビオチンシラン化合物23

【０１３５】

【化２７】

【０１３６】〔実施例７〕表面の分析方法 7.1 導波管測定法 ＡＳＩ (Artificial Sensing Instruments、チューリッ
ヒ) 社からのセンサーおよび装置を使って測定を行っ
た。この測定法では、レーザー光をセンサー上の格子の
上にある導波層にカップリングする。カップリング条件
（角度）は導波層の界面の条件に依存する。従って、成
長する層の厚みはカップリング条件の変化から推定する
ことができる。測定はフローキュベットで行った。導波
層はＳｉＯ ₂／ＴｉＯ₂からなる混合酸化物である。

【０１３７】7.2 白色光干渉法（ＷＩＦ） Zeiss CLX-111 白色光源および検出器としてZeiss MCS-
310 ダイオードアレイスペクトロメーターを備えたZeis
s 測定装置を使って測定を行った。センサーとしては、
Leybold 被覆装置 Univex 450 で約 800 nm のＳｉＯ₂
を被覆した Schott カラーフィルターガラスWG 345を使
用した。測定はフローキュベットで行った。得られた干
渉図から層の厚みを決定することができる。

【０１３８】〔実施例８〕酸化物表面へのビオチンシランの適用 8.1 表面の調製 被覆すべき酸化物表面を王水（濃硝酸と濃塩酸の混合
液）中で数分間煮沸し、次に再蒸留水で３回すすいで、
減圧下に80℃で１時間乾燥させた。8.2 シラン希釈剤を使用しない、薄いビオチン層をも
たらす表面の不完全シラン化 シラン１を乾燥メタノールに10^-3重量％の濃度で溶解し
た。8.1 に従って調製した被覆すべき試験片をこの溶液
に浸し、室温で30分間この溶液中に保持した。その後表
面を乾燥メタノールで３回すすいで、減圧下に80℃で30
分間状態調整（コンディショニング）した。

【０１３９】8.3 酸化物表面にビオチンシラン、親水
性希釈剤または両方の混合層を被覆する方法 シランまたはその混合物を、混合物中のそれらのモル割
合に応じて１重量％の総濃度で乾燥メタノールに溶解し
た。8.1 に従って調製した被覆すべき試験片に、密閉容
器内でメタノール飽和不活性ガスの雰囲気下にこの溶液
を被覆した。反応時間は室温で４時間であった。その後
表面をメタノールですすぎ、サンプルを乾燥器内で120
℃で４時間状態調整した。

【０１４０】〔実施例９〕分析（白色光干渉法）の結果 白色光干渉法による測定の場合には、タンパク質溶液を
テフロンキュベットからPharmacia 蠕動ポンプを使って
移送した。各サイクルは中間すすぎのために５分の間隔
をおいて10分であった（すなわち、バッファー：10分、
タンパク質溶液１：10分、バッファー：５分、タンパク
質溶液２：10分など）。

【０１４１】9.1 使用した溶液 バッファー：PBS バッファー (50 mM リン酸カリウム,
150 mM NaCl, pH 7.2) ストレプトアビジン溶液：ｃ＝0.5 mg/ml PBS ビオチン-<HCG>-Fab断片 (Bi-Fab) ：ｃ＝0.1 mg/ml PB
S ヒト絨毛性ゴナドトロピン (HCG)：ｃ＝５μg/ml ウシフィブリノーゲン：ｃ＝３ mg/ml

【０１４２】9.2 フィブリノーゲンの結合 PBS バッファー10分、フィブリノーゲン溶液10分、PBS
バッファー10分をＷＩＦにより測定した。9.2.1 均一に官能化された表面（混合層ではない） フルオロシランおよびトリクロロ−オクタデシルシラン
を除いて、すべてのシラン類を8.3 に従って適用した。
フルオロシランおよびトリクロロ−オクタデシルシラン
用の溶媒としてはクロロホルムを使用した。

【０１４３】

【０１４４】9.2.2 混合層を有する表面

【０１４５】

【０１４６】9.3 ストレプトアビジンの特異的結合

【０１４７】

【０１４８】9.4 ストレプトアビジンの非特異的結合
ビオチンで飽和させたストレプトアビジンをセンサー面
の上に移送した。 センサー 層の厚みの増加(nm) 希釈剤５／ビオチンシラン１（Ｘ_B ＝0.2 ） 0.0 希釈剤５／ビオチンシラン１（Ｘ_B ＝0.5 ） 0.0 希釈剤４／ビオチンシラン２（Ｘ_B ＝0.5 ） 1.5

【０１４９】9.5 ＨＣＧイムノテスト法 ストレプトアビジンを被覆したセンサーにビオチニル化
＜ＨＣＧ＞Ｆａｂ断片を被覆した。その後、ＨＣＧ溶液
をセンサーの上に移送した。

【０１５０】

【０１５１】〔実施例10〕導波管法（ＡＳＩ）を用いた分析の結果 ＡＳＩセンサーにビオチンシラン化合物１、13、15およ
び17を被覆した。この被覆は8.2 に記載した方法に従っ
て希釈剤を使用しないで行った。これらセンサーへのス
トレプトアビジンの結合能ならびに非特異的に結合した
ストレプトアビジンの割合を分析した。

【０１５２】センサーの層の厚みは、被覆前よりもビオ
チンシランを被覆した後の方が小さかった（0.01〜0.81
nm ）。カップリング(TM+) および(TE+) の角度は同様
に被覆によって減少した。総ストレプトアビジン結合に
対する、シラン化ＡＳＩセンサー面へのストレプトアビ
ジンの非特異的結合の割合は、個々のビオチンシラン化
合物によって非常にバラツキがあった。

【０１５３】 ビオチンシラン17 24 ％ ビオチンシラン15 73 ％ ビオチンシラン１ 9 ％ ビオチンシラン13 20 ％ メタノール 91 ％ ビオチンシラン17、１および13がストレプトアビジンと
良好に結合する（→放出がない）。

【０１５４】ビオチンで飽和させたストレプトアビジン
面への（ビオチンの存在下での）Ｂｉ−ＭＡＢ＜ＴＳＨ
＞の非特異的結合の割合もまた、全てのビオチンシラン
化合物において変化した。 ビオチンシラン17 20 ％ ビオチンシラン15 <100 ％ ビオチンシラン１ 42 ％ ビオチンシラン13 31 ％ メタノール 24 ％ ビオチンシラン17が試験したビオチンシラン化合物のう
ちで最もよかった。ビオチンシラン17で処理したセンサ
ーはアナライト（ＴＳＨ）に対して最高のシグナル幅を
与えた。

【０１５５】〔実施例11〕イムノアッセイにおける微小区画化結合マトリックスの
使用 11.1 蒸着によるＳｉＯ₂ スポットの作製 Leybold 高真空被覆装置 (Univex 450) を使って電子ビ
ーム蒸着により、金属マスク（ｄ＝0.5 mm、アルミニウ
ム材料）を用いて寸法８×８ cm の“Lexan”ポリカー
ボネートフォイル（製造会社：General Electric、厚
み：0.75 mm ）の上に、36×36の丸いＳｉＯ₂ スポット
（合計1296個のスポット）を規則正しい間隔で蒸着し
た。蒸気被覆酸化物の層の厚みは150 mmであった。スポ
ットの直径は１mmで、個々のスポットはあらゆる方向で
１mm離れていた。

【０１５６】11.2 スポットへのビオチンシランの適用 シラン１とシラン５の混合物（モル比１：９）をメタノ
ールに溶解して総濃度を１重量％とした。この溶液に１
％の水を加え、スポットを有する支持体をこの溶液の中
に浸した。反応時間は４時間であった。その後、プレー
トをメタノールで洗い、120 ℃で４時間乾燥させた。

【０１５７】11.3 ストレプトアビジンの適用 このようにしてスポットを被覆したプレートに、50 mmo
l/l リン酸Ｋバッファー pH 7.2中のストレプトアビジ
ン溶液（ｃ＝0.5 mg/ml ）を１時間重層させた。その
後、プレートを50 mmol/l リン酸Ｋバッファー pH 7.
2、２％スクロース、0.9 ％ＮａＣｌおよび0.3 ％ウシ
血清アルブミンの溶液で洗い、気候室(climatic chambe
r)内で25℃、湿度40％にて20時間乾燥させた。

【０１５８】11.4 ＴＳＨ試験法 ＴＳＨ試験はストレプトアビジンを被覆したスポット上
で次のように実施した。 １．ビオチニル化モノクローナル抗ＴＳＨ抗体 1.20 Ｂ
ｉ（ＯＳｕ）１：８とともに45分間インキュベートす
る。抗体の濃度は10μg/mlであった。バッファー：20 m
mol/l リン酸Ｋ pH 7.4 ； ２．バッファーで洗う； ３．“Enzymun”標品 (Boehringer Mannheim Company)
とともに、あるいは血漿サンプルとともに数分インキュ
ベートする； ４．バッファーで洗う； ５．蛍光ラテックス−抗体（Ａ８）結合体（バッチ DF4
99）（バッファー中の固体含量 0.02 ％）とともに数分
インキュベートする； ６．バッファーで洗う； ７．同焦点蛍光顕微鏡 (Biorad社) で測定する。

【０１５９】11.5 結果 ２標品（０μＵおよび2.3 μＵのＴＳＨ）ならびに3.2
μＵのＴＳＨを含有する血漿サンプルを測定した。こう
して下記の相対強度が得られた。

【０１６０】サンプル 相対強度 ０ μU TSH 26.4 2.3 μU TSH 112.7 血漿(3.2μU TSH) 186.7

【０１６１】

【発明の効果】本発明の結合マトリックスによれば、固
相反応体の流出及びタンパク質の非特異的結合が減少す
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ハンス−ゲオルグ バッツ ドイツ連邦共和国 82327 チュトツィン ク トラオビンゲル シュトラーセ 63番 地

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酸化物表面を有するキャリア物質と、ア
   ンカー基によりそれに共有結合された、少なくとも１の
   遊離の反応相手と結合できる固相反応体とを含む結合マ
   トリックスであって、前記固相反応体が、希釈された、
   実質的に横方向に均質な結合層を前記キャリア物質の表
   面上に形成しており、アンカー基がシラン基でありスペ
   ーサ分子を介して前記固相反応体に結合しているもので
   ある前記結合マトリックス。
2. 【請求項２】 キャリア物質の表面上の固相反応体の被
   覆が最大の被覆の１〜40％である請求項１記載の結合マ
   トリックス。
3. 【請求項３】 アンカー基が、酸化物キャリア物質表面
   と、下記一般式(I) または／及び(II) R¹R²R³Si− (I) または 【化１】 （式中、R¹、R²、R³及びR⁴は同一でも異なってもよく、
   Si原子上の置換基を示し、但し式(I) 中の置換基R¹、R²
   及びR³の少なくとも１つ、または式(II)中のR¹、R²、R³
   及びR⁴の少なくとも１つは酸化物表面に共有結合できる
   ものである）の表面反応性シラン基との反応により形成
   されたものである請求項１または２に記載の結合マトリ
   ックス。
4. 【請求項４】 アンカー基が、２〜50原子の鎖長を有す
   る柔軟な直鎖スペーサ分子を介して固相反応体に結合し
   ている請求項１〜３のいずれか一つに記載の結合マトリ
   ックス。
5. 【請求項５】 固相反応体に結合したスペーサ分子に加
   えて、アンカー基により固相に共有結合により結合した
   希釈剤分子を含む請求項１〜４のいずれか一つに記載の
   結合マトリックス。
6. 【請求項６】 固相反応体が、内部及び外部成分からな
   り、外部成分が少なくとも１の遊離の反応相手と結合で
   きるものである請求項１〜５のいずれかに記載の結合マ
   トリックス。
7. 【請求項７】 内部成分がビオチンであり、外部成分が
   ストレプトアビジンである請求項６に記載の結合マトリ
   ックス。
8. 【請求項８】 それぞれが請求項１〜７のいずれか一つ
   に記載の結合マトリックスを含む、空間的に分離された
   複数の領域がキャリア物質上に配置された、区画された
   結合マトリックス。
9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれか一つに記載の希
   釈された結合マトリックスを含む分析エレメントであっ
   て、固相反応体が、反応相手の１または数個の追加の層
   により被覆されている分析エレメント。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の区画された結合マト
    リックスを含む、試料中の異なる分析物を決定するため
    の請求項９に記載の分析エレメントであって、個々の空
    間的に分離した結合マトリックス領域が、それぞれ異な
    る別の反応相手により被覆されている前記分析エレメン
    ト。
11. 【請求項１１】 バイオアフィニティを有する少なくと
    も２種の反応体であって、その１種が固相に結合されて
    存在し、その他の１または複数種の反応相手は遊離のも
    のである反応体の間の特異的結合反応により試料溶液中
    の分析物を測定する方法であって、請求項１〜８のいず
    れか一つに記載の結合マトリックスあるいは請求項９ま
    たは10に記載の分析エレメントの成分である固相に結合
    された反応体が使用される前記方法。
12. 【請求項１２】 試料溶液中の異なる分析物を同時に決
    定するための請求項11に記載の方法であって、試料溶液
    が、請求項８に記載の区画された結合マトリックスまた
    は請求項10に記載の分析エレメントと接触させられ、試
    料溶液中の異なる分析物の存在または／及び量が、個々
    の空間的に分離された結合マトリックス領域上の局所分
    解測定により決定される前記方法。
13. 【請求項１３】 請求項１〜７のいずれか一つに記載の
    結合マトリックスを製造する方法であって、酸化物キャ
    リア物質が、表面活性シラン末端基と、スペーサ分子を
    介してそれに結合した固相反応体とからなる分子を含む
    反応溶液とインキュベートされる前記方法。
14. 【請求項１４】 請求項８に記載の区画された結合マト
    リックスの製造方法であって、酸化物表面を有するキャ
    リア物質上の空間的に分離した領域が、表面活性シラン
    末端基と、スペーサ分子を介してそれに結合した同一ま
    た異なる固相反応体とからなる分子を含む同一また異な
    る複数の反応溶液とインキュベートされる前記方法。
15. 【請求項１５】 下記一般式(III) または(IV) R¹R²R³Si-Sp-X¹ (III) または 【化２】 （式中、R¹、R²、R³及びR⁴は同一でも異なってもよく、
    Si原子上の置換基を示し、但し式(III) 中の置換基R¹、
    R²及びR³の少なくとも１つ、または式(IV)中の置換基
    R¹、R²、R³及びR⁴の少なくとも１つは酸化物表面に共有
    結合できるものであり、Spは２〜50原子の鎖長の柔軟な
    直鎖スペーサ分子である）を有するシラン化合物。
16. 【請求項１６】 酸化物表面に対するタンパク質の非特
    異的結合を減少させる方法であって、酸化物表面を、請
    求項15記載の１種または複数のシランにより、シラン化
    合物と表面の反応が生起する条件下で処理するものであ
    り、式(III) 及び(IV)中のX¹、X²及びX³がC₁-C₄ アルコ
    キシ（オリゴ-C₂-C₄- アルキレン−オキシド）基である
    前記方法。
17. 【請求項１７】 酸化物表面を有する物体であって、酸
    化物表面が、請求項15記載の１種または複数のシランと
    表面との反応により形成された結合層により少なくとも
    部分的に被覆されており、式(III) 及び(IV)中のX¹、X²
    及びX³がC₁-C₄ アルコキシ（オリゴ-C₂-C₄- アルキレン
    −オキシド）基である前記物体。